專利名稱：槐糖脂在制備抗宮頸癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及槐糖脂的藥物應用，尤其涉及利用擬威克酵母變種 (Wickerhamielladomercqiae var. sophorolipid)發(fā)酵產生的生物表面活性劑槐糖脂在制 備抗宮頸癌藥物中的應用。
背景技術：
槐糖脂是一種重要的生物表面活性劑，對于它的研究始于二十世紀五、六十年代， 主要是通過微生物發(fā)酵獲得。與化學合成的表面活性劑相比，槐糖脂具有表面性能優(yōu)良、環(huán) 境友好等許多優(yōu)點。 近年來，國外對于槐糖脂作為藥物的研究，特別是抗腫瘤藥物方面也已經有一些 文獻報道。Scholz和Mehta.等人報道，粗品槐糖脂及槐糖脂衍生物能夠抑制人類白血病細 胞株HL60和人頭頸癌細胞的增殖，并且證明了槐糖脂的抗腫瘤活性與槐糖脂的乙?；?關，通過化學反應去掉槐糖脂的乙?；?，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性明顯降低，但對其抗腫瘤機制沒 有進一步的研究。Isoda等人報道，槐糖脂能夠導致HL60白血病細胞系的細胞分化和抑制 蛋白激酶C的活性。此外，槐糖脂可用作帕金森氏病、老年性癡呆癥、牛皮癬、艾滋病治療的 免疫調節(jié)劑，還可用作抗病毒的免疫剌激。申請人也曾經對微生物產生的槐糖脂生物表面 活性劑用于抑制人肝癌細胞系和肺癌細胞系進行了初步研究，完善了槐糖脂粗提物的制備 方法，并于2006年申請了中國發(fā)明專利"一種擬威克酵母變種抗腫瘤活性槐糖脂粗提物的 制備方法，專利號ZL 200610042181. x"。然而，因各類腫瘤性質及發(fā)病機理各不相同，槐糖 脂對其作用的藥理效果也不盡相同，經文獻和專利檢索，利用槐糖脂在制備抗宮頸癌藥物 的研究方面還未見報道。 目前，宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以 上，其死亡率為婦女惡性腫瘤的首位。宮頸癌早期常用的治療方法多為廣泛性全子宮切除， 對患者及家庭都會帶來不良影響，晚期宮頸癌的治療方法主要有放化療及中醫(yī)藥治療，隨 著治療時間延長，帶來的毒副作用也越大。因此，研究和開發(fā)一種對人體毒性較小的治療宮 頸癌藥物有重要意義。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中所述的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種槐糖脂在制備抗宮 頸癌藥物中的應用。 本發(fā)明所述槐糖脂在制備抗宮頸癌藥物中的應用；同時還包括以槐糖脂為有效成 分的組合物在制備抗宮頸癌藥物中的應用。 以本發(fā)明所述槐糖脂再添加藥學上可接受的輔料或賦形劑可以制成任何一種抗 宮頸癌的藥劑學上所說的劑型；本發(fā)明所述抗宮頸癌藥物的劑型優(yōu)選栓劑或軟膏劑；其 中，所述劑型中槐糖脂的藥物濃度為20ii g/ml 125ii g/ml。
上所述劑型中槐糖脂的藥物濃度進一步優(yōu)選30 ii g/ml 100 y g/ml。
上述劑型中槐糖脂的藥物濃度最優(yōu)選40 ii g/ml 80 ii g/ml 。
上述栓劑的藥物制劑按照本行業(yè)已知的方法制備，在制備過程中使用常用基質， 例如脂肪性基質(可可豆脂、半合成甘油脂肪酸酯類、香果脂、氫化油類)、水溶性及親水性 基質(甘油明膠、聚乙二醇、吐溫-61、硬脂酸聚烴氧(40) S旨、水溶性殼聚糖、泊洛沙姆)。在 基質中加入吸收促進劑，如月桂氮酮類、乙酰乙酸甘油酯類、脂肪酸衍生物、P _環(huán)糊精、聚 乙烯吡咯烷酮、尿素、碳酸氫鈉、己二酸等發(fā)泡劑均能增加栓劑的釋藥速度；在基質中加入 少量吐溫-80、脂肪酸甘油酯、甘油、丙二醇，能降低脂肪的脆性，增加彈性；加入鯨蠟醇、硬 脂醇等能改善基質的黏性；加入蜂蠟、鯨蠟可提高基質的熔點。另外，在基質中加入一定的 吸收阻滯劑，如天然或氫化大豆磷脂、卵磷脂、海藻酸、羥丙基甲基纖維素、卡波姆、硬脂酸 和蜂蠟等，可延長藥物作用時間，達到緩釋和控釋藥物的目的；相對于一般栓劑而言，緩釋 栓劑解決了藥物制劑的"峰谷"現(xiàn)象——藥物濃度高時可能超過適宜的治療濃度，以致引起 不良反應的發(fā)生，藥物濃度低時可能不能產生期望的療效的問題。故我們對緩釋栓劑給予 了特殊關注。 上述軟膏劑的藥物制劑按照本行業(yè)已知的方法制備，在制備過程中使用可藥用輔
料或賦形劑，例如黏合劑(如預膠化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基纖維素)、填料(例如乳
糖、蔗糖、甘露醇等)、潤滑劑(例如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)、崩解
劑(例如淀粉、羧甲基纖維素鈉)或者潤濕劑(例如十二烷基硫酸 鈉)。 為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面以槐糖脂的藥理實驗及其結果來說明槐糖脂
作為抗宮頸癌藥物的應用。 本發(fā)明所述槐糖脂以如下方法制備(詳見專利號ZL 200610042181. x中的相關描 述) (1)菌禾中選擇擬威克酵母變禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于基本無機鹽培養(yǎng)基，其中添加質量體積比為1. 5 2. 0%的瓊脂，25 35t:條件下，靜止培養(yǎng)24 48小時； (3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 100ml含有質量體積比為4 14%的葡萄糖和1 8%的菜籽油的基本無機鹽培養(yǎng)基中， 25 35t:條件下，振蕩培養(yǎng)24 48小時，制得種子液； (4)擴大培養(yǎng)以5 10%的體積比的接種量，將種子液接種于100 1000ml含
有質量體積比為4 14%的葡萄糖和1 8%的菜籽油的基本無機鹽培養(yǎng)基中，25 35°C 條件下，振蕩培養(yǎng)96 288小時； (5)收集發(fā)酵產物將步驟(4)所得的發(fā)酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖 瓶底部的淺黃色粘稠液體，之后以4000 7000轉/分鐘將所述粘稠物質離心，收集沉淀部 分，即為槐糖脂粗提物； (6)減壓蒸餾將步驟(5)所得槐糖脂粗提物，在溫度50 7(TC，壓力0.2 0. 8Kg/cm2，真空度為0. 02 0. 08Mpa的條件下進行減壓蒸餾，蒸發(fā)去除其中的水分；
(7)收集物干燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在50 10(TC，真空度0.02 0. 08Mpa條件下，真空干燥12 24小時，制得固體槐糖脂。 以上述方法制得的固體槐糖脂進行體外抗宮頸癌細胞試驗，具體方法如下
1、實驗材料 1.細胞 腫瘤細胞人宮頸癌Hela細胞系貼壁細胞； 2.培養(yǎng)液含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液。 n、實驗條件 生物安全三級實驗室 ni、實驗步驟及結果 1. MTT法測定槐糖脂作用后腫瘤細胞的存活率，計算槐糖脂對宮頸癌細胞半數(shù)致 死濃度(IC5。);結果顯示當終濃度分別為5ii g/ml、10ii g/ml、15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml的槐糖脂樣品，分別作用于宮頸癌細胞24h，細胞的存活 率隨樣品濃度的增加而降低(表1)，并且在0 ii g/ml到40 ii g/ml的濃度范圍內，細胞的存 活率與樣品濃度呈負相關，當樣品濃度大于40 ii g/ml時，細胞全部死亡(圖1)?；碧侵瑢?人宮頸癌Hela細胞系的IQ為20. 33yg/ml。
表1 :MTT法測定槐糖脂作用后宮頸癌細胞存活率
作用濃度 (ug/mL)0510152025303540
100.096.0887.3680.7871.8674.9762.397.33-1.89
細胞存活±±:h±±±±±土
率(％)0.002.658.122.772.卯2.848.661,583.94 2. CPE法結合MTT法確定藥物對正常宮頸細胞的無毒濃度藥物取6個濃度即 1000ii g/ml，500ii g/ml、250ii g/ml、125ii g/ml、62. 5ii g/ml、30ii g/ml，進行細胞毒性測 定，每濃度做4個復孔，結果顯示最大無毒濃度為125 ii g/ml 。 3.藥物的最大無毒濃度對上述宮頸癌Hela細胞系的藥效測定取濃度為125 y g/ ml藥液，做4個復孔，觀察對上述腫瘤細胞的抑制作用。試驗設正常宮頸細胞對照。結果顯 示該濃度藥物對這株腫瘤細胞有完全抑制作用，而正常細胞生長正常。
4.倒置顯微鏡觀察槐糖脂作用前后宮頸癌細胞形態(tài)變化以終濃度分別為0 ii g/ m1、5 ii g/ml、 10 ii g/ml、 15 ii g/ml、20 ii g/ml、25 ii g/ml、30 ii g/ml、35 u g/ml、40 u g/ml的槐 糖脂樣品分別作用于宮頸癌細胞24h，在倒置顯微鏡下觀察結果顯示，正常宮頸癌細胞增殖 活躍并可見各期分裂相，細胞之間排列緊密，形態(tài)呈不規(guī)則多角形或圓形，輪廓清晰，核呈 圓形或橢圓形，并可見多核和巨大核細胞，核仁多個，形狀不規(guī)則；經槐糖脂作用后的宮頸 癌細胞，隨著槐糖脂濃度增大，相鄰細胞之間界限變得不明顯，部分細胞皺縮變圓，并且皺 縮細胞數(shù)目隨著槐糖脂濃度增大而增多，核仁變得不明顯，當樣品濃度達到40ii g/ml時， 宮頸癌細胞基本上全部皺縮，體積縮小，細胞表面突起小球體，形似酵母菌出芽，核仁消失， 并可見小球體和碎片懸浮于培養(yǎng)液中(圖2)。 上述實驗表明，所述槐糖脂有效抑制宮頸癌的藥物濃度為20ii g/ml 125 y g/ ml ;優(yōu)選的有效抑制宮頸癌的藥物濃度為30ii g/ml 100ii g/ml ;最優(yōu)選的有效抑制宮頸 癌的藥物濃度為40 ii g/ml 80 ii g/ml。
本發(fā)明所述的槐糖脂抗宮頸癌藥物制劑價格低廉，且用量少，抗腫瘤效果顯著，對 人體無任何毒副作用，臨床上可以部分甚至全部替代手術切除、化療等治療方法，極具應用 前景。


圖1MTT法測定槐糖脂作用后宮頸癌細胞存活率 顯示細胞的存活率隨樣品濃度的增加而降低，并且在0 ii g/ml到40 y g/ml的濃度 范圍內，細胞的存活率與樣品濃度呈負相關，當樣品濃度大于40 ii g/ml時，細胞全部死亡。
橫坐標為槐糖脂作用濃度(y g/ml)，縱坐標為細胞存活率。
圖2槐糖脂作用前后宮頸癌細胞形態(tài)變化 其中A未加槐糖脂的正常的宮頸癌細胞B終濃度為25ii g/ml槐糖脂作用后的宮 頸癌細胞C終濃度為40 ii g/ml槐糖脂作用后的宮頸癌細胞 顯示正常宮頸癌細胞增殖活躍并可見各期分裂相，細胞之間排列緊密，形態(tài)呈不 規(guī)則多角形或圓形，輪廓清晰，核呈圓形或橢圓形，并可見多核和巨大核細胞，核仁多個，形 狀不規(guī)則；經槐糖脂作用后的宮頸癌細胞，隨著槐糖脂濃度增大，相鄰細胞之間界限變得 不明顯，部分細胞皺縮變圓，并且皺縮細胞數(shù)目隨著槐糖脂濃度增大而增多，核仁變得不明 顯，當樣品濃度達到40yg/ml時，宮頸癌細胞基本上全部皺縮，體積縮小，細胞表面突起小 球體，形似酵母菌出芽，核仁消失，并可見小球體和碎片懸浮于培養(yǎng)液中。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明內容作進一步的說明。
實施例1 :槐糖脂的制備 (1)菌禾中選擇擬威克酵母變禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于基本無機鹽培養(yǎng)基，其中添加質量體積比為1. 6%的 瓊脂，25t:條件下，靜止培養(yǎng)24小時； (3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20ml 含有質量體積比為4%的葡萄糖和1 %的菜籽油的培養(yǎng)基中，25°C條件下，振蕩培養(yǎng)24小 時，制得種子液； (4)擴大培養(yǎng)以5%的體積比的接種量，將種子液接種于100ml含有質量體積比 為1%的菜籽油的培養(yǎng)基中，251:條件下，振蕩培養(yǎng)96小時； (5)收集發(fā)酵產物將步驟(4)所得的發(fā)酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖 瓶底部的淺黃色粘稠液體，之后以5000轉/分鐘將上述粘稠物質離心，收集固態(tài)部分，即為 槐糖脂粗提物。 (6)減壓蒸餾將步驟(5)所得槐糖脂粗提物，在溫度60°C ，壓力0. 4kg/cm2，真空 度為0. 04Mpa的條件下進行減壓蒸餾，蒸發(fā)去除其中的水分； (7)收集物干燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在7(TC，真空度0. 04Mpa條件下，真 空干燥16小時；制得固體槐糖脂。
實施例2 :槐糖脂的制備
(1)菌禾中選擇擬威克酵母變禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于基本無機鹽培養(yǎng)基，其中添加質量體積比為1. 6%的 瓊脂，3(TC條件下，靜止培養(yǎng)36小時； (3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50ml 含有質量體積比為8%的葡萄糖和3X的菜籽油的培養(yǎng)基中，3(TC條件下，振蕩培養(yǎng)36小 時，制得種子液； (4)擴大培養(yǎng)以7%的體積比的接種量，將種子液接種于500ml含有質量體積比 為3X的菜籽油的培養(yǎng)基中，3(TC條件下，振蕩培養(yǎng)200小時； (5)收集發(fā)酵產物將步驟(4)所得的發(fā)酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖 瓶底部的淺黃色粘稠液體，之后以6000轉/分鐘將上述粘稠物質離心，收集固態(tài)部分，為槐 糖脂粗提物。 (6)減壓蒸餾將步驟(5)所得槐糖脂粗提物，在溫度70°C ，壓力0. 8kg/cm2，真空 度為0. 08Mpa的條件下進行減壓蒸餾，蒸發(fā)去除其中的水分； (7)收集物干燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在IO(TC ，真空度0. 08Mpa條件下， 真空干燥24小時；制得固體槐糖脂。
實施例3 :槐糖脂樣品制備 采用實施例1的方法提取的擬威克酵母變種抗腫瘤活性槐糖脂粗提物lg，用10ml 無水乙醇溶解后，配成濃度為100000 iig/ml的槐糖脂母液，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋至 10 u g/ml、20u g/ml、30u g/ml、40u g/ml、50u g/ml、60u g/ml、70u g/ml、80u g/ml的濃度 或1000ii g/ml、500ii g/ml、250ii g/ml、125ii g/ml、62. 5ii g/ml、30ii g/m1，0. 22踐膜過濾 除菌即可。 實施例4 :槐糖脂粗品作為抗宮頸癌藥物的應用
宮頸癌細胞培養(yǎng) 采用實施例3的方法得到的槐糖脂樣品，以人宮頸癌Hela細胞系、含10%胎牛血 清的DMEM完全培養(yǎng)液為實驗材料，利用MTT法測定槐糖脂作用于宮頸癌Hela細胞系后細 胞的存活率，計算槐糖脂對宮頸癌細胞半數(shù)致死濃度(IC5。) ；CPE法結合MTT法確定藥物對 細胞的無毒濃度；藥物的最大無毒濃度對人宮頸癌Hela細胞系藥效測定等方法，進行槐糖 脂體外抗腫瘤試驗。具體實驗步驟如下 1. MTT法測定槐糖脂作用后腫瘤細胞的存活率，計算槐糖脂對宮頸癌Hela細胞半 數(shù)致死濃度(IC5。)； (1)收集細胞將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞1000r/min離心5min，棄上清，用 DMEM完全培養(yǎng)液稀釋成細胞懸液，計數(shù)，濃度為1.0X105cells/ml ; (2)樣品處理細胞取50 L細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后每 孔分別加入50ii L濃度為1 Oil g/ml 、20 ii g/ml 、30 ii g/ml 、40 ii g/ml 、50 ii g/ml 、60 ii g/ml 、 70 ii g/ml、80 ii g/ml的槐糖脂樣品，使其終濃度為5 y g/ml、 10 y g/ml、 15 y g/ml、20 y g/ ml、25ii g/ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml，每組樣本6個復孔，并設細胞對照組(只加細 胞和培養(yǎng)液)和空白對照組(只加培養(yǎng)液，無細胞)；
(3)置37 °C ， 5 % C02孵箱中培養(yǎng)24h ;
(4)加入10 ii LMTT (5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h ; (5)加入100 L SDS溶液，37°〇，5% C02孵箱中培養(yǎng)過夜，使甲臢結晶充分溶解， 570nm測0D值并計算細胞存活率； 2. CPE法結合MTT法確定藥物對正常宮頸細胞的無毒濃度；
3.藥物的最大無毒濃度對上述宮頸癌Hela細胞系的藥效測定；
4實驗結果 (1)將槐糖脂粗品稀釋成lOii g/ml、20ii g/ml、30ii g/ml、40ii g/ml、50ii g/ml、 60ii g/ml、70ii g/ml、80ii g/ml的樣品，與細胞懸液按照等體積混合，故作用于細胞的槐 糖脂樣品終濃度分別為5 ii g/ml 、 10 ii g/ml 、 15 ii g/ml 、 20 y g/ml 、 25 y g/ml 、 30 y g/ml 、 35ii g/ml、40ii g/ml，分別作用于宮頸癌細胞24h，細胞的存活率隨樣品濃度的增加而降低 (表l)，并且在Oil g/ml到40iig/ml的濃度范圍內，細胞的存活率與樣品濃度呈負相關， 當樣品濃度大于40yg/ml時，細胞全部死亡(圖1)?；碧侵瑢θ藢m頸癌Hela細胞系的 IC5。為20. 33 g/ml。而申請者之前在對槐糖脂對肝癌細胞的作用研究時發(fā)現(xiàn)其IC5。值是 28. 66i!g/ml，說明槐糖脂對宮頸癌細胞作用效果比對肝癌細胞好一些，此實驗同時說明因 為各類腫瘤性質及發(fā)病機理各不相同，槐糖脂對其作用的藥理效果也不盡相同。
(2)藥物取6個終濃度艮卩1000 ii g/ml ，500 ii g/ml 、250 ii g/ml 、125 ii g/ml 、 62. 5 g/ml、30 y g/ml，進行細胞毒性測定，每濃度做4個復孔，結果顯示最大無毒濃度為 125 li g/ml。 (3)取125 g/ml藥液，做4個復孔，觀察對上述腫瘤細胞的抑制作用。試驗設正 常細胞對照。結果顯示該濃度藥物對這株腫瘤細胞有完全抑制作用。
實施例5 :槐糖脂粗品作為抗宮頸癌藥物的應用 (1)收集細胞將傳代5次的處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞1000r/min離心5min，棄 上清，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋成細胞懸液，計數(shù)，細胞濃度分別為lX105cellS/ml
(2)加樣品和細胞取1ml加入24孔細胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h ;每孔中分別加 入1ml濃度為10 g/ml、20 u g/ml、30 u g/ml、40 u g/ml、50 u g/ml、60 u g/ml、70 u g/ml、 80 ii g/ml的樣品使其終濃度為5ii g/ml、10ii g/ml、15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ml、30ii g/ ml、35 g/ml、40 y g/ml，處理24h，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。并設細胞對照組 (只加培養(yǎng)液和細胞)和空白對照組(只加培養(yǎng)液，無細胞)。 結果顯示，在倒置顯微鏡下觀察時，正常宮頸癌細胞增殖活躍并可見各期分裂相， 細胞之間排列緊密，形態(tài)呈不規(guī)則多角形或圓形，輪廓清晰，核呈圓形或橢圓形，并可見多 核和巨大核細胞，核仁多個，形狀不規(guī)則；經槐糖脂作用后的宮頸癌細胞，隨著槐糖脂作用 濃度增大，相鄰細胞之間界限變得不明顯，部分細胞皺縮變圓，并且皺縮細胞數(shù)目隨著槐糖 脂濃度增大而增多，核仁變得不明顯，當樣品濃度達到40 g/ml時，宮頸癌細胞基本上全 部皺縮，體積縮小，細胞表面突起小球體，形似酵母菌出芽，核仁消失，并可見小球體和碎片 懸浮于培養(yǎng)液中(圖2)。 實施例6 :槐糖脂作為抗宮頸癌藥物栓劑制備 將聚乙二醇400 (PEG 400) 600g，聚乙二醇6000 (PEG6000) 200g，硬脂酸聚烴氧酯 200g，一起水浴融化，攪勻，慢慢加入實施例1制取的槐糖脂O. 4g，邊加邊攪拌，攪勻后，注 入預先用液體石蠟涂抹過的栓模，待凝固后，鏟去多余部分，啟模，用蠟紙逐個包裝即可，共制500粒。 實施例7 :槐糖脂作為抗宮頸癌藥物緩釋栓劑制備 稱取8g羥丙基甲基纖維素(HPMC)于100ml純水中自然溶脹，過夜。使其成8% HPMC溶液。稱取0. lg實施例1制得的槐糖脂粗品過6號篩，加入30g甘油、3g無水乙醇， 攪拌使其溶解。稱取233g硬脂酸聚烴氧酯，7(TC水浴加熱，待熔化后邊攪拌邊緩慢加入上 述主藥溶液，攪拌均勻，冷卻至50°C 。逐滴加入8% HPMC溶液23. 52g，攪拌均勻，靜置，除氣 泡、灌模、凝固、刮平，得栓劑100枚，包裝，置陰涼處。按《中國藥典》對栓劑及緩釋制劑的 相關要求對該緩釋陰道栓進行考察，該制劑的各項質量標準均符合要求。
實施例8 :槐糖脂作為抗宮頸癌藥物軟膏劑的制備 取實施例1制取的槐糖脂0. 4g加入液狀石蠟125g加熱至80°C ，另取甘油50g，羥 苯乙酯lg，加蒸餾水至875g，也加熱至80°C ，然后將油相加入水相中，邊加邊攪拌至冷，裝 入塑料軟管，每管裝入量為25g，即得槐糖脂軟膏劑。
實施例9 :槐糖脂作為抗宮頸癌藥物液體洗劑制備 取實施例1制取的槐糖脂O. 4g，加入二甲亞砜至1000g，使槐糖脂溶解，裝入100ml 塑料瓶中，即得。 實施例10 :以槐糖脂為有效成分的組合物作為抗宮頸癌藥物栓劑的制備
將聚乙二醇400 (PEG 400) 600g，聚乙二醇6000 (PEG 6000) 200g，硬脂酸聚烴氧酯 200g， 一起水浴融化，攪勻，慢慢加入實施例1制取的槐糖脂0. 4g和鴉膽子0. 5g，邊加邊攪 拌，攪勻后，注入預先用液體石蠟涂抹過的栓模，待凝固后，鏟去多余部分，啟模，用蠟紙逐 個包裝即可，共制500粒。 實施例11 :以槐糖脂為有效成分的組合物作為抗宮頸癌藥物緩釋栓劑的制備
稱取8g羥丙基甲基纖維素(HPMC)于100ml純水中自然溶脹，過夜。使其成8% HPMC溶液。稱取0. lg實施例1制得的槐糖脂粗品及0. 125g鴉膽子分別過6號篩，加入30g 甘油、3g無水乙醇，攪拌使其溶解。稱取233g硬脂酸聚烴氧酯，7(TC水浴加熱，待熔化后邊 攪拌邊緩慢加入上述主藥溶液，攪拌均勻，冷卻至50°C 。逐滴加入8% HPMC溶液23. 52g，攪 拌均勻，靜置，除氣泡、灌模、凝固、刮平，得栓劑100枚，包裝，置陰涼處。按《中國藥典》對栓 劑及緩釋制劑的相關要求對該緩釋陰道栓進行考察，該制劑的各項質量標準均符合要求。
實施例12 :以槐糖脂為有效成分的組合物作為抗宮頸癌藥物軟膏劑的制備
取實施例1制取的槐糖脂0. 4g和鴉膽子0. 5g，加入液狀石蠟125g加熱至80°C 。 另取甘油50g，羥苯乙酯lg，加蒸餾水至835g，也加熱至80°C ，然后將油相加入水相中，邊加 邊攪拌至膏狀，裝入塑料軟管，每管裝入量為10g，即得槐糖脂軟膏劑。
實施例13 :槐糖脂緩釋栓劑對宮頸癌細胞體外作用實驗 (1)取實施例7制得的緩釋栓劑切碎，移至100ml容量瓶，加純凈水適量，7(TC水浴 溶解，涼后定容，搖勻，備用。 (2)將溶液進行稀釋，使其槐糖脂含量分別為10iig/ml、20iig/ml、30iig/ml、 40 u g/ml 、 50 u g/ml 、 60 u g/ml 、 70 u g/ml 、 80 u g/ml ，備用。 (3)收集細胞將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞1000r/min離心5min，棄上清，用 DMEM完全培養(yǎng)液稀釋成細胞懸液，計數(shù)，濃度為1.0X105cells/ml ; (4)樣品處理細胞取50 i！ L細胞懸液加入96 細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后每孔分別加入50ii L上述制得的濃度為lOii g/ml、20ii g/ml、30ii g/ml、40ii g/ml、50ii g/ml、 60ii g/ml、70ii g/ml、80ii g/ml的槐糖脂緩釋栓劑樣品，使其終濃度為5 y g/ml、 10 y g/ml、 15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml，每組樣本6個復孑L并設細 胞對照組(只加細胞和培養(yǎng)液)和空白對照組(只加培養(yǎng)液，無細胞)；
(5)置37 °C ， 5 % C02孵箱中培養(yǎng)24h ;
(6)加入10 ii LMTT (5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h ; (7)加入100 L SDS溶液，37°〇，5% C02孵箱中培養(yǎng)過夜，使甲臢結晶充分溶解， 570nm測0D值并計算細胞存活率； 結果顯示，槐糖脂緩釋栓劑同槐糖脂溶液相比，對宮頸癌細胞的抑制作用無明顯 區(qū)別，其IC5。值均小于30ii g/ml。 實施例14槐糖脂制劑對動物宮頸癌模型的體內抑瘤實驗 (1)裸小鼠宮頸癌模型的建立HeLa細胞在37t:，5XC02，含10X胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細胞用0. 25X胰蛋白酶消化，用無菌PBS液重懸制成 5 X 107/mL的單細胞懸液，每只裸小鼠于右側頸背部皮下接種0. 2mL細胞懸液，共接種20 只，每天觀察各注射點有無紅腫破潰。 (2)抑瘤實驗將20只裸小鼠隨機分為2組，每組10只，實驗設槐糖脂治療組和 空白對照組?；碧侵委熃M于接種細胞懸液2周后腹腔注射10mg/kg劑量的槐糖脂注射液 (用生理鹽水配制)，3天1次，連續(xù)給藥4周；而對照組則腹腔注射等體積的生理鹽水。實 驗中觀察腫瘤體積和生長速度，實驗進行4周后頸椎脫臼處死裸小鼠，稱量體重和瘤重，計 算抑瘤率。 結果顯示所有20只裸小鼠在實驗過程中均成活，各個細胞懸液接種點未見紅腫 破潰及出血表現(xiàn)。在細胞懸液接種的第14天，各個接種點均可見腫瘤結節(jié)，直徑> 0. 5cm。 裸小鼠在給予槐糖脂后，對從裸小鼠上剝離下將的腫瘤組織的進行肉眼觀察，呈結節(jié)狀，灰 白色，質地偏硬，表面有假包膜，容易和周圍組織剝離，用藥組腫瘤橫斷面大部分可見中央 出現(xiàn)明顯的壞死灶，對照組則少見壞死灶。而稱量實驗組和對照組小鼠體重，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠 并沒有明顯區(qū)別，而腫瘤瘤體重量卻是實驗組明顯小于對照組。
權利要求
槐糖脂在制備抗宮頸癌藥物中的應用，其特征在于，所述抗宮頸癌藥物的劑型是栓劑或軟膏劑；其中，所述劑型中槐糖脂的藥物濃度為20μg/ml～125μg/ml。
2. 如權利要求l所述的應用，其特征在于，所述劑型中槐糖脂的藥物濃度為30i!g/ ml 100 li g/ml。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述劑型中槐糖脂的藥物濃度為40yg/ ml 80 g/ml 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種槐糖脂在制備抗宮頸癌藥物中的應用，其中，所述藥物的劑型是栓劑或軟膏劑，劑型中槐糖脂的藥物濃度為20μg/ml～125μg/ml。本發(fā)明的制劑價格低廉，且用量少，抗腫瘤效果顯著，對人體無任何毒副作用，臨床上在某些方面可以替代手術切除、化療等治療方法，極具應用前景。
文檔編號A61P35/00GK101703514SQ20091023062
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權日2009年11月23日
發(fā)明者宋欣, 曲音波, 李慧 申請人:山東大學