專(zhuān)利名稱(chēng)：用于通過(guò)調(diào)整bmp-6來(lái)調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的治療、預(yù)防和改善。本發(fā)明更具體地涉及使用 BMP-6和BMP-6蛋白特異性試劑諸如抗體用于改變?nèi)说难彖F、血清血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容水平的方法。此類(lèi)抗體可用于預(yù)防和治療血色素沉著病和炎癥性貧血的藥物組合物中。
背景技術(shù)：
鐵是幾乎每一種生物體生長(zhǎng)和生存所需要的必需元素。紅細(xì)胞(RBC)含有血紅蛋白(Hb)，其是一種紅色的富鐵蛋白，將氧從肺攜帶至身體的所有肌肉和器官，在此其反應(yīng)而為身體提供其正?；顒?dòng)的能量需求。當(dāng)紅細(xì)胞的數(shù)目或它們含有的血紅蛋白的量降低至正常水平以下時(shí)，身體接收到的氧和產(chǎn)生的能量小于其正常發(fā)揮功能所需要的氧和能量。這種狀況通常稱(chēng)為貧血。在嬰兒和兒童中貧血的常見(jiàn)病因是鐵缺乏。在美國(guó)中多達(dá)20%的兒童和發(fā)展中國(guó)家中多達(dá)80%的兒童在18歲前的某個(gè)時(shí)候?qū)l(fā)生貧血。Martin，P. L.等，The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics (貧血，兒科學(xué)原理和實(shí)踐)，1657 (第二版，Lippincott 1994)。在哺乳動(dòng)物中，鐵平衡主要在十二指腸吸收膳食鐵的水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。在人類(lèi)中， 遺傳性血色素沉著病(HH)是由過(guò)多吸收膳食鐵引起血漿和多個(gè)器官(包括特別地胰腺、肝臟和皮膚)中的鐵過(guò)載并且由于鐵沉積引起這些器官和組織損害而導(dǎo)致的一種常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病。青少年血色素沉著病是由編碼主要的鐵調(diào)節(jié)激素鐵調(diào)素(hepcidin) (HAMP)和血幼素(hemojuvelin) (HFE2)的基因中的突變導(dǎo)致的一種鐵過(guò)載失調(diào)(Roetto，A.，等.2003. Nut. Genet. 33 :21-22 ；Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36 :77-82.)。已經(jīng)顯示血幼素是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)共同受體，且血幼素-介導(dǎo)的BMP信號(hào)調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝(Babitt，J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117 1933-1939.)。然而，鐵調(diào)素的體內(nèi)內(nèi)源性BMP調(diào)節(jié)物還未知。BMP是TGF-β超家族的成員，該超家族由超過(guò)40種配體組成(Sii，Y.和 Massague, J. 2003. Cell 113 =685-700.)。這些生長(zhǎng)因子介導(dǎo)多種多樣的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和圖形化(patterning)。BMP/TGF-β超家族配體通過(guò)與I型和II型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體的復(fù)合物結(jié)合而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大?；罨氖荏w復(fù)合物磷酸化細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白，然后后者轉(zhuǎn)位至核中以調(diào)整基因表達(dá)。近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑在主要的鐵調(diào)節(jié)激素鐵調(diào)素的調(diào)節(jié)中的作用(Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，H 等 JClin Invest. 117 1933-1939 ；Wang，R. H.，等 2005. Cell Metab. 2 :399-409.)。被肝臟分泌后，鐵調(diào)素通過(guò)減少鐵運(yùn)輸因子(exporter)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin)的細(xì)胞表面表達(dá)來(lái)抑制腸的鐵吸收和巨噬細(xì)胞的鐵釋放(Nemeth, E.，等2004. Science. 306 =2090-2093)。通過(guò)施用鐵使鐵調(diào)素上調(diào)(Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276 :7811-7819, Nicolas, G.，等 2002. J.Clin. Invest. 110 :1037-1044 ；Nemeth, Ε.，等 2004.J. Clin. Invest. 113 :1271-1276.)， 而貧血抑制鐵調(diào)素(Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110 :1037-1044)。鐵調(diào)素缺乏和不受抑制的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性是遺傳性鐵過(guò)載失調(diào)遺傳性血色素沉著病的常見(jiàn)發(fā)病機(jī)制，其原因是HAMP本身、HFE2、HFE、TFR2 (編碼2型轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的突變以及罕見(jiàn)的 SCLA0A1 (編碼膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)突變(Pietrangelo, A. 2006. Biochim Biophys Acta 1763 700-710)。鐵調(diào)素還被炎性細(xì)胞因子諸如IL-6上調(diào)，并且鐵調(diào)素過(guò)量與炎癥性貧血的發(fā)病機(jī)制有關(guān)(Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276 :7811-7819，Nicolas，G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110 :1037-1044 ；Nemeth,Ε.，等 2004. J. Clin. Invest. 113 :1271-1276 ；Nemeth,Ε.， 等 2003. Blood. 101 :2461-2463 ；Weiss, G.和 Goodnough, L. Τ. 2005. N. Engl. J. Med. 352 1011-1023 ；Andrews NC. 2008. Blood. 112219-30.)。通過(guò)肝臟特異性條件性敲除共用的BMP/TGF- β細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)Smad4 (Wang, R. H.， 等2005. Cell Metab. 2 :399-409.)，或通過(guò)HFE2 (其編碼BMP共同受體血幼素)的突變 (Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36 :77-82 ；Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 531-539 ；Huang, F. W.，等 J. Clin. Invest. 115 :2187-2191 ；NiederkofIer, V.，Salie, R.， Arber, S. 2005. J Clin Invest. 115 :2180-6)，減少肝臟BMP信號(hào)傳導(dǎo)與不適宜的低鐵調(diào)素表達(dá)和鐵過(guò)載相關(guān)。BMP信號(hào)在體外轉(zhuǎn)錄水平上正向地增加鐵調(diào)素表達(dá)(Babitt，J.L.， 等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，H 等 J Clin Invest. 117 :1933-1939 ； Wang, R. H.，等 2005. Cell Metab. 2 :399-409 ；Truksa, J.，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 :10289-10293 ；Verga Falzacappa, Μ. V.，等 2008. J Mol Med. 86 :531-40.)。在體內(nèi)施用鐵增加肝臟BMP信號(hào)傳導(dǎo)(Yu, P. B.，等2008. Nut Chem Biol. 4 :33-41)。在體內(nèi)施用BMP增加鐵調(diào)素表達(dá)并減少血清鐵(Babitt, J. L.，H等J Clin Invest. 117 :1933-1939)。 相反，在體內(nèi)施用與人免疫球蛋白Fc的Fc部分融合的可溶性血幼素(HJV. Fe)(其選擇性地抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6，但不抑制BMP-7或BMP-9)，在體內(nèi)抑制鐵調(diào)素表達(dá)， 增加膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，動(dòng)員網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞鐵儲(chǔ)備，和增加血清鐵(Babitt，J. L.，等2007. J Clin Invest. 117 :1933-1939.)。施用非選擇性小分子BMP抑制劑Dorsomorphin也在體內(nèi)抑制鐵調(diào)素表達(dá)和增加血清鐵(Yu, P. B.，等2008. Nut Chem Biol. 4 :33-41)。血幼素(也稱(chēng)為RGMc)是蛋白質(zhì)的排斥導(dǎo)向分子(Impulsive Guidance Molecule)家族的成員，包括RGMa和DRAGON (RGMb)，它們共享50-60 %氨基酸同一性 (Samad, Τ· A.，等 2004. J. Neurosci. 24 :2027-2036.)。象血幼素一樣，RGMa (Babitt, J. L.，等 2005. J. Biol. Chem. 280 :29820-29827)和 DRAGON(Samad, Τ· A.，等 2005. J. Biol. Chem. 280 :14122-14129)也起B(yǎng)MP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的共同受體的作用。存在著對(duì)用于調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的低成本的有效方法的需求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了調(diào)整BMP-6的新方法，所述方法用于治療由于鐵調(diào)素缺乏引起的鐵過(guò)載失調(diào)或由于鐵調(diào)素過(guò)量弓I起的炎癥性貧血。本發(fā)明涉及BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物，所述調(diào)節(jié)物在由于鐵調(diào)素缺乏引起的鐵過(guò)載失調(diào)或由于鐵調(diào)素過(guò)量引起的炎癥性貧血的治療中發(fā)揮作用。本發(fā)明涉及一種用于調(diào)節(jié)受試者中鐵穩(wěn)態(tài)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述有效量以足以改變所述受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)、血紅蛋白水平和 /或血細(xì)胞比容水平的水平來(lái)調(diào)整BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)。在一些方面，所述組合物的施用減少 BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)。在一些方面，所述組合物包含能夠結(jié)合BMP-6的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 幻處結(jié)合BMP-6。在一些方面，所述試劑是抗體。在一些方面，所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。在某些具體實(shí)施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. Hi s。在其他方面，所述抗體通過(guò)在與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合BMP-6的結(jié)構(gòu)域無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)域處結(jié)合BMP-6來(lái)抑制BMP-6 活性。在某些具體的實(shí)施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. His。本發(fā)明涉及其中化合物的施用減少血幼素-介導(dǎo)的對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)的方法。 在一些方面，所述試劑以足以抑制血幼素和BMP-6之間的相互作用的量施用。在一些方面，所述試劑優(yōu)選地對(duì)人BMP-6的表達(dá)或活性的抑制超過(guò)對(duì)BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或 BMP-9的抑制。在一些方面，所述試劑結(jié)合BMP-6的親和性比結(jié)合BMP-7的親和性大至少5 倍。本發(fā)明提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致受試者中的血清鐵水平增加或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度增加。本發(fā)明還提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致血紅蛋白或血細(xì)胞比容水平增加。本發(fā)明提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)的增加。在一些方面，所述組合物包含能夠增加血清BMP-6水平的試劑。在一些方面，所述試劑增加 BMP-6表達(dá)水平。本發(fā)明提供了治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀，所述癥狀選自增加的血清鐵水平、增加的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、減少的鐵調(diào)素表達(dá)、減少的脾鐵儲(chǔ)備、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和組織鐵過(guò)載。本發(fā)明提供了施用該組合物的方法，其減小BMP-6的表達(dá)水平。在一些方面，所述組合物包含能夠抑制BMP-6基因表達(dá)的試劑，其中所述試劑為反義DNA、siRNA、干擾RNA、微小RNA(miRNA)或反義RNA，且其中BMP-6表達(dá)的減少足以增加所述受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。本發(fā)明提供了一種分離的單克隆抗體，其特異性地結(jié)合人BMP-6，其中所述人 BMP-6由SEQ ID NO=I中所示的氨基酸序列組成，并且所述結(jié)合抑制BMP-6的鐵調(diào)節(jié)活性， 并且提供了包含所述分離的單克隆抗體的組合物，所述組合物包含足以增加受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的量的抗體。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制可溶性人血幼素蛋白與BMP-6的結(jié)合，從而將與BMP-6的結(jié)合減少25% -100%。 在某些具體實(shí)施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. His。在更具體的實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制BMP-6與抗BMP-6抗體的結(jié)合達(dá)25% -100%，所述抗BMP-6抗體選自R&D Systems的針對(duì)人BMP-6的單克隆抗體，MAB507 (克隆74219) ；R&Dsystems的針對(duì)BMP-6的多克隆抗體，AF507 (lot CXL04A)；和Santa Cruz多克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體在與結(jié)合HJV. Fc的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域處結(jié)合BMP-6。本發(fā)明還提供了抗BMP-6抗體諸如人抗體，由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、 單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體、maxibody和納米抗體。在一些方面，分離的單克隆抗體結(jié)合人BMP-6和鼠BMP-6兩者。本發(fā)明還提供了分離的核酸分子和表達(dá)載體，所述核酸分子包含編碼抗BMP-6抗體的核苷酸序列，所述表達(dá)載體包含與調(diào)控序列可操作地連接的所述核酸分子。本發(fā)明還提供了一種使用包含要求保護(hù)的載體或核酸分子的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括在合適的條件下培養(yǎng)要求保護(hù)的宿主細(xì)胞使得表達(dá)所述核酸以產(chǎn)生所述抗體。本發(fā)明還提供了通過(guò)施用治療有效量的(a)足夠以足以改變鐵穩(wěn)態(tài)、血紅蛋白水平和/或血細(xì)胞比容水平的水平調(diào)整BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)的藥物組合物和(b)紅細(xì)胞生成刺激物來(lái)治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀。示例性的紅細(xì)胞生成刺激物包括促紅細(xì)胞生成素、促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)劑變體、以及結(jié)合和活化促紅細(xì)胞生成素受體的肽或抗體。紅細(xì)胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯汀(印oetin alfa), β 依泊汀(epoetin beta), δ 依泊汀(epoetin delta), ω 依泊汀(epoetin omega), ι依泊汀(印oetin iota), ζ依泊汀(印oetin zeta)和它們的類(lèi)似物，模擬肽 (mimetic ρ印tide)、模擬抗體(mimetic antibody)和HIF抑制劑(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)2005/0020487，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并)。具體地，促紅細(xì)胞生成素包括，但不限于，如下列專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)中公開(kāi)的促紅細(xì)胞生成素分子或其變體或類(lèi)似物美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，703，008 ；5，441，868 ；5，547，933 ；5，618，698 ；5，621，080 ；5，756，349 ；5，955，422 和 5,856,298 ；和 WO 91/05867 ；WO 95/05465 ；WO 00/24893 和 WO 01/81405，每一篇專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用合并入本文中。在某些示例性實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成刺激物選自由人促紅細(xì)胞生成素和α達(dá)貝泊汀(darb印oetin)組成的組。本發(fā)明還提供了一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括(a)使來(lái)自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人 BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的在所述樣品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。本發(fā)明還提供了一種監(jiān)測(cè)其中施用BMP-6拮抗劑的治療的方法，所述方法包括
(a)使來(lái)自已經(jīng)施用了BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在
(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。在一些方面，所述拮抗劑是抗體或小分子。本發(fā)明還提供了一種治療具有升高的鐵水平或患有貧血的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法通過(guò)施用調(diào)整BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)的藥物組合物進(jìn)行。本發(fā)明還提供了一種用于治療與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的失調(diào)的試劑盒，所述試劑盒包含制品，所述制品包括包含抗BMP-6抗體的小瓶或預(yù)充式注射器。本發(fā)明還提供了一種篩選與人BMP-6結(jié)合的化合物的方法，該方法包括使候選化合物與包含生物活性BMP-6的組合物接觸，和檢測(cè)所述候選化合物和所述組合物中的人BMP-6之間的復(fù)合物，其中檢測(cè)到復(fù)合物指示所述候選化合物與人BMP-6的結(jié)合，并且進(jìn)一步其中所述候選化合物將BMP-6與HJV. Fc的結(jié)合抑制至少25%。本發(fā)明還提供了一種生成針對(duì)人BMP-6的抗體的方法，該方法包括將免疫球蛋白生成細(xì)胞與包含SEQ ID NO :1的BMP-6序列或其變體的多肽接觸，并分離由所述細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了一種用于治療缺鐵性失調(diào)的組合物，其包含特異性結(jié)合BMP-6和 HJV. Fc的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制可溶性人血幼素綴合物(HJV. Fe)蛋白與BMP-6的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制可溶性人血幼素綴合物(HJV. Fe)蛋白與BMP-6的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合BMP-6上的與結(jié)合HJV. Fc的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體的量足以將HJV. Fc與BMP-6的結(jié)合減小 25% -100%。優(yōu)選地，抗體選自由RandD系統(tǒng)單克隆抗體、RandD系統(tǒng)多克隆抗體和Santa Cruz多克隆抗體組成的組。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體是人抗體。在其他實(shí)施方案中， 所述抗體選自由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體(diabodyhmaxibody和納米抗體組成的組。本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼特異性結(jié)合BMP-6的抗體的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種包含與調(diào)控序列可操作地連接的此核酸分子的表達(dá)載體。 本發(fā)明還提供了包含權(quán)利要求31所述的載體或權(quán)利要求30所述的核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種使用權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)該權(quán)利要求所述的宿主細(xì)胞使得所述核酸表達(dá)以產(chǎn)生所述抗體。本發(fā)明還提供了一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括使來(lái)自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6 結(jié)合的條件下接觸；和定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的所述樣品中 BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。本發(fā)明還提供了一種監(jiān)測(cè)其中施用BMP-6拮抗劑的治療的方法，所述方法包括 使來(lái)自已經(jīng)施用了 BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。在具體的實(shí)施方案中，所述拮抗劑是抗體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述拮抗劑是小分子。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人BMP-6的抗體，其中在一定濃度的包含 TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗體被競(jìng)爭(zhēng)不與人 BMP-6特異性結(jié)合。本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO 3)的任何5個(gè)連續(xù)氨基酸的抗體。在具體的實(shí)施方案中，所述抗體特異性地結(jié)合TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO 3)的6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸。在下面的發(fā)明詳述和附圖以及實(shí)施方案中，本發(fā)明和本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢(shì)將變得進(jìn)一步顯而易見(jiàn)。


圖1A-1D顯示DRAGON. Fc選擇性地抑制BMP對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)的證據(jù)；圖2A-2G顯示在小鼠中施用DRAGON. Fc不影響鐵調(diào)素表達(dá)或鐵代謝的證據(jù)；圖3A-3D顯示特異性中和BMP-6的抗體在體內(nèi)抑制肝臟鐵調(diào)素表達(dá)和增加血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的證據(jù)；圖4A-4H顯示Bmp6敲除小鼠顯示減少的肝臟鐵調(diào)素表達(dá)、增加的脾膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、增加的肝臟鐵含量和減少的脾鐵含量的證據(jù)；圖5A-5C顯示在小鼠中施用BMP-6增加鐵調(diào)素mRNA表達(dá)和減少血清鐵的證據(jù)；圖 6 是對(duì) BMP-6 的 Western 印跡；圖7是對(duì)HJV的Western印跡；圖 8 是對(duì) hBMP-6 的 Western 印跡。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)BMP-6是鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的重要調(diào)節(jié)物。與可溶性血幼素(HJV. Fe)相比，同源的DRAGON. Fc融合蛋白在體外是對(duì)BMP-2和BMP-4產(chǎn)生的鐵調(diào)素啟動(dòng)子活化的較為有效的抑制劑，但是為BMP-6的不太有效的抑制劑。在體內(nèi)， DRAGON. Fc對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝沒(méi)有作用，而HJV. Fc或特異性中和BMP-6的抗體抑制鐵調(diào)素表達(dá)并增加血清鐵。此外，Bmp6敲除小鼠具有類(lèi)似遺傳性血色素沉著病的表型，其具有減少的鐵調(diào)素表達(dá)、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、減少的脾鐵儲(chǔ)備和組織鐵過(guò)載。本發(fā)明人顯示在小鼠中施用BMP-6增加鐵調(diào)素表達(dá)并減少血清鐵。 總之，這些數(shù)據(jù)支持了 BMP-6作為體內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物的關(guān)鍵作用。特異性中和BMP-6的抗體的施用導(dǎo)致增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，表明對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的作用。通過(guò)siRNA或中和抗體抑制內(nèi)源性BMP-6抑制血幼素-介導(dǎo)的對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)。BMP-6可能是血幼素的配體。此外，發(fā)現(xiàn)添加外源性BMP-6增加鐵調(diào)素表達(dá)并導(dǎo)致血清鐵和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的劑量依賴(lài)性減少。pro-BMP-6的氨基酸序列顯示在下表1中
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)受試者中鐵穩(wěn)態(tài)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述有效量足夠以足以改變所述受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)的水平來(lái)調(diào)整BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物的施用減少BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含能夠結(jié)合BMP-6的試劑。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述試劑在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO 3)內(nèi)結(jié)合BMP-6。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述試劑是抗體。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體結(jié)合BMP-6上的與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
10.權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述化合物的施用減少血幼素-介導(dǎo)的對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)。
11.權(quán)利要求3-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑以足以抑制血幼素和BMP-6之間的相互作用的量施用。
12.權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑優(yōu)選地對(duì)人BMP-6的抑制超過(guò)對(duì) BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7 或 BMP-9 的抑制。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述試劑結(jié)合BMP-6的親和性比結(jié)合BMP-7的親和性大至少5倍。
14.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用導(dǎo)致所述受試者中的血清鐵水平增加。
15.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用導(dǎo)致所述受試者中的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度增加。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物的施用增加BMP-6信號(hào)傳導(dǎo)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述組合物包含能夠增加血清BMP-6水平的試劑。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述試劑增加BMP-6表達(dá)水平。
19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀，所述癥狀選自下列各項(xiàng)組成的組增加的血清鐵水平、增加的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、 減少的鐵調(diào)素表達(dá)、減少的脾鐵儲(chǔ)備、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和組織鐵過(guò)載。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試劑以足以減輕與遺傳性血色素沉著病相關(guān)的至少一種癥狀的量施用。
21.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用減小BMP-6的表達(dá)水平。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物包含能夠抑制BMP-6基因表達(dá)的試劑。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑為siRNA、miRNA或反義RNA。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中BMP-6表達(dá)的減少足以增加所述受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。
25.一種用于治療缺鐵性失調(diào)的組合物，其包含特異性結(jié)合BMP-6的抗體。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO 3)內(nèi)結(jié)合BMP-6。
27.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
29.權(quán)利要求25所述的組合物，所述抗體結(jié)合BMP-6上的與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。
30.權(quán)利要求四所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
31.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體的量足以將HJV.Fc與BMP-6的結(jié)合減少 25% -100%。
32.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體選自由RandD系統(tǒng)單克隆抗體mAb507、 RandD系統(tǒng)多克隆抗體和Santa Cruz多克隆抗體組成的組。
33.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體是人抗體。
34.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體選自由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體、maxibody和納米抗體組成的組。
35.一種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求25的抗體的核苷酸序列。
36.一種表達(dá)載體，其包含與調(diào)控序列可操作地連接的權(quán)利要求35所述的核酸分子。
37.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求30所述的載體或權(quán)利要求36所述的核酸分子。
38.一種使用權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞，使得所述核酸表達(dá)以產(chǎn)生所述抗體。
39.權(quán)利要求25所述的組合物，其還包含藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
40.一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括(a)使來(lái)自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中在(b)中所定量的所述樣品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。
41.一種監(jiān)測(cè)其中施用BMP-6拮抗劑的療法的方法，所述方法包括(a)使來(lái)自已經(jīng)施用了BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述拮抗劑是抗體。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述拮抗劑是小分子。
44.一種治療需要治療鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的方法，其包括向所述受試者施用權(quán)利要求25的單克隆抗體。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)是貧血。
46.一種篩選與人BMP-6結(jié)合的化合物的方法，其包括使候選化合物與包含生物活性BMP-6的組合物接觸，和檢測(cè)所述候選化合物和所述組合物中的人BMP-6之間的復(fù)合物，其中檢測(cè)到復(fù)合物指示所述候選化合物與人BMP-6的結(jié)合，并且進(jìn)一步其中所述候選化合物將BMP-6與HJV. Fc的結(jié)合抑制至少25%。
47.一種特異性結(jié)合人BMP-6的抗體，其中在一定濃度的包含TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗體被競(jìng)爭(zhēng)不與人BMP-6特異性結(jié)合。
48.一種特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的任何5個(gè)連續(xù)氨基酸的抗體。
49.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何6個(gè)連續(xù)氨基酸。
50.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何7個(gè)連續(xù)氨基酸。
51.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何8個(gè)連續(xù)氨基酸。
52.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何9個(gè)連續(xù)氨基酸。
53.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何10個(gè)連續(xù)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)調(diào)整BMP-6活性來(lái)調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。提供了使用BMP-6和BMP-6蛋白特異性試劑諸如抗體用于改變?nèi)搜彖F水平的方法。此類(lèi)抗體可用于預(yù)防和治療血色素沉著病和炎癥性貧血的藥物組合物中。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102215869SQ200980145449
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者H·林, 朱迪·巴比特 申請(qǐng)人:通用醫(yī)療公司