專利名稱：Fgf21突變體及其用途的制作方法
FGF21突變體及其用途本申請(qǐng)要求2008年6月4日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/058，861、2008年6 月4日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/058，919、2009年3月27日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申 請(qǐng)?zhí)?1/164，364和2009年3月5日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/175，736的優(yōu)先權(quán)，各 臨時(shí)申請(qǐng)通過引用其整體結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及編碼FGF21突變體多肽的核酸分子、FGF21突變體多肽、包含F(xiàn)GF21突 變體多肽的藥物組合物和使用這類核酸、多肽或藥物組合物用于治療代謝紊亂的方法。2.
背景技術(shù)：
FGF21是屬于包括FGF19、FGF21和FGF23的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)亞家族的 分泌多肽(Itoh等，2004，Trend Genet. 20 :563-69)。FGF21是非典型的FGF，因?yàn)樗灰蕾?于肝素，并且在葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝的調(diào)節(jié)中起激素的作用。從肝cDNA文庫中分離出作為肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰腺中高表達(dá)，并且 是主要在肝中表達(dá)的FGF家族的唯一成員。過量表達(dá)FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠具有生長(zhǎng)速率緩 慢、血漿葡萄糖和甘油三酯水平低下的代謝表型，并且不存在年齡相關(guān)性2型糖尿病、胰島 增大和肥胖癥。在嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類模型中藥物性給予重組FGF21蛋白導(dǎo)致血漿葡萄糖水 平正?；?、甘油三酯和膽固醇水平降低以及葡萄糖耐量和胰島素敏感性得到改善。另外， FGF21通過增加能量消耗、體力活動(dòng)和代謝率而減輕體重和體脂肪。實(shí)驗(yàn)研究為藥物性給予 FGF21以治療人的2型糖尿病、肥胖癥、脂血癥和其它代謝狀況或代謝紊亂提供了支持。人FGF21具有短的體內(nèi)半壽期。在小鼠中，人FGF21的半壽期為1_2小時(shí)，在獼猴 中，半壽期為2. 5-3小時(shí)。在開發(fā)在2型糖尿病的治療中用作藥物的FGF21蛋白時(shí)，可能需 要延長(zhǎng)半壽期。具有半壽期延長(zhǎng)的FGF21蛋白可允許較低頻率地給予待給予該蛋白質(zhì)的患 者。本文中描述了這類蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本公開內(nèi)容提供包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的分離多肽，其還包含用任何氨 基酸對(duì)以下氨基酸殘基的取代45位上的丙氨酸殘基、86位上的亮氨酸殘基、98位上的亮 氨酸殘基、111位上的丙氨酸殘基、129位上的丙氨酸殘基、170位上的甘氨酸殘基、171位上 的脯氨酸殘基或在172位上的絲氨酸殘基，及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽包含用 任何氨基酸對(duì)以下氨基酸殘基的取代98位上的亮氨酸殘基，171位上的脯氨酸殘基或98 位上的亮氨酸殘基和171位上的脯氨酸殘基兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽包含用 任何氨基酸取代98位上的亮氨酸殘基和171位上的脯氨酸殘基兩者。本公開內(nèi)容還提供包含具有以下氨基酸取代的SEQ ID NO :4的氨基酸序列的分 離多肽(a)是以下的至少一個(gè)氨基酸取代(i) 19位上的谷氨酰胺、異亮氨酸或賴氨酸殘 基；(ii) 20位上的組氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；(iii) 21位上的異亮氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸或纈氨酸殘基；(iv) 22位上的異亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(ν) 150位上的丙氨 酸或精氨酸殘基；(vi) 151位上的丙氨酸或纈氨酸殘基；(vii)在152位上的組氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(viii) 170位上的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸或絲氨酸殘基；(ix) 171位上的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨 酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸 殘基；(χ) 172位上的亮氨酸或蘇氨酸殘基；或(xi) 173位上的精氨酸或谷氨酸殘基；和(b) 是以下的至少一個(gè)氨基酸取代(i)沈位上的精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(ii) 45位上的 精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(iii) 52位上的蘇氨酸殘基；(iv) 58位上 的半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸或絲氨酸殘基；(ν) 60位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸 殘基；(vi) 78位上的丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸或組氨酸殘基；(vii)86位上的半胱氨酸或 蘇氨酸殘基；(viii)88位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸或絲氨酸殘基；(ix)98位上 的精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(x)99位上的精氨酸、天冬 氨酸、半胱氨酸或谷氨酸殘基；(xi) 111位上的賴氨酸或蘇氨酸殘基；(χ ) 129位上的精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸或賴氨酸殘基；或(xiii) 134位上的精 氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸或酪氨酸殘基；以及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，98位上的殘 基為精氨酸，且171位上的殘基為脯氨酸，在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可包含與SEQID NO 4 的氨基酸序列有至少85%同一性的氨基酸序列，但其中(a) (i)-(xi)和(b) (i)-(xiii)的 至少一個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一步修飾。本公開內(nèi)容還另提供包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的分離多肽，其具有是以 下的至少一個(gè)氨基酸取代(a) 19位上的谷氨酰胺、賴氨酸或異亮氨酸殘基；(b) 20位上 的組氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；(c)21位上的異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或纈氨酸殘 基；(d) 22位上的異亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(e) 150位上的丙氨酸或精氨酸殘基； (f) 151位上的丙氨酸或纈氨酸殘基；(g) 152位上的組氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘 基；(h) 170位上的丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或脯氨酸殘基；(i) 171位上的丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、色氨酸或酪氨酸殘基；(j) 172位上的亮氨酸殘基；或(k) 173位上的精氨酸或谷氨酸 殘基；以及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，171位上的殘基為脯氨酸，在另一個(gè)實(shí)施方案中，多 肽可包含與SEQ ID NO :4的氨基酸序列有至少85%同一性的氨基酸序列，但其中(a)-(k) 的至少一個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一步修飾。本公開內(nèi)容另提供包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的分離多肽，其具有是以下的 至少一個(gè)氨基酸取代(a) 26位上的精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(b)45位上的精氨酸、谷 氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(c) 52位上的蘇氨酸殘基；(d) 58位上的谷氨酸、甘 氨酸或絲氨酸殘基；(e) 60位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(f) 78位上的丙氨 酸、精氨酸或組氨酸殘基；(g) 88位上的丙氨酸殘基；(h)98位上的精氨酸、谷氨酸、谷氨酰 胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(i)99位上的精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或谷氨酸殘基；(j) 111 位上的賴氨酸或蘇氨酸殘基；(k) 129位上的精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰 胺、組氨酸或賴氨酸殘基；或(1)134位上的精氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸或酪氨酸殘基； 以及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，98位上的殘基為精氨酸，在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可包 含與SEQ ID NO :4的氨基酸序列有至少85%同一性的氨基酸序列，但其中(a)-(l)的至少 一個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一步修飾。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開的多肽還可包含是以下的至少一個(gè)氨基酸取代(a) 179位上的苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸；(b) 180位上的谷氨酸、甘氨酸、 脯氨酸或絲氨酸；或(c) 181位上的賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸或脯氨酸，且還 可包含1-10個(gè)與多肽的C端融合的氨基酸殘基，并且可以是任何氨基酸，例如一個(gè)或多個(gè) 選自甘氨酸、脯氨酸及其組合的殘基。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開的多肽可包含(a)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基 端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其 中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；或(c)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短和不超過12 個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖。在一些實(shí)施方案中，本文所公開的多肽可與一個(gè)或多個(gè)聚合物(例如PEG)共價(jià) 連接。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可任選通過接頭(例如GGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO 23))與異源氨基酸序列融合。異源氨基酸序列可以是IgG恒定結(jié)構(gòu)域或其片段，例如 SEQID NO :13的氨基酸序列。本文公開的這類融合多肽還可形成多聚體。本公開內(nèi)容還提供包含本文公開的多肽和藥學(xué)上可接受的調(diào)制劑(formulation agent)的藥物組合物。這類藥物組合物可用于治療代謝紊亂的方法，所述方法包括給予有 需要的病人本發(fā)明的藥物組合物?？梢灾委煹拇x紊亂包括糖尿病和肥胖癥。本文還提供編碼本文公開的多肽的分離核酸分子，以及包含這類核酸分子的載體 和包含這類核酸分子的宿主細(xì)胞。本文還公開了 SEQ ID NO 4的多肽的截短形式。在多個(gè)實(shí)施方案中，多肽可包含 (a)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過 12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；或(c)不超過8個(gè)氨 基酸殘基的氨基端截短和不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中多肽能夠降低哺乳 動(dòng)物的血糖。本公開內(nèi)容另提供可包含以下序列的分離融合蛋白(a) IgG恒定結(jié)構(gòu)域；(b)與 IgG恒定結(jié)構(gòu)域融合的接頭序列；和(c)與接頭序列融合并且包含SEQ ID NO :4的氨基酸 序列的FGF21突變體，其中精氨酸殘基取代了 98位上的亮氨酸殘基且甘氨酸殘基取代了 171位上的脯氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭序列可包含GGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)，在另一個(gè)中，IgG恒定結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID N0:13。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭序列 包含GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO :2；3)，IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO: 13的氨基酸序列。 在另外又一個(gè)實(shí)施方案中，接頭的N端與IgG恒定結(jié)構(gòu)域的C端融合，且FGF21突變體的N 端與接頭的C端融合。所公開的融合蛋白可形成多聚體。在多個(gè)融合蛋白的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21突變體組分可包含是以下的至少一個(gè)氨基 酸取代(a) 179位上的苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸；(b) 180位上的谷氨酸、 甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；或(c)181位上的賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸或脯氨 酸，且還可包含1-10個(gè)與FGF21突變體的C端融合的氨基酸殘基，1-10個(gè)氨基酸殘基可以 是任何氨基酸，例如，一個(gè)或多個(gè)選自甘氨酸、脯氨酸及其組合的殘基。在另外又一個(gè)融合蛋白的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21突變體組分可包含(a)不超過8個(gè) 氨基酸殘基的氨基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過12個(gè)氨基酸殘 基的羧基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；或(c)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基 端截短和不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖。在另
9一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白的FGF21突變體組分可包含與SEQ ID NO 4的氨基酸序列有至 少85%同一性的氨基酸序列，但其中精氨酸和甘氨酸殘基不被進(jìn)一步修飾。本公開內(nèi)容還提供包含本文公開的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的調(diào)制劑的藥物組 合物。這類藥物組合物可用于治療代謝紊亂的方法，所述方法包括給予有需要的病人本發(fā) 明的藥物組合物?？梢灾委煹拇x紊亂包括糖尿病和肥胖癥。本文還提供編碼本文公開的融合蛋白的分離核酸分子，以及包含這類核酸分子的 載體和包含這類核酸分子的宿主細(xì)胞。從下面某些實(shí)施方案和權(quán)利要求書的更詳細(xì)的說明來看，本發(fā)明的具體實(shí)施方案 將是顯而易見的。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1B表示FGF21截短突變體7-181和8-181(圖1A)及FGF21截短突變體 1-172、1-171、1-169和1-164(圖1B)的ELK-螢光素酶活性測(cè)定結(jié)果；各圖表示所得到的 對(duì)于人FGF21對(duì)照的結(jié)果。圖 2 表示人 FGF21 對(duì)照及 FGF21 截短突變體 3-181、4-181、5-181、7-181、8_181、 1-180、1-178、1-177、1-176、1-175、1-174、1-173、1-172、9-181 和 1-149 的 ELK-螢光素酶活 性測(cè)定結(jié)果。圖3表示在注射PBS (實(shí)心條形柱)、人FGF21對(duì)照(空心條形柱)或FGF21截短 突變體8-181 (灰色條形柱)和9-181 (點(diǎn)狀條形柱)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖4表示在注射PBS (實(shí)心圓)、Fc_FGF21對(duì)照(WT)(空心圓)或者包含氨基酸殘 基5-181(實(shí)心三角)或7-181(空心三角)的截短FC-FGF21融合蛋白的小鼠中測(cè)定的血 糖水平變化百分比。圖5表示在注射PBS (實(shí)心圓)、FGF21_Fc對(duì)照(WT)(空心圓)、包含殘基1-175的 截短FGF21-FC融合蛋白(實(shí)心三角)或包含氨基酸殘基1-171的截短Fc_FGF21蛋白(空 心三角)的小鼠中測(cè)定的血糖水平變化百分比。圖6A-6D表示人Fc (5) FGF21對(duì)照樣品(圖6A)和注射后6小時(shí)(樣品D6 ；圖6B)、 24小時(shí)(樣品D24 ；圖6C)和48小時(shí)(樣品D48 ；圖6D)從小鼠中抽取的Fc(5)FGF21樣品 的液相層析法-質(zhì)譜法(LC-MQ分析結(jié)果。圖7A-7D表示哺乳動(dòng)物衍生的人FGF21 (3)Fc對(duì)照樣品(圖7A)和注射后6小時(shí) (樣品E6 ；圖7B)、24小時(shí)(樣品EM ；圖7C)和48小時(shí)(樣品E48 ；圖7D)從小鼠中抽取 的FGF21 (3)Fc樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖8A-8D表示Fc (15)FGF21對(duì)照樣品(圖8A)和注射后6小時(shí)(圖8B)、24小時(shí) (圖8C)和48小時(shí)(圖8D)從小鼠中抽取的Fc(15)FGF21樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖9A-9D表示FGF21 (15)Fc對(duì)照樣品(圖9A)和注射后6小時(shí)(圖9B)、24小時(shí) (圖9C)和48小時(shí)(圖9D)從小鼠中抽取的FGF21 (15)Fc樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖 10A-10B 表示由注射入小鼠的 Fc(15)FGF21(圖 10A，SEQ IDNO 24)和 FGF21(15)Fc(圖10B, SEQ ID NO 25)融合蛋白的LC-MS分析而鑒定出的切割位點(diǎn)。圖11表示在注射PBS(實(shí)心條形柱)、Fc(15)FGF21(空心條形柱)或者Fc(15) FGF21 突變體 Fc (15) FGF21 G170E (灰色條形柱)、Fc (15) FGF21P171A (點(diǎn)狀條形柱)、Fc (15) FGF21S172L (空心斜線交叉條形柱)、Fc (15) FGF21G170E/P171A/S172L (實(shí)心水平交叉條形柱)或Fc(15)FGF21G151A(空心斜線交叉條形柱)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖12表示在注射PBS(實(shí)心圓)、Fc(15)FGF21(空心圓)或者Fc (15) FGF21突變體 Fc(15)FGF21G170E (實(shí)心三角)、Fc (15) FGF21P 171A (空心三角)、Fc (15) FGF21S 172L (實(shí) 心菱形)>Fc(15)FGF21G170E/P171A/S172L(空心菱形)或 Fc (15) FGF21G151A (實(shí)心方形) 的小鼠中測(cè)定的血糖水平變化百分比。圖13表示在注射PBS (實(shí)心條形柱)、Fc (15) FGF21(空心條形柱)或者Fc (15) FGF21 突變體？(3(15汗6 2卟15(^/615認(rèn)/1152￥(灰色條形柱)1(；(15汗6 21617(^(空心斜 線交叉條形柱)、Fc (15) FGF21G170E/P171A (灰色斜線交叉條形柱)或Fc (15) FGF21G170E/ S172L(空心斜線交叉條形柱)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖14表示在注射PBS (實(shí)心方形)、Fc(15)FGF21(空心方形)或者Fc (15) FGF21 突變體Fc (I5) FGF2IPl5OAAn5IAAl52V (實(shí)心倒三角)、Fc (I5) FGF2IGl7OE (空心倒三角)、 Fc(15)FGF21G170E/P171A(實(shí)心圓)或 Fc (15) FGF21G170E/S172L (空心圓)的小鼠中測(cè)定 的血糖水平變化百分比。圖15表示在注射PBS(實(shí)心條形柱)或者Fc(15)FGF21突變體Fc(15) FGF21G170E (空心條形柱)、Fc (15) FGF21G170A (灰色條形柱)、Fc (15) FGF21G170C (空心交 叉條形柱)、Fc (15) FGF21G170D (灰色與白色條形柱)、Fc (15) FGF21G170N(實(shí)心交叉條形 柱)或Fc(M)FGF21G170S(空心交叉條形柱)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖16表示在注射PBS (實(shí)心圓)或者Fc(15)FGF21突變體Fc(15)FGF21G170E (空 心圓)、Fc(15)FGF21G170A(實(shí)心三角)、Fc (15) FGF21G170C (空心三角),Fc (15) FGF2IGl7OD (實(shí)心菱形)、Fc (I5)FGF2IGl7OM 空心菱形)或 Fc (I5) FGF2IGl7OS (實(shí)心倒三 角)的小鼠中測(cè)定的血糖水平變化百分比。圖17表示在注射PBS(實(shí)心條形柱)或者Fc(15)FGF21突變體Fc(15) FGF21G170E (空心條形柱)、Fc (15)FGF21P171E (灰色條形柱)、Fc (15)FGF21P171H(實(shí)心交 叉條形柱)、？(3(巧汗6 21 1710(空心交叉條形柱)、？((巧汗6 21 17111(點(diǎn)狀條形柱)或 Fc(15)FGF21P171Y(灰色交叉條形柱)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖18表示在注射PBS (實(shí)心圓)或者Fc(15)FGF21突變體Fc(15)FGF21G170E (空 心圓)、Fc(15)FGF21P171E(實(shí)心三角)、Fc (15)FGF21P171H(空心三角)、Fc (15) FGF21P171Q (實(shí)心菱形)、Fc (15) FGF21P171T (空心菱形)或 Fc (15) FGF21P171Y (實(shí)心方形) 的小鼠中測(cè)定的血糖水平變化百分比。圖19A-19D表示Fc(15)FGF21對(duì)照樣品(圖19A)和注射后6小時(shí)(圖19B)、24 小時(shí)(圖19C)和48小時(shí)(圖19D)從小鼠中抽取的樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖20A-20D表示Fc(15)FGF21G170E對(duì)照樣品(圖20A)和注射后6小時(shí)(圖20B)、 24小時(shí)(圖20C)和48小時(shí)(圖20D)從小鼠中抽取的Fc (15)FGF21G170E樣品的LC-MS分 析結(jié)果。圖2認(rèn)_210表示？((15汗6 2卟17認(rèn)對(duì)照樣品(圖21A)和注射后6小時(shí)(圖21B)、 24 (圖21C)和48小時(shí)(圖21D)從小鼠中抽取的Fc (15)FGF21P171A樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖22A-22D表示Fc(15)FGF21S172L對(duì)照樣品(圖22A)和注射后6小時(shí)(圖22B)、 24小時(shí)(圖22C)和48小時(shí)(圖22D)從小鼠中抽取的Fc (15) FGF21S172L樣品的LC-MS分析結(jié)果。圖 23A-23D 表示由注射入小鼠中的 Fc(15)FGF21(圖 23A，SEQ IDNO :24)、Fc (15) FGF21G170E (圖 23B，SEQ ID NO :26)、Fc (15) FGF21P171A (圖 23C，SEQ ID NO :27)和 Fc (15) FGF21S172L(圖23D，SEQID NO 28)融合蛋白的LC-MS分析而鑒定出的切割位點(diǎn)。圖 24A-24C 表示 FGF21 突變體 FGF21L99R、FGF21L99D 和 FGF21A111T (圖 24A)； FGF21 突變體 FGF21A129D、FGF21A129Q 和 FGF21A134K (圖 24B)；以及 FGF21 突變體 FGF21A134Y, FGF21A134E和FGF21AU9K(圖MC)的ELK-螢光素酶活性測(cè)定結(jié)果；各圖表 示所得到的對(duì)于人FGF21對(duì)照的結(jié)果。圖 25A-2OT 表示 Fc-FGF21 突變體 Fc_FGF21P171G、Fc_FGF21P171S 和 Fc-FGF21P171T(圖 25A) ；Fc_FGF21 突變體 Fc_FGF21P171Y、Fc_FGF21P171W 禾口 Fc-FGF21P171C(圖 25B) ；Fc (15)FGF21、Fc (15) FGF21A45K/G170E 和 FGF21A45K(圖 25C)； &&Fc(15)FGF21、Fc(15)FGF21P171E*Fc(15)FGF21A45K/G170E(圖 25D)的 ELK-螢光素 酶活性測(cè)定結(jié)果；各圖表示所得到的對(duì)于人FGF21對(duì)照的結(jié)果。圖26A-B表示野生型成熟FGF21和各種FGF21突變體隨時(shí)間而變化的聚集；圖 26A表示將65mg/mL蛋白質(zhì)在4°C下溫育1天、2天和4天后FGF21對(duì)照(WT，實(shí)心菱形) 和FGF21A45K(實(shí)心圓)的聚集變化百分比，而圖26B表示將65mg/mL蛋白質(zhì)在4°C下溫育 1 天、6 天和 10 天后 FGF21 對(duì)照(WT)和 FGF21P78C、P78R、L86T、L86R、L98C、L98R、A111T、 A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y和A134E (在圖中均有標(biāo)記)的聚集變化百分比。圖 27 表示人 FGF21 對(duì)照和 FGF21 突變體 FGF21A45K、FGF21L52T 和 FGF21L58E 的 ELK-螢光素酶活性測(cè)定結(jié)果。圖^A圖示在4 °C下溫育1天、4天和8天后Fc(15)FGF21突變體Fc (15) FGF216_181/G170E (實(shí)心菱形)、Fc (I5) FGF21A45K/G170E (空心方形)、Fc(l5) FGF2IPl7IE (實(shí)心三角)、Fc (I5) FGF2IPl7IA (交叉線)、Fc (I5) FGF2IGl7OE (空心三角)和 FGF21對(duì)照(實(shí)心圓)聚集水平的變化，圖28B是同樣顯示溫育結(jié)果的柱狀圖。圖四表示在注射PBS(溶媒)(實(shí)心圓)或者Fc(15)FGF21突變體Fc(15) FGF21A45K/G170E(空心圓)、Fc (15) FGF21A45K/P171G (實(shí)心三角)或 Fc (15) FGF21L98R/ P171G(空心三角)的小鼠中測(cè)定的血糖水平。圖30圖示人FGF21 (實(shí)心圓，實(shí)線)、Fc_FGF21 (空心圓，實(shí)線)和Fc_FGF21L98R/ P171G (實(shí)心三角，虛線)的ELK-螢光素酶活性測(cè)定結(jié)果。圖31圖示于室溫(圖31A)和4°C (圖31B)9天后觀察到的FGF21 (實(shí)心圓，實(shí) 線)、Fc-FGF21(空心圓，實(shí)線)和FC-FGF21L98R/P171G (實(shí)心三角，虛線)的高分子量聚集 物百分比。圖32是在168小時(shí)時(shí)間內(nèi)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上觀察到的Fc_FGF21L98R/P171G變化的 系列MALDI質(zhì)譜跡線。圖33圖示ob/ob小鼠中由PBS溶媒對(duì)照(空心圓)、野生型成熟FGF21 (實(shí)心方 形)以及FGF21突變體L98R、P171G (實(shí)心倒三角)；L98R、P171G、182P (空心菱形)和L98R、 P171G、182G(實(shí)心圓)中的每一種所引起的血糖水平變化百分比。圖34圖示ob/ob小鼠中由PBS溶媒對(duì)照(實(shí)心圓)及FGF21突變體L98R、 P171G (實(shí)心三角)山981 、卩1716、1826、1836(空心三角)、L98R、P171G、182G (實(shí)心菱形)和
1L98R、P171G、182P(空心菱形)中的每一種所引起的血糖水平變化百分比。圖35圖示ob/ob小鼠中PBS溶媒對(duì)照(空心圓)及FGF21突變體L98R、P171G (實(shí) 心方形)；L98R、P171G，Y179S (空心三角)、L98R、P171G，Y179A (實(shí)心倒三角)、L98R、P171G、 180S (空心菱形)和L98R、P171G，A180G(實(shí)心圓)中的每一種所引起血糖水平變化百分比。圖36圖示ob/ob小鼠中PBS溶媒對(duì)照(實(shí)心圓)和FGF21突變體L98R、P171G (空 心方形)；L98R、P171G，Y179F (實(shí)三角)和L98R、P171G、A180E (空心菱形)中的每一種所 引起的血糖水平變化百分比。圖37是圖示獼猴中進(jìn)行6周劑量遞增研究的研究設(shè)計(jì)簡(jiǎn)圖；圖中，陰影符號(hào)表示 在空腹?fàn)顟B(tài)下抽血，點(diǎn)狀符號(hào)表示在進(jìn)食狀態(tài)下抽血。圖38A-D是隨機(jī)分配獼猴的OGTT分布曲線、OGTT AUC和體重的系列圖；圖38A表 示在化合物或溶媒分配給各組前在OGTTl中的基線葡萄糖水平，實(shí)心方形對(duì)應(yīng)于A組，實(shí)心 圓、實(shí)線對(duì)應(yīng)于B組和空心圓，短劃線對(duì)應(yīng)于C組；圖38B表示在化合物或溶媒分配給各組 前，在0GTT2中的基線葡萄糖水平，實(shí)心方形對(duì)應(yīng)于A組，實(shí)心圓、實(shí)線對(duì)應(yīng)于B組和空心 圓，實(shí)線對(duì)應(yīng)于C組；圖38C表示以AUC顯示的OGTTl和2的基線葡萄糖水平，點(diǎn)狀條形柱 對(duì)應(yīng)于A組，陰影條形柱對(duì)應(yīng)于B組，空心條形柱對(duì)應(yīng)于C組；圖38D表示基線體重，點(diǎn)狀條 形柱對(duì)應(yīng)于A組，陰影條形柱對(duì)應(yīng)于B組，空心條形柱對(duì)應(yīng)于C組。圖39圖示溶媒、FGF21和Fc_FGF21 (RG)對(duì)獼猴體重的作用；陰影條形柱1和2對(duì) 應(yīng)于低劑量下的第1周和第2周，空心條形柱3和4對(duì)應(yīng)于中等劑量下的第3周和第4周， 實(shí)心條形柱5和6對(duì)應(yīng)于高劑量下的第5周和第6周，點(diǎn)狀條形柱7、8和9對(duì)應(yīng)于沖洗期 的第7-9周。圖40圖示相對(duì)于溶媒基線，F(xiàn)GF21和Fc_FGF21 (RG)對(duì)獼猴空腹胰島素水平的空 腹胰島素變化百分比；陰影條形柱1和2對(duì)應(yīng)于低劑量下的第1周和第2周，空心條形柱3 和4對(duì)應(yīng)于中等劑量下的第3周和第4周，實(shí)心條形柱5和6對(duì)應(yīng)于高劑量下的第5周和 第6周，點(diǎn)狀條形柱7和8對(duì)應(yīng)于沖洗期的第7和8周。圖41圖示以高劑量給予的溶媒、FGF21和Fc_FGF21 (RG)對(duì)研究的第5和第6周期 間得到的獼猴的餐后胰島素水平的作用；實(shí)心條形柱對(duì)應(yīng)于第5周，陰影條形柱對(duì)應(yīng)于第6周。圖42圖示在兩周高劑量FC-FGF21 (RG)治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行的0GTT5的葡萄糖 分布；實(shí)心圓、實(shí)線對(duì)應(yīng)于溶媒，空心方形、虛線對(duì)應(yīng)于FGF21，實(shí)心三角、實(shí)線對(duì)應(yīng)于 Fc-FGF21(RG)。圖43圖示在兩周高劑量FC-FGF21 (RG)治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行的0GTT5的胰島素 分布；實(shí)心圓、實(shí)線對(duì)應(yīng)于溶媒，空心方形、虛線對(duì)應(yīng)于FGF21，實(shí)心三角、實(shí)線對(duì)應(yīng)于 Fc-FGF21(RG)。圖44圖示在獼猴的各劑量期(低、中和高劑量)結(jié)束時(shí)測(cè)定的葡萄糖OGTT AUC1-3 ；空心條形柱對(duì)應(yīng)于在0GTT3期間由葡萄糖測(cè)量值計(jì)算的AUC3，實(shí)心條形柱對(duì)應(yīng)于 在0GTT4期間由葡萄糖測(cè)量值計(jì)算的AUC4，陰影條形柱對(duì)應(yīng)于在0GTT5期間由葡萄糖測(cè)量 值計(jì)算的AUC5。圖45圖示溶媒、FGF21和Fc_FGF21 (RG)對(duì)相對(duì)于獼猴各組的空腹血漿甘油三酯 基線水平的變化百分比的作用；陰影條形柱1和2對(duì)應(yīng)于低劑量下的第1周和第2周，空心條形柱3和4對(duì)應(yīng)于中等劑量下的第3周和第4周，實(shí)心條形柱5和6對(duì)應(yīng)于高劑量下的 第5周和第6周和點(diǎn)狀條形柱7、8和9對(duì)應(yīng)于沖洗期的第7-9周。圖46圖示在以高劑量用溶媒、FGF21或FC-FGF21 (RG)治療第5周和第6周期間測(cè) 量的獼猴各組的餐后血漿甘油三酯水平；陰影條形柱對(duì)應(yīng)于第5周，實(shí)心條形柱對(duì)應(yīng)于第6 周。圖47圖示給藥前、5天、12天、19天和沈天，用在每次注射后約21小時(shí)獲得的樣 品測(cè)定的每只猴的FGF21水平。圖48圖示給藥前、5天、12天、19天和沈天用在每次注射后約5天獲得的樣品測(cè) 定的每只猴的FC-FGF21(RG)水平。圖49圖示在各低、中和高劑量后進(jìn)行的三次OGTT測(cè)定的FGF21和Fc_FGF21 (RG) 水平的平均濃度；陰影條形柱對(duì)應(yīng)于低劑量的0GTT3，實(shí)心條形柱對(duì)應(yīng)于中等劑量的 0GTT4，空心條形柱對(duì)應(yīng)于高劑量的0GTT5。發(fā)明詳述可以采用本文公開的方法和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備具有改進(jìn)性質(zhì)(例如半壽 期延長(zhǎng)和/或聚集減少)的人FGF21蛋白。任選可通過抗體或其部分與野生型FGF21序列 的N端或C端融合而使半壽期進(jìn)一步延長(zhǎng)。還可通過將氨基酸取代引入蛋白質(zhì)中而進(jìn)一步 延長(zhǎng)野生型FGF21蛋白的半壽期或減少聚集。這類經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)在本文被稱為突變體 或FGF21突變體，并構(gòu)成本發(fā)明的實(shí)施方案。本文使用(包括在實(shí)施例中)的重組核酸方法一般是Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989) 5 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等主編，Green Publishers Inc.禾口 Wiley 禾口 Sons 1994)中給出的方法，兩個(gè)參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中用于任何目的。1. 一般定義術(shù)語“分離核酸分子”是指本發(fā)明的核酸分子(1)當(dāng)總核酸從來源細(xì)胞分離時(shí)， 從與之天然共存的至少約50%的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其它材料中分離出來，(2)不 與“分離核酸分子”天然連接的多核苷酸的全部或部分連接，(3)與天然不與之連接的多核 苷酸有效連接，或(4)天然不存在的作為較大多核苷酸序列的部分。優(yōu)選本發(fā)明的分離核 酸分子基本上無任何其它的污染核酸分子或在其自然環(huán)境存在的可能干擾多肽產(chǎn)生或其 治療、診斷、預(yù)防或研究用途的其它的污染物。術(shù)語“載體”用來指用于向宿主細(xì)胞傳遞編碼信息的任何分子(例如核酸、質(zhì)?；?病毒)O術(shù)語“表達(dá)載體”是指適于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化并含有指導(dǎo)和/或控制插入異源核酸序 列表達(dá)的核酸序列的載體。表達(dá)包括但不限于轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪接(如果內(nèi)含子存在的 話)等加工。術(shù)語“有效連接”本文用來指旁側(cè)序列的排列方式，其中所述旁側(cè)序列按所述方式 排列或裝配從而發(fā)揮其常規(guī)功能。因此，與編碼序列有效連接的旁側(cè)序列能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序 列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，該編碼序列與該啟 動(dòng)子有效連接。旁側(cè)序列不必與編碼序列鄰接，只要正確起作用即可。因此，例如，間插入 的未翻譯但卻轉(zhuǎn)錄的序列可存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，啟動(dòng)子序列仍可被視為與編碼序列“有效連接”。術(shù)語“宿主細(xì)胞”用來指被核酸序列轉(zhuǎn)化或能夠被核酸序列轉(zhuǎn)化然后能夠表達(dá)選 定的目標(biāo)基因的細(xì)胞。該術(shù)語包括親代細(xì)胞的子代，無論子代在形態(tài)或遺傳組成上是否與 最初的親代相同，只要存在選定的基因。術(shù)語“分離多肽”是指本發(fā)明的多肽(1)當(dāng)從來源細(xì)胞分離時(shí)，從與之天然共存 的至少約50%的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其它物質(zhì)中分離出來，(2)不與“分離多肽” 天然連接的多肽的全部或部分連接(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)，C3)與天然不與之連接 的多肽有效連接(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)，或(4)天然不存在。優(yōu)選分離多肽基本上 無任何其它污染多肽或在其自然環(huán)境中存在的可能干擾其治療、診斷、預(yù)防或研究用途的 其它污染物。術(shù)語“天然存在的”當(dāng)與生物材料例如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等聯(lián)用時(shí)，是指自 然界中存在的且未受人為操作的材料。同樣，本文使用的“非天然存在的”是指自然界不存 在的或在結(jié)構(gòu)上經(jīng)過人為修飾或合成的材料。當(dāng)與核苷酸聯(lián)用時(shí)，術(shù)語“天然存在的”是指 堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。當(dāng)與氨基酸聯(lián)用時(shí)， 術(shù)語“天然存在的”是指20個(gè)氨基酸，即丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸 (E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨 酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨 酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。術(shù)語“FGF21多肽”是指在人體內(nèi)表達(dá)的天然存在的野生型多肽。對(duì)于本公開內(nèi)容 的目的，術(shù)語“FGF21多肽”可互換使用是指任何全長(zhǎng)FGF21多肽，例如由209個(gè)氨基酸殘 基組成并由SEQ ID NO :1的核苷酸序列編碼的SEQ ID NO :2 ；多肽的任何成熟形式，例如由 181個(gè)氨基酸殘基組成并由SEQ ID NO :3的核苷酸序列編碼的SEQ ID NO :4，其中剔除了在 全長(zhǎng)FGF21多肽的氨基端的觀個(gè)氨基酸殘基(即，其構(gòu)成信號(hào)肽)及其變體。術(shù)語“FGF21多肽突變體”和“FGF21突變體”是指其中天然存在的FGF21氨基酸 序列已被修飾的FGF21多肽變體。這類修飾包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，包括被 非天然存在的氨基酸類似物的取代和截短。因此，F(xiàn)GF21多肽突變體包括但不限于本文所 述的定向位點(diǎn)FGF21突變體、截短FGF21多肽、蛋白酶解抗性FGF21突變體、聚集減少FGF21 突變體、FGF21組合突變體和FGF21融合蛋白。為了鑒定本發(fā)明的FGF21突變體的具體截短 和氨基酸取代，截短或突變的氨基酸殘基編號(hào)與成熟181-殘基FGF21多肽的編號(hào)相對(duì)應(yīng)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21多肽突變體包含與SEQ IDNO :4的氨基酸序列 有至少約85%同一性的氨基酸序列，但是其中為FGF21多肽突變體提供所需性質(zhì)(例如蛋 白酶解抗性、半壽期延長(zhǎng)或聚集減少性質(zhì)及其組合)的特定殘基不被進(jìn)一步修飾。換句話 講，在已被修飾而提供蛋白酶解抗性、減少聚集或其它性質(zhì)的FGF21突變體序列中的殘基 除外，在FGF21突變體序列中約15%的所有其它氨基酸殘基都可被修飾。例如在FGF21突 變體Q173E中，至多15%的所有氨基酸殘基都可被修飾，除取代173位上的谷氨酰胺的谷 氨酸殘基以外。在其它的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21多肽突變體包含與SEQ ID NO :4的氨基酸序 列有至少約90 %，或約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列，但是其中賦予 FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性或聚集減少性質(zhì)的特定殘基不被進(jìn)一步修飾。這類FGF21 多肽突變體具有至少一種野生型FGF21多肽的活性。
本發(fā)明還包括編碼FGF21多肽突變體的核酸分子，所述FGF21多肽突變體包含與 SEQ ID NO :4的氨基酸序列有至少約85%同一性的氨基酸序列，但是其中賦予FGF21多肽 突變體所需性質(zhì)(例如蛋白酶解抗性、半壽期延長(zhǎng)或聚集減少性質(zhì)及其組合)的特定殘基 不被進(jìn)一步修飾。換句話講，編碼已被修飾而提供蛋白酶解抗性、減少聚集或其它性質(zhì)的 FGF21突變體序列的殘基的核苷酸除外，F(xiàn)GF21突變體序列中約15%的所有其它核苷酸都 可被修飾。例如在FGF21突變體Q173E中，至多15 %的所有核苷酸都可被修飾，除編碼取 代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸殘基的核苷酸以外。本發(fā)明還包括編碼包含與SEQ ID NO 4的氨基酸序列有至少約90 %、或約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列的 FGF21多肽突變體的核酸分子，但是其中賦予FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性或聚集減少 性質(zhì)的特定殘基不被進(jìn)一步修飾。這類FGF21突變體具有至少一種野生型FGF21多肽的活 性。本發(fā)明還包括包含與SEQ ID NO :3的核苷酸序列有至少約85%同一性的核苷酸 序列的核酸分子，但是其中賦予編碼FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性、聚集減少或其它性 質(zhì)的氨基酸殘基的核苷酸不被進(jìn)一步修飾。換句話講，已被修飾而提供蛋白酶解抗性、聚集 減少或其它性質(zhì)的FGF21突變體序列中的殘基除外，F(xiàn)GF21突變體序列中約15%的所有的 其它氨基酸殘基都可被修飾。例如在FGF21突變體Q173E中，至多15%的所有氨基酸殘基 都可被修飾，除取代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸殘基以外。本發(fā)明還包括包含與SEQ ID NO 3的核苷酸序列有至少約90%、或約95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列 的核酸分子，但是其中賦予編碼FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性或聚集減少性質(zhì)的編碼氨 基酸殘基的核苷酸不被進(jìn)一步修飾。這類核酸分子編碼具有至少一種野生型FGF21多肽的 活性的FGF21突變體多肽。術(shù)語“有生物活性的FGF21多肽突變體”是指具有野生型FGF21多肽活性的本文 所述的任何FGF21多肽突變體，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇的能力；減輕體 重；和改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性，而不論已引入FGF21多肽突變體的修飾 的類型或數(shù)目。雖然如此，與野生型FGF21多肽相比，F(xiàn)GF21活性的水平略微降低的FGF21 多肽突變體仍可視為是有生物活性的FGF21多肽突變體。術(shù)語“有效量”和“治療有效量”分別是指用來支持野生型FGF21多肽的一種或多 種生物活性的可觀察水平的FGF21多肽突變體的量，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽 固醇水平的能力；減輕體重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性。本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”或“生理學(xué)上可接受的載體”是指適用于 完成或促進(jìn)FGF21多肽突變體遞送的一種或多種制劑材料。術(shù)語“抗原”是指能夠被抗體結(jié)合，并且還能夠用于動(dòng)物中以產(chǎn)生能結(jié)合該抗原表 位的抗體的分子或分子部分?？乖删哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。術(shù)語“天然Fe”是指包含或是單體形式或是多聚體形式的非抗原結(jié)合片段的序列 的分子或序列，并且可含有鉸鏈區(qū)，所述非抗原結(jié)合片段由整個(gè)抗體消化得到或通過其它 方法產(chǎn)生。天然Fc最初的免疫球蛋白源優(yōu)選為人源的，并可以是任一種免疫球蛋白，盡管 優(yōu)選為IgGl和IgG2。天然Fc分子可以通過共價(jià)(即二硫鍵)和非共價(jià)締合連接成二聚 體或多聚體形式的單體多肽構(gòu)成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)目為 1-4的范圍，這取決于類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgAl和IgGA^。天然Fc的一個(gè)實(shí)例是由木瓜蛋白酶消化IgG得到的二硫鍵鍵合的二聚體(參見 Ellison 等，1982，Nucleic Acids Res. 10 :4071-9)。本文使用的術(shù)語“天然 Fe” 通用于單 體、二聚體和多聚體形式。Fc多肽序列的實(shí)例見SEQ ID N0:13。術(shù)語“Fe變體”是指是天然Fc的修飾形式但仍包含補(bǔ)救受體(salvage receptor) Fcfoi(新生Fc受體)的結(jié)合位點(diǎn)的分子或序列。國際申請(qǐng)?zhí)朩O 97/34631和WO 96/32478 披露了示例性Fc變體以及與補(bǔ)救受體的相互作用，并通過引用并入本文。因此，術(shù)語“Fe變 體”可包含從非人類天然Fc經(jīng)人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可被剔除的區(qū)域， 因?yàn)樗鼈兲峁┍景l(fā)明的FGF21突變體的融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物活性。因此，術(shù) 語“Fe變體”包含缺失影響或參與以下功能的一個(gè)或多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基，或者其中影 響或參與以下功能的一個(gè)或多個(gè)Fc位點(diǎn)或殘基被修飾的分子或序列(1) 二硫鍵形成，(2) 與所選的宿主細(xì)胞不相容，(3)在選定宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的N端異質(zhì)性，(4)糖基化，(5)與 補(bǔ)體相互作用，(6)與補(bǔ)救受體以外的Fc受體結(jié)合，或(7)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。 下文中將進(jìn)一步描述Fc變體。術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域”包括天然Fc和Fc變體及如上定義的序列。至于Fc變體和天 然Fc分子，術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域”包括單體或多聚體形式的分子，不論是由整個(gè)抗體消化還是 通過其它方法產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可通過例如Fc結(jié)構(gòu)域和FGF21 序列之間的共價(jià)鍵與FGF21或FGF21突變體(包括FGF21或FGF21突變體的截短形式)融 合。這類融合蛋白可通過Fc結(jié)構(gòu)域的締合形成多聚體，這些融合蛋白及其多聚體兩者均屬 于本發(fā)明的方面。2.位點(diǎn)特異性FGF21突變體術(shù)語“位點(diǎn)特異性FGF21突變體”或“取代FGF21突變體”是指具有的氨基酸序列 不同于天然存在的FGF21多肽序列(例如SEQ ID NO 2和4及其變體)的氨基酸序列的 FGF21突變體多肽。位點(diǎn)特異性FGF21突變體可通過尤其在FGF21多肽的特定位置引入保 守或非保守的氨基酸取代，并且使用天然或非天然存在的氨基酸而產(chǎn)生。“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸殘基(即存在于野生型FGF21多肽序列指定 位置上的殘基)被非天然殘基(即不存在于野生型FGF21多肽序列指定位置上的殘基)取 代，使得對(duì)該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有或沒有影響。保守氨基酸取代還 包括通常通過化學(xué)上的肽合成而不是通過在生物系統(tǒng)中合成而摻入的非天然存在的氨基 酸殘基。這些包括模擬肽(ρ印tidomimetics)和氨基酸部分的其它反轉(zhuǎn)形式或反向形式?？筛鶕?jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)將天然存在的殘基分為以下幾類(1)疏水性正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性親水性Cys、Ser、Thr ；(3)酸性Asp、Glu ；(4)堿性Asn、Gin、His、Lys、Arg ；(5)影響鏈方向的殘基Gly、Pro ；和(6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。保守取代可包括這些類別中的一種的一個(gè)成員與同一類別的另一個(gè)成員交換。非 保守取代可包括這些類別中的一種的一個(gè)成員與另一類別的一個(gè)成員交換。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在需要這類取代時(shí)，可確定所需要的氨基酸取代(不管是保守還是非保守)。示例性(但不是限制性的)氨基酸取代表見表1?？被崛〈?br> 權(quán)利要求
1.一種分離多肽，其包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，還包含用任何氨基酸對(duì)以下氨 基酸殘基的取代45位上的丙氨酸殘基、86位上的亮氨酸殘基、98位上的亮氨酸殘基、111 位上的丙氨酸殘基、1 位上的丙氨酸殘基、170位上的甘氨酸殘基、171位上的脯氨酸殘基 或172位上的絲氨酸殘基，及其組合。
2.權(quán)利要求1的分離多肽，其中所述分離多肽包含用任何氨基酸對(duì)以下氨基酸殘基的 取代98位上的亮氨酸殘基、171位上的脯氨酸殘基或98位上的亮氨酸殘基和171位上的 脯氨酸殘基兩者。
3.權(quán)利要求2的分離多肽，其中所述分離多肽包含用任何氨基酸取代98位上的亮氨酸 殘基和171位上的脯氨酸殘基兩者。
4.一種分離多肽，其包含具有以下取代及其組合的SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)至少一個(gè)是以下的氨基酸取代(i)19位上的谷氨酰胺、異亮氨酸或賴氨酸殘基；(ii)20位上的組氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；(iii)21位上的異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或纈氨酸殘基；(iv)22位上的異亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基； (ν) 150位上的丙氨酸或精氨酸殘基；(vi)151位上的丙氨酸或纈氨酸殘基；(vii)152位上的組氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(viii)170位上的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸或 絲氨酸殘基；(ix)171位上的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸殘基；(χ) 172位上的亮氨酸或蘇氨酸殘基；或 (xi) 173位上的精氨酸或谷氨酸殘基；和(b)至少一個(gè)是以下的氨基酸取代(i)26位上的精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(ii)45位上的精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(iii)52位上的蘇氨酸殘基；(iv)58位上的半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸或絲氨酸殘基； (ν) 60位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(vi)78位上的丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸或組氨酸殘基；(vii)86位上的半胱氨酸或蘇氨酸殘基；(viii)88位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸或絲氨酸殘基；(ix)98位上的精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基； (χ)99位上的精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或谷氨酸殘基；(xi)111位上的賴氨酸或蘇氨酸殘基；(xii)129位上的精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸或賴氨酸殘 基；或(xiii)134位上的精氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸或酪氨酸殘基。
5.權(quán)利要求4的分離多肽，其中98位上的殘基為精氨酸，且171位上的殘基為脯氨酸。
6.權(quán)利要求4的分離多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO :4的氨基酸序列有至少 85%同一性的氨基酸序列，但是其中權(quán)利要求4(a) (i)-(xi)和4(b) (i)-(xiii)的至少一 個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一步修飾。
7.一種分離多肽，其包含具有是以下的至少一個(gè)氨基酸取代及其組合的SEQ ID NO 4 的氨基酸序列(a)19位上的谷氨酰胺、賴氨酸或異亮氨酸殘基；(b)20位上的組氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；(c)21位上的異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或纈氨酸殘基；(d)22位上的異亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(e)150位上的丙氨酸或精氨酸殘基；(f)151位上的丙氨酸或纈氨酸殘基；(g)152位上的組氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸殘基；(h)170位上的丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或脯氨酸殘基；(i)171位上的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨 酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸殘基；(j) 172位上的亮氨酸殘基；或 (k) 173位上的精氨酸或谷氨酸殘基。
8.權(quán)利要求7的分離多肽，其中171位上的殘基為脯氨酸。
9.權(quán)利要求7的分離多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO :4的氨基酸序列有至少 85%同一性的氨基酸序列，但是其中權(quán)利要求7(a)-(k)的至少一個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一 步修飾。
10.一種分離多肽，所述分離多肽包含具有是以下的至少一個(gè)氨基酸取代及其組合的 SEQ ID NO 4的氨基酸序列(a)26位上的精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(b)45位上的精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(c)52位上的蘇氨酸殘基；(d)58位上的谷氨酸、甘氨酸或絲氨酸殘基；(e)60位上的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基；(f)78位上的丙氨酸、精氨酸或組氨酸殘基；(g)88位上的丙氨酸殘基；(h)98位上的精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸殘基；(i)99位上的精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或谷氨酸殘基； (j) 111位上的賴氨酸或蘇氨酸殘基；(k) 129位上的精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸或賴氨酸殘基；或(1) 134位上的精氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸或酪氨酸殘基。
11.權(quán)利要求10的分離多肽，其中98位上的殘基是精氨酸。
12.權(quán)利要求10的分離多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO :4的氨基酸序列有至少85%同一性的氨基酸序列，但是其中權(quán)利要求10(a)-(l)的至少一個(gè)氨基酸取代不被進(jìn)一 步修飾。
13.權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的分離多肽，其還包含是以下的至少一個(gè)氨基酸取代(a)179位上的苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸；(b)180位上的谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；或(c)181位上的賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
14.權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的分離多肽，其還包含與多肽的C端融合的1-10個(gè)氨基酸殘基。
15.權(quán)利要求10的分離多肽，其中所述1-10個(gè)氨基酸殘基選自甘氨酸、脯氨酸及其組I=I O
16.權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的分離多肽，其中所述多肽包含(a)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；或(c)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短和不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其 中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖。
17.權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的分離多肽，其中所述多肽與一種或多種聚合物共 價(jià)連接。
18.權(quán)利要求17的分離多肽，其中所述聚合物是PEG。
19.一種融合多肽，其包含與異源氨基酸序列融合的權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的 分離多肽。
20.權(quán)利要求19的融合多肽，其中所述多肽通過接頭與異源氨基酸序列融合。
21.權(quán)利要求20的融合多肽，其中所述接頭包含GGGGGSGGGSGGGGS(SEQID NO :23)。
22.權(quán)利要求20的融合多肽，其中所述異源氨基酸序列是IgG恒定結(jié)構(gòu)域或其片段。
23.權(quán)利要求22的融合多肽，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO 13的氨基酸序列。
24.一種多聚體，其包含兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的權(quán)利要求23的融合多肽。
25.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的分離多肽和藥學(xué)上可接 受的調(diào)制劑。
26.一種用于治療代謝紊亂的方法，所述方法包括給予有需要的病人權(quán)利要求25的藥 物組合物。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
29.一種分離核酸，其編碼權(quán)利要求1、4、7或10中任一項(xiàng)的多肽。
30.一種載體，其包含權(quán)利要求四的核酸分子。
31.一種宿主，其包含權(quán)利要求四的核酸分子。
32.一種包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的分離多肽，其中所述多肽包含(a)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短，且其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，且其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血 糖；或(c)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短和不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，且 其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖。
33.一種分離融合蛋白，其包含(a)IgG恒定結(jié)構(gòu)域；(b)與IgG恒定結(jié)構(gòu)域融合的接頭序列；和(c)與接頭序列融合且包含SEQID N0:4的氨基酸序列的FGF21突變體，其中精氨酸 殘基取代了 98位上的亮氨酸殘基且甘氨酸殘基取代了 171位上的脯氨酸殘基。
34.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述接頭序列包含GGGGGSGGGSGGGGS(SEQID NO 23)。
35.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO :13。
36.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述接頭序列包含GGGGGSGGGSGGGGS(SEQID NO :23)，且所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求36的分離融合蛋白，其中所述接頭的N端與IgG恒定結(jié)構(gòu)域的C端融合， 所述FGF21突變體的N端與所述接頭的C端融合。
38.一種多聚體，所述多聚體包含兩種或更多種權(quán)利要求33的融合蛋白。
39.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述FGF21突變體還包含是以下的至少一個(gè)氨 基酸取代(a)179位上的苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸；(b)180位上的谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；或(c)181位上的賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
40.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述FGF21突變體還包含與FGF21突變體的C 端融合的1-10個(gè)氨基酸殘基。
41.權(quán)利要求40的分離融合蛋白，其中所述1-10個(gè)氨基酸殘基選自甘氨酸、脯氨酸及 其組合。
42.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述FGF21突變體包含(a)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；(b)不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖；或(c)不超過8個(gè)氨基酸殘基的氨基端截短和不超過12個(gè)氨基酸殘基的羧基端截短，其 中所述多肽能夠降低哺乳動(dòng)物的血糖。
43.權(quán)利要求33的分離融合蛋白，其中所述FGF21突變體包含與SEQID NO :4的氨基 酸序列有至少85%同一性的氨基酸序列，但是其中98位上的精氨酸和171位上的甘氨酸不 被進(jìn)一步修飾。
44.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求33或權(quán)利要求38的分離融合蛋白 和藥學(xué)上可接受的調(diào)制劑。
45.一種用于治療代謝紊亂的方法，所述方法包括給予有需要的病人權(quán)利要求44的藥 物組合物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
48.一種分離核酸，其編碼權(quán)利要求33的融合蛋白。
49.一種載體，其包含權(quán)利要求48的核酸分子。
50.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求48的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼FGF21突變體多肽的核酸分子、FGF21突變體多肽、包含F(xiàn)GF21突變體多肽的藥物組合物及使用這類核酸、多肽或藥物組合物治療代謝紊亂的方法。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102143758SQ200980130476
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者A·E·漢伯格, E·J·貝羅斯基, J·孫, J·徐, M·L·邁克爾斯, M·M·埃利森, R·I·赫奇特, Y-S·李 申請(qǐng)人:安姆根有限公司