專利名稱：白細胞介素-10抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及白細胞介素-IO(IL-IO)特異性抗體和其用途。更具體地，本 發(fā)明涉及人源化的抗體，其識別人類IL-10并調(diào)整其活性，特別是在自體免疫失調(diào)中。
背景技術(shù)：
最初被稱為細胞因子合成抑制因子或CSIF的白細胞介素-IO(IL-IO)是造血細 胞、特別是免疫細胞的有效的免疫調(diào)節(jié)物。一些細胞，例如活化的Th2細胞、B細胞、 角質(zhì)形成細胞、單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生IL-10。參見，例如，Moore等，Anne.Rev. Immunol.ll 165(1993)。IL-10抑制許多細胞，包括T細胞、單核細胞和巨噬細胞的活 化和效應(yīng)物功能.特別地，IL-10抑制細胞，例如Thl細胞、天然殺傷細胞、單核細胞和 巨噬細胞的細胞因子合成，包括IL-1、IFN-Y和TNF的合成。參見，例如，F(xiàn)iorentino 等，J.Exp.Med.，170 2081-2095(1989) ； Fiorentino 等，J.Immunol.146 3444(1991)； Hsu 等，Int.Immunol.i 563(1992) ； Hsu 等，Int.Immunol.i 563(1992) ； D ‘ Andrea 等，J.Exp.Med.IZS 1041 (1993) ； de Waal Malefyt 等，J.Exp.Med. IH 915(1991)； Fiorentino 等，J.Immunol.147 3815(1991)。多種病原體，特別是細胞內(nèi)病原體，引起IL-IO產(chǎn)生來減慢或完全地停止由免疫 反應(yīng)有效地去除病原體。Moore等，Annu.Rev.Immunol.ll: 165(1993)。例如，在來自 患有HIV、麻瘋病或肺結(jié)核的患者的血液淋巴細胞中，當用病原體攻擊時，外周血淋巴 細胞在體外一般是無變應(yīng)性的或非響應(yīng)性的。然而，在這些當中IL-IO的中和作用表明 活性的效應(yīng)物應(yīng)答，即，Thl反應(yīng)性存在于這些細胞中。因而，相信IL-IO被病原體有 效地利用來促進其傳染性狀態(tài)。IL-IO還與體內(nèi)自身免疫相關(guān)。自身免疫由靶向正常組織的自身抗體、自身反 應(yīng)性T細胞或它們的某些組合的發(fā)展引起。自身免疫性疾病的一個實例是全身性紅斑狼 瘡(SLE)，一種慢性風濕性疾病，在其中全身的結(jié)締組織都成為炎性的。自身抗體攻擊 正常的身體組織，好象正常的身體組織是外部侵入的，引起特征性的炎癥。雖然還不完 全了解準確的原因，研究人員相信它兼?zhèn)溥z傳性和環(huán)境性的因素。特別地，B細胞超活 動性和各種自身抗體的存在是SLE的特征。一般地，與雙鏈DNA反應(yīng)的IgG自身抗體 (IgG抗dsDNA abs)在SLE患者中升高了。60到70 %之間的SLE患者產(chǎn)生IgG抗dsDNA abs,其中一些是有腎臟毒性的。SLE在女性中比在男性中高發(fā)十倍，具有的癥狀從面部 的皮疹到致殘性和潛在危急生命的器官功能障礙。它可以在任何年齡發(fā)作，但最常見的 是在年輕成年人中。
大量的研究證明了 IL-10在與SLE相關(guān)的病理過程中的作用。例如，盡管IL_10 一般不由未受適當刺激的細胞產(chǎn)生，但是來自SLE患者的B細胞和巨噬細胞在體外都自 然地產(chǎn)生高水平的 IL-10。Llorente 等，Arthritis Rheum.迎249-60(1997)。在幾項研 究中，研究人員證明了 IL-10血清水平和疾病活動性之間的相關(guān)性。此外，體內(nèi)和體外 研究都表明，阻斷IL-10產(chǎn)生可以減輕SLE的臨床表現(xiàn)。參見，例如，Gonzalez-Amaro 等，JAutoimmunityll: 395-402(1998)。迄今為止，已經(jīng)通過使用免疫抑制性治療，例如，糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺，治 療了 SLE的表現(xiàn)之一，狼瘡腎炎。盡管是有效的，這些治療是非特異性的，并且存在妨 礙長期治療的顯著的毒性。因而，特異性中和抗體可能是IL-IO的有效拮抗物，容許除 去IL-IO的抑制性效果而保持免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的其余部分的完整性。在體內(nèi)使用抗體作為治療劑的最重要限制是抗體的免疫原性。大多數(shù)單克隆抗 體來源于嚙齒動物，在人類中重復使用引起針對治療性抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。這種免 疫反應(yīng)最小會引起治療效力的損失，最大會引起潛在的致死性過敏反應(yīng)。降低嚙齒動物 抗體的免疫原性的最初的努力包括產(chǎn)生嵌合抗體，其中鼠可變區(qū)與人類恒定區(qū)融合。Liu 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 3439(1987)。然而，用人類可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的雜合 體注射的小鼠發(fā)展出針對人類可變區(qū)的強烈的抗抗體反應(yīng)，提示在這種嵌合抗體中保留 完整的嚙齒動物Fv區(qū)域仍可能在患者中產(chǎn)生不需要的免疫原性。普遍認為的是，可變結(jié)構(gòu)域的互補決定區(qū)(CDR)環(huán)包括抗體分子的結(jié)合位點。 因此，嘗試將嚙齒動物CDR環(huán)移植到人類框架上(即，人源化)來進一步最小化嚙齒動 物序列。Jones 等，Nature 321 522(1986) ； Verhoeyen 等，Science 239 1534(1988)。 然而，CDR環(huán)交換仍然不能一致地產(chǎn)生具有與起始抗體相同結(jié)合性質(zhì)的抗體。在人源 化抗體中涉及CDR環(huán)支持的框架殘基(FR)的變化也是保存抗原結(jié)合親合性所需的。 Kabat等，J.Immunol.147 1709(1991)。盡管已經(jīng)報道了在許多人源化抗體構(gòu)建體中使 用CDR移植和框架殘基保留，還是很難預測具體的序列是否會產(chǎn)生具有期望的結(jié)合性 質(zhì)、有時是生物學性質(zhì)的抗體。參見，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA巡 10029(1989)，Gorman 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 4181(1991)，and Hodgson, Bio/ Technology 9 421(1991)。此外，大多數(shù)在先的研究使用了不同的人類序列用于動物的 輕鏈和重鏈可變序列，使得這種研究的預測的性質(zhì)是不可靠的。已經(jīng)使用了已知抗體的 序列，或更典型地，具有已知X射線結(jié)構(gòu)的那些抗體，抗體NEW和KOL的序列。參 見，例如，Jones等，見上文；Verhoeyen等，見上文；和Gorman等，見上文。僅對少 數(shù)的人源化構(gòu)建體報道了確切的序列信息。本發(fā)明提供了識別人類IL-IO并調(diào)整其活性，特別是關(guān)于自體免疫失調(diào)的活性的 人源化單克隆抗體。人源化抗體應(yīng)當提供沒有與當前的治療相關(guān)的毒性和非特異性的替 換性治療選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在此提供的是一種結(jié)合IL-IO的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至 少一個抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 1、CDR2 的SEQ ID NO 2和CDR3的SEQ ID NO 3構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和 至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自CDRl的SEQ ID NO 6、CDR2 的SEQ ID NO 7和CDR3的SEQ ID NO 8的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框 架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。在此 還提供的是抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO: 4的可變區(qū)的多 肽。在一個特定的實施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO 5的 可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在一個特定的實施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具 有SEQ ID NO: 9的可變區(qū)的多肽。在另一個特定的實施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié) 合片段包含具有SEQ ID NO 10的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在此進一步提供是一種結(jié)合IL-IO的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含 至少一個抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO: 1、 CDR2的SEQ ID NO 2和CDR3的SEQ IDNO 3構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多 肽；和至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ IDNO 6、CDR2的SEQ ID NO 7和CDR3的SEQ ID NO 8構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列 的多肽。還在此提供的是一種結(jié)合IL-IO的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含 至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 11、CDR2的 SEQ ID NO 12和CDR3的SEQ ID NO 13構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)， 其中所述框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和至少 一個抗體重鏈或其結(jié)合片段，包括具有選自由CDRl的SEQ IDNO 15、CDR2^SEQ ID NO: 16和CDR3的SEQ ID NO 17構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中所 述框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。在一個特定的 實施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO : 14的可變區(qū)和恒定區(qū)的 多肽。在又一個特定的實施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO 18的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在此進一步提供是一種結(jié)合IL-IO的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含 至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 11、CDR2的 SEQ ID NO 12和CDR3的SEQ ID NO 13構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和 至少一個抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 15、CDR2的 SEQ ID NO 16和CDR3的SEQ ID NO 17構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽。在一個實施方式中，以上描述的抗體進一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒 定區(qū)包含Yl、Υ2, Υ3或人類重鏈恒定區(qū)或其變體。在一個實施方式中，上述抗 體進一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類輕鏈恒定區(qū)。 在某些實施方式中，這些抗體的結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、scFv> F(ab，)2和雙抗體(diabody)構(gòu)成的組的抗體片段。在此進一步提供的是在人類受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受 試者以有效阻斷IL-IO的生物學活性的量施用特異于IL-IO的抗體或其結(jié)合片段，其中所 述抗體是在此公開的抗體。通過這種方法抑制的免疫反應(yīng)是體液的或細胞的反應(yīng)。在一 個實施方式中，用這種方法治療的受試者患有全身性紅斑狼瘡。在另一個實施方式中，所述受試者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。在又一個實施方式中，所述受試者患 有狼瘡腎炎。在進一步的實施方式中，所述受試者患有HIV。在另一個實施方式中，所 述受試者患有肝炎C。在一個特定的實施方式中，在人類受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法 包括向需要其的受試者施用(1)有效阻斷IL-10的生物學活性的量的特異于IL-10的抗體 或其結(jié)合片段，其中所述抗體是在此公開的抗體，和(2)免疫抑制試劑。在此提供的是一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學上可接受的載體或 稀釋劑組合，其中所述抗體是以上公開的抗體之一。進一步提供的是編碼以上公開的抗體的多肽的分離的核酸。在此還提供的是表 達載體，包含與控制序列可操作連接的分離的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn) 染的宿主細胞識別。在此提供的是包含所述載體的宿主細胞，所述載體包含所述分離的 核酸序列。在此進一步提供的是生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達所述核酸序列的條件下培 養(yǎng)包含所述載體的宿主細胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細胞回收所述多肽。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 19的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO 20的核酸序列的重鏈。在進一步的實施 方式中，所述輕鏈于2004年4月20日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號 為PTA-5923，所述重鏈于2004年4月20日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)， 具有ATCC保藏號PTA-5922。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 21的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO 22的核酸序列的重鏈。在進一步的實 施方式中，所述輕鏈于2004年4月20日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，具有 ATCC保藏號PTA-5927，所述重鏈于2004年4月20日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)，具有 ATCC 保藏號 PTA-5926。在此進一步提供的是編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由上述 核酸序列編碼。在一個實施方式中，所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、 Fv、scFv和F(ab，)2構(gòu)成的組的抗體片段。在此提供的是鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，包括步驟a)鑒定具 有期望的生物學活性的非人類抗體；b)確定非人類抗體Vh和Vl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列； 和c)將非人類抗體序列與一組人類種系序列進行比較，其中所述比較包括子步驟1)給 非人類Vh和Vl結(jié)構(gòu)域序列的序列分配殘基編號；2)描繪序列中的CDR和FR區(qū)域；3) 在非人類和人類種系序列相同的每個殘基位置分配預定的數(shù)字分值；和4)總和所有的殘 基分值來產(chǎn)生每個人類種系序列的總分值；和d)將具有最高的總殘基分值的人類種系序 列鑒定作為接受體種系序列。在一個實施方式中，所述方法進一步包括子步驟5)在子 步驟(4)之后，為具有相同總殘基分值的種系序列，對在子步驟(3)中未計分的非人類 和人類種系序列相同的每個殘基位置分配數(shù)字分值1; 6)總和所有殘基分值來產(chǎn)生每個 人類種系序列的總分值。在特定的實施方式中，所述非人類抗體特異于IL-10并且抑制 IL-10的生物學活性。在特定的實施方式中，對于Vh和Vl區(qū)分別如表2和3中的將數(shù) 字分值分配給殘基。在此進一步提供的是通過上述方法產(chǎn)生的抗體。


附圖IA顯示了相對于抗人類IL-10抗體12G8的可變輕鏈，給潛在的接受體種 系序列分配殘基編號和數(shù)字分值。附圖IB顯示了相對于抗人類IL-10抗體12G8的可變重鏈，給潛在的接受體種 系序列分配殘基編號和數(shù)字分值。附圖IC顯示了相對于抗人類IL-10抗體11D8的可變輕鏈，給潛在的接受體種 系序列分配殘基編號和數(shù)字分值。附圖ID顯示了相對于抗人類IL-10抗體12D8的可變重鏈，給潛在的接受體種 系序列分配殘基編號和數(shù)字分值。附圖2A是如實施例III中描述i.v.施用的12G8抗體的濃度-時間分布曲線， 0.03mg/kg-30mg/kg的靜脈內(nèi)彈丸施用后的濃度時間分布。附圖2B是如實施例III中描述s.c.施用的12G8的濃度-時間分布曲線，0.03mg/ kg-30mg/kg的皮下彈丸施用后的濃度時間分布。附圖3A顯示了施用人源化抗IL-10抗體SCH708980，在IL-10轉(zhuǎn)基因小鼠中賦 予了對Leishmania major感染的抗性。感染通過在指定的時間用卡尺測量爪墊腫脹來確 定。如實施例VI中描述的施用12G8抗體。附圖3B顯示了施用大鼠抗IL-10抗體12G8，在IL_10轉(zhuǎn)基因小鼠中賦予了對 Leishmania major感染的抗性。感染通過在指定的時間用卡尺測量爪墊腫脹來確定。如 實施例VI中描述的施用12G8抗體。
具體實施例方式為了公開的清楚性，而不是進行限制，將發(fā)明的詳細說明分成以下的小節(jié)。A.定義如果沒有另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 的一個普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在此引用的所有專利、申請、公開的申請 和其他出版物通過引用將它們完整地合并。如果在本節(jié)中闡述的定義與通過引用合并在 此的專利、申請、公開的申請和其他出版物闡述的定義相反或不一致，在本節(jié)中闡述的 定義優(yōu)于通過引用合并在此的定義。如在此使用的，“a”或“an”意指“至少一個”或“一個或多個”。如在此使用的，術(shù)語“抗體”是指展現(xiàn)出期望的生物學活性的任何形式的抗體 或其片段。因而，在最寬泛的含義上使用它，并且特別地涵蓋單克隆抗體(包括全長單 克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們 展現(xiàn)了期望的生物學活性。如在此使用的，術(shù)語“IL-10結(jié)合片段”或“其結(jié)合片段”包括仍然基本上保 存了它抑制IL-10活性的生物學活性的抗體的片段或衍生物。因此，術(shù)語“抗體片段” 或IL-10結(jié)合片段是指全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的 實例包括Fab、Fab’、F(ab’片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例 如，sc-Fv;和由抗體片段形成的多特異性抗體。典型地，結(jié)合片段或衍生物保持了它的 IL-10抑制活性的至少50%。優(yōu)選的，結(jié)合片段或衍生物保持了它的IL-10抑制活性的至少60%、70%, 80%, 90%, 95%, 99%或100%。還預期的是IL-10結(jié)合片段可以
包括基本上不改變它的生物活性的保守性氨基酸替換。此處使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體， 即，除了可能以少量存在的可能自然發(fā)生的突變之外，組成所述群體的單個抗體是同一 的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原性表位。相比之下，常規(guī)的(多克隆 的)抗體制品一般包括針對(或特異于)不同表位的許多抗體。修飾語“單克隆”表明 了抗體是從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的特性，不能被看作是需要通過任何特別的方法 產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等，Nature，256 495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法制備(參見，例如， 美國專利No.4,816,567)。 “單克隆抗體”也可以利用，例如，Clackson等，Nature， 352 624-628(1991)和 Marks 等，J.Mol.Biol.222 581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌 體抗體文庫中分離。在此單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗體 中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相 應(yīng)序列同一或同源，而該鏈的其余部分與來源于另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞 類的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，還包括這種抗體的片段，只要它們顯示出期望的 生物學活性(美國專利 No.4,816,567 ；和 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81 6851-6855(1984))。如在此使用的，術(shù)語“單鏈Fv”或“scFv”抗體是指包含抗體的Vh和Vl結(jié)構(gòu) 域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以單個多肽鏈存在。通常，F(xiàn)v多肽進一步包含Vh和Vl 結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其允許SFv形成用于抗原結(jié)合的期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于SFv的綜述， 參見 Pluckthun，THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol.113, Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York, pp.269-315 (1994)。如在此使用的，術(shù)語“雙抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小的抗體片段， 所述片段在同一多肽鏈中包含連接到輕鏈可變區(qū)(VJ的重鏈可變區(qū)(Vh) (Vh-Vl)。通 過使用非常短以致不能容許在同一鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另 一鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體在例如EP 404，097 ； WO 93/11161 ；禾Π Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA迎6444-6448(1993)中有更詳細的 描述。如在此使用的，術(shù)語“人源化抗體”是指含有來自非人類(例如，鼠)抗體以 及人類抗體的序列的抗體形式。這種抗體是含有來源于非人類免疫球蛋白的最小序列的 嵌合抗體。一般地，人源化抗體包括基本上所有至少一個，典型地是兩個可變結(jié)構(gòu)域， 其中，所有的或基本上所有的高變環(huán)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，和所有的或基本 上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒 定區(qū)(Fe)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。如在此使用的，術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體的負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變 區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 23-34 (Li)，50-56 (L2)和 89-97 (L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基 31-35 (Hl)，50-65 (Η2) 禾口 95—102 (Η3) ； Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))，和 / 或來自“高變
環(huán)”的那些殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (Li)，50-52 (L2)和91-96 (L3) 和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和 96-101 (H3) ； Chothia and Lesk.J.Mol. Biol.196 901-917(1987))。如在此使用的，術(shù)語“框架”或“FR”殘基是指除了在此
定義為CDR殘基的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)殘基。如在此使用的，術(shù)語“保守性替換”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸替換， 并可以在通常不改變產(chǎn)生的分子的生物學活性的情況下進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員都認可的 是，一般地，在多肽的非關(guān)鍵區(qū)域的單個氨基酸替換基本上不改變生物學活性(參見， 例如，Watson 等，Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co.， p.224(4th Edition 1987))。這種示范性的替換優(yōu)選的根據(jù)以下的表1申闡述的那些來進 行表 1初始殘基保守性替換Ala(A) Gly ； SerArg (T) LysAsn (N) Gln ； HisCys (C) SerGln (Q) AsnGlu(E) AspGly(G) Ala ； ProHis (H) Asn ； Glnlie (I) Leu ； ValLeu(L) Ile ； ValLys (K) Arg ； Gln ； GluMet(M)Leu ； Tyr ； IlePhe (F) Met ； Leu ； TyrSer(S) ThrThr(T) SerTrp (W) TyrTyr(Y) Trp ； PheVal (V) Ile ； Leu其他替換也是可允許的，可以經(jīng)驗性地或根據(jù)已知的保守性替換來確定。如在此使用的，術(shù)語“分離的核酸分子”是指鑒定和分離自至少一個污染物 核酸分子的核酸分子，在抗體核酸的天然來源中所述核酸分子通常與污染物核酸分子締 合。分離的核酸分子不同于其天然存在的形式或環(huán)境(setting)。因此分離的核酸分子不 同于在天然細胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括被包含在通常表達抗體 的細胞中的核酸分子，在所述細胞中，例如，所述核酸分子位于不同于天然細胞的染色 體位置中。表達“控制序列”是指在特定的宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合于原核生物的控制序列包括啟動子、任選地包括操縱序列和 核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。當被置于與另一個核酸序列的功能性關(guān)系中時，核酸是“可操作地連接的”。 例如，如果被表達為參與多肽分泌的蛋白原，前序列(presequence)或分泌前導區(qū)的DNA 可操作地與多肽的DNA連接；如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子可操作地與編碼 序列連接；或如果將其放置以便于翻譯，核糖體結(jié)合位點可操作地與編碼序列連接。一 般地，“可操作地連接”意思指被連接的DNA序列是連續(xù)的，以及對分泌前導區(qū)而言， 是連續(xù)的并處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必是連續(xù)的。通過在方便的限制性位點進行 連接來實現(xiàn)連接。如果這種位點不存在，按照常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸銜接子或接 頭。如在此使用的，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換地使用， 所有這樣的指定都包括子代。因而，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細胞”包括原始的目標 細胞和由此衍生的培養(yǎng)物，不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)理解的是，由于有意的或無意的突 變，所有子代在DNA內(nèi)容方面可能不是精確相同的。根據(jù)最初轉(zhuǎn)化的細胞篩選的具有相 同功能或生物學活性的突變子代也包括在內(nèi)。當希望不同的指定時，可以從上下文來明 確。如在此使用的，“聚合酶鏈式反應(yīng)”或“PCR”是指一種過程或技術(shù)，其中按 照例如美國專利Νο.4,683,195中描述的擴增核酸、RNA和/或DNA的微量的特定片段。 通常，需要得到目標區(qū)域的末端或其以外的序列信息，從而可以設(shè)計寡核苷酸引物；這 些引物在序列上與要擴增的模板的相對的鏈是相同的或類似的。兩個引物的5’末端核 苷酸可以與擴增的材料的末端重合。PCR可用于擴增特定的RNA序列、來自總基因組 DNA的特定DNA序列，和從總細胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般地 參見 Mullis 等，ColdSpringHarbor Symp.Quant.Biol.51 263(1987) ； Erlich，ed.，PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y., 1989)。如在此使用的，PCR 被認為是一個，但 不是僅有的核酸聚合酶反應(yīng)方法的實例，用于擴增核酸測試樣品，包括使用已知核酸作 為引物和核酸聚合酶來擴增或產(chǎn)生核酸的特定片段。如在此使用的，術(shù)語“種系序列”是指未重排(unreammged)的免疫球蛋白 DNA序列的序列?？梢允褂梦粗嘏琶庖咔虻鞍椎娜魏芜m合的來源。如在此使用的，術(shù)語“免疫抑制試劑”是指抑制或調(diào)整免疫反應(yīng)的天然的或合 成的試劑。所述免疫反應(yīng)是體液的或細胞的反應(yīng)。B.IL-10特異性抗體在此公開的組合物和方法涉及調(diào)節(jié)IL-IO活性，特別是在免疫反應(yīng)中。特別地， 此處的組合物和方法使用特異于細胞因子IL-IO的抗體。IL-IO是強力的細胞因子，通過 調(diào)控涉及免疫反應(yīng)的各種細胞類型的生長、分化和細胞因子合成來調(diào)整T細胞和B細胞 反應(yīng)。值得注意的，IL-10產(chǎn)生常常與自體免疫疾病和病原體誘導的免疫病理相關(guān)。因 此，調(diào)整和抑制IL-10活性的組合物和方法可以改變自身免疫性疾病和相關(guān)癥狀的發(fā)展和 持續(xù)，和改善或降低病原體相關(guān)的免疫病理。用人源化抗體靶向IL-10活性提供了幾種獨特的益處。首先，用抗體靶向IL-10 允許特異性抑制IL-10活性而保留免疫反應(yīng)的其余部分的完整性。在許多病原體誘導的免疫病理的情況下，IL-10活性的降低或消除將允許期望的效應(yīng)物免疫反應(yīng)來消除病原體 而不發(fā)生進一步的病變。對于自體免疫患者來說，IL-10活性的降低或消除將降低或消 除疾病和/或疾病的癥狀而保留患者的免疫能力。第二，人源化IL-10抗體繞過了與免 疫原性嚙齒動物抗體有關(guān)的限制。使用人類序列消除了外源性施用的抗體的免疫原性， 容許治療性地施用。人源化抗體含有來自非人類以及人類抗體的序列。一般地，人源化的過程從產(chǎn) 生具有期望生物學活性，即，抑制IL-10活性的非人類抗體開始。一旦鑒定出具有合適 的特性的非人類抗體，則采用重組手段使用非人類和人類序列來產(chǎn)生雜交序列。C.IL-10特異性抗體的產(chǎn)生可以使用任何用于產(chǎn)生單克隆抗體的適合的方法。例如，可以用IL-10或其片 段免疫接受者?？梢允褂萌魏芜m合的免疫方法。這樣的方法可以包括佐劑、其他免疫刺 激劑、重復強化免疫，和使用一種或多種免疫途徑?？梢允褂萌魏芜m合的IL-10來源作為免疫原用于產(chǎn)生在此公開的組合物和方 法的非人類抗體。這樣的形式包括，但不限于完整蛋白質(zhì)、肽和表位，通過本領(lǐng)域 已知的重組的、合成的、化學的或酶降解手段來產(chǎn)生。IL-10是酸敏感的、兩個滲透 (interpenetrating)多肽鏈的非共價同源二聚體。該細胞因子的長度是160個氨基酸，具有 良好保守的序列，包括類似于干擾素和造血細胞因子的α-螺旋管束結(jié)構(gòu)。人類和鼠的 IL-10具有73%氨基酸同源性，人類IL-10對鼠和人細胞是有活性的。IL-10是商業(yè)上 可獲得的或可以使用公知的分子生物學技術(shù)生產(chǎn)。對于人類、豬尾恒河猴、mangabey、 恒河猴、和貓頭鷹猴、狐猴、小鼠、大鼠、豚鼠、金黃倉鼠、兔、貓、狗以及其他， Genbank eDNA序列都是可獲得的。重組人IL-10是沒有N_糖基化的17_18kDa多肽。足以產(chǎn)生生物學活性的抗體的任何形式的抗原可被用于產(chǎn)生抗體。因而，引發(fā) 抗原可以是單獨的單個表位、多個表位、或完整蛋白質(zhì)，或與本領(lǐng)域已知的一種或多種 免疫原性增強試劑組合。引發(fā)抗原可以是分離的全長蛋白質(zhì)、細胞表面蛋白(例如，用 抗原的至少一部分轉(zhuǎn)染的細胞來免疫)，或可溶蛋白質(zhì)(例如，僅用蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu) 域部分來免疫)?？乖梢栽谶z傳地修飾的細胞中生產(chǎn)。編碼所述抗原的DNA可以是 基因組或非基因組的(例如，cDNA)并且編碼細胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分。如在此使 用的，術(shù)語“部分”是指視情況組成目標抗原的免疫原性表位的最小數(shù)量的氨基酸或核 酸。可以采用適合于轉(zhuǎn)化目標細胞的任何遺傳載體，包括但不限于腺病毒載體、質(zhì)粒和 非病毒載體，例如陽離子脂質(zhì)?？梢允褂萌魏芜m合的方法來引發(fā)具有期望的生物性質(zhì)的抗體來抑制IL-10。期 望的是從各種哺乳動物宿主，例如小鼠、嚙齒動物、靈長類、人類等制備單克隆抗體 (mAbs)。可以在，例如，Stites 等(eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.)Lange Medical Publications, Los Altos, CA,禾口其中引用的參考文獻；Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL CSH Press ； Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY中找到制備這樣的單克隆抗體的技術(shù)的說明。因而，可以通過本領(lǐng)域 研究人員熟知的各種技術(shù)來獲得單克隆抗體。一般地，通常通過與骨髓瘤細胞融合來 使來自用期望抗原免疫的動物的脾臟細胞永生化。參見Kohler和Milstein (1976) Eur.J.Immunol.6 511-519。永生化的替換性方法包括用Epstein Barr Virus、致癌基因或逆 轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化，或本領(lǐng)域已知的其他方法。參見，例如，Doyle，等(eds.1994和定期的 增刊)CELL AND TISSUE CULTURE LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY。根據(jù)對抗原有期望特異性和親合性的抗體的產(chǎn)生來篩選產(chǎn)自單個 永生細胞的集落，由這種細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量可以通過各種技術(shù)來增強，包括 注射到脊椎動物宿主的腹膜腔內(nèi)。做為選擇，人們可以根據(jù)例如Huse等(1989) Science M6 1275-1281描述的一般性方案通過篩選來自人類B細胞的DNA文庫，來分離編碼單 克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。其他適合的技術(shù)包括在噬菌體或類似的載體中選擇抗體的文庫。參見，例如， Huse 等，Seience 246 1275-1281 (1989)；和 Ward 等，Nature Mi 544-546 (1989)。 本發(fā)明的多肽和抗體可以有修飾或沒有修飾地使用，包括嵌合的或人源化的抗體。經(jīng)常 地，多肽和抗體通過共價地或非共價地連接提供可檢測信號的物質(zhì)來進行標記。各種標 記物和連接技術(shù)是已知的，在科學和專利文獻中有廣泛的報道。適合的標記物包括放射 性核素、酶、底物、輔助因子、抑制物、熒光部分、化學發(fā)光部分、磁性粒子，等等。 教導了使用這樣的標記物的專利包括美國專利Nos.3,817,837 ； 3,850,752 ； 3,939,350 ； 3,996,345 ； 4,277,437 ； 4,275,1 49 ；和4,366,241。并且，可以生產(chǎn)重組免疫球蛋白， 參見 Cabilly 美國專利 No.4,816,567 ；和 Queen 等(1989) Proc.Nat ‘ 1 Acad.Sci.USA 86 10029-10033 ；或在轉(zhuǎn)基因小鼠中制造，參見 Mendez 等(1997) Nature Genetics 15 146-156 ；也參見 Abgenix 和 Medarex 技術(shù)?？梢酝ㄟ^用多肽、片段、肽或表位與載體蛋白的結(jié)合物免疫動物，來產(chǎn)生針對 IL-10的預定片段的抗體或結(jié)合組合物。從分泌期望抗體的細胞制備單克隆抗體。可以 篩選這些抗體來結(jié)合正常的或缺陷的IL-10。通常經(jīng)ELISA測定，這些單克隆抗體通常 以至少約ΙμΜ、更一般地至少約300ηΜ、典型地至少約30ηΜ、優(yōu)選的至少約10ηΜ、更 優(yōu)選的至少約3nM或更好的Kd值結(jié)合。也可以使用以下的小節(jié)D中描述的生物測定來 鑒定適合的非人類抗體。C.IL-10特異性抗體的人源化可以使用任何適合的非人類抗體作為高變區(qū)的來源。非人類抗體的來源包括， 但不限于，鼠、狼、牛和靈長類。對于大多數(shù)的部分來說，人源化的抗體是人免疫球蛋 白(受者抗體)，在其中受者的高變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大 鼠、兔或非人靈長類的、具有期望的特異性、親合性和能力(capacity)的高變區(qū)殘基替 代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此 外，人源化抗體可以包含既不在受者抗體也不在供體抗體中存在的殘基。進行這些修飾 以進一步改善抗體的期望生物學活性性能。有關(guān)詳細情形，參見Jones等，Nature·: 522-525(1986) ； Reichmann 等，Nature 332 323-329(1988)；和 PreSta，Curr.Op.Struct. Biol.2 593-596(1992)。已經(jīng)描述了重組性地工程化抗體的方法，例如，Boss等(美國專利 No.4,816,397)，Cabilly 等(美國專利 No.4,816,567)，Law 等(歐洲專利申請公開 No.438 310)和Winter (歐洲專利申請公開No.239400)。通過向人源化抗IL-10抗體DNA中導入合適的核苷酸變化或通過肽合成，來制備人源化抗IL-10抗體的氨基酸序列變體。這樣的變體包括，例如，刪除和/或插入和/ 或替換人源化抗IL-10 F (ab)所示的(例如，SEQ ID NO 5和10)氨基酸序列內(nèi)的殘基。 進行刪除、插入和替換的任何組合來得到最終的構(gòu)建體，條件是最終的構(gòu)建體具有期望 的特性。氨基酸變化也可能改變?nèi)嗽椿笽L-10抗體的翻譯后加工，例如，改變糖基化 位點的數(shù)目或位置。用于鑒定作為優(yōu)選的的突變位置的、人源化抗IL-10抗體多肽的某些殘基 或區(qū)域的方法，稱為“丙氨酸掃描突變”，由Cunningham和Wells，Science 244 1081-1085(1989)所描述。在此，鑒定殘基或一組目標殘基(例如，帶電殘基如arg、 asp、his、Iys和glu)，并用中性的或帶負電的氨基酸(最優(yōu)選的丙氨酸或聚丙氨酸)替換 來影響氨基酸與IL-10抗原的相互作用。然后通過在替換的位點導入進一步的或其他的 變化來改進表現(xiàn)出對替換有功能敏感性的氨基酸殘基。因而，當確定了導入氨基酸序列 變化的位點時，不必預先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析在給定位點的突變的性 能，在目標密碼子或區(qū)域進行ala掃描或隨機突變，并根據(jù)期望的活性篩選表達的人源化 抗IL-10抗體的變體。氨基酸序列插入包括在氨基和/或羧基末端的、長度為一個殘基到含有一百個 或更多殘基的多肽的融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)的插入。末端插入的實 例包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的人源化抗IL-10抗體或與表位標簽融合的抗體。人 源化抗IL-10抗體分子的其他插入變體包括提高抗體的血清半衰期的酶或多肽與人源化抗 IL-10抗體的N-或C-末端的融合。另一種類型的變體是氨基酸替換變體。這些變體具有在人源化抗IL-10抗體分 子中除去的至少一個氨基酸殘基和在它的位置上插入的不同的殘基。替換突變的最感興 趣的位點包括高變環(huán)，但FR改變也是期望的。在以下描述的方法中的表2和表3提供了 關(guān)于可改變的高變區(qū)殘基的指導。涉及抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基或FR殘基一般以相對保守 的方式替換?？贵w的另一種類型的氨基酸變體改變了抗體的原始的糖基化模式。改變的意思 是刪除抗體中存在的一個或多個碳水化合物部分，和/或添加不存在于抗體中的一個或 多個糖基化位點?？贵w的糖基化典型地是N-連接的或O-連接的。N-連接的是指碳 水化合物部分附著到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰 胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分酶促附著到天冬 酰胺側(cè)鏈的識別序列。因而，在多肽中這些三肽序列的任何一個的存在都產(chǎn)生潛在的糖 基化位點。O-連接的糖基化是指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著到羥基 氨基酸上，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，而5-羥脯氨酸或5-羥基賴氨酸也可以使用?？梢酝ㄟ^改變氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一個或多個(用于N-連接的 糖基化位點)來方便地實現(xiàn)給抗體添加糖基化位點。也可以通過向原始抗體的序列中添 加或替換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于ο-連接的糖基化位點)來進行改變。通過本領(lǐng)域已知的各種方法來制備編碼人源化IL-10特異性抗體的氨基酸序列變 體的核酸分子。這些方法包括，但不限于，從天然來源分離(對于天然發(fā)生的氨基酸序 列變體)，或通過寡核苷酸介導的(或定點)突變，PCR突變，和較早制備的人源化抗 IL-10抗體的變體或非變體型式的表達盒突變來制備。
通常，人源化抗IL-10抗體的氨基酸序列變體具有的氨基酸序列與輕鏈或重鏈的 原始人源化抗體氨基酸序列(例如，如SEQ ID NO 5和1 0)具有至少75%的氨基酸序 列同一性，更優(yōu)選的至少80%，更優(yōu)選的至少85%，更優(yōu)選的至少90%，最優(yōu)選的至少 95%。對這個序列的同一性或同源性在此被定義為在候選序列中與人源化抗IL-10殘基相 同的氨基酸殘基的百分比，如果有必要，在比對序列和導入缺口之后，以到達最大的序 列同一性百分比，而不考慮任何保守性替換作為序列同一性的部分。對抗體序列的N-末 端、C-末端或內(nèi)部延伸、刪除或插入，都不應(yīng)被認為影響序列同一性或同源性。人源化抗體可以選自任何類型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和 IgE。優(yōu)選的，抗體是IgG抗體?？梢允褂肐gG的任何同種型，包括IgGp IgG2、IgG3 和IgG4。IgG同種型的變體也是被考慮的。人源化抗體可以包含來自超過一個類型或同 種型的序列。通過在如下所述的生物測定中篩選抗體來容易地實現(xiàn)必需恒定結(jié)構(gòu)域序列 的優(yōu)化以產(chǎn)生期望的生物活性。同樣地，任一類型的輕鏈都可用于此處的組合物和方法中。特別地，在當前的 組合物和方法中，kappa、lambda或其變體是有用的?？梢允褂脕碜苑侨祟惪贵w的CDR序列的任何適合的部分。通過替換、插入或刪 除至少一個殘基來突變CDR序列，使得CDR序列不同于所采用的人類和非人類抗體序 列。期望的是這種突變是最小的。一般地，至少75%的人源化抗體殘基相應(yīng)于非人類 CDR殘基，更經(jīng)常地為90%，最優(yōu)選的大于95%?？梢允褂脕碜匀祟惪贵w的FR序列的任何適合的部分。通過替換、插入或刪除至 少一個殘基來突變FR序列，使得FR序列不同于所采用的人類和非人類抗體序列。期望 的是這種突變是最小的。一般地，至少75%的人源化抗體殘基相應(yīng)于人類FR殘基，更 經(jīng)常地為90%，最優(yōu)選的大于95%。CDR和FR殘基根據(jù)Kabat的標準序列定義來確定。Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987)。在此提供的是鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，該方法包括步驟a) 鑒定具有期望的生物學活性的非人類抗體；b)確定非人類抗體Vh和Vl結(jié)構(gòu)域的氨基 酸序列；和c)將非人類抗體序列與一組人類種系序列進行比較，其中所述比較包括子步 驟1)根據(jù)上述Kabat給非人類V序列分配殘基編號；2)根據(jù)上述Kabat描繪序列中 的CDR和FR區(qū)域；3)在非人類和人類抗體種系序列的相同的特定殘基位置分配預定的 數(shù)字分值；和4)總和所有的殘基分值來產(chǎn)生每個人類種系序列的總分；和d)將具有最 高的總殘基分值的人類種系序列鑒定作為接受體種系序列。在一個實施方式中，所述方 法進一步包括子步驟5)在子步驟(4)之后，為具有相同總殘基分值的種系序列，對在 子步驟(3)中未計分的非人類和人類抗體種系序列相同的每個FR殘基位置分配數(shù)字分值 1 ； 6)總和所有殘基分值來產(chǎn)生每個人類種系序列的總分值。在特定的實施方式中，所 述非人類抗體特異于IL-10并且抑制IL-10的生物學活性。在此還提供的是通過上述方 法產(chǎn)生的抗體。在一個實施方式中，使用以下方法對IL-10抗體進行人源化。首先，對IL-10 抗體的非人類Vl和Vh結(jié)構(gòu)域進行克隆和序列，并測定氨基酸序列。然后，將非人類Vh 序列與一組五個人類Vh種系氨基酸序列比較。這五個的組含有來自IGHVl和IGHV4亞群的一個代表和來自IGHV3亞群的三個代表。Vh亞群在M.-P.Lefranc，Exp.Clin. Immunogenetics，18 100-116 (2001)中列出了。特別地，與五個種系序列的比較從根據(jù) Kabat編號系統(tǒng)給非人類Vh序列分配殘基編號開始。參見Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services, NIH Pub.91-3242 (5th Ed., 1991).然后將非人類 Vh 序列與五 個人類種系序列中的每一個進行比對。由于V基因僅包含Vh殘基1-94，在比對中僅考 慮這些殘基。接下來，描繪序列中的互補決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)。根據(jù)在Kabat， 等，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Pub.91-3242 (5th Ed., 1991)和 C.Chothia & A.M丄esk，J.Mol.Biol.，196 901-917(1987)中提供的定義的組合來描繪 CDR和FR。因此，使用的CDR定義對于Vh結(jié)構(gòu)域是CDRl為殘基26-35，CDR2為殘 基50-65，CDR3為殘基95-102。接下來的步驟包括在非人類和人類序列吻合的鑒定的 殘基位置分配數(shù)字分值。這種計分的一個實例在以下的表2中示出。
表2殘基#分值原因24影響 CDR-Hl,3*43影響 CDR-Hl，3243影響CDR-Hl264影響 CDR-Hl *274影響 CDR-H 1,3*294影響 CDR-H1*344影響 CDR-Hl*352VH/VL 接口372VH/VL 接口392VH/VL 接口442VH/VL 接口452VH/VL 接口474VH/VL 接口 ，CDR-L3483影響CDR-H2493影響CDH-H2502VH/VL 接口513影響CDR-H2582VH/VL 接口593影響CDR-H2602VH/VL 接口633影響CDR-H2673影響CDR-H2693影響CDR-H2714影響 CDR-H2*733影響CDR-Hl763影響CDR-Hl783影響CDR-Hl912VH/VL 接口933彩響CDR-H3944影響 CDR-H3*max 89* 表示影響 CDR 構(gòu)象，C.Chothia 等，Nature 342 877-883，(1989)。在給殘基位置分配數(shù)字分值之后，總和所有殘基的分值。接受體種系序列是具 有最高總分的那個。在兩個或多個種系序列具有相同的分值的情況下，則在以下殘基 1，3，5-23，25，36，38，40-43，46，66，68，70，72，74，75，77，79-90 和 92 上非 人類和人類序列相同的每個位置上給總分加1 (最大49)。再次總計殘基分值，接受體種 系序列是具有最高總分的那個。如果兩個或多個種系序列仍然具有相同的分值，任何一 個都可被用作接受體種系序列。如果Vl序列是Vl的kappa亞類的成員，將來自IL-10特異性抗體的非人類Vl 序列與一組四個人類\ kappa種系氨基酸序列進行比較。這四個序列由來自在V.Barbie &M.-P.Lefranc, Exp.Clin.Immunogenetics 15 171-183 (1998)和 M.-P.Lefranc, Exp.Clin. Immunogenetics 18 161-174(2001)中列出的四個已確定人類Vl亞群的每個的一個代表 組成。這四個序列也相應(yīng)于 Kabat 等，U.S.Department of Health and Human Services, NIH Pub.91-3242, pp.103-130 (5th Ed., 1991)中列出的四個亞群。非人類序列與四 個種系序列的比較從根據(jù) Kabat 等，U.S.Department of Health and Human Services.NIH Pub.91-3242(5thEd 1991)給非人類Vl序列殘基分配殘基編號開始。然后將非人類Vl 序列與四個人類種系序列中的每一個進行比對。由于V基因僅包含^殘基1-95，在比對 中僅考慮這些殘基。接下來，描繪序列中的互補決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)。根據(jù)在 Kabat等，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Pub.91-3242 (5th Ed., 1991) 和 C.Chothia&A.M丄esk，J.Mol.Biol.，196 901-917(1987)中提供的定義的組合來描繪 CDR禾PFR。因此，使用的CDR定義對于Vl結(jié)構(gòu)域是CDRl為殘基24-34，CDR2為殘 基50-56，CDR3為殘基89-97。接下來的步驟包括在非人類和人類序列吻合的鑒定的殘 基位置分配數(shù)字分值。這種計分的一個實例在以下的表3中示出。表3殘基#分值原因24影響 CDR-L1,3*43影響 CDR-Ll，3254影響 CDR-Ll *294影吻 CDR-Ll ,3*334影響 CDR-Ll ,3*342VL/VH 接口362VLZVi^o382VL/VH 接口432VL/VH 接口442VL/VH 接口464VUVH 接口 ，CDR-H3473影響CDR-L2484影響 CDR-L2*492VUVH 接口552VL/VH 接口583影響CDR-L2623影響CDR-L2644影響 CDR-L2,714影響 CDR-L1*872VL/VH 接口892VLZVI^d904影響 CDR-L3 912VL/VH 接口942VL/VH 接口954影響 CDR-L3** 表示影響 CDR 構(gòu)象，C.Chothia 等，Nature 342 877-883，(1989)。在給殘基位置分配數(shù)字分值之后，總和所有殘基的分值。接受體種系序列是具 有最高總分的那個。在兩個或多個種系具有具有相同的分值的情況下，則在以下殘基 1，3，5-23，35，37，39-42，57，59-61，63，65-70，72-86 和 88 上非人類和人類序列 相同的每個位置上給總分加1。再次總計殘基分值，接受體種系序列是具有最高總分的那 個。如果兩個或多個種系序列仍然具有相同的分值，任何一個都可被用作接受體種系序 列。對于抗體的重組生產(chǎn)，分離編碼抗體的核酸，并插入到可復制載體中用于進一 步的克隆(DNA的擴增)或用于表達。利用常規(guī)程序容易地分離編碼單克隆抗體的DNA 并測序(例如，利用能與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。許 多載體是可獲得的。載體成分一般包括，但不限于，一種或多種以下成分信號序列、 復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個實施方式中，抗體是結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段， 包含至少一個抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO: 1 (KTSQNIFENLA)、CDR2 的 SEQ ID NO 2 (NASPLQA)禾口 CDR3 的 SEQ ID NO 3CHQYYSGYT)構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個抗體重鏈可變區(qū)或 其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 6 (GFTFSDYHMA)、CDR2的SEQ ID NO 7 (SITLDATYTYYRDSVRG)禾P CDR3 的 SEQ ID NO 8 (HRGFSVWLDY)構(gòu)成
的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上 全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。在特定的實施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段 包含具有SEQ IDNO 4(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPKLLIY NASP LQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSG-YTFGPGTKLELKRT)的可變區(qū)的多肽。在一個特定的實施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含 具有SEQ ID NO 5的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。參見表4。在一個特定的實施方式中， 所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO 9(QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWV RQAPG KGLEWVASITLDAT YT YYRDS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS)的可變區(qū)的多肽。在另一個特定的實施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包 含具有SEQ ID NO: 10的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。參見表5。含有編碼人源化12G8輕鏈和重鏈的核酸的質(zhì)粒于2004年4月20日保藏在美國 典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號分別為PTA-5923和PTA-5922。表4.人源化12G8抗體的輕鏈的全長序列SEQ ID NO 5人源化12G8抗體的全長氨基酸序列SEQ ID NO 19人源化12G8抗體的全長核酸序列—>可變輕鏈結(jié)構(gòu)域DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITGAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACTCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPTGC AAG ACA AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCTKLLIYNASPLQAGVPSRFSGSGAAG CTC CTG ATC TAT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGASGTDFTLTISSLQPEDFATYYCTCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCAACT TAC TAC TGT—> 人類HQYYSGYTFGPGTKLELKRTVACAC CAG TAT TAT AGC GGG TAC ACG TTT GGA CCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGT ACG GTG GCT輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVGCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT CAT GAG CAG TTG AAA TCT GGAACT GCC TCT GTT GTGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQTGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAASGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGCTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAGGLSSPVTKSFNRGECGGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT表5.人源化12G8抗體的重鏈的全長序列SEQ ID NO 10人源化12G8抗體的全長氨基酸序列SEQ ID NO 20人源化12G8抗體的全長核酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCCAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGTAASGFTFSDYHMAWVRQAPGKG GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAT ATG GCC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGGLEWVASITLDATYTYYRDSVRGCTG GAG TGG GTG GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTG CGC GGCRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRACGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCTEDTAVYYCARHRGFSVWLDYWGGAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC- >人類IgGl恒定重鏈結(jié)構(gòu)域QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCG TCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCCSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPETCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLCCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTAQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQCAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAGTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAASCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVTCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTCFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVTTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTGVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVGTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTGHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLCAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTCPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACCLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFCTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTCY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTTAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG CAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACGPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRCCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGGWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQTGG CAG CAG GCG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG
KSLSLSPGKAAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA在一個實施方式中，抗體是結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片 段，包含至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO: 11 (RASESVDDYGHSFMH)、CDR2 的 SEQ ID NO 12 (RASTLES)禾口 CDR3 的 SEQ ID NO: 13(QQGNEDPWT)構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架 區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個抗體重鏈 或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 15 (GFSLTNYGVH)、CDR2的 SEQ ID NO 16 (VIWSGGSTDYNAAFIS)和 CDR3 的 SEQ ID NO 17 (NRGYDVYFDY) 構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基 本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。在一個特定的實施方式中，所述抗體輕鏈或其 結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO: 14的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。參見表6。在又一個特定 的實施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ IDNO : 18的可變區(qū)和恒定區(qū) 的多肽。參見表7。含有人源化11D8重鏈和輕鏈的質(zhì)粒于2004年4月20日保藏在ATCC，保藏號 分別為 PTA-5926 和 PTA-5927。表6.人源化11D8抗體的輕鏈的全長序列SEQ ID NO 14人源化11D8抗體的全長氨基酸序列SEQ ID NO 21人源化11D8抗體的全長核苷酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATGAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACCLSCRASESVDDYGHSFMHWYCTC TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT GAT TAT GGC CAT AGT TTT ATG CAC TGG TACQQKPGQAPRLLIYRASTLESCAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC ACC CTA GAA TCTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISGGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGCRLEPEDFAVYYCQQGNEDPWAGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAA GGT AAT GAG GAT CCG TGGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFACG TTC GGT CAA GGT ACC AAG GTG GAA ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTCIFPPSDEQLKSGTASVVCLLATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTTGTG TGC CTG CTG NNFYPREAKVQWKVDNALQS AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT
AAC GCC CTC CAA TCGGNSQESVTEQDSKDSTYSLSGGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGCSTLTLSKADYEKHKVYACEVAGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTCTHQGLSSPVTKSFNRGECACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT表7.人源化11D8抗體的重鏈的全長序列SEQ ID NO 18人源化11D8抗體的全長氨基酸序列SEQ ID NO 22人源化11D8抗體的全長核苷酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSCAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCCLRLSCAASGFSLTNYGVHWVCTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGT TTC TCA TTA ACA AAC TAT GGT GTA CAC TGG GTCRQAPGKGLEWVAVIWSGGSTCGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACADYNAAFISRFTISRDNSKNTGAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACGLYLQMNSLRAEDTAVYYCARCTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCGAGANRGYDVYFDYWGQGTLVTVSAAT AGG GGG TAC GAC GTC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC CTT GTC ACA GTC TCGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSTCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCTGGTAALGCLVKDYFPEPVTVGGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCCGAA CCG GTGACG GTGSWNSGALTSGVHTFPAVLQSTCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCCSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAGTYICNVNHKPSNTKVDKKVEACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGCCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCACCT GAA CTC CTG GGGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTGGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACCPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNCCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AACWYVDGVEVHNAKTKPREEQYTGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TACNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGAAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGCKEYKCKVSNKALPAPIEKTIAAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAAACC ATCSKAKGQPREPQVYTLPPSRDTCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GATELTKNQVSLTCLVKGFYPSDGAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GACIAVEWESNGQPENNYKTTPPATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCCVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRGTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTGGAC AAG AGC AGGWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TACTQKSLSLSPGKACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA在一個實施方式中，以上描述的抗體進一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒 定區(qū)包含Yl、Υ2, Υ3或人類重鏈恒定區(qū)或其變體。在一個實施方式中，上述抗 體進一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類輕鏈恒定區(qū)。 在某些實施方式中，這些抗體的結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、scFv> F(ab，)2和雙抗體(diabody)構(gòu)成的組的抗體片段。還提供的是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一 個抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 1、CDR2的 SEQ IDNO 2和CDR3的SEQ IDNO 3構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和至 少一個抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 6、CDR2 的SEQ ID NO 7和CDR3的SEQ ID NO 8構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽。在特定的實施方式中，嵌合重組抗體分子具有SEQ ID NO 23中列出的輕鏈和 SEQ ID NO 24中列出的重鏈。參見表8。編碼12G8嵌合抗體輕鏈和重鏈的核酸于 2004年4月20日保藏在ATCC，保藏號分別為PTA-5925和PTA-5924。表8.嵌合12G8抗人類IL-IO抗體的序列
SEQ ID NO 23輕鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 25輕鏈的核酸序列_—>信號序列MAPVQLLGLLVLFLPAMRCATG GCT CCA GTT CAA CTT TTA GGG CTT TTG GTG CTC TTC CTC CCA GCC ATG AGA TGT成熟IgG—>大鼠12G8輕鏈可變結(jié)構(gòu)域DIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNGAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT TCA CTC CTG TCT GCA TCT GTG GGA GAC AGA GTC ACT CTC AACCKTSQNIFENLAWYQQKLREPPTGC AAG ACA AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAA AAG CTT AGA GAA CCT CCCKLLIFNASPLQAGIPSRFSGSGAAA CTC CTG ATT TTT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGC ATC CCT TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGASGTDFTLTITSLQPEDVATYFC
TCT GGT ACA GAT TTC ACA CTC ACC ATC ACC AGC CTG CAG CCT GAG GAT GTT GCC ACA TAT TTC TGC— > 人類HQYYSGYTFGPGTKLELKRTVACAC CAG TAT TAT AGC GGG TAC ACG TTT GGA CCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGT ACG GTG GCT恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVGCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGAACT GCC TCT GTT GTGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQTGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAASGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGCTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAGGLSSPVTKSFNRGECGGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAA SEQ ID NO 24重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 26重鏈的核酸序列_MDIRLSLVFLVLFMKDVQCATG GAC ATC AGG CTC AGC TTG GTT TTC CTT GTC CTT TTT ATG AAA GAT GTC CAG TGT成熟IgG—>大鼠12G8可變重鏈結(jié)構(gòu)域EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCGAG GTG CAG TTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTG CGG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGTTASGFTFSDYHMAWVRQSPDKG ACA GCC TCA GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAC ATG GCC TGG GTC CGC CAG TCT CCA GAC AAG GGTLEWVASITLDATYTYYRDSVRGCTG GAG TGG GTC GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTGAGG GGC
RFTISRNNAKTTLYLQMDSLRSCGA TTC ACC ATC TCC CGA AAT AAT GCA AAA ACC ACC CTT TAC CTG CAA ATG GAC AGT CTG AGG TCTEDTATFYCTRHRGFSVWLDYWGGAG GAC ACG GCC ACT TTT TAC TGT ACA AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC—>人類IgGl重鏈QGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPCAA GGA GTC ATG GTC ACT GTC TCT TCA GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCCSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPETCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAAPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLCCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTAQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQCAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAGTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAASCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVTCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTCFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVTTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTGVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVGTG GTG GAC GTG AGC CAC CAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTGHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLCAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTCPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCCCGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC在此進一步提供是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含 至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 11、CDR2的 SEQ ID NO 12和CDR3的SEQ ID NO 13構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和 至少一個抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 15、CDR2的 SEQ ID NO 16和CDR3的SEQ ID NO 17構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽。進一步提供的是編碼以上公開的抗體的多肽的分離的核酸。在此還提供的是表 達載體，包含與控制序列可操作連接的分離的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn) 染的宿主細胞識別。在此提供的是包含所述載體的宿主細胞，所述載體包含所述分離的 核酸序列。在此進一步提供的是生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達所述核酸序列的條件下培 養(yǎng)包含所述載體的宿主細胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細胞回收所述多肽。在此提供的是編碼特異于IL-IO的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 19的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO 20的核酸序列的重鏈。參見表4和5。在此提供的是編碼特異于IL-IO的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 21的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO 22的核酸序列的重鏈。參見表6和7。在此進一步提供的是編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由上述 核酸序列編碼。在一個實施方式中，所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、 Fv、scFv、F(ab，)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。在本發(fā)明的方法和組合物中雙特異性抗體也是有用的。如在此使用的，術(shù)語 “雙特異性抗體”是指具有對至少兩個不同的抗原表位的結(jié)合特異性的抗體，一般是單
克隆抗體。在一個實施方式中，表位來自相同的抗原。在另一個實施方式中，表位來 自兩個不同的抗原。制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以利用共表 達兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對來重組性地產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，Milstein 等，NatureM^: 537-39(1983)。做為選擇，可以利用化學連接來制備雙特異性抗體。 參見，例如，Brennan等，Science — : 81(1985)。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片 段。參見，例如，Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90 6444-48 (1993)，Gruber 等，J.Immunol.152 5368(1994)。D.人源化抗IL-IO抗體的生物學活性可以根據(jù)體外的抑制性生物活性或適合的結(jié)合親合性來篩選具有人源化抗IL-IO 抗體中期望的、在此鑒定的特征的抗體。為了篩選結(jié)合人類IL-IO上的表位的抗體，所 述表位被目標抗體結(jié)合(例如，阻斷細胞因子與其受體結(jié)合的那些)，可以進行常規(guī)的交 叉阻斷(cross-blocking)分析，例如在 ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和 David Lane (1988)中描述的。做為選擇，可以進行 表位作圖，例如，Champe等，J.Biol.Chem.270 1388-1394(1995)中描述的，來確定抗 體是否結(jié)合目標表位?？梢允褂脴藴实腟catchard分析來測定抗體親合性(例如，對人類 IL-IO的親合性)。優(yōu)選的人源化抗體是以不超過約1 X ΙΟ"7 ；優(yōu)選的不超過約1 X 10_8 ； 更優(yōu)選的不超過約ι χ 10_9 ；和最優(yōu)選的不超過約2 X 10,的Kd值與人類IL-IO結(jié)合的那 些。在當前組合物和方法中有用的抗體和其片段是生物學活性的抗體和片段。如在此使用的，術(shù)語“生物學活性的”是指能夠結(jié)合期望的抗原表位并且直接或間接地發(fā)揮 生物效應(yīng)的抗體或抗體片段。一般地，這些效應(yīng)由IL-10與其受體結(jié)合的失敗所引起。 如在此使用的，術(shù)語“特異性”是指抗體與目標抗原表位的選擇性結(jié)合?？梢酝ㄟ^在給 定的條件組合的情況下比較與IL-10的結(jié)合和與不相關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合，來檢測 抗體的結(jié)合特異性。如果抗體與IL-10的結(jié)合是與不相關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合的至 少10倍，優(yōu)選的50倍，則它被認為是特異性的。抑制性IL-10特異性抗體可以以任何方式抑制IL-10的生物學活性，包括但不限 于 IL-1、IFN- Y > PGE2、IL-12、TNF> CC 和 CXC 趨化因子的產(chǎn)生，禾Π MHC II 類抗 原、CD54、CD80和CD86的細胞表面表達?？梢酝ㄟ^任何有用的方法來測定IL-10特 異性抗體的生物活性。參見，例如，美國專利Nos 6,239,260和6,207,154。在一個實例 中，使用鼠肥大細胞系MC9/2在細胞增殖分析中評定生物活性。參見Thompson-Snipes 等，J.Exp.Med.m: 507-10(1991)。IL-10刺激這個細胞系的增殖，因而可以通過其降 低增殖的能力來鑒定抑制性抗體。MC9/2細胞系的增殖的ED5tl—般是0.5-1.0ng/ml。相 對于不存在抗體的情況下或存在非結(jié)合抗體的情況下細胞的增殖，如果抗體抑制細胞的 增殖，則抗體對于增殖是抑制性的?？梢允褂萌魏芜m合的方法來測定增殖。一般地，通 過評定放射性標記的核苷酸(例如，3H-胸腺嘧啶核苷)對DNA的摻入來測定增殖。在 另一個實施方式中，通過ATP熒光來測定增殖。優(yōu)選的，在當前組合物中有用的抗體抑 制IL-10的生物活性的80%，更優(yōu)選的95%，最優(yōu)選的99%。E.人源化抗IL-10抗體的使用在此提供的是在人類受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括以有效阻斷IL-10的生 物學活性的量向需要其的受試者施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是 結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個抗體輕鏈可變區(qū)或其 結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ IDNO 1、CDR2的SEQ ID NO 2和CDR3的 SEQ ID NO 3構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸 序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其 結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 6、CDR2的SEQ ID NO 7和CDR3 的SEQ ID NO: 8構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨 基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。進一步提供的是在人類受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括以有效阻斷IL-10的 生物學活性的量向需要其的受試者施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體 是結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合 片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 11、CDR2的SEQ ID NO 12和CDR3的 SEQ ID NO 13構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基 酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個抗體重鏈或其結(jié)合 片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO 15、CDR2的SEQ ID NO 16和CDR3的 SEQ ID NO 17構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基 酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。通過這種方法抑制的免疫反應(yīng)是體液的或細胞的反應(yīng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的 方法測定對體液和細胞反應(yīng)的抑制。例如，在與高水平的自身反應(yīng)性抗體相關(guān)的疾病中，例如，SLE，相對于治療之前的血清水平，這些抗體的血清水平的減少是抑制體液 反應(yīng)的指示。同樣地，可使用公知的體外分析來測定對細胞免疫反應(yīng)的抑制，例如，增 殖和細胞毒性化驗或通過例如流動細胞計數(shù)分析來鑒定外周血淋巴細胞的活化表型。參 見，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，最新的版本。在一個實施方式中，用 這種方法治療的受試者患有全身性紅斑狼瘡。在另一個實施方式中，所述受試者患有免 疫性血小板減少性紫癜(ITC)。在又一個實施方式中，所述受試者患有狼瘡腎炎。在進 一步的實施方式中，所述受試者患有HIV。在另一個實施方式中，所述受試者患有肝炎 C。在此提供的是一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學可接受的載體或稀 釋劑組合，其中所述抗體是在此公開的抗體之一。可從IL-10特異性抗體的治療受益的任何受試者都可以使用在此提供的組合物和 方法進行治療。任何受試者都可以用在此提供的方法和組合物進行治療。這樣的受試者 是患有自身免疫性疾病或癥狀或病原體誘導的免疫病理的哺乳動物，優(yōu)選的是人類。在 一個特定的實施方式中，受試者患有SLE、狼瘡腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、ITC、HIV或肝 炎C。公開的方法和組合物的獸醫(yī)學用途也是預期的。如在此使用的，“抑制”或“治療(treat)”或“治療(treatment)”包括延緩與
自身免疫性疾病或病原體誘導的免疫病理有關(guān)的癥狀的發(fā)展和/或降低將要或預期會發(fā) 展的這種癥狀的嚴重程度。這些術(shù)語進一步包括改善現(xiàn)有的不受控制或不需要的自體免 疫相關(guān)的或病原體誘導的免疫病理癥狀，預防其他的癥狀，和改善或預防這種癥狀的根 本原因。因而，這些術(shù)語表示已經(jīng)賦予脊椎動物受試者有益結(jié)果，所述受試者患有自體 免疫或病原體誘導的免疫病理疾病或癥狀，或有發(fā)展出這種疾病或癥狀的可能性。如在此使用的，術(shù)語“治療有效量”或“有效量”是指IL-10特異性抗體的數(shù) 量，當單獨地或與其他治療劑組合地向細胞、組織或受試者施用時，對于預防或改善與 自身免疫性疾病或病原體誘導的免疫病理相關(guān)的疾病或狀況，或疾病的發(fā)展是有效的。 治療有效劑量進一步是指足以引起癥狀的改善的化合物的數(shù)量，例如，相關(guān)醫(yī)學狀況的 治療、治愈、預防或改善，或這種狀況的治療、治愈、預防或改善的比例方面的提高。 當應(yīng)用于單獨施用的單個活性成分時，治療有效劑量單指該成分。當應(yīng)用于組合時，治 療有效劑量是指產(chǎn)生治療效果的活性成分的組合的量，無論是組合、順序還是同時地施 用的。在當前方法中有用的抗體(從任何來源衍生的，無限制地包括來自重組和非重 組的來源)可以單獨施用給需要的受試者，或在藥物組合物中施用，在所述藥物組合物 中抗體與一定劑量的適合的載體或賦形劑混合，來治療或改善各種失調(diào)。這種組合物也 可以含有(除蛋白質(zhì)和載體之外)稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖液、穩(wěn)定劑、增溶劑和其他 本領(lǐng)域公知的材料。術(shù)語“藥學上可接受的”意思指不干擾活性成分的生物學活性的有 效性的無毒材料。載體的特征取決于施用途徑。本發(fā)明的藥物組合物也可以含有其他免疫抑制試劑或免疫調(diào)節(jié)試劑?？梢?使用任何適合的免疫抑制試劑，包括但不限于抗炎劑、皮質(zhì)類固醇類、環(huán)孢霉素、他 克莫司(即，F(xiàn)K-506)、西羅莫司、干擾素、可溶細胞因子受體(例如，sTNRF和 sIL-IR)、中和細胞因子活性的試劑(例如，英夫單抗、etanercept)、霉酚酸莫非替克、15-deoxyspergualin,酞胺哌啶酮、拉格太咪爾、咪唑硫嘌呤、來氟洛米、環(huán)磷酰胺、氨
甲蝶呤，等等。藥物組合物也可以采用其他治療形式，例如光線療法和放射療法。在另一個實施方式中，提供了試劑盒，其含有進行在此提供的方法的化驗所必 需的試劑。在此特別提供的是分室試劑盒，包括一個或多個容器，其中第一容器包含一 種或多種特異于IL-10的抗體，一個或多個其他容器包含一種或多種以下試劑重構(gòu)試 劑，施用試劑。所述容器可以是玻璃的、塑料的、或塑料或紙的試片(strips)。在一個 實施方式中，試劑盒還含有書面指導。在實施在此提供的治療方法或用途時，在此提供的治療有效量的抗體被施用給 具有適合于用IL-10治療的狀況的哺乳動物。所述抗體可以根據(jù)在此提供的方法單獨施 用，或與其他治療組合施用，例如，采用其他免疫調(diào)節(jié)因子(例如，細胞因子)、免疫抑 制制劑等的治療。當與一種或多種生物活性試劑共施用時，在此提供的抗體可以與生物 活性試劑同時地或順序地施用。如果順序地施用，主治醫(yī)師將決定與生物活性試劑組合 施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的合適順序。單獨地或與其他免疫抑制試劑組合施用的抗體組合物的毒性和治療效能可以通 過細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W程序來測定，例如，測定LD5tl (對群體的50%的 致死劑量)和ED5tl(在群體的50%中治療有效的劑量)。在有毒和治療效果之間的劑量 比例是治療指數(shù)，它可以被表示為LD5tl和ED5tl之間的比例。展現(xiàn)出高治療指數(shù)的抗體 是優(yōu)選的。從這些細胞培養(yǎng)分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制用于人類的劑量范 圍。這種化合物的劑量優(yōu)選地處在包括很小或沒有毒性的ED5tl的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取 決于采用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變動。配制和施用本方法的抗體的技術(shù)可以在REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, MackPublishing Co., Easton, Pa.最新的版本中找到。施用的方式不是特別 重要的。適合的施用途徑可包括例如，口的、直腸的、穿粘膜的或腸的施用；胃腸外的 遞送，包括肌肉內(nèi)的、皮下的、髓內(nèi)的注射，以及鞘內(nèi)的、直接心室內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、 腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的或眼球內(nèi)注射。用于藥物組合物或用于實踐本發(fā)明的方法的抗體施用 可以以各種常規(guī)途徑進行，例如，口服攝取、吸入、局部施用或皮膚的、皮下的、腹膜 內(nèi)的、胃腸外的、動脈內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射。對患者靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。替換性地，可以以局部而不是全身性方式施用抗體，例如通過將所述抗體直接 注射到關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)或病原體誘導的以免疫病理為特征的病灶，通常以儲庫或持續(xù)釋放 制劑的形式。此外，可以在靶向藥物遞送系統(tǒng)中施用抗體，例如在包被有組織特異性抗 體的脂質(zhì)體中，靶向例如關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)或病原體誘導的以免疫病理為特征的病灶。所述 脂質(zhì)體靶向患病組織并被患病組織選擇性地吸收。因而根據(jù)當前方法使用的藥物組合物可以使用一種或多種生理學上可接受的載 體按常規(guī)的方式來配制，所述載體包括便于將活性化合物加工成可以藥學上使用的制品 的賦形劑和輔助劑。這些藥物組合物可以按照本身已知的方式，例如，通過常規(guī)的混 合、溶解、?；?、制成糖衣、研磨、乳化、密封、包埋或凍干過程來制造。適當?shù)呐浞?取決于選擇的給藥途徑。當以液體形式施用時，可以添加液體載體，例如水、石油、動 物或植物來源的油，例如花生油、礦物油、豆油、或芝麻油、或合成油。藥物組合物的 液體形式可以進一步含有生理鹽溶液、葡萄糖或其他糖類溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當以液體形式施用時，藥物組合物含有按重量計約0.5到90%的本 發(fā)明的蛋白質(zhì)，和優(yōu)選的約1到50%的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。當通過靜脈注射、皮膚或皮下注射施用治療有效量的此處的方法的抗體時，本 發(fā)明的蛋白質(zhì)將處于無熱原的、胃腸外可接受的水溶液的形式。制備這種胃腸外可接受 的蛋白質(zhì)溶液，適當考慮pH、等滲性、穩(wěn)定性等，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。用 于靜脈注射、皮膚或皮下注射的優(yōu)選的藥物組合物，除本發(fā)明的蛋白質(zhì)之外應(yīng)含有等滲 賦形劑，例如氯化鈉注射液、Ringer' s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射 液、LactatedRinger' s注射液或本領(lǐng)域已知的其他賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物也可 含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的添加物。為了注 射，可將本發(fā)明的藥劑配制在水溶液中，優(yōu)選的在生理學相容的緩沖液例如Hanks'溶 液、Ringer' s溶液或生理鹽水緩沖液中。對于穿粘膜施用，將適合于需透過的障礙物的 滲透劑用在配方中。這種滲透劑是本領(lǐng)域公知的。對于吸入施用，使用適合的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯 四氟乙烷、二氧化碳或其他適合的氣體，以氣溶膠噴霧呈現(xiàn)的形式從加壓的包裝物或噴 霧器方便地遞送用于根據(jù)當前方法使用的抗體。對于加壓的氣霧劑來說，劑量單位可以 通過提供一閥來遞送計量的數(shù)量來確定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明膠的藥囊 和藥筒可以配制為含有化合物和適當?shù)姆勰┗鶆?，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。所?化合物可以配制為通過注射用于腸胃外施用，例如，通過彈丸注射或連續(xù)的輸注。用于 注射的制劑可以單位劑型存在，例如，在帶有添加的防腐劑的安瓿瓶或多劑量容器中。 組合物可以采用在油或水賦形劑中的懸浮液、溶液或乳劑的形式，可以含有配方試劑， 例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。用于腸胃外施用的藥物制劑包括水可溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活 性化合物的懸浮液可以視情況制備為油性注射懸浮液。適合的親油性溶劑或賦形劑包括 脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性 注射懸浮液可以含有提高懸浮液的粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉鹽、山梨醇或葡聚 糖。任選的，懸浮液也可以含有適合的穩(wěn)定劑或提高化合物的溶解性以允許制備高濃度 溶液的試劑。做為選擇，活性成分可以是粉未形式用于在使用前與適合的賦形劑，例 如，無菌的無熱原水構(gòu)制。在本發(fā)明的藥物組合物中在公開的方法中有用的抗體的數(shù)量將取決于待治療的 狀況的性質(zhì)和嚴重程度，并取決于患者已經(jīng)經(jīng)歷的在先治療的性質(zhì)。最后，主治醫(yī)師將 決定治療每個單獨的患者所用的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的數(shù)量。預期的是，劑量將根據(jù)單個患 者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。起初，主治醫(yī)師將施用低劑量的當前方法的抗體，并觀 察患者的反應(yīng)。可以給患者施用更大劑量的本發(fā)明的抗體直到獲得最佳的治療效果，在 這個時候不再進一步提高劑量。期待的是，用于實踐此處的方法的各種藥物組合物應(yīng)含 有每kg體重約0.01 μ g到約IOOmg (優(yōu)選的約0.1 μ g到約10mg，更優(yōu)選的約0.1 μ g到約 Img)的本發(fā)明的抗體。當施用時，用于本發(fā)明的治療組合物理所當然地是無熱原的、 生理學可接受的形式。除了當前方法的抗體之外也可任選地包括在如上所述的組合物中 的治療有用的試劑，可以替換性地或附加地與本發(fā)明的方法中的組合物同時地或順序地 施用?？梢杂瑟毩⒌尼t(yī)師根據(jù)患者的狀況選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量。參見，例如，F(xiàn)ingl 等，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (最新版本)。
可以分別調(diào)整劑量數(shù)量和間隔以提供足以維持期望的治療效果的活性部分的血漿水平、 或最小有效濃度(MEC)。對于每種化合物MEC將變化，但可以根據(jù)體外數(shù)據(jù)估計；例 如，使用在此描述的化驗達到50-90%生物活性抑制作用所必需的濃度。在此提供的抗體可以單獨地或與其他治療形式組合施用。在此提供的抗體也可 以單獨地或與鑒定為IL-10活性的抑制物的其他抗體或其他免疫抑制試劑組合施用。涉及自身免疫的任何疾病都可以用當前方法治療。優(yōu)選的，可用IL-10特異性 抗體治療的自體免疫疾病的特征在于異常的IL-10表達水平和/或缺乏適合的細胞，即， Thl介導的，反應(yīng)。這種疾病包括，但不限于，全身性紅斑狼瘡(SLE)、免疫性血小板 減少性紫癜(ITC)、狼瘡腎炎、糖尿病、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、類風濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) ο涉及病原體誘導的免疫病理的任何疾病都可以用當前的方法治療。優(yōu)選的，可 用IL-10特異性抗體治療的病原體誘導的免疫病理的特征在于異常的IL-10表達水平和 /或缺乏適合的細胞，即，Thl介導的，反應(yīng)。這種疾病包括，但不限于，HIV、肝炎 C、內(nèi)臟利什曼病(visceral leishmaniasis)、瘧疾、絲蟲病、麻瘋病、肺結(jié)核、念珠菌病和 M.avium 感染。參考以下實施例最好地了解本發(fā)明的寬闊范圍，其不意味著將本發(fā)明限制到特 定的實施方式。F.實施例實施例I. 一般方法描述或參考了一些標準方法，例如，Maniatis等(1982)MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press ； Sambrook 等(1989) MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, (2d ed.), vols.1—3，CSH Press, NY ; Ausubel 等，BIOLOGY, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY;或 Ausubel 等(1987 和增干 Ij ) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene/Wiley, New York。蛋白質(zhì)純化方 法包括這樣的方法，如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶，等。參見，例如， Ausubel 等(1987 和定期的增刊)；Deutscher(1990) “ Guide to Protein Purification " in METH.ENZYMOL.，vol.182,和這套叢書中的其他卷；和關(guān)于蛋白質(zhì)純化產(chǎn)品的使用的 廠家資料，例如 Pharmacia、Piscataway、N.J.或 Bio-Rad，Richmond, CA。結(jié)合重組技 術(shù)容許與合適的片段融合，例如FLAG序列或同等物，其可以通過蛋白酶可除去序列融 合。參見，例如，Hochuli (1990) “ Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) GENETIC ENGINEERING, PRINCIPLE AND METHODS 12 87-98，Plenum Press, N.Y.；和 Crowe 等(1992) QIAEXPRESS : THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEIN PURIFICATION SYSTEM，Qiagen, Inc., Chatsworth, CA。進行計算機序列分析，例如，使用可用的軟件程序，包括來自GCG(U. Wisconsin)和GenBank來源的那些。還使用了公眾的序列數(shù)據(jù)庫，例如來自GenBank等 的。實施例II.抗人類IL-IO抗體的人源化
如以上小節(jié)C中描述的進行大鼠抗人類IL-10抗體12G8的人源化。附圖1顯示 了分配殘基編號和為與檢查的種系序列相同的殘基位置分配相應(yīng)的數(shù)字分值。顯示了對 12G8抗人類IL-10抗體的輕鏈(附圖1A)和重鏈(附圖1B)的12G8可變區(qū)，和對11D8 抗人類IL-10抗體的輕鏈(附圖1C)和重鏈(附圖1D)的可變區(qū)進行的計算。實施例III.杭λ類IL-10杭體12G8的藥物動力學目的在鼠模型中獲得對12F8抗體的體內(nèi)終末半衰期和皮下生物利用率的估 計?？贵w在IOmM醋酸鈉、8%蔗糖、ρΗ 5.25的賦形劑中施用抗體。小鼠Crl CD-I (ICR) BR 雌性小鼠購自 Charles River Laboratories。實驗設(shè)計小鼠接受靜脈內(nèi)(i.v.側(cè)面尾靜脈)或皮下(s.c.頸背部或肩胛中或體 側(cè))單次抗體彈丸注射?？贵w劑量包括0.03、0.3、3.0和30mg/kg每小鼠。觀察小鼠直 到注射后28天。在這個時間周期期間，對小鼠稱重并采取血清樣品。對于12G8(SCH 708980)組(組 1-8)，在注射后 0.5、1、3、6、10、16 小時，第 1、2、3、5、7、10、 14、21和28天，用5只小鼠/時點，采取血清樣品。在賦形劑組(組9)中，僅在注射 前、注射后1小時、14天或21天使用5小鼠/時點采取血清樣品。使用特異性ELISA 測定血清IL-10水平和血清12G8抗體水平。藥物動力學參數(shù)測定。使用WinNonlin Pro v4.0估計或計算所有參數(shù)。對于非 分區(qū)分析，使用Model 200 (SC)或Model 201 (IV)。輸入數(shù)據(jù)是劑量標準化的組算術(shù)平均 濃度-時間數(shù)據(jù)。對于組2-4和6-8，輸入劑量是標稱劑量。對于組1和5，輸入劑量 是0.014mg/kg。對于分區(qū)分析，使用Model 3 (SC)或Model 7 (IV)。輸入數(shù)據(jù)是劑量標 準化的單個動物濃度_時間數(shù)據(jù)。所有匹配對各數(shù)據(jù)點使用均一的權(quán)重(wt = 1)。對于 組2-4和6-8，輸入劑量是標稱劑量。對于組1和5，輸入劑量是0.014mg/kg。使用目 測檢查評估好的匹配，對估計的/計算的參數(shù)、留數(shù)和AIC&SBC指標進行SE的比較。在下表中顯示了給藥溶液回收的概述。表9.體重、劑量水平、給藥溶液濃度的概述(平均值士SD)
權(quán)利要求
1.結(jié)合IL-IO的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQID NO : 11、CDR2 的SEQ ID NO 12和CDR3的SEQ ID NO 13構(gòu)成的組的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列； 禾口至少一個抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自CDRl的SEQIDN0 15、CDR2的 SEQ ID NO 16和CDR3的SEQ ID NO 17的至少一個氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)， 其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類免疫球蛋白氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的抗體，進一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含Y1、 Y 2、Y 3或γ 4人類重鏈恒定區(qū)或其變體。
3.權(quán)利要求1的抗體，進一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或 kappa人類輕鏈恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、 scFv、F(ab，)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQID NO 14的 可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQID NO: 18的 可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
7.結(jié)合IL-IO的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有CDRl的SEQ IDNO : 11、CDR2的SEQ ID NO 12和CDR3的SEQ ID NO 13的至少一個氨基酸序列的多肽；禾口至少一個抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有CDRl的SEQ IDNO : 15、CDR2的SEQ ID NO 16和CDR3的SEQ ID NO 17的至少一個氨基酸序列的多肽。
8.在人類受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受試者以有效阻斷IL-IO的 生物學活性的量施用特異于IL-IO的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是權(quán)利要求1或7 的抗體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫反應(yīng)是體液反應(yīng)。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者患有全身性紅斑狼瘡。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者患有狼瘡腎炎。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者患有HIV。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者患有肝炎C。
15.權(quán)利要求8的方法，進一步包括施用免疫抑制試劑。
16.—種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學上可接受的載體或稀釋劑組合，其 中所述抗體是權(quán)利要求1或7的抗體。
17.編碼權(quán)利要求1或7的多肽的分離的核酸。
18.—種表達載體，包含與控制序列可操作連接的權(quán)利要求17的核酸序列，所述控制 序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞識別。
19.包含權(quán)利要求18的載體的宿主細胞。
20.生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達所述核酸序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求19的宿主細 胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細胞回收所述多肽。
21.—種表達載體，包含與控制序列可操作連接的權(quán)利要求17的核酸序列，所述控制 序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞識別。
22.包含權(quán)利要求21的載體的宿主細胞。
23.生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達所述核酸序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求22的宿主細 胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細胞回收所述多肽。
24.編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQIDNO 21的核酸序 列的輕鏈和具有SEQ ID NO 22的核酸序列的重鏈。
25.權(quán)利要求24的核酸，其中所述輕鏈具有ATCC保藏號PTA-5927，所述重鏈具有 ATCC 保藏號 PTA-5926。
26.編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由權(quán)利要求47的核酸序列編碼。
27.權(quán)利要求26的核酸，其中所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’_SH、Fv、 scFv、F(ab，)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及白細胞介素-10抗體。具體地，在此提供的方法和組合物一般地涉及IL-10特異性抗體和其用途。更具體地說，人源化IL-10特異性抗體的組合物和使用這樣的抗體的方法，用于調(diào)整IL-10的生物學活性，特別是在自體免疫失調(diào)和病原體介導的免疫病理中。
文檔編號A61K38/00GK102010471SQ20101000458
公開日2011年4月13日 申請日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者L·G·普雷斯塔 申請人:先靈公司