專利名稱：一種防治宮頸癌的藥物組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其制備方法，特別涉及一種防治宮頸癌的藥物組合 物及其制備方法。
背景技術：
子宮頸癌是女性第二大常見癌癥，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位；每年全球大 約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，20多萬人死于宮頸癌，其中，80%的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。 我國每年新發(fā)生子宮頸癌13. 15萬，占世界子宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28. 8%。隨著分子生 物學與流行病學的發(fā)展，人乳頭瘤狀病毒(human papillomauirus, HPV)感染與下生殖道 疾病關系研究的不斷深入?，F(xiàn)已證實，生殖道的HPV(人乳頭瘤病毒)與宮頸癌關系明確。 2001年FIGO流行病學和統(tǒng)計學報告，子宮頸癌的發(fā)病有年輕化的趨勢，年齡由20世紀50 年代的平均年齡60歲下降到90年代末的50歲，嚴重威脅廣大婦女生命健康。研究宮頸癌 發(fā)生的病理機制，探索有效的治療方法，挽救宮頸癌患者的生命，成為每一個婦科醫(yī)務工作 者的重要使命。目前認為放療和手術是治療宮頸癌的有效方法，然而臨床上很多高危因素的病 例，如晚期癌、桶狀癌、淋巴結轉(zhuǎn)移或小細胞癌，無論手術或放療均不滿意，宮頸腫瘤局部復 發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因，即使應用現(xiàn)代的放療設備和根治手術，都很難治愈， 況且其創(chuàng)傷大，副反應重，可能剝奪年輕患者的生育功能，所帶來的身心痛苦經(jīng)濟負擔以及 對患者生活質(zhì)量的影響往往為許多婦女不愿接受或難以耐受。為此，學者們一直致力于尋 求新的微創(chuàng)、副反應小、作用局限可以根治腫瘤的方法，隨著新的化療藥物不斷問世和化療 技術的不斷發(fā)展，化療在宮頸癌治療中的作用日益重要，但現(xiàn)代醫(yī)學中多數(shù)抗腫瘤藥物缺 少選擇性抑制腫瘤的作用，在殺傷腫瘤細胞的同時，也常伴有不同程度的毒性反應。中醫(yī)認為癌是正氣不足、氣滯、痰凝、血瘀日久而引起的，中醫(yī)認為治療癌癥要以 “軟堅散結”為原則。決定最佳的治療方式前必須考慮很多因素，包括腫瘤大小，病患年齡及 整體健康狀況還有早期晚期等等。中醫(yī)藥從辨證論治出發(fā)，調(diào)整機體功能，改善臨床癥狀， 減輕放療、化療的毒副反應，提高手術前后機體抗感染能力和細胞免疫能力，可大大提高臨 床療效，應貫穿于治療的始終，現(xiàn)已成為治療癌癥的主要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開一種防治宮頸癌的藥物組合物，本發(fā)明的目的還在于公開該 藥物組合物的制備方法。本發(fā)明目的是通過如下方案實現(xiàn)的本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成為銀花5-25重量份 莪術10-40重量份 連翹5_25重量份蜈蚣5-25重量份 紫草5-25重量份 黃柏5_25重量份。本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成優(yōu)選為
銀花15重量份 莪術30重量份 連翹15重量份蜈蚣15重量份 紫草15重量份 黃柏15重量份。本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成優(yōu)選為銀花20重量份 莪術15重量份 連翹10重量份蜈蚣20重量份 紫草20重量份 黃柏10重量份。本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成優(yōu)選為銀花10重量份 莪術35重量份 連翹20重量份蜈蚣10重量份 紫草10重量份 黃柏20重量份。取本發(fā)明原料藥，按常規(guī)工藝，加入常規(guī)輔料制備成臨床可接受的外用劑型包括 但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或膏劑。本發(fā)明藥物組合物的制備方法還可以為如下步驟取原料藥莪術和連翹加5-10重量倍的水，提取5-10小時，得揮發(fā)油和提取液a ； 取原料藥銀花和蜈蚣加5-10重量倍的水，煎煮5-10次，每次0. 5-2. 0小時，得提取溶b ；取 原料藥黃柏和紫草，加50% -90%乙醇提取1-3次，回收乙醇，得提取液c ；合并以上提取液 a、b和c，濃縮，干燥，得藥粉，出粉率為10-15%;往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加 入常規(guī)輔料制備成臨床可接受的外用劑型包括但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或 膏劑。本發(fā)明藥物組合物的制備方法還可以優(yōu)選為如下步驟取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油和提取液a ；取原料 藥銀花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏和紫草，加 70%乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c;合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥，得藥粉，出 粉率為12% ；往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加入常規(guī)輔料制備成臨床可接受的外 用劑型包括但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或膏劑。其中，本發(fā)明藥物組合物栓劑的原料組成為藥粉1重量份 半合成脂肪酸脂2-8重量份 揮發(fā)油2-5體積份。其中，本發(fā)明藥物組合物栓劑的原料組成優(yōu)選為藥粉1重量份 半合成脂肪酸脂5重量份 揮發(fā)油3. 5體積份。其中，上述重量份與體積份的關系為g/μ 1的關系。


圖1 口服空白對照組凋亡率及DNA含量；圖2 本發(fā)明藥物組合物栓劑口服組凋亡率及DNA含量；圖3 空白組含藥血清作用72小時的細胞情況(10*視野圖像)；圖4 本發(fā)明藥物組合物栓劑組含藥血清作用72小時的細胞情況(10*視野圖 像)；圖5 對P53基因表達的影響。本發(fā)明藥物組合物由紫草、莪術、銀花等藥物組成，主要制成栓劑、泡騰劑、噴霧 劑、氣霧劑或膏劑等外用劑型，臨床及藥效實驗表明本發(fā)明藥物組合物具有顯著的抗炎作 用，并可通過分化-轉(zhuǎn)化從而促進細胞凋亡，從而對人宮頸鱗癌SiHa細胞產(chǎn)生作用；本發(fā)明藥物組合物還可直接抑制宮頸癌細胞的生長，并可能通過調(diào)控P53基因表達的分子機制， 達到抑制腫瘤的目的。因此，本發(fā)明藥物組合物在防治宮頸癌方面具有較好的臨床治療效 果，而且用藥方便、經(jīng)濟、無毒副反應，臨床用藥安全，是一種安全、有效、無副反應的防治宮 頸病變的中藥外用制劑。下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例1本發(fā)明藥物組合物治療宮頸糜爛98例臨床療效觀察1臨床資料1. 1診斷標準根據(jù)糜爛面積大小分為3度輕度(I度)指糜爛面積占整個宮頸面積的1/3 ；中 度(II度)指糜爛面積占整個宮頸面積的1/3-2/3 ；重度(III度)指糜爛面積占整個宮頸 面積的2/3以上。根據(jù)糜爛深淺程度分為3型單純型指在炎癥初期，糜爛面被單純柱狀上 皮所覆蓋，表面平坦；顆粒型指宮頸腺上皮過度增生并伴有間質(zhì)增生，糜爛面凸凹不平成顆 粒狀；乳頭型指間質(zhì)增生顯著，表面不平現(xiàn)象更加明顯呈乳頭狀。1. 2 一般資料98例病例均為2003年4月-2005年7月就診的門珍患者，年齡20-45歲，平均 32. 21歲；病程1-2年43例，3_8年50例，8年以上5例；白帶增多者84例，腰骶酸痛者48 例，下腹墜痛者32例，性交出血者34例；宮頸糜爛輕度22例，中度46例，重度30例；單純 型宮頸糜爛41例，顆粒型宮頸糜爛50例，乳頭型宮頸糜爛7例。見表1。表198例患者宮頸糜爛程度分布情況(例)
糜爛程度單純型顆粒型乳頭型合計輕度1210022中度2023346重度917430合計41507981. 3納入病例標準符合慢性宮頸糜爛診斷標準年齡在20-45歲。1. 4排除病例標準年齡< 20歲或> 45歲者；宮頸癌及癌前病變者；由滴蟲、霉菌、淋病等所致的炎 癥；1個月內(nèi)使用過同類藥物治療者；妊娠、哺乳期婦女。2治療方法使用本發(fā)明實施例1制備得到的藥物組合物栓劑治療，月經(jīng)干凈后3d開始用藥， 用窺器暴露宮頸，干棉球拭去宮頸表面分泌物，將藥物放置帶線棉碗上，覆蓋于宮頸，線頭 留于陰道口外，24h自行取出棉碗，隔日用1次，10次為1個療程，連續(xù)治療2個療程。經(jīng)期 停用，治療期間禁止性生活。3 結果3.1療效判定標準治愈子宮頸光滑，糜爛面消失，恢復彈性；顯效輕度宮頸糜爛面積縮小> 50%, 中度糜爛轉(zhuǎn)為輕度糜爛；重度糜爛轉(zhuǎn)為中度或輕度；有效輕度宮頸糜爛面積縮小< 50%，
5中度、重度糜爛面積縮小不足輕度，或糜爛面積無變化，但乳頭型轉(zhuǎn)為顆粒型，顆粒型轉(zhuǎn)為 單純型；無效糜爛面無變化或有發(fā)展。3. 2治療結果3. 2. 1宮頸糜爛療效本發(fā)明藥物組合物栓劑治療宮頸糜爛98例患者中，治愈32例，占32. 653% ；顯效 32例，占32. 653%;有效23例，占23. 469%;無效11例，占11. 225%，總有效率為88. 775%。3. 2. 2宮頸糜爛成都與療效的關系本發(fā)明藥物組合物栓劑對輕度宮頸糜爛療效明顯高于中度及重度宮頸糜爛，單純 型宮頸糜爛療效明顯高于顆粒型及乳頭型宮頸糜爛，差異顯著，有統(tǒng)計學意義。提示宮頸糜 爛深淺程度越輕，糜爛面積越小，療效越好。結果見表2、表3。表298例宮頸糜爛面積與療效關系
糜爛程度η治愈顯效有效無效總有效例%例%例%例%例%輕度221463.64627.2729. 09002210000中度461226.091634.781226. 09613. 044086.96重度30620.001033.33930. 00516.672583.33表398例宮頸糜爛深淺不同與療效關系
糜爛程度η治愈顯效有效無效總有效例%例%例%例 ％例%申.純型412151.221229.27819.510 C4110000顆粒型501020.002040. 001326.007 14.004186.00乳頭型7114.2900228.574 57.14542.863. 2. 3臨床癥狀改善情況用消毒治療后，白帶增多、腰骶酸痛、下腹墜痛、性交出血等臨床癥狀改善明顯。結 果見表4。表498例患者用藥前后臨床癥狀消失改善情況
癥狀體征用藥前陽性用藥后消失例%例%白帶增多8485. 7184100. 00腰骶酸痛4848. 984695.83下腹墜痛3232. 653093. 75性交出血3434. 692882. 353. 3不良反應69例患者治療前后進行血\尿常規(guī)及肝腎功能等安全性指標檢查，未發(fā)現(xiàn)異常； 98例在用藥期間尚未發(fā)現(xiàn)1例副反應及過敏現(xiàn)象。實驗例2本發(fā)明藥物組合物抗炎作用實驗
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1.材料與方法1. 1 材料(1)實驗藥物本發(fā)明實施例1制備的藥物組合物栓劑，制成膏劑(濃度為Ig/ ml)；康婦特栓，劑量2. Og/粒，含生藥0. 5g/粒，主要成分莪術油、氯苯米唑硝酸鹽，由唐山 太陽石制藥廠生產(chǎn)。(2)實驗動物雌性Wistar大鼠100只，體重130 150g ；昆明種小鼠100只，體 重25 30g。由北京維邁利華動物技術有限公司提供。1. 2實驗方法(1)本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠蛋清性關節(jié)炎的影響實驗將50只雌性Wistar 大鼠隨機分為5組①陰性對照組(空白栓劑)；②本發(fā)明藥物組合物栓劑高劑量組 (0. 4043g/kg)；③本發(fā)明藥物組合物栓劑中劑量組(0.2052g/kg)；④本發(fā)明藥物組合物栓 劑低劑量組(0.0513g/kg)；⑤陽性對照組(康婦特栓)。實驗各組均陰道給藥，每次上藥一 枚，隔日一次，共10次。于末次給藥后30分鐘開始造模，10%蛋清生理鹽水0. 05ml注入每 只大鼠右后足部，于不同時間測量左右后足關節(jié)周長，差值為腫脹度。分別記錄給藥0.5、1、 2、3、4、5、6小時足關節(jié)周長。(2)本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠角叉采膠足跖腫的影響實驗將50只雌性Wistar大鼠隨機分為5組①陰性對照組(空白栓劑)；②本發(fā)明藥 物組合物栓劑高劑量組(0.4043g/kg)；③本發(fā)明藥物組合物栓劑中劑量組(0.2052g/kg)； ④本發(fā)明藥物組合物栓劑低劑量組(0.0513g/kg)；③陽性對照組(康婦特栓)。實驗各組 均陰道給藥，每次上藥一枚，隔日一次，共10次。末次給藥30分鐘后以1 %角叉采膠生理鹽 水注射液0. 5ml，注入每只大鼠右后足跖皮下，此后不同時間測量左右后肢踝關節(jié)周長，其 差值為腫脹度。分別記錄給藥0.5、1、2、3、4、6小時踝關節(jié)的周長。(3)本發(fā)明藥物組合物栓劑對二甲苯致小鼠耳廓炎癥影響的實驗取雌性小鼠50只，隨機分成5組①陰性對照組(空白栓劑)②本發(fā)明藥物組合 物栓劑高劑量組(0.5928g/kg)③本發(fā)明藥物組合物栓劑中劑量組(0.2964g/kg)；④本發(fā) 明藥物組合物栓劑低劑量組(0.0741g/kg)；⑤陽性對照組(康婦特栓)。各組均隔日陰道 給藥一次，每次上藥一枚，共10次，于末次給藥后30min致炎貼一直徑0. 7cm的濾紙片在 左耳上，滴二甲苯3滴(0. 06ml)于濾紙上，20min后處死動物，剪下耳廓，用直徑為7mm打孔 器取下左右耳片，兩耳片重量之差為腫脹度。(4)本發(fā)明藥物組合物栓劑對小鼠慢性增生性炎癥影響的實驗將雌性小鼠50只，隨即分成5組①陰性對照組(空白栓劑)；②本發(fā)明藥物組合 物栓劑高劑量組(0.5928g/kg)；③本發(fā)明藥物組合物栓劑中劑量(0.2964g/kg)；④本發(fā)明 藥物組合物栓劑低劑量組(0.0741g/kg)；⑤陽性對照組(康婦特栓)。采用棉球肉芽腫法， 取雌性小鼠50只，在2%戊巴比妥淺麻醉和無菌條件下，于兩側腋部皮下各植入2mg消毒 棉球一個，術后當日起分5組，組別、劑量同前。各組均陰道給藥，每次上藥一枚，每日1次， 連續(xù)7d，第8d將小鼠處死，剝離并取出棉球肉芽腫，于70°C烘箱烘烤后稱重，減去原棉球重 量，即為肉芽腫重量。(5)統(tǒng)計分析應用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，劑量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采X2檢驗。
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2.結果2. 1本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠蛋清性關節(jié)炎的影響見表5。2. 2本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠角叉采膠足跖腫的影響詳見表6。2. 3本發(fā)明藥物組合物栓劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響詳見表7。2. 4本發(fā)明藥物組合物栓劑對小鼠棉球肉芽腫的影響詳見表8。表5本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠蛋清性關節(jié)炎足關節(jié)周長的影響(mm) (χ 士SD) 注與康婦特組比較灰P < 0. 05 ▲▲ P < 0. 01與陰性對照組比較*Ρ < 0. 05**Ρ < 0. 01表6本發(fā)明藥物組合物栓劑對大鼠角叉采膠中跖腫試驗后足關節(jié)周長的影響(單 位mm) (χ 士 SD)
注與康婦特組比較灰P < 0. 05 ▲▲ P < 0. 01 與陰性對照組比較*P < 0. 05**P < 0. 01
表7本發(fā)明藥物組合物栓劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響G 士SD)
注與康婦特組比較灰P < 0. 05 ▲▲ P < 0. 01 與陰性對照組比較*P < 0. 05**P < 0. 01
表8本發(fā)明藥物組合物栓劑對小鼠棉球肉芽腫重量的影響( 士SD) 注與康婦特組比較灰P < 0. 05 ▲▲ P < 0. 01與陰性對照組比較*Ρ < 0. 05#Ρ < 0. 01結果表明，大鼠蛋清性關節(jié)炎試驗中本發(fā)明藥物組合物栓劑各治療組與模型組的 關節(jié)腫脹度比較差異有顯著性；大鼠角叉采膠足跖腫試驗中本發(fā)明藥物組合物栓劑各治療 組成模型組的關節(jié)腫脹度比較差異顯著；二甲苯致小鼠耳廓炎癥實驗中本發(fā)明藥物組合物 栓劑各治療組致炎后兩耳片重量差值與模型組差異極顯著；小鼠慢性增生性炎癥實驗本發(fā) 明藥物組合物栓劑各治療組棉球肉芽腫重量差值與模型組對照差異極顯著。四個抗炎實驗 均證實本發(fā)明藥物組合物栓劑具有顯著的抗炎作用。實驗例3本發(fā)明藥物組合物對宮頸癌SiHa細胞凋亡及周期的影響1材料與方法1.1 材料(1)實驗藥物本發(fā)明實施例1所述藥物組合物栓劑；中藥陽性對照藥保婦康 栓；西藥陽性對照藥安達芬栓(重組人干擾素儀一 2b粉針劑)。(2)人宮頸癌細胞系一 SiHa(HPV16陽性的人宮頸鱗癌細胞系)購自美國ATCC細 胞庫，保存于北京大學人民醫(yī)院干細胞中心婦科實驗室。(3)試劑DMEM全培養(yǎng)液(購自美國GIBCO公司)、胎牛血清(購自元享圣馬公 司)、青霉素和鏈霉素(購自華北制藥廠)、胰酶及EDTA(購自SERVA公司及賽多利斯公司)、 RNaseA禾口 PI購自Sigma公司。1.2 方法(1)本發(fā)明藥物組合物栓劑、空白及陽性對照藥含藥血清的提取選雌性健康SD 大鼠64只，體重為220 250g，隨機編號，將大鼠分為4組空白對照組、保婦康組、干擾素 組和本發(fā)明藥物組合物栓劑組。每組分為口服和陰道給藥兩組.按人臨床給藥劑量的等效 劑量的10倍給藥(計算公式200g體重大鼠給藥劑量=60Kg體重人給藥劑量*0. 018*10)。 每日給藥1次，連續(xù)給藥6天。取給藥后Ih血清(西藥陽性對照肌注組給藥后40min取 血)，37°C水浴靜置0. 5h，3000rpm離心IOmin取血清，血清水浴滅活后備用。(2)細胞培養(yǎng)選用人宮頸癌細胞系一 SiHa(HPV16陽性的人宮頸鱗癌細胞系)于 含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μ g/ml的DMEM全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在恒溫培 養(yǎng)箱中以5% C02、37°C和飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。(3)流式細胞儀檢測生長周期的變化及凋亡分別收集以不同含藥血清培養(yǎng)液作 用72h及對照組細胞，75%冷乙醇固定，4°C過夜。PBS沖洗去除固定液，加入10mg/ml的 RnaseA溶液300 μ 1混勻。37°C孵育30min，加入PI染液至終濃度25 μ g/ml50 μ 1混勻，常
9溫避光染色Ih后以應用Cell Quest軟件獲取細胞10000個，以Modi Fit軟件進行細胞周 期分析，并繪制DNA分布圖。1.3統(tǒng)計分析所測數(shù)據(jù)以^ 士 s表示，檢測結果應用SPSS 10. 0軟件進行t檢驗和單因素方差分 析，P < 0. 05認為差異有顯著性。2實驗結果各組均以血清作用72h后進行比較。2. 1流式細胞儀檢測細胞周期各時相的變化(1) 口服給藥各組不同周期細胞占總細胞比例結果顯示，口服各組含藥血清組 S期所占比例較空白血清對照組減少，差異有顯著性(P <0.05)，尤以西藥陽性組明顯(P < 0. 01)，本發(fā)明藥物組合物栓劑組次之，中藥陽性組再次之。而GO Gl期所占比例較空 白血清對照組增加，其差異有顯著性(P <0.01)，見表9?？诜鹘M流式細胞儀檢測DNA的 含量，本發(fā)明藥物組合物栓劑組較空白血清對照組明顯減少(見圖1、圖2)。表9 口服給藥各組不同周期細胞占總細胞比例(％， 士s) 與空白口服組同期比較，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0.01ο(2)陰道給藥各組不同周期細胞占總細胞的比例結果顯示，陰道給藥各組血清 作用細胞后GO-Gl期所占比例較空白組有增加趨勢，見表10。表10陰道給藥各組不同周期細胞占總細胞的比例(％，5 士S) 2. 2流式細胞儀檢測凋亡的變化(1) 口服給藥各組細胞凋亡率比較結果顯示，口服給藥各組中，本發(fā)明藥物組 合物栓劑含藥血清組對細胞凋亡有促進作用，與空白血清對照組相比，具有統(tǒng)計學差異(P < 0.01)；西藥陽性對照組含藥血清對細胞凋亡有促進作用，與空白血清對照組相比，有統(tǒng) 計學差異(P <0.05)；中藥陽性對照組含藥血清未見明顯差異(見表11、圖1、圖2)。表11 口服給藥各組細胞凋亡率比較(％， 士S) 與空白口服組同期比較，*P < 0. 05，**P < 0. Ol0(2)陰道給藥各組細胞凋亡率比較結果顯示，未見明顯差異(見表12)。表12陰道給藥各組細胞凋亡率比較(％，^ 士S) 2. 3細胞生長狀況觀察倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀況，見培養(yǎng)基對照組細胞生長狀態(tài)良好，細胞形 狀規(guī)則，邊緣光滑，細胞貼壁緊密，死亡細胞少，與10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)下的細胞 無明顯差異。空白血清組與其亦無明顯差異，中藥陽性對照組死亡細胞量增加，西藥陽性對 照組及本發(fā)明藥物組合物栓劑組死亡細胞量增加更為明顯(見圖3、圖4)。實驗例4本發(fā)明藥物組合物對宮頸癌SiHa細胞P53基因調(diào)控作用的實驗研究1材料與方法1.1實驗材料1. 1. 1實驗藥物受試藥物本發(fā)明實施例1制備的藥物組合物栓劑；中藥陽性對照 藥保婦康栓及按其成分配備的口服溶液，西藥陽性對照藥安達芬栓及重組人干擾素a_2b 粉針劑。人宮頸癌細胞系一 SiHa(HPV16陽性的人宮頸鱗細胞系)，購自美國ATCC細胞庫。 保存于北京大學人民醫(yī)院干細胞中心婦科實驗室。1. 1. 2試劑DMEM全培養(yǎng)液(購自美國GIBCO公司)；胎牛血清(購自元享圣馬公 司)；青霉素和鏈霉素(購自華北制藥廠)；二甲基亞砜(DMSO)為上海華舜產(chǎn)品；胰酶及乙 二胺四乙酸二鈉(EDTA)(購于SERVA公司及賽多利斯公司)；RNaseA和PI購于Sigma公 司；噻唑藍(MTT)購于Sigma公司；Trizol試劑盒為北京Invitrogen公司產(chǎn)品，cDNA逆轉(zhuǎn) 錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2實驗方法1. 2. 1本發(fā)明藥物組合物栓劑、空白及陽性對照藥含藥血清的提取選雌性健康SD 大鼠64只，體質(zhì)量為220-250g，隨機分組法分為8組(每組8只)空白對照陰道組(VBC)， 中藥陽性對照陰道組(VHC)，西藥陽性對照陰道組(vwc)，本發(fā)明藥物組合物栓劑陰道組 (VQ)，空白口服組(0BC)，中藥陽性口服組(OHC)，西藥陽性對照肌注組(owe)，本發(fā)明藥物 組合物栓劑口服組(OQ)，按人臨床給藥劑量的等效劑量的10倍給藥(計算公式為200g體 質(zhì)量大鼠給藥劑量=60kg體質(zhì)量人給藥劑量*0. 018*10)，給藥1次/d，連續(xù)給藥6d，取給 藥后Ih血清，(西藥陽性對照肌注組給藥后40min取血)37°C水浴靜置0. 5h，3000r/min離心IOmin取血清，血清水浴滅活后備用。1. 2. 2細胞培養(yǎng)選用人宮頸癌細胞系_SiHa(HPV16陽性的人官頸鱗細胞系)于含 10%胎牛血清、青霉素100kU/L、鏈霉素100mg/L的DMEM全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱中 以5%二氧化碳(CO2)、37°C及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。1.2.3MTT法測定含藥血清對宮頸癌SiHa細胞的生長抑制作用取對數(shù)生長期 細胞制成單細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為7. 5xl07個/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μ L(7. 5χ103/孔)。含藥血清用含2. 5%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋為0. 5%U%>2%,4%, 8%,終體積為100 μ L/孔，每種濃度設立6個平等對照，并設正常對照，囂正常培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。24h換液1次，分別于含藥血清作用24、48、72及96h后，上機檢測吸光度(A)值。1. 2. 4流式細胞儀檢測生長周期的變化及凋亡分別收集以不同含藥血清培養(yǎng)液作 用72h及對照組細胞，75%冷乙醇固定，4°C過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去除固定液，加 入10g/L的RnaseA溶液300 μ L混勻，37°C孵育30min，加入PI染液至終濃度25mg/L50 μ L 混勻，常溫避光染色Ih后以應用Cell Quest軟件獲取細胞10000個，以Modi Fit軟件進 行細胞周期分析并繪制DNA分布圖。1.2. 5逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)法半定量研究P53表達的改變?nèi)∵M 入對數(shù)生長期的細胞，以8%不同含藥血清培養(yǎng)液作用72h后，以Triaol試劑盒提 取細胞中的總RNA，經(jīng)Promega逆轉(zhuǎn)錄反應體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，P53及內(nèi)參β 2m引 物序列如下，由賽百盛生物技術公司合成。P53的引物序列(擴增片段長度128bp) 上游 5， 一CTACTTCCIGAAAACAACGTTC-3，、下游 5， -GGCATTCTGGGAGCTTCATCT-3，， 擴增條件48 "C 45min，94 "C 2min 預變性；94 "C 變性 30s，59 °C 退火 lmin，72 "C 延 伸Imin共35循環(huán)；72 °C后延伸7min。內(nèi)參β 2m引物序列(擴增長度312bp)上 游-5，AGTATGCCTGCCGTGTGAAC-3，下游 5，-AAGTTGCCGCCAGCCCTCCTAG-3，。擴增條件 480C 45min,94°C 2min 預變性；94°C變性 30s，55°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 共 35 循環(huán)； 72°C后延伸7min。PCR產(chǎn)物分析擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相， 用 Phoretisld AdvancedV4. 0 軟件分析。1. 3統(tǒng)計學分析所有檢測數(shù)據(jù)采用SPSS12. 0軟件包進行統(tǒng)計學處理、采用方差分 析。2 結果2. 1對細胞生長及增殖的影響2. 1. IMTT法檢測各孔A值用藥后各組與對照組出現(xiàn)了活細胞數(shù)量減少，吸光度值 有降低趨勢，(P < 0. 05)，雖然本發(fā)明藥物組合物栓劑含藥血清對SiHa細胞的抵制作用無 濃度及時間正相關依賴性，但可以看到各組含藥血清在各時間點與空白對照組均有抑制作 用，尤以8%濃度、72h為顯著，與空白組比較有顯著性差異(P <0.01)，西藥陽性藥組抑制 作用最強，本發(fā)明藥物組合物栓劑組次之，但本發(fā)明藥物組合物栓劑組與西藥陽性藥組間 比無顯著性差異(0. 05)。見表13，表14。表13各組細胞生長增殖情況比較(5 士s，η = 6) 注各組均與空白對照組相比*P < 0. 05，< 0. 01 ；陰道給藥組和口服給藥組 分別比較。表14各組S期細胞占總細胞比例及細胞凋亡率比較^士s) 注各組均與空白對照組相比*P < 0. 05，< 0. 01 ；陰道給藥組和口服給藥組 分別比較。2. 1. 2流式細胞儀檢測細胞周期各時相的變化空白血清組S期所占比例較培養(yǎng) 基組增加，口服各組含藥血清組S期所占比例較空白血清對照組減少，有顯著性差異(P < 0. 05)，尤以西藥陽性組明顯，本發(fā)明藥物組合物栓劑組次之，中藥陽性組再次之。陰道給 藥組未見明顯差異。見表14。2. 1. 3流式細胞儀檢測凋亡的變化口服給藥實驗組本發(fā)明藥物組合物栓劑血清組 對細胞凋亡有促進作用，與空白血清對照組相比有統(tǒng)計學差異(P <0.05)；其余含藥血清 組未見明顯差異。見表14。2. 2對P53基因表達的影響經(jīng)RT-PCR并測定電泳條帶吸光度值，計算P53與132m 基因擴增片段的吸光度比值，可見口服各組含藥血清與對照組相比，P53mRNA的表達量增加 (P < 0. 01)，以西藥陽性藥組最佳，本發(fā)明藥物組合物栓劑次之，但本發(fā)明藥物組合物栓劑 與西藥陽性組相比較無顯著性差異。陰道給藥各組未見明顯差異。見圖5。實驗例5本發(fā)明藥物組合物栓劑治療宮頸人乳頭瘤病毒亞臨床感染的臨床研究1.臨床資料及方法1.1 一般資料病例來源為北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院婦科門診2004年8月 2005年6月就診的 宮頸HPV亞臨床感染的患者共60例。隨機分成試驗組(本發(fā)明實施例1制備的藥物組合 物栓劑組)、對照組(安達芬組)兩組進行治療觀察，兩組資料具有可比性。(詳見表15)表15兩組臨床資料比較(X 士 s) 注P < 0. 05差別有顯著性意義；P < 0. 01差別有極顯著性意義1.2用藥方法及觀察項目本發(fā)明藥物組合物栓劑由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院提供，規(guī)格0.57g/枚。安達 芬栓由安徽安科生物工程有限公司提供，規(guī)格10萬IU/枚。本發(fā)明藥物組合物栓劑組每 次陰道塞藥1枚，隔日1次，經(jīng)期停用。安達芬組用法同前。10次為一療程，連續(xù)治療2個 療程。觀察項目①治療前后臨床癥狀及宮頸局部情況；②臨床療效指標HC-IIHPVDNA、臨 床癥狀評分；③安全性指標血壓、心率、呼吸，肝、腎功能等。所有患者均簽署知情同意書， 符合臨床試驗倫理學要求。1. 3診斷及療效判定標準診斷標準HC-II (雜交捕獲二代)檢測HPVDNA陽性(Rlu/CO > 1)。臨床癥狀評 分標準參照國家藥品監(jiān)督管理局《中藥新藥臨床研究指導原則》。療效判定標準①痊愈 HC-II < 1. Opg/ml，臨床癥狀、體征積分比彡90 ；②顯效HC_II病毒載量下降彡60%,70^ 臨床癥狀、體征積分比< 90 ；③有效HC-II病毒載量下降> 30%,30 <臨床癥狀、體征積 分比< 70 ； (4)無效HC-II病毒載量下降< 30%或上升，臨床癥狀、體征積分比< 30。
治療前總積分-治療后總積分積分比=-*100%
治療前總積分1.4統(tǒng)計分析應用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采用X2檢 驗；等級資料用秩和檢驗。2.結果2. 1兩組治療前后HC-II HPVRlu/co均值、臨床癥狀積分比較本發(fā)明藥物組合物栓劑治療后病毒負荷量均值及臨床癥狀積分與療前比較均下 降明顯P < 0. 05，差異有顯著性；安達芬治療后病毒負荷量均值及臨床癥狀積分與療前比 較同樣下降明顯。治療后兩組間進行病毒負荷量下降均值比較P >0.05，差異無顯著性。 (見表16)2. 2治療后病毒負荷量療效比較本發(fā)明藥物組合物栓劑治療后有10例患者HPVDNA顯示陰性，達到治愈；13例 HC-IIHPVRlu/co下降值彡60%；7例下降值彡30%；5例下降值< 30%，其中2例治療后比 值升高，定為無效。有效率為85. 7% (30/35)。安達芬治療后7例患者HPVDNA顯示陰性， 達到治愈；9例HC-II HPVRlu/co下降值彡60% ；6例下降值彡30% ；3例下降值< 30%， 其中有1例治療后比值升高，定為無效。有效率為88.0% (22/25)。兩組病毒載量療效經(jīng)非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)P >0. 05，說明本發(fā)明藥物組合物栓劑與安達芬的療效無顯著性差 異。(見表17)2. 3治療后臨床癥狀、體征積分療效比較本發(fā)明藥物組合物栓劑治療后有6例患者臨床癥狀、體征積分比> 90 ；11例70 ( 積分比< 90 ；10例30 <積分比< 70 ；8例積分比< 30，定為無效。有效率為77. 14% (27/35)。安達芬治療后有4例患者臨床癥狀、體征積分比> 90 ；8例70 <積分比< 90 ；7 例30 <積分比< 70 ；6例積分比< 30，定為無效。有效率為76. 00% (19/25)。兩組積分療 效經(jīng)非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)P > 0. 05，說明本發(fā)明藥物組合物栓劑與安達芬對臨床癥狀、 體征的改善兩組比較無顯著性差異。(見表18)表16兩組治療前后病毒負荷量均值、臨床癥狀分比較 注治療前后自身比較*P < 0. 05#P < 0.01表17治療后HC-II HPVRlu/co療效比較 注P > 0. 05兩組比較無顯著性差異。表18治療后臨床癥狀、體征積分療效比較 注P > 0. 05兩組比較無顯著性差異。下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例所述的效果。
具體實施例方式實施例1 本發(fā)明藥物組合物栓劑銀花3kg莪術6kg連翹3kg蜈蚣3kg紫草3kg黃柏3kg ；取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油25-30 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏和紫草，加70%乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c;合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥， 得藥粉，出粉率為12% ；取半合成脂肪酸脂40g，取上述藥粉8g，再噴入上述所得揮發(fā)油，按 常規(guī)方法制得3500枚本發(fā)明藥物組合物栓劑。實施例2 本發(fā)明藥物組合物栓劑銀花4kg莪術3kg連翹2kg蜈蚣4kg紫草4kg黃柏2kg ；取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油30-40 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏 和紫草，加70%乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c;合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥， 得藥粉，出粉率為12% ；取半合成脂肪酸脂20g，取上述藥粉8g，再噴入上述所得揮發(fā)油，按 常規(guī)方法制得3500枚本發(fā)明藥物組合物栓劑。實施例3 本發(fā)明藥物組合物栓劑銀花2kg莪術7kg連翹4kg蜈蚣2kg紫草2kg黃柏4kg ；取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油20-25 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏 和紫草，加70%乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c;合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥， 得藥粉，出粉率為12% ；取半合成脂肪酸脂60g，取上述藥粉8g，再噴入上述所得揮發(fā)油，按 常規(guī)方法制得3500枚本發(fā)明藥物組合物栓劑。實施例4 本發(fā)明藥物組合物泡騰劑銀花15kg莪術30kg連翹15kg蜈蚣15kg紫草15kg黃柏15kg ；取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油25-30 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏 和紫草，加70%乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c;合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥， 得藥粉，出粉率為12% ；取半合成脂肪酸脂40g，取上述藥粉8g，再噴入上述所得揮發(fā)油，再 加入常規(guī)輔料按常規(guī)方法制得本發(fā)明藥物組合物泡騰劑。實施例5 本發(fā)明藥物組合物氣霧劑銀花20kg莪術15kg連翹IOkg蜈蚣20kg紫草20kg黃柏IOkg ；取原料藥莪術和連翹加6重量倍的水，提取9小時，得揮發(fā)油30-40 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加6重量倍的水，煎煮9次，每次1. 5小時，得提取溶b ；取原料藥黃 柏和紫草，加80%乙醇提取1次，回收乙醇，得提取液c ；合并以上提取液a、b和c，濃縮，干 燥，得藥粉，出粉率為11%;往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加入常規(guī)輔料制備成本 發(fā)明藥物組合物氣霧劑。實施例6 本發(fā)明藥物組合物膏劑銀花IOkg莪術35kg連翹20kg蜈蚣IOkg紫草IOkg黃柏20kg ；取原料藥莪術和連翹加9重量倍的水，提取6小時，得揮發(fā)油20-25 μ 1和提取液 a ；取原料藥銀花和蜈蚣加9重量倍的水，煎煮6次，每次0. 8小時，得提取溶b ；取原料藥黃 柏和紫草，加60%乙醇提取3次，回收乙醇，得提取液c ；合并以上提取液a、b和c，濃縮，干 燥，得藥粉，出粉率為14%;往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加入常規(guī)輔料制備成本 發(fā)明藥物組合物膏劑。
權利要求
一種防治宮頸癌的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物原料藥組成為銀花5 25重量份莪術10 40重量份連翹5 25重量份蜈蚣5 25重量份紫草5 25重量份 黃柏5 25重量份。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物原料藥組成為銀花15重量份 蜈蚣15重量份 或銀花20重量份 蜈蚣20重量份 或銀花10重量份 蜈蚣10重量份莪術30重量份 紫草15重量份莪術15重量份 紫草20重量份莪術35重量份 紫草10重量份連翹15重量份 黃柏15重量份；連翹10重量份 黃柏10重量份；連翹20重量份 黃柏20重量份。
3.如權利要求1-2任一所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取原料藥莪術和連翹加5-10重量倍的水，提取5-10小時，得揮發(fā)油和提取液a ；取原 料藥銀花和蜈蚣加5-10重量倍的水，煎煮5-10次，每次0. 5-2. 0小時，得提取溶b ；取原料 藥黃柏和紫草，加50% -90%乙醇提取1-3次，回收乙醇，得提取液c ；合并以上提取液a、b 和c，濃縮，干燥，得藥粉，出粉率為10-15%;往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加入常 規(guī)輔料制備成臨床接受的外用劑型包括但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或膏劑。
4.如權利要求3所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取原料藥莪術和連翹加8重量倍的水，提取8小時，得揮發(fā)油和提取液a ；取原料藥銀 花和蜈蚣加8重量倍的水，煎煮2次，每次1小時，得提取溶b ；取原料藥黃柏和紫草，加70 % 乙醇提取2次，回收乙醇，得提取液c ；合并以上提取液a、b和c，濃縮，干燥，得藥粉，出粉 率為12% ；往藥粉中噴入上述揮發(fā)油，按常規(guī)工藝，加入常規(guī)輔料制備成臨床接受的外用劑 型包括但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或膏劑。
5.如權利要求3或4所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于其中藥物組合物栓劑 的制備方法中原料組成為藥粉1重量份 半合成脂肪酸脂2-8重量份 揮發(fā)油2-5體積份。
6.如權利要求5所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于其中藥物組合物栓劑的制 備方法中原料組成為藥粉1重量份 半合成脂肪酸脂5重量份 揮發(fā)油3. 5體積份。
7.如權利要求1-2任一所述的藥物組合物在制備防治宮頸癌的藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于其中所述的防治宮頸癌是指阻斷人宮頸鱗癌 SiHa細胞從GO Gl期向S期分化，并促進其凋亡。
9.如權利要求7所述的應用，其特征在于其中所述的防治宮頸癌是指抑制宮頸癌細胞 的生長。
10.如權利要求7所述的應用，其特征在于其中所述的防治宮頸癌是指調(diào)控P53基因表 達的分子機制而抑制腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治宮頸癌的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物的原料藥組成為銀花、莪術、連翹、蜈蚣、紫草和黃柏，在制備方法中先將莪術和連翹提揮發(fā)油，其余原料藥制得藥粉，與揮發(fā)油混合，進一步加工成臨床可接受的外用劑型包括但不限于栓劑、泡騰劑、噴霧劑、氣霧劑或膏劑。藥效學實驗表明本發(fā)明藥物組合物具有顯著的抗炎作用，并可通過分化-轉(zhuǎn)化從而促進細胞凋亡，從而對人宮頸鱗癌SiHa細胞產(chǎn)生作用；本發(fā)明藥物組合物還可直接抑制宮頸癌細胞的生長，并可能通過調(diào)控P53基因表達的分子機制，達到抑制腫瘤的目的，是一種安全、有效、無副反應的防治宮頸病變的中藥外用制劑。
文檔編號A61P35/00GK101919991SQ20101010956
公開日2010年12月22日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權日2010年2月9日
發(fā)明者金哲 申請人:金哲