專利名稱：絲氨酸蛋白酶抑制劑在治療皮膚病中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及為絲氨酸蛋白酶的抑制劑的治療性化合物、其藥物組合物以及其在治 療人體或動物體中的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療、診斷或預后皮膚病的方法， 包括向需要其的受試者給予治療有效量的絲氨酸蛋白酶抑制劑。
背景技術：
蛋白酶或蛋白水解酶在生物體——從細菌和病毒至哺乳動物——中是必要的。蛋 白酶通過水解肽鍵消化和降解蛋白質。絲氨酸蛋白酶(EC. 3.4.21)的活性位點有共同的特 征，主要是有活性的絲氨酸殘基。有兩種主要類型的絲氨酸蛋白酶；胰凝乳蛋白酶/胰蛋 白酶/彈性蛋白酶樣和枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，它們具有相同空間排列的催化性 His、Asp和Ser，但蛋白骨架完全不同。然而，超過20個家族的絲氨酸蛋白酶(S1-S27)已 被鑒定，基于結構相似性和其他功能證據將它們分成6族類SA、SB、SC、SE、SF和SG0胰凝 乳蛋白酶/胰蛋白酶/彈性蛋白酶樣家族絲氨酸蛋白酶被細分成兩類?！按笮汀鳖?約230 個殘基)基本上包括哺乳動物酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、激肽釋放酶 和凝血酶?！靶⌒汀鳖?約190個殘基)包括細菌酶。催化性His、Asp和Ser的側翼是底物C末端或“主要(prime)，，側的稱為Sl ’、 S2'、S3'等以及N末端側的稱為S1、S2、S3等的底物氨基酸側鏈殘基結合袋。該術語 記載于 Structure and Mechanism in ProteinScience :A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, Alan Fersht,1999(W. H. Freeman and Company)pages 40_43and Brik et al，Org. Biomol.Chem.，2003，1，5-14。胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶/彈性蛋白酶 樣絲氨酸蛋白酶還可通過存在于Sl袋中的殘基進一步細分，如Introduction toProtein Structure,Carl Branden and John Tooze, 1991(GarlandPublishing Inc)pages 231-241 中所述。細分物為胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(Si袋中Gly-226、Ser-189和Gly-216)、 胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(Si中Gly-226、Asp-189和Gly-216)和彈性蛋白酶樣絲氨酸蛋 白酶(Si中Val-226和Thr_216)，其中殘基編號依據標準的胰凝乳蛋白酶編號進行。胰蛋 白酶樣絲氨酸蛋白酶更傾向將Lys或Arg置于Sl袋中的底物。絲氨酸蛋白酶具有共同的催化機制，特征在于使用胰凝乳蛋白酶編號體系在位置 195處有一個特別有反應性的Ser殘基。絲氨酸蛋白酶的實例包括胰蛋白酶、類胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、激肽釋放酶、補體Cl、頂體蛋白酶、溶酶體蛋白 酶、蠶繭酶、α-水解蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶B、絲氨酸羧肽酶π、枯草桿菌蛋白酶、尿激酶 (uPA)、因子Vila、因子IXa和因子Xa。由于絲氨酸蛋白酶在調節(jié)種種生理過程中的作用， 它們多年以來已被廣泛研究，并且是藥物靶向研究的主要焦點。涉及絲氨酸蛋白酶的過程包括血液凝固、纖維蛋白溶解、受精、發(fā)育、惡化、神經肌 肉形成模式和發(fā)炎。公知的是，這些化合物可抑制多種血液蛋白酶，以及在組織中活化或釋 放的蛋白酶。還已知的是，絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制關鍵的細胞過程，例如粘附、遷移、自 由基產生和凋亡。另外，動物實驗表明，靜脈內給藥的絲氨酸蛋白酶抑制劑、變體或表達絲氨酸蛋白酶抑制劑的細胞可提供抵御組織損傷的保護。絲氨酸蛋白酶激肽釋放酶(KLK)被證明在正常的皮膚生理學中起到關鍵作用。 KLK5 和 7 最初從角質層分離和克隆(Hansson et al. , 1994 ；Brattsand and Egelrud, 1999)，并被證明通過加工角質橋粒(corneodesmosome)(即角質鎖鏈素(⑶SN)、橋粘素 I(DSGl)和和橋板素I(DSCl))的細胞外粘附蛋白參與皮膚脫屑(Caubet et al. ,2004 ； Descargues et al.，2005)。KLK5被證明可切割所有3種組分，而KLK7僅能夠消化CDSN和 DSCl (Caubet et al.，2004)。進一步的IHC研究支持提出的KLK7在脫屑中的作用(Sondell et al.，1995)。體外研究證明了通過涉及KLK5和14的蛋白質水解級聯(lián)的KLK7的潛在活 化機制(Brattsand et al. ,2005) 同時，已經報道了在SC中有不同水平的KLK1、6、8、10、 11 和 13 (Komatsu et al. ,2005 ；Borgono et al.，2006)，KLK1、5、6 和 14 被認為通過 DSGl 加工參與皮膚脫屑(Borgono et al.，2006)。KLK14被認為在皮膚重塑中起到主要作用，原 因是它貢獻了 SC層中大約一半的總胰蛋白酶樣蛋白水解活性(Stefansson et al.，2006)。 KLK8被認為在皮膚脫屑加工DSGl和CDSN中起到部分相同的作用(Kishibeet al.，2006)。 已在體外(in vitro)和體內(in vivo)證明了 KLK通過調節(jié)cathelicidin肽在皮膚中有 著額外的抗微生物功能(Yamasaki et al.，2006)。已有報道稱，在大量皮膚病變中存在通過基因過表達或活性失調的KLK蛋白水 解活性不平衡，所述皮膚病變包括慢性瘙癢性皮炎、脫皮綜合征、銀屑病、特應性皮炎和內 瑟頓綜合征(Netherton syndrome) (Komatsu et al.，2005b ；Descargues et al.，2005 ； Hachem et al.，2006 ；Komatsu et al.，2006 ；Hansson et al.，2002 ；Ekholm and Egelrud, 1999)。多種KLK的表達在銀屑病、特應性皮炎、B型脫皮綜合征和特應性皮炎的慢性損傷 中顯著上調(Komatsu et al. , 2005b ；Komatsu et al. , 2006 ；Hansson et al.,2002)o 已 經證明，患有內瑟頓綜合征(一種常染色體隱性皮膚病變)的患者在編碼LEKTI的SPINK5 基因中出現(xiàn)了閱讀框偏移和無義突變(Chavanas et al. ,2000 ；Komatsu et al. ,2002 ； Chavanas et al. ,2000 ；Sprecher et al.，2001)，LEKTI 為具有對抗多種 KLK (包括KLK5、6、 7、13 和 14)的活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑(Borgono et al.，2006 ；Egelrud et al.，2005 ； Deraison et al.，2007)。這類基因缺陷會導致抑制結構域的缺失(Chavanas et al. ,2000 ； Sprecher et al.,2001)o還感興趣的是，激肽釋放酶可能通過活化蛋白酶活化受體(PAR)參與脫屑型病變 的皮膚炎癥。PAR 1-4為G蛋白偶聯(lián)受體，被包括激肽釋放酶在內的多種蛋白酶活化。特別 感興趣的是PAR2，原因是它通過胰蛋白酶切割被活化，并且與組織激肽釋放酶共存于皮膚 組織中。在特應性皮炎和內瑟頓綜合征患者的皮膚損傷中，PAR2受體出現(xiàn)過表達并且與人 組織激肽釋放酶共存(Descargues et al.，2006)。這導致了這樣的假設，即這類KLK-PAR 通路參與這些疾病的發(fā)病機制，并且KLK經PAR2活化可在這些皮膚病變中誘導炎癥。Oikonomopoulou et al. (2006)最近的體外和體內研究已證明，PAR活性可以被活 性KLK5、6和14靶向。KLK5和KLK6被發(fā)現(xiàn)可活化PAR2，而KLK14被報道可失活PARI以及 活化PAR2和PAR4。其他的報道表明了 PARI或PAR2在不同細胞類型中被KLKl、2、4、5、6和 14 活化(Mize et al.，2008 ；Stefansson et al.，2008 ；Vande 11 et al. ,2008)。對皮膚學家和化妝師來說，PAR2受體是有吸引力的研究靶標，這是由于它們涉及 皮膚炎癥、細胞增殖、腫瘤抑制、皮膚色素沉著和皮膚潮濕。激肽釋放酶作為PAR2受體的激活劑，正受到研究上文提及的皮膚過程的研究者越來越多的關注。大豆源的天然非變性 胰蛋白酶抑制劑被用作靶向皮膚色素沉著、UV暴露和皮膚潮濕的化妝產品的成分。大豆源 的豆種子(soy seed)和豆?jié){分別含有大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)和包曼-畢爾克抑制劑 (Bowman-Birk inhibitor, BBI) (Paine et al.，2001)。這些產品的所需效應歸因于導致 PAR2活化被阻斷的胰蛋白酶抑制作用。已經證明KLK5和KLK7在UVB輻照下過表達，同時 LEKTI表達降低，這表明了這些皮膚激肽釋放酶在UVB應激下在角質層脫屑中的作用(Nin M et al. ，2008)。已被提出的是，STI可減少UV光誘導的皮膚癌，原因是外用STI可停止長期暴露 UVB的小鼠中的腫瘤進展(Huang et al.，2004)。已提出，包含天然大豆提取物的產品可通 過激肽釋放酶抑制來阻斷PAR2活化。STI已經被證明可高效率地抑制胰蛋白酶樣KLK5和 14 (Brattsandet al.，2005)。已經報道了干燥皮膚的上層SC中的KLK5和7表達降低，以 及 UV 輻射后 KLK 活性升高(Voegeli et al.，2007)。絲氨酸蛋白酶抑制劑還已被預測可能在多個臨床領域疾病的治療中具有有益用 途，所述臨床領域例如腫瘤學、神經病學、血液學、肺醫(yī)學、免疫學、炎癥和傳染性疾病。絲 氨酸蛋白酶抑制劑還可能有助于如下疾病的治療血栓性疾病、哮喘、肺氣腫、肝硬化、關 節(jié)炎、癌、黑色素瘤、再狹窄、動脈粥樣硬化、創(chuàng)傷、休克和再灌注損傷。有用的綜述參見 Expert Opin. Ther. Patents (2002)，12(8)。絲氨酸蛋白酶抑制劑公開于美國公布的專利申 請 US 2003/0100089 和 2004/0180371，以及美國專利 6，784，182,6, 656，911,6, 656，910、 6，608，175,6, 534，495 和 6，472，393。皮膚病例如接觸性超敏反應、特應性皮炎、罕有遺傳性皮膚病(例如內瑟頓綜合 征)和銀屑病的特征在于超增殖性和炎癥性皮膚反應。大量人群患有這些疾病。例如，特 應性皮炎——一種遺傳性慢性皮膚病——在美國影響大約8百萬成年人和兒童。人們認為， 包括遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素在內的多因素的組合可能導致皮膚病。雖然大多數(shù)皮 膚病不是致命的，但是它們大大影響了患有這些疾病的患者的生命質量。通常用于治療皮膚病的含類固醇軟膏或抗組胺劑經常會造成很大的副作用。例 如，在長期使用時，外用或口服類固醇可使皮膚層變薄，造成骨質疏松并抑制兒童生長。還 出現(xiàn)的情況是，類固醇應用終止后經常會出現(xiàn)損傷復發(fā)。因此需要開發(fā)改良的非類固醇劑，用在用于治療皮膚病的治療性方法、預防性方 法或診斷方法中。本發(fā)明提供了用于治療、診斷或預防皮膚病的改良且可靠的方法，包括向 需要其的受試者給予治療有效量的絲氨酸蛋白酶抑制劑。這些目標以及從前述應明顯看出的其他目標已被本發(fā)明實現(xiàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及治療或預防皮膚病的方法，包括向哺乳動物給予包含重組體絲氨酸蛋 白酶抑制劑的藥物組合物。還公開了絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備用于治療皮膚病的藥劑中的用途。本發(fā)明的另一目標是治療或預防皮膚病的試劑盒，所述試劑盒包含重組體絲氨酸 蛋白酶抑制劑的藥物組合物。通過閱讀后面的具體實施方式
和隨附的權利要求書，其他目標和優(yōu)點對本領域技
6術人員將是明顯的，所述具體實施方式
參考如下示例性附圖進行。


圖1表示hK2蛋白酶抑制劑MD 820的DNA和蛋白序列。圖2表示hK2蛋白酶抑制劑MD 62的DNA和蛋白序列。圖3表示hK2蛋白酶抑制劑MD 83的DNA和蛋白序列。圖4表示hK2蛋白酶抑制劑MD 67的DNA和蛋白序列。圖5表示hK2蛋白酶抑制劑MD 61的DNA和蛋白序列。圖6表示hK2蛋白酶抑制劑MD 518的DNA和蛋白序列。圖7表示hK2蛋白酶抑制劑MDCI的DNA和蛋白序列。圖8表示野生型ACT的DNA和蛋白序列。圖9表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-Gl的DNA和蛋白序列。圖10表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-GlG的DNA和蛋白序列。圖11表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-Cll的DNA和蛋白序列。圖12表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-CllG的DNA和蛋白序列。圖13表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-E5的DNA和蛋白序列。圖14表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-E8的DNA和蛋白序列。圖15表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-Fll的DNA和蛋白序列。圖16表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-F3的DNA和蛋白序列。圖17表示hK14蛋白酶抑制劑ACT-G9的DNA和蛋白序列。圖18表示野生型AAT的DNA和蛋白序列。圖19表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-Gl的DNA和蛋白序列。圖20表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-GlG的DNA和蛋白序列。圖21表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-Cll的DNA和蛋白序列。圖22表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-C11G的DNA和蛋白序列。圖23表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-E5的DNA和蛋白序列。圖24表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-E8的DNA和蛋白序列。圖25表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-Fll的DNA和蛋白序列。圖26表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-F3的DNA和蛋白序列。圖27表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-G9的DNA和蛋白序列。圖28表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-G1V的DNA和蛋白序列。圖29表示hK14蛋白酶抑制劑AAT-C11D的DNA和蛋白序列。圖30示出用于轉基因hKLK5小鼠內瑟頓模型的皮膚損傷的分級體系。圖31示出在內瑟頓綜合征小鼠模型上形成的皮膚損傷大小。在外用2%羥乙基纖 維素(Natrosol)(第1組，對照)或溶于2%羥乙基纖維素中的MDPK67b (第2組)后1、15 和28天監(jiān)測損傷大小和損傷級別。
具體實施例方式本發(fā)明涉及絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備用于治療皮膚病的藥劑中的用途。絲氨酸蛋白酶抑制劑的生物學活性片段也可用于制備所述藥劑。胰凝乳蛋白酶超家族的一些絲氨酸蛋白酶(包括t-PA、纖溶酶、U-PA和血液凝固 級聯(lián)的蛋白酶)是除包含絲氨酸蛋白酶催化結構域還包含部分負責調節(jié)其活性的其他結 構域的大分子(Barrett, 1986 ；Gerard et al, 1986 ；Blasi et al.，1986)。重要的絲氨酸 蛋白酶有胰蛋白酶樣酶，例如胰蛋白酶、類胰蛋白酶、凝血酶、激肽釋放酶和因子Xa。絲氨酸 蛋白酶的靶標與諸如以下過程相關血液凝固、補體介導的水解、免疫應答、腎小球腎炎、疼 痛感覺、炎癥、胰腺炎、癌癥、調節(jié)受精、細菌感染和病毒成熟。通過抑制對具體靶標有高專 一性的絲氨酸蛋白酶，可以在體內抑制很多生物學過程，這可能對宿主有明顯的作用。絲氨酸蛋白質酶抑制劑(serpin)包含多組蛋白質，這些蛋白質形成已包含超 過100個來自多種生物體(例如病毒、植物和人)的成員的超家族。絲氨酸蛋白酶抑 制劑已演化超過5億年，在系統(tǒng)發(fā)生學中分成有抑制功能和非抑制功能的蛋白質(Hunt and Dayhoff，1980)。非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑如卵清蛋白缺乏蛋白酶抑制活性 (Remold-O' Donnell, 1993) 0絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員的主要功能似乎是中和過表 達的絲氨酸蛋白質酶活性(Potempa et al.，1994)。絲氨酸蛋白酶抑制劑在細胞外基質重 塑、炎癥反應的調節(jié)和細胞遷移中起作用(Potempa et al.，1994)。絲氨酸蛋白酶抑制劑分成如下家族牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(Kimitz)家族，也被 稱為基礎蛋白酶抑制劑(Ketcham et al. , 1978) ；Kazal家族；鏈霉菌屬枯草桿菌蛋白酶抑 制劑家族；絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)家族；大豆胰蛋白酶抑制劑(Kimitz)家族；馬 鈴薯抑制劑家族；和包曼-畢爾克(Bowman-Birk)家族(Laskowski et al.，1980 ；Readet al. , 1986 ；Laskowski et al.，1987)。屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的絲氨酸蛋白酶抑制 劑包括纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑PAI-1、PAI-2和PAI-3 ；Cl酯酶抑制劑，α -2-抗纖 維蛋白溶素、contrapsin、α-l-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、蛋白酶連接蛋白I、α-l-抗胰 凝乳蛋白酶、蛋白C抑制劑、肝素輔助因子II和生長激素調節(jié)蛋白(Carrelletal.，1987 ； Sommeretal.，1987 ；Suzuki et al.，1987 ；Stump et al.，1986)。許多絲氨酸蛋白酶抑制劑具有較寬特異性，能夠抑制胰凝乳蛋白酶超家族的蛋 白酶(包括血液凝固絲氨酸蛋白酶)和鏈霉菌屬枯草桿菌蛋白酶超家族的絲氨酸蛋白 酶(Laskowski et al.，1980)。絲氨酸蛋白酶抑制劑對絲氨酸蛋白酶的抑制已被綜述于 Travis et al. (1983) ,Carrelletal. (1985)和 Sprengers et al. (1987)中。可獲得大量 完整抑制劑和切割形式的絲氨酸蛋白酶抑制劑α-1-抗胰蛋白酶的晶體學數(shù)據(Read et al.，1986)，所述完整抑制劑包括BPTI、Kazal、SSI、大豆胰蛋白酶和馬鈴薯抑制劑家族的成 員。雖然這些絲氨酸蛋白酶抑制劑是具有不同大小和序列的蛋白質，但是迄今為止研究的 完整抑制劑都共同具有從所述分子表面伸出的特征環(huán)，稱為反應位點環(huán)，該環(huán)包含所述同 源絲氨酸蛋白酶的活性位點的識別序列(Levin et al.，1983)。不同絲氨酸蛋白酶抑制劑 中環(huán)的結構相似性是驚人的(Papamokos et al.，1982)。每種抑制劑的特異性被認為主要 是由緊鄰絲氨酸蛋白酶對抑制劑的可能的切割位點氨基末端的氨基酸的特性確定。該氨基 酸被稱為Pi位點殘基，被認為可與絲氨酸蛋白酶活性位點的絲氨酸形成酰鍵(Laskowski et al.，1980)。絲氨酸蛋白酶抑制劑是否擁有抑制功能強烈依賴于位于編碼區(qū)羧基末端附 近的反應位點環(huán)的鉸鏈區(qū)中的共有序列。在所述反應位點環(huán)外部，不同家族的絲氨酸蛋白 酶抑制劑一般是結構上不相關的，但Kazal家族和鏈霉菌屬枯草桿菌蛋白酶家族的抑制劑呈現(xiàn)出一些結構和序列的相似性。提供在本文中使用的如下定義，目的是使對本發(fā)明的理解更容易?！癮 (—個)”或“an ( —種)”是指“至少一種”或“一種或多種”。術語“包含”通常用于表示包括的意思，就是說允許存在一個或多個特征或組分。本文使用的術語“蛋白”、“多肽”、“多肽的”、“肽”和“肽的”或“肽鏈”在本文中可以 互換使用，用于表示通過相鄰殘基的α"氨基和羧基之間的肽鍵連接的一串氨基酸殘基。絲氨酸蛋白酶抑制劑優(yōu)選為重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑并選自SEQID No 2、4、6、 8、10、12和14，或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。所述重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑還優(yōu)選選自SEQ ID No 39_59或者其具有絲氨酸 蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段?！鞍被釟埢笔侵副绢I域技術人員已知的任何氨基酸殘基。這涵蓋天然出現(xiàn)的氨 基酸(包括例如，使用三字母代碼表示的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、 Leu、Lys, Met、Phe, Pro、Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)以及稀有和/或合成氨基酸及其衍生物 (包括例如 Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu> Des、Dpm> Hyl、McLys、McVal、Nva 等)。所述氨基酸殘基或其衍生物可以是任意異構體，特別是任意手性異構體，例如 L-型或D-型。氨基酸衍生物在此是指本領域中已知的任意氨基酸衍生物。例如，氨基酸衍生物 包括可衍生自天然氨基酸的攜帶額外側鏈(例如烷基側鏈)和/或雜原子取代的的殘基?！吧飳W活性片段”是指與各自的底物活性位點序列在長度上共享至少40%氨基 酸的序列?？梢允褂眠@些序列的條件是它們呈現(xiàn)與它們的天然來源序列相同的性質。這些 序列優(yōu)選與各自的底物活性位點序列在長度上共享超過70 %，優(yōu)選超過80 %，特別是超過 90%氨基酸。本發(fā)明還包括絲氨酸蛋白酶抑制劑序列的變體。術語“變體”是指具有在一定程 度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列是通過以下方式成為不同 于所述天然序列的氨基酸序列保守氨基酸置換，藉此一個或多個氨基酸被具有相同特征 和構象作用的另一氨基酸置換。所述氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的 某些位置處具有置換、缺失和/或插入。保守氨基酸置換在本文中定義為如下5組的一組 中的置換I.小的脂肪族、非極性或弱極性殘基Ala、Ser, Thr、Pro、GlyII.極性、帶正電荷殘基His、Arg、LysIII.極性、帶負電荷殘基及其酰胺Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳族殘基Phe、Tyr、TrpV.大的脂肪族非極性殘基Met、Leu、lie、VaUCys0本發(fā)明中應用的“給藥”是指藥物的、治療的、診斷的藥劑或組合物與受試者(優(yōu) 選人)的接觸。術語“激肽釋放酶”涉及腺體或組織激肽釋放酶。腺體或組織激肽釋放酶是絲 氨酸蛋白酶亞家族，具有高度的底物特異性，并且在多種組織和生物流體中的表達不同。 術語“激肽釋放酶”在20世紀30年代第一次出現(xiàn)于文獻中，當時在胰(胰在希臘語中是 “Kallikreas”)分離物中發(fā)現(xiàn)了大量蛋白酶(Kraut et al. 1930，Werle 1934)。如今，激肽釋放酶被分成兩組，血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶，這兩組激肽釋放酶的分子量、底 物特異性、免疫學特征、基因結構和所釋放激肽的類型顯著不同。激肽釋放酶包含15種 25_30kDa的同源單鏈的分泌型絲氨酸內肽酶的家族，有 直系同源物存在于來自至少6個哺乳動物目的物種中。這些激肽釋放酶是hK2、hK3、hK2、 hK5、hK6、hK7、hK8、hK9、hK10、hKll、hK12、hK13、hK14 和 hK15。擬被抑制的激肽釋放酶優(yōu) 選選自 hK2、hK5、hK7 和 hK14。本文中使用的“疾病”是指多種原因(例如感染、遺傳缺陷或環(huán)境應激)引起的生 物體部位、器官或系統(tǒng)的病理狀態(tài)，并且其特征在于可辨認的一組體征或癥狀。表皮已被證明可表達多種絲氨酸蛋白酶，包括激肽釋放酶、尿激酶、纖溶酶、 typtase樣酶和中性粒細胞彈性蛋白酶。這些絲氨酸蛋白酶參與皮膚中的多種活動，包括表 皮細胞增殖、細胞分化、皮膚和脂質屏障平衡以及組織重塑。最重要的是，在最外皮膚層脫 落(稱為脫屑)之前，絲氨酸蛋白酶和其他酶對角質層(SC)角質橋粒的蛋白水解是至關重 要的事件。再者，包括激肽釋放酶、纖溶酶和尿激酶在內的蛋白酶活性增加參與到皮膚的炎 癥反應。炎性皮膚病的列表示于表XX。還觀測到蛋白酶活性增加，形式為對包括如紫外線輻照暴露和溫度變化的環(huán)境因 子的多種刺激的應激反應，或者形式為對不同表面活性劑的反應。多種激肽釋放酶(特別是hK5、hK7和hK14)是導致皮膚脫屑中的蛋白質水解級聯(lián) 的原因。通過復雜的抑制和活化過程對這些蛋白水解過程進行控制，并且其去調控可以造 成嚴重的皮膚癥。罕有遺傳性疾病(內瑟頓綜合征、脫皮綜合征)以及較常見皮膚病如特 應性皮炎或銀屑病的特征在于至少部分地由激肽釋放酶活性增加造成的皮膚脫屑增加。本發(fā)明還涉及絲氨酸蛋白酶在制備用于治療或改善不良皮膚病癥的化妝品或藥 妝品中的用途。絲氨酸蛋白酶抑制劑的生物學活性片段也可用于所述化妝品或藥妝品中的 制備。“不良皮膚病癥”在本發(fā)明中是指感染皮膚或皮膚外觀的可能通常不將其看作是 疾病的問題。本文使用的“化妝品”是用于提升或保護人皮膚外觀的組合物?；瘖y品包括皮膚 養(yǎng)護乳膏、洗齊 、粉齊 、香水、唇膏、指甲和趾甲上光齊 、眼睛和面部化妝品、燙發(fā)齊 、染發(fā)齊U、 頭發(fā)噴霧劑和凝膠劑、除臭劑、嬰兒產品、沐浴油、泡沫劑、沐浴鹽、黃油和許多其它類型的
女口
廣 PFt ο“藥妝品”是被認為具有類似藥物益處的化妝品產品。一般標記為藥妝品的產品實 例包括抗衰老乳膏和保濕劑。藥妝品可含聲稱的活性成分，例如維生素、植物化學品、酶、抗 氧劑和精油。本文使用的“皮膚病”涉及感染皮膚的病癥。所述皮膚病通常選自表XX。本發(fā)明 優(yōu)選適合于治療皮膚病，例如特應性皮炎、接觸性皮炎(變應性)、接觸性皮炎(刺激性)、 濕疹、銀屑病、痤瘡、表皮過度角化、棘層肥厚、表皮炎癥、真皮炎癥或搔癢癥、酒渣鼻、內瑟 頓綜合征、A型和B型脫皮綜合征、遺傳性魚鱗病、化膿性汗腺炎和紅皮病(全身性剝脫性 皮炎)。所述皮膚病最優(yōu)選選自內瑟頓綜合征、特應性皮炎、銀屑病和脫皮綜合征。內瑟頓綜合征(NS)是由SPINK5(LEKTI)(皮膚激肽釋放酶級聯(lián)的一種主要抑制 劑)中的突變造成的罕有常染色體隱性遺傳性皮膚病。激肽釋放酶活性增加已經被證明是其臨床癥狀的成因。NS (—種多系統(tǒng)魚鱗病綜合征)的特征在于魚鱗病、紅皮病、毛干缺陷 和異位性特征。由皮膚的屏障功能嚴重受損引起的多發(fā)性感染非常常見。NS非常罕見，但可獲得的關于頻率的數(shù)據很少，這可能部分地由于難以鑒定NS。 如今，每百萬人診斷出不超過10例?？蛇x的治療方法十分有限且是非治愈性的。它們主要集中在處理各種皮膚感染以 及減少瘙癢和疼痛(例如皮質醇)。激肽釋放酶(hK5、hK7、hK14)活性過大被證明是皮膚病變的癥狀的成因。天然激 肽釋放酶抑制劑(LEKTI)活性的降低可以由其他激肽釋放酶抑制劑代替。令人驚奇的是，申請人已證明(例如在實施例4中)，應用包括MD67 (SEQ ID N。8) 的絲氨酸蛋白酶抑制劑在小鼠模型(原位hK5過表達)中顯著降低了癥狀的嚴重度，所述 癥狀出現(xiàn)于未處理的皮膚病(例如NS)模型中。所述癥狀的特征在于皮膚的嚴重脫皮，這 一點歸因于由成熟前橋粒蛋白的降解導致的角質橋粒的分裂和角質層脫離。這一點會造成 皮膚屏障功能的嚴重喪失，導致嚴重的脫水、紅斑和強擦傷。特應性皮炎(AD)是病因不詳?shù)酿W性疾病，它通常在嬰兒早期開始并且以瘙癢、 濕疹損傷和皮膚干厚為特征。AD與其他特應性病(例如約30%的患者中的哮喘、變態(tài)反 應)相關，并且常見有皮膚感染。對AD的病理生理學了解很少。似乎有遺傳成分。涉及TH2細胞異常的免疫缺陷被 提出，并且蛋白酶活性的失調被發(fā)現(xiàn)參與該疾病。該失調被認為可造成角質層中屏障功能 損壞，導致抗原進入，這會致使多種炎癥細胞因子產生。在美國，兒童的患病率為10-12%， 成人為0.9%。在其他發(fā)達國家中，患病率高達18%且還在增加，特別是在發(fā)達國家中。該 疾病是慢性的，但大多數(shù)患者從童年期到成年期會有所好轉。仍無治愈性療法。根據癥狀嚴重程度，通常開出局部用類固醇、抗組胺劑和免疫調 節(jié)劑或者抗生素、抗病毒劑和抗真菌劑的處方。銀屑病是一種慢性病，它是非接觸傳染的并且通常呈現(xiàn)為發(fā)炎的皮膚水腫損傷， 但也出現(xiàn)于口腔粘膜上。10%患者的關節(jié)也受到影響(關節(jié)炎)。紅腫塊與多種全身和環(huán)境 因素包括應激事件或感染有關。銀屑病有遺傳傾向，并且有越來越多的自身免疫病變跡象 的證據。蛋白酶(例如激肽釋放酶)活性增加參與到典型的皮膚脫屑過多。在美國，2-3% 的人群患病，每年出現(xiàn)超過200，000新病例。每年大約150萬患有銀屑病關節(jié)炎的人就醫(yī)， 每年4萬人死于銀屑病相關原因。銀屑病在其他國家的發(fā)病率類似，但取決于氣候和人群 的遺傳情況(genetic heritage) 0它不常見于熱帶和深膚色人中。目前，沒有治愈性的療法。根據癥狀嚴重程度可開出局部用皮質醇、煤焦油、角質 軟化劑或類視色素的處方。用于治療目的的“哺乳動物”是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、家養(yǎng)和農 場動物以及動物園動物、體育動物或寵物，例如狗、馬、貓、奶牛、猴子等。哺乳動物優(yōu)選是 人?！爸委煛笔侵钢委熜灾委熀皖A防或防備措施。需要治療者包括已經患有所述病變的 治療者，以及待防備所述病變的治療者。因此，待治療的哺乳動物在本文中可以被診斷為患 有所述病變，或者可以對所述病變有傾向或易感。術語“受試者”是指人或其他哺乳動物患者，包括希望使用本發(fā)明的方法檢查或治
11療的任何個體。然而，應理解“患者”不是自動地表示存在癥狀或疾病。短語“可藥用的”是指這樣的分子實體和組合物，即它們是生理耐受的，并且在被 給予人時一般不產生變應性反應或類似的不良反應，例如反胃、頭暈等。本文使用的術語“蛋白酶”是指一類識別分子并在所述分子中切割活化序列的酶。 所述蛋白酶可以是切割內部肽鍵的內肽酶?；蛘撸龅鞍酌缚梢允菑亩嚯幕虻鞍追肿拥腘 末端或C末端水解肽鍵的外肽酶。所述蛋白酶折疊成一種構象，以形成接受并切割所述活 化序列的催化位點?！耙种苿笔侵竷?yōu)選通過結合激肽釋放酶或絲氨酸蛋白酶來特異性抑制所述激肽 釋放酶或絲氨酸蛋白酶的多肽或化合物?！胺磻越z氨酸蛋白酶抑制劑環(huán)”、“反應位點環(huán)”或RSL是指出現(xiàn)于絲氨酸蛋白酶 抑制劑中并參與與可能的靶蛋白酶相互作用的暴露的柔性反應位點環(huán)。從易切斷鍵的氨基 側的殘基開始離開所述鍵往外，殘基通常稱為PI、P2、P3等。所述易切斷鍵后的殘基稱為 P1，、P2，、P3，等。RSL通常由6-12個氨基酸殘基組成。本發(fā)明的“絲氨酸蛋白酶抑制劑”或絲氨酸蛋白酶抑制劑可選自α-1抗胰凝乳 蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制劑(PCI)、α-1抗蛋白質酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相關蛋 白前體(ATR)、α-2-纖溶酶抑制劑(ΑΑΡ)、人抗凝血酶-III前體(ATIII)、蛋白酶抑制劑 IO(PIlO)、人膠原結合蛋白2前體(CBP2)、蛋白酶抑制劑7(ΡΙ7)、蛋白酶抑制劑肝素輔因 子(leUSerpin)2(HLS2)、人血漿蛋白酶Cl抑制劑(ClINH)、單核細胞/中性粒細胞彈性蛋 白酶抑制劑(M/NEI)、纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑_3(PAI3)、蛋白酶抑制劑4(PI4)、蛋白 酶抑制劑5(PI5)、蛋白酶抑制劑12(PI12)、人纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1前體內皮 型(PAI-I)、人纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-2胎盤型(PAI2)、人色素上皮衍生因子前體 (PEDF)、蛋白酶抑制劑6(PI6)、蛋白酶抑制劑8(PI8)、蛋白酶抑制劑9 (PI9)、人鱗狀細胞癌 抗原1 (SCCA-I)、人鱗狀細胞癌抗原2(SCCA-2)、T4_結合球蛋白(TBG)、MegSin、蛋白酶抑制 劑14(PI14)、它們的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。由于大多數(shù)這些絲氨酸蛋白酶抑制劑具有不同的名稱，本申請人給出了下表I，總 結它們的詳細說明表 I
權利要求
絲氨酸蛋白酶抑制劑或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段在制備用于治療皮膚病的藥劑中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑是重組體抑制劑蛋白。
3.權利要求1-2的用途，其中所述絲氨酸蛋白酶選自激肽釋放酶、纖溶酶、胰凝乳蛋白 酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、類胰蛋白酶和中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、以及/或者它們的結 合物。
4.權利要求3的用途，其中所述激肽釋放酶選自hK2、hK5、hK7和hK14、和/或它們的結合物。
5.權利要求1-4的用途，其中所述皮膚病選自內瑟頓綜合征、特應性皮炎、銀屑病和脫 皮綜合征。
6.權利要求5的用途，其中所述皮膚病為內瑟頓綜合征。
7.權利要求1-6的用途，其中所述重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑選自SEQID No 2、4、6、 8、10、12和14、或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。
8.權利要求1-6的用途，其中所述重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑選自SEQID No 39-59， 或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。
9.一種用于在哺乳動物中治療或預防皮膚病的方法，包括向所述哺乳動物給予包含重 組體絲氨酸蛋白酶抑制劑或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段的藥物 組合物。
10.權利要求9的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶選自激肽釋放酶、纖溶酶、胰凝乳蛋白 酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、類胰蛋白酶和中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、以及/或者它們的結 合物。
11.權利要求10的方法，其中所述激肽釋放酶選自hK2、hK5、hK7和hK14、和/或它們的結合物。
12.權利要求11的方法，其中所述皮膚病選自內瑟頓綜合征、特應性皮炎、銀屑病和脫 皮綜合征。
13.權利要求12的方法，其中所述皮膚病為內瑟頓綜合征。
14.權利要求9-13的方法，其中所述重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑選自SEQID No 2、4、 6、8、10、12和14，或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。
15.權利要求9-13的方法，其中所述重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑選自SEQID No 39-59，或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。
16.一種用于治療或預防皮膚病的試劑盒，所述試劑盒包含重組體絲氨酸蛋白酶，以及 任選的試劑和/或使用說明書。
17.一種用于改善不利皮膚病癥的化妝品組合物，包含藥物有效量的重組體絲氨酸蛋 白酶抑制劑或者其具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的生物學活性片段。
18.權利要求17的化妝品組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制劑為重組體抑制劑蛋白。
19.權利要求18的化妝品組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶選自激肽釋放酶、纖溶酶、胰 凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、類胰蛋白酶和中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、以及/或者 它們的結合物。
20.權利要求21的化妝品組合物，其中所述激肽釋放酶選自hK2、hK5、hK7*hK14、* /或它們的結合物。
21.絲氨酸蛋白酶抑制劑或其生物學活性片段在制備用于改善不利皮膚病癥的化妝品 組合物中的用途。
22.一種用于在組織樣品中診斷或預后皮膚病的檢測測定法，包括將所述組織樣品與 具有檢測標記的重組體絲氨酸蛋白酶抑制劑相接觸，確定并測量所述檢測標記的量，并且 將該量與所述組織樣品中存在或不存在疾病相關聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及為絲氨酸蛋白酶抑制劑的治療性化合物，涉及其藥物組合物并且涉及它們在治療人體或動物體中的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療、診斷或預后皮膚病的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的絲氨酸蛋白酶抑制劑。
文檔編號A61K8/64GK101977626SQ200980109973
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權日2008年1月21日
發(fā)明者A·霍夫納尼安, C·德雷松, C·昆丁, D·德佩爾特 申請人:德莫迪斯公司;國立健康與醫(yī)學研究所