專利名稱：具有丙型肝炎病毒基因的重組痘苗病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎的預(yù)防藥及治療藥。詳細(xì)而言，涉及能夠表達(dá)丙型肝炎病毒 基因的重組痘苗病毒、以及含有該重組痘苗病毒的丙型肝炎用的預(yù)防藥及治療藥。
背景技術(shù)：
在日本，丙型肝炎病毒(HCV)的感染者存在200萬(wàn)人以上，其中每年有3萬(wàn)6千之 多的人發(fā)生肝細(xì)胞癌，其癌患者很多會(huì)死亡。現(xiàn)在唯一且有效的抗HCV藥使用的是干擾素 (IFN)，但其效果有限，副作用也很嚴(yán)重，因此要求開(kāi)發(fā)更安全且有效的藥劑。進(jìn)而，感染者 在高齡化，與此相伴得癌的風(fēng)險(xiǎn)也增高，因此要求快速應(yīng)對(duì)?，F(xiàn)狀下，開(kāi)發(fā)了抑制HCV的病毒復(fù)制的核酸類似物、蛋白酶抑制劑等藥劑并用于 治療。然而，使用這些藥劑進(jìn)行治療時(shí)，容易出現(xiàn)耐藥性病毒，另外從其作用機(jī)理來(lái)看也難 以完全排除病毒，因此需要終生投藥治療。從這樣的現(xiàn)狀出發(fā)，強(qiáng)烈希望建立一種根治療 法，以從終生投藥治療中脫離和解放。本發(fā)明人等通過(guò)制作具有感染性的HCV的cDNA克隆、建立可感染HCV的轉(zhuǎn)基因小 鼠及人肝臟嵌合小鼠等感染動(dòng)物等，建立了有關(guān)HCV研究的研究資源，并逐漸建立了各種 模型實(shí)驗(yàn)體系(例如參照非專利文獻(xiàn)1)。作為HCV感染的很大的特征，可列舉出高發(fā)的持 續(xù)感染和向慢性肝炎發(fā)病的轉(zhuǎn)變。本發(fā)明人等長(zhǎng)年累月從免疫耐受的獲得和其破壞等觀 點(diǎn)出發(fā)，用上述模型實(shí)驗(yàn)體系等對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了深入的分析和研究(例如參照非專利文獻(xiàn) 2)。迄今為止，嘗試開(kāi)發(fā)了很多用于預(yù)防HCV感染的疫苗，但沒(méi)有獲得能夠完全預(yù)防 感染的結(jié)果(例如參照非專利文獻(xiàn)3、4、5、6)。非專利文獻(xiàn)1 =Wakita T.，et al.，J. Biol. Chem.，1998，vol. 273，p9001_9006非專利文獻(xiàn) 2 Inoue K.，et al.，Hepatology, 2007, vol. 45，p921_928非專利文獻(xiàn)3 =Choo QL.，et al.，Pros. Natl. Acad. Sci. 1994，vol. 91，1294-1298非專利文獻(xiàn)4 =Puig Μ.，et. al.，Vaccine 2004，vol. 22，991-1000非專利文獻(xiàn)5 =Abraham JD.，Vaccine 2004，vol. 22，3917-3928非專禾丨J 文獻(xiàn) 6 =Elmowalid GA.，et. al.，Pros. Natl. Acad. Sci. 2007, vol. 104， 8427-843
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題在于，提供一種含有對(duì)阻止丙型肝炎的感染發(fā)病有效的重組 痘苗病毒的治療藥或預(yù)防藥。本發(fā)明人等基于前述有關(guān)HCV感染的分析及研究結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行了深入研究， 結(jié)果想到，將使用重組牛痘疫苗帶來(lái)的免疫強(qiáng)力活化與有力的丙型肝炎感染預(yù)防法聯(lián)系起 來(lái)。進(jìn)而想到，將使用重組牛痘疫苗等帶來(lái)的免疫引起清除(elimination)系統(tǒng)的強(qiáng)力活 化與一個(gè)有力的丙型肝炎根治療法聯(lián)系起來(lái)，能夠有望完全控制難以根治的病毒疾患的病情。并且，本發(fā)明人等以由長(zhǎng)年有關(guān)病毒感染癥的研究得到的見(jiàn)解為基礎(chǔ)，為了解決上述課 題而進(jìn)行了深入研究。結(jié)果成功制作了對(duì)阻止丙型肝炎的感染發(fā)病有效的重組痘苗病毒， 從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。(1) 一種重組痘苗病毒，其包含表達(dá)啟動(dòng)子、及丙型肝炎病毒基因組的cDNA的全 部或一部分。作為痘苗病毒，例如可列舉出LC 16m8株。另外，丙型肝炎病毒基因組的cDNA可 列舉出編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA，另外，也可以 是編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白這兩者的cDNA。具體而言，丙型肝炎病毒基因組的cDNA可例示出以下的(a) (f)的DNA (a)由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)與由序列號(hào)1所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜 交、且編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的DNA，(c)由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(d)與由序列號(hào)2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜 交、且編碼丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA，(e)由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(f)與由序列號(hào)3所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜 交、且編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA。進(jìn)而，作為本發(fā)明的重組痘苗病毒中所含的表達(dá)啟動(dòng)子，例如可列舉出雜合啟動(dòng) 子。具體而言，雜合啟動(dòng)子的堿基序列可例示出以下的(a)或(b)的DNA:(a)由序列號(hào)4所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)與由序列號(hào)4所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜 交、且具有啟動(dòng)子活性的DNA，(2)含有上述(1)的重組痘苗病毒的藥物組合物。上述藥物組合物可作為丙型肝炎的預(yù)防藥或治療藥使用。


圖1是表示用于制作H CV重組痘苗病毒的質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)的圖。圖2是表示利用PCR確認(rèn)HCV基因?qū)胫兴褂玫囊锏奈恢煤兔Q的圖。圖3是表示利用PCR確認(rèn)HCV基因?qū)氲慕Y(jié)果的、瓊脂糖凝膠電泳的照片。圖4是表示利用免疫印跡法確認(rèn)HCV蛋白表達(dá)的結(jié)果的、PVDF膜的照片。圖5是表示HCV-RVV的體液性/細(xì)胞性免疫誘導(dǎo)功能的確認(rèn)方法的圖。圖6是表示通過(guò)ELISA法測(cè)定HCV-RVV的作為疫苗的體液性免疫誘導(dǎo)功能效果得 到的結(jié)果的圖。圖7是表示通過(guò)ELISP0T分析測(cè)定HCV-RVV的作為疫苗的細(xì)胞性免疫誘導(dǎo)功能效 果得到的結(jié)果的圖。圖8是表示表達(dá)丙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)基因小鼠的Cre/loxP開(kāi)關(guān)基因表達(dá)的圖。圖9是表示HCV基因表達(dá)后的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)HCV核心蛋白量的經(jīng)日變化(畫面A)及轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的肝炎發(fā)病所致的組織變化(畫面B)的圖。圖10是表示向HCV轉(zhuǎn)基因小鼠投與HCV重組痘苗病毒的日程表的圖。圖11是表示向HCV轉(zhuǎn)基因小鼠投與HCV重組痘苗病毒后的治療效果的圖。
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明的重組痘苗病毒及其用途進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍并不局 限于這些說(shuō)明，除以下的例示以外，可在不損害本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)作適當(dāng)變更而實(shí)施。本說(shuō)明書包含作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)要求的基礎(chǔ)的日本國(guó)專利申請(qǐng)即日本特愿 2008-57515號(hào)(2008年3月7日申請(qǐng))及日本特愿2008-294361號(hào)(2008年11月18日申 請(qǐng))的說(shuō)明書的內(nèi)容。另外，本說(shuō)明書中引用的專利文獻(xiàn)、非專利文獻(xiàn)及其他出版物作為參照而引入本 說(shuō)明書中。1.概要在各種疫苗中，活疫苗是特別有效的疫苗之一，已知的是通常開(kāi)發(fā)新病毒的減毒 疫苗需要非常長(zhǎng)的時(shí)間，認(rèn)為這一點(diǎn)上HCV也同樣。作為在這種情況下采取的方法之一，已知有制作重組痘苗病毒(RVV)作為活疫苗 的基因工程學(xué)的方法。例如，已證實(shí)本發(fā)明人等開(kāi)發(fā)的狂犬病病毒用或牛瘟(rinderpest) 用的重組痘苗病毒在野外試驗(yàn)等中可發(fā)揮優(yōu)異的感染發(fā)病預(yù)防效果(例如參照Tsukiyama K.，et al.，Arch. Virol.，1989，vol. 107，p. 225—235)。另外關(guān)于新型肺炎SARS，本發(fā)明人等成功制作了具有已知為其病原體的 SARS-CoV的cDNA的重組痘苗病毒(W02006/038742)，確認(rèn)是具有優(yōu)異的預(yù)防效果和可再投 與的制劑(例如參照 Kitabatake M.，et al.，Vaccine, 2007, vol. 25，p. 630-637)。作為用于制作RVV的重組母體即痘苗病毒，必須是已確定安全性的疫苗株，作為 這種疫苗株，已知有痘苗病毒LC 16m8株(例如參照臨床和病毒vol. 3, No. 3, 269，1975)。 LC 16m8株由Lister株分離得到，具有實(shí)際作為預(yù)防疫苗的投與成績(jī)，且已確認(rèn)安全性及 有效性，是現(xiàn)在制造的唯一的疫苗株。另外，本發(fā)明人等在開(kāi)發(fā)研究針對(duì)牛瘟、HIV、SARS-CoV等的重組痘苗病毒的過(guò) 程中發(fā)現(xiàn)，使用能夠大大提高抗體產(chǎn)生功能及細(xì)胞性免疫的誘導(dǎo)功能的基因表達(dá)啟動(dòng)子， 對(duì)于本發(fā)明的痘苗病毒是有效的。具體而言，發(fā)現(xiàn)作為質(zhì)粒載體優(yōu)選使用PSFJ 1-10、 PSFJ2-16 (例如參照 Jin N-Y, et al.，Arch. Virol. 1994，Vol. 138，p. 315-330、Elmowalid GA.，et. al.，Pros. Natl. Acad. Sci. 2007，vol. 104，8427-8432 ；Arch. Virol. 138，315-330， 1994 ；日本特開(kāi)平6-237773號(hào)公報(bào)等)。其結(jié)果是，本發(fā)明人通過(guò)將編碼HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白的基因和/或編碼結(jié)構(gòu)蛋白的 基因與啟動(dòng)子一起引入痘苗病毒中，從而成功制作了 HCV重組痘苗病毒。作為本發(fā)明的重組痘苗病毒的母體的病毒是如上所述的痘苗病毒。在其基因組中 引入HCV的cDNA即得到本發(fā)明的重組痘苗病毒。分別克隆編碼HCV的蛋白的所有基因區(qū)、 外殼蛋白區(qū)域及參與復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的基因，將其作為表達(dá)單元，并分別導(dǎo)入到痘 苗病毒載體中。將該表達(dá)單元導(dǎo)入到痘苗病毒的HA遺傳區(qū)(GENETIC REGION)中。已知的 是，即使在HA遺傳區(qū)中導(dǎo)入外來(lái)基因，對(duì)于痘苗病毒的增殖活性也沒(méi)有影響，因此可使用
5增殖能力弱的安全的疫苗株作為重組母病毒(Vaccine 12，675-681，1994)。重組牛痘活疫苗中，針對(duì)狂犬病病毒、牛瘟病毒的疫苗進(jìn)行了野外試驗(yàn)，證明了其 感染發(fā)病預(yù)防效果的優(yōu)秀性。本發(fā)明人在雜合啟動(dòng)子的下游插入編碼丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白的所有基因、 編碼外殼蛋白區(qū)域的基因、及編碼參與復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的基因，并將這些基因引入 到減毒痘苗病毒株的血細(xì)胞凝集素(HA)基因區(qū)中，從而制作了重組痘苗病毒(RVV)。雜合啟動(dòng)子由痘病毒A型包涵體(ATI)啟動(dòng)子及多次重復(fù)的痘苗病毒7. 5kDa 蛋白(p7. 5)早期表達(dá)啟動(dòng)子構(gòu)成(參照 JinN-Y，et al.，Arch. Virol. 1994，vol. 138， p. 315-330)。該啟動(dòng)子由北海道大學(xué)的志田壽利博士開(kāi)發(fā)，也能夠由該博士提供。已確認(rèn)通過(guò)使制作的RVV感染動(dòng)物細(xì)胞可大量表達(dá)HCV蛋白，另外還確認(rèn)通過(guò)接 種到動(dòng)物個(gè)體早期產(chǎn)生了針對(duì)HCV的高效價(jià)的抗體。另外，通過(guò)ELISP0T分析確認(rèn)接種到 動(dòng)物個(gè)體時(shí)細(xì)胞性免疫也被活化，從而完成了本發(fā)明。2. HCV重組痘苗病毒的制作編碼丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白的所有基因、編碼外殼蛋白區(qū)域的基因及編碼參 與復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的基因已被克隆，并插入到質(zhì)粒中。因此，本發(fā)明的重組病毒中所 含的基因可通過(guò)通常的基因工程學(xué)的方法獲得。例如可使用基因工程學(xué)的方法中通常使用 的利用DNA合成裝置合成核酸的方法。另外，可以使用分離或合成作為模板的基因序列 后，設(shè)計(jì)各個(gè)基因的特異性引物，使用PCR裝置擴(kuò)增其基因序列的PCR法；或使用克隆載體 的基因擴(kuò)增法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等容易地進(jìn)行上述方法。所得PCR產(chǎn)物的純化可使用公知的方 法。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，模板可使用上述質(zhì)粒中插入的HCV基因(基因型Ib ；核 酸號(hào) 1-9611 ；DDB J/EMBL/GenB ankaccession number ；AY045702)。并且，以 HCV 基因 cDNA 作為模板，使用HCV基因特異性引物進(jìn)行PCR，從而能夠制備HCV的各基因區(qū)。本發(fā)明中， 將HCV的所有基因區(qū)稱為“CN5”，將編碼外殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的基因稱為“CN2”，將編 碼參與復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的基因稱為“N25”。CN2.N25及CN5的堿基序列分別如序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3所示。但是，除由 序列號(hào)1 3所示的堿基序列構(gòu)成的DNA以外，本發(fā)明中還可以使用以下的DNA。與由序列號(hào)1所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、 且編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的DNA (CN2的突變型DNA)。與由序列號(hào)2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、 且編碼丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA(N25的突變型DNA)。與由序列號(hào)3所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、 且編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA (CN5的突變型DNA)。這里，“編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白”是指編碼構(gòu)成病毒的外殼的蛋白，具體而 言，至少編碼核心區(qū)域、El區(qū)域、E2區(qū)域(圖1的A)。另外，“編碼丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋 白”是指編碼病毒增殖時(shí)細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白，具體而言，至少編碼NS2區(qū)域、NS3區(qū)域、NS4a 區(qū)域、NS4b區(qū)域、NS5a區(qū)域、NS5b區(qū)域(圖1的B)。另外，上述編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因及編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，除全長(zhǎng)序列以外，也包
6含其部分序列。為CN2時(shí)，只要包含核心區(qū)域、El區(qū)域及E2區(qū)域的全部或任一區(qū)域，則沒(méi)有 必要是全長(zhǎng)，也可以是其一部分。例如，可使用序列號(hào)1所示的堿基序列的El區(qū)域(589 1164位)、E2的區(qū)域(1165 2253位)。為N25時(shí)，只要包含NS2區(qū)域、NS3區(qū)域、NS4a區(qū) 域、NS4b區(qū)域、NS5a區(qū)域及NS5b區(qū)域的全部或任一區(qū)域，則沒(méi)有必要是全長(zhǎng)，也可以是其 一部分。例如，可使用序列號(hào)2所示的堿基序列的NS2區(qū)域(805 1455位)、NS3區(qū)域 (1456 3348位)。為CN5時(shí)，只要包含核心區(qū)域、El區(qū)域、E2區(qū)域、NS2區(qū)域、NS3區(qū)域、 NS4a區(qū)域、NS4b區(qū)域、NS5a區(qū)域及NS5b區(qū)域的全部或任一區(qū)域，則沒(méi)有必要是全長(zhǎng)，也可 以是其一部分。例如，可使用序列號(hào)3所示的堿基序列的El區(qū)域(589 1164位)、E2區(qū) 域(1165 2253 位)、NS2 區(qū)域(2443 3093 位)、NS 3 區(qū)域(3094 4986 位)。上述突變型DNA可通過(guò)化學(xué)合成獲得，或者，以由序列號(hào)1 3所示的堿基序列 構(gòu)成的DNA或其片段作為探針，通過(guò)菌落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交法，由 cDNA文庫(kù)及基因組文庫(kù)獲得。上述雜交中，作為嚴(yán)格的條件，例如可列舉出0. IXSSC 10XSSC、0. 1. 0% SDS及20°C 80°C的條件，更詳細(xì)而言，可列舉出在37°C 56°C下 進(jìn)行30分鐘以上預(yù)雜交后，在0. 1XSSC、0. 1% SDS中、室溫下進(jìn)行1 3次10 20分鐘 的洗滌的條件。關(guān)于雜交法的詳細(xì)步驟，可參照“MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nd ed. ” (Cold Spring HarborPress (1989))等。另外，可使用與序列號(hào)1所示的堿基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、 80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu) 蛋白的DNA(CN2的突變型DNA)，與序列號(hào)2所示的堿基序列具有50%以上、60%以上、70% 以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且編碼丙型肝炎病毒 的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA (N25的突變型DNA)，與序列號(hào)3所示的堿基序列具有50%以上、60% 以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且編碼丙型 肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白及結(jié)構(gòu)蛋白的DNA(CN5的突變型DNA)。本發(fā)明的重組痘苗病毒中所含的啟動(dòng)子是痘苗病毒的血細(xì)胞凝集素(HA)基因區(qū) 內(nèi)由痘病毒A型包涵體(ATI)啟動(dòng)子及多次重復(fù)的痘苗病毒7. 5kDa蛋白(p7. 5)早期表 達(dá)啟動(dòng)子構(gòu)成的雜合啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒連接，例如已知有pBMSF7C(Arch. Virol. 138,315-330,1994 ；日本特開(kāi)平 6-237773 號(hào)公報(bào))。本發(fā)明中可使用的雜合啟動(dòng)子的堿基序列如序列號(hào)4所示。但是，除由序列號(hào)4 所示的堿基序列構(gòu)成的DNA以外，本發(fā)明中也可以使用與由序列號(hào)4所示的堿基序列的互 補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、且具有啟動(dòng)子活性的DNA?！皣?yán)格的條件”與 前述相同?！熬哂袉?dòng)子活性”是指具有編碼結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄活性。通過(guò)該雜合啟動(dòng)子表達(dá)的蛋白從痘苗病毒感染前期至后期可以受到完全的糖修 飾的形式大量表達(dá)。本發(fā)明中，將在PBMSF7C的啟動(dòng)子下游插入有HCV基因(CN5)的質(zhì)粒 載體稱為PBMSF7C-CN5。另外，本發(fā)明中，將在pBMSF7C的啟動(dòng)子下游插入有外殼蛋白區(qū)域 基因(CN2)的質(zhì)粒載體稱為pBMSF7C-CN2。進(jìn)而，將在pBMSF7C的啟動(dòng)子下游插入有非結(jié)構(gòu) 蛋白基因(N25)的質(zhì)粒載體稱為pBMSF7C-N25。通過(guò)將這些質(zhì)粒載體導(dǎo)入到作為宿主的痘苗病毒中，可制作重組痘苗病毒。質(zhì)粒 載體向宿主中的導(dǎo)入可采用公知的任意方法，例如通過(guò)在感染了減毒痘苗病毒LC 16m8株 的動(dòng)物細(xì)胞中分別導(dǎo)入質(zhì)粒載體pBMSF 7C-CN5、pBMSF7C-CN2、pBMSF7C-N25，從而在痘苗病毒的血細(xì)胞凝集素(HA)基因區(qū)引起同源重組，可制作分別表達(dá)HCV的各蛋白的重組痘苗病 毒(RVV-CN5、RVV-CN2 及 RVV-N25)。另外，用于制作RVV的痘苗病毒LC16m8株是可在動(dòng)物個(gè)體中增殖、但在神經(jīng)細(xì)胞 中的增殖性非常低的減毒株。在日本被批準(zhǔn)作為天花疫苗，接種于約5萬(wàn)的幼兒，結(jié)果沒(méi)有 產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用(厚生省種痘研究班研究報(bào)告、臨床和病毒vol. 3, No. 3，269，1975)。另 一方面，據(jù)報(bào)道免疫誘導(dǎo)功能與作為親株的Lister株相同，LC 16m 8株是安全且有效的疫
田ο所制作的RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25由于在痘苗病毒的HA基因區(qū)插入了 HCV 的蛋白基因，因此HA蛋白的表達(dá)欠缺，不會(huì)引起紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。因此，使動(dòng)物細(xì)胞感染 RVV-CN5、RVV-CN2及RVV-N25，以由此形成的噬菌斑中的雞紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)為指標(biāo)，進(jìn)行 RVV的篩查。目標(biāo)RVV只要篩選沒(méi)有出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集的白噬菌斑即可。對(duì)于由白噬菌斑獲得的病毒，以病毒基因組作為模板通過(guò)HCV基因特異性引物進(jìn) 行PCR，可確認(rèn)HCV的基因?qū)?。HCV蛋白的表達(dá)可以感染RVV-CN5、RVV-CN2及RVV-N25后的動(dòng)物細(xì)胞作為樣品、 并通過(guò)免疫印跡法進(jìn)行確認(rèn)。另外，抗體可使用由用HCV多肽進(jìn)行免疫而制作的抗血清 (J. Biol. Chem. 279 14531-14541，2004)通過(guò) Protein G 純化 IgG 而得到的抗體。作為RVV的制作中目標(biāo)基因的插入部位，除HA基因區(qū)以外，通常使用胸苷激酶 (TK)基因區(qū)，已知的是，通過(guò)在TK基因區(qū)插入目標(biāo)基因，由于TK的表達(dá)缺陷而RVV的增殖 性降低。另一方面，據(jù)報(bào)道，HA蛋白表達(dá)缺陷對(duì)RVV的增殖性基本沒(méi)有影響(Vaccine 12， 675-681,1994)。因此，本發(fā)明中，作為目標(biāo)基因的插入部位，優(yōu)選HA基因區(qū)。3.丙型肝炎預(yù)防或治療用藥物組合物本發(fā)明提供含有上述重組痘苗病毒的丙型肝炎預(yù)防藥及丙型肝炎治療藥(藥物 組合物)。本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)所有公知的方法例如肌肉、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)或皮下等的 注射、或由鼻腔、口腔或肺的吸入、經(jīng)口投與導(dǎo)入到生物體內(nèi)。進(jìn)而，也可以將本發(fā)明的藥物 組合物中所含的重組病毒與現(xiàn)有抗病毒藥(例如干擾素)并用。并用的方式?jīng)]有特別限定， 可以同時(shí)投與本發(fā)明的重組病毒和現(xiàn)有抗病毒藥，也可以通過(guò)投與一者后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后 投與另一者的方法導(dǎo)入到生物體內(nèi)。另外，本發(fā)明的藥物組合物可以與賦形劑、增量劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑等公知的藥學(xué) 上容許的載體、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、著色劑、保存劑、香料、風(fēng)味劑、甜味劑等混合。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、液劑、糖漿劑等經(jīng) 口投與劑、注射劑、外用劑、坐劑、滴眼劑等非經(jīng)口投與劑等形態(tài)進(jìn)行經(jīng)口投與或非經(jīng)口投 與。優(yōu)選例示出對(duì)皮內(nèi)、肌肉、腹腔等的局部注射等。投與量可根據(jù)有效成分的種類、投與途徑、投與對(duì)象、患者的年齡、體重、性別、癥 狀及其他條件適當(dāng)選擇，作為病毒的一天投與量，經(jīng)口時(shí)為1000 1000000000PFU(噬菌斑 形成單位，plaq ue forming units)左右，優(yōu)選為100000 100000000PFU左右，非經(jīng)口時(shí) 為 100 1000000000PFU(plaq ue formingunits)左右，優(yōu)選為 1000 100000000PFU 左 右。病毒可以1天1次投與，也可以分?jǐn)?shù)次投與。本發(fā)明的重組病毒可作為丙型肝炎預(yù)防用或治療用疫苗使用。另外，迄今為止，在針對(duì)HCV的疫苗的開(kāi)發(fā)中，著眼于針對(duì)HCV的抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)進(jìn)行了研究。因 此，優(yōu)選預(yù)先測(cè)定作為疫苗的抗體效價(jià)或細(xì)胞性免疫活性。例如，針對(duì)所制作的RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25或作為親株的LC 16m8株的抗體 效價(jià)可通過(guò)將這些病毒株接種于兔后，經(jīng)時(shí)回收血清，測(cè)定血清的針對(duì)HCV的ELI SA價(jià)而 獲得。接種了 RVV-CN5、RVV-CN2的兔的血清從接種4周后確認(rèn)到針對(duì)HCV的抗體效價(jià)開(kāi)始上升。另外，關(guān)于細(xì)胞性免疫活性，將RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25或作為親株的LC 16m8 株接種于小鼠后，從免疫了的小鼠分離脾細(xì)胞，通過(guò)ELISP OT分析測(cè)定HCV特異性CTL是 否被誘導(dǎo)。本發(fā)明中，若將RVV-CN5免疫BALB/c小鼠來(lái)源的脾細(xì)胞用制性的E 1 特異性CTL表位序列的合成肽進(jìn)行刺激，則檢測(cè)到接近于對(duì)照的10倍的INF-Y產(chǎn)生細(xì)胞。 由此可知，RVV-CN5免疫在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)El特異性CTL。以上，確認(rèn)了本發(fā)明人等制作的HCV-RVVs可誘導(dǎo)針對(duì)HCV的體液性及細(xì)胞性免疫。通過(guò)以下的實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例只是用于說(shuō)明，并不限定本 發(fā)明的范圍。[實(shí)施例1]重組痘苗病毒的制作通過(guò)在pBMSF7C質(zhì)粒(日本特開(kāi)平6_237773)的SbfI和SgfI位點(diǎn)中引入丙型 肝炎病毒的所有基因區(qū)(CN5)、外殼蛋白區(qū)域(CN2)及參與復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域(N25) 的基因區(qū)(DDBJ/EMBL/GenBank accession number ;AY045702)，從而制作在血細(xì)胞凝集素 (HA)基因區(qū)內(nèi)的ΑΤΙ ·ρ7. 5雜合啟動(dòng)子下游插入了 HCV基因的質(zhì)粒載體pBMSF7C-CN5、 pBMSF7C-CN2、pBMSF7C-N25。(圖 1)將初代腎培養(yǎng)細(xì)胞接種于T175燒瓶中，達(dá)到匯合生長(zhǎng)時(shí)，以moi = 10在30°C下感 染痘苗病毒減毒株LC16m8株2小時(shí)。另外，moi (感染復(fù)數(shù)，multiplicity of infection) 是指每1個(gè)細(xì)胞的PFU。感染后，吸除病毒溶液，將細(xì)胞用PBS(-)洗滌。接著，通過(guò)0.05% 胰蛋白酶/0. 5mM EDTA/PBS (-)進(jìn)行處理，以10% FCS/MEM培養(yǎng)基、PBS (-)、HeBS緩沖液 洗滌后，將細(xì)胞懸浮于HeBS緩沖液600 μ 1中。將質(zhì)粒載體pBMSF7C_CN5、pBMSF7C_CN2及 PBMSF7C-N25各40 μ g用HeB S緩沖液稀釋至各自的總量為200 μ 1，加入細(xì)胞懸浮液并混 合，在冰上靜置10分鐘。將添加有質(zhì)粒載體的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至0. 4cm比色杯中，用電穿 孔儀(Bio-Rad公司制)進(jìn)行電穿孔(0. 2kV、960y F)。電穿孔后，立即將10% FCS/MEM培 養(yǎng)基Iml加到細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行稀釋。將該細(xì)胞懸浮液添加到預(yù)先接種于T175燒瓶中的 RK13細(xì)胞或初代腎培養(yǎng)細(xì)胞中，在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)后，吸除培養(yǎng)上清，用PBS(_)洗滌細(xì)胞。接著，進(jìn)行0.05%胰蛋白酶 /0. 5mM EDTA/PBS (-)處理后，將細(xì)胞懸浮于10% FCS/MEM培養(yǎng)基中?；厥占?xì)胞懸浮液，在冷 水中進(jìn)行超聲波處理(30秒X4次)后，離心分離(2000rpm、10分鐘)。使用該上清作為病 毒溶液。將病毒溶液稀釋到10% FCS/MEM培養(yǎng)基中，在30°C下感染預(yù)先接種在IOOmrn培養(yǎng) 皿中的初代腎培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。吸除病毒溶液后，用PBS (-)洗滌細(xì)胞。添加10% FCS/0. 5% 甲基纖維素/MEM培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)72小時(shí)后，吸除上清，以PBS (-)進(jìn) 行洗滌。將用PBS(+)稀釋了的雞紅細(xì)胞溶液添加到IOOmrn培養(yǎng)皿中，在37°C下培養(yǎng)30分鐘。吸除紅細(xì)胞溶液后，將細(xì)胞用PBS(-)洗滌2次。用自動(dòng)移液器(Pipetman)回收沒(méi)有 吸附雞紅細(xì)胞的噬菌斑?；厥盏氖删咄ㄟ^(guò)PCR及基因序列的鑒定確認(rèn)HCV基因的導(dǎo)入。 對(duì)于確認(rèn)到基因?qū)氲氖删撸貜?fù)3次噬菌斑純化。對(duì)于經(jīng)3次噬菌斑純化的病毒，進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)。將第3次得到的菌落懸浮于 700 μ 1的10% FCS/MEM培養(yǎng)基中，在冷水中進(jìn)行超聲波處理。進(jìn)行離心分離(2000rpm、10 分鐘)后，將上清500 μ 1添加到事先接種于Τ25中的初代腎培養(yǎng)細(xì)胞中，在30°C下感染2小 時(shí)。感染后，吸除病毒溶液，用2. 5ml的10% FCS/MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。吸除培養(yǎng)基，新添 加2. 5ml的10% FCS/MEM培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。72小時(shí)后用刮板將細(xì)胞從燒瓶 剝離，回收細(xì)胞懸浮液。將回收的細(xì)胞懸浮液在冷水中進(jìn)行超聲波處理(30秒、4次)后，離 心分離，回收其上清作為病毒溶液。將回收的病毒溶液系列稀釋并添加到事先接種于6孔 板中的RK 13細(xì)胞或初代腎培養(yǎng)細(xì)胞中，在30°C下感染1小時(shí)。吸除病毒溶液后，用PBS(-) 將細(xì)胞洗滌2次后，添加10% FCS/0. 5%甲基纖維素/MEM培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。 72小時(shí)后，通過(guò)數(shù)出孔中形成的噬菌斑數(shù)而算出效價(jià)(titer)。以該算出的效價(jià)(titer)為基礎(chǔ)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。在10個(gè)T175燒瓶中接種RK13 細(xì)胞或初代腎培養(yǎng)細(xì)胞，達(dá)到匯合生長(zhǎng)時(shí)，以moi = 0. 1在30°C下感染重組痘苗病毒溶液2 小時(shí)。感染后，吸除病毒溶液，用20ml的10% FCS/MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。吸除培養(yǎng)基，新添 加20ml的10% FCS/MEM培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。72小時(shí)后用刮板將細(xì)胞從燒瓶剝 離，回收細(xì)胞懸浮液，在-80°C下冷凍保存。將該細(xì)胞懸浮液進(jìn)行三次冷凍融化后，在冷水中 進(jìn)行超聲波處理(30秒、4次)、離心分離，回收其上清作為病毒溶液。將回收的病毒溶液轉(zhuǎn) 移至高速離心用管中，以ISOOOrpm進(jìn)行45分鐘離心分離，使病毒沉淀。吸除上清后，將顆 粒用少量的10% FCS/MEM培養(yǎng)基再懸浮。通過(guò)該操作制備與在T175燒瓶中培養(yǎng)時(shí)相比濃 縮了 10倍的病毒溶液。將該濃縮病毒溶液系列稀釋，感染事先接種于6孔板中的RK 13細(xì) 胞或初代腎培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)與上述同樣的方法計(jì)算出溶液中的病毒效價(jià)(titer)。將計(jì)算出 效價(jià)(titer)的該濃縮病毒溶液用于以下的實(shí)施例所示的各種實(shí)驗(yàn)。[實(shí)施例2]利用PCR的HCV基因?qū)氲拇_認(rèn)使用對(duì)HCV基因?yàn)樘禺愋缘囊韵碌囊?，以得到的重組痘苗病毒基因組作為模 板，通過(guò)進(jìn)行PCR，確認(rèn)是否在該病毒基因組中導(dǎo)入了 HCV基因(圖2、圖3)。(1)克隆用引物堿基序列Fw =HCV-CL-Fw (序列號(hào) 5)5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAA ACCCCAAAGAAAAACCAAACG-3Rv HCV-CL-MRv (序列號(hào) 6)5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTAAAGGAGCCGCCACCCCTGCCCTTCAAGACTATC-3Fw HCV-CL-MFw (序列號(hào) 7)5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGACGCGGCCGCCGCA AGGCAACTGGTTCGGC-3Rv HCV-CL-Rv (序列號(hào) 8)5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATGCCTAC-3
(2)插入確認(rèn)PCR用引物堿基序列<HA>Fw :HA-1-S(序列號(hào) 9)5-GGTCTTATATACACCGAGTAAGG-3Rv :PB SF-110-350_R20(序列號(hào) 10)5-TCAGGAAAGACAGCCATAGC-3〈前半?yún)^(qū)域〉Fw :PB SF-110-1204_S22(序列號(hào) 11)5-CATCACATTGAAACATTGGGAC-3Rv :6-354_R20(序列號(hào) 12)5-GATTTGTGCTCATGATGCAC-3Rv :6-2139_R23(序列號(hào) 13)5-CCGAACCACATTTTGTGTAAGTG-3〈后半?yún)^(qū)域〉Fw :6-3251_18S(序列號(hào) 14)5-AGTAGAGCCCGTTGTCTT-3Fw :6-9168_S20(序列號(hào) 15)5-TACCTCTTCAACTGGGCAGT-3Rv :HA-6-R(序列號(hào) 16)5-CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG-3具體而言，反應(yīng)液組成為相對(duì)于市售的聚合酶附帶的緩沖液50 μ L，DNA聚合酶 為1U，dNTP為0. 3mM，F(xiàn)引物為1 μ M，R引物為1 μ Μ，循環(huán)條件為以在95°C下熔解0. 5分 鐘、在58°C下退火0. 5分鐘、在72°C下延伸2分鐘作為1循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。將所得到 的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，確認(rèn)條帶。其結(jié)果是，若確認(rèn)到通過(guò)引物設(shè)計(jì)而預(yù)想的 長(zhǎng)度的單一條帶，則可知重組病毒基因組中導(dǎo)入了 HCV基因，另一方面，若沒(méi)有確認(rèn)到該條 帶，則可知沒(méi)有導(dǎo)入HCV基因。如圖3所示，由PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增片段)的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果可知，在重 組病毒基因組中導(dǎo)入了 HCV基因。[實(shí)施例3]利用免疫印跡法的HCV蛋白的表達(dá)確認(rèn)用重組痘苗病毒以moi = 30的RVV-S在30°C下感染預(yù)先接種于6孔板中的RK 13 細(xì)胞2小時(shí)。感染后，吸除病毒溶液，通過(guò)PB S(-)將細(xì)胞洗滌2次。在各孔中添加2ml的 10% FCS/MEM培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，吸除培養(yǎng)基，添加100 μ 1的溶解 緩沖液(1% SDS.0. 5% ΝΡ-40、0. 15Μ NaClUOmMTris-HCl (ρΗ 7. 4))將細(xì)胞溶解，將該溶液 轉(zhuǎn)移至1. 5ml的埃彭道夫(印pendorf)管中。將回收的溶液在冷水中進(jìn)行超聲波處理直至 沒(méi)有粘性。制備的溶液中的蛋白量通過(guò)Lowry法進(jìn)行定量。使用10%丙烯酰胺凝膠對(duì)50μ g的蛋白進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，用半干 印跡儀(Semi-dry blotter)以5. 5mA/cm2通電60分鐘，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。 將膜用TBS-T溶液洗滌后，浸漬到5%脫脂乳-TBS-T溶液中進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，將膜用TBS-T溶液洗滌3次。第一抗體為小鼠單克隆抗體，使用將Core-31-2、El-384、E2-544、 NS3-10-1、NS4B-52-1、NS5B-14-5克隆經(jīng)IgG純化而得到的抗體。純化的抗體的蛋白量通 過(guò)Lowry法進(jìn)行定量，調(diào)制成10 μ g/ml使用。與第一抗體的反應(yīng)結(jié)束后，將膜用TBS-T溶 液洗滌3次。第二抗體使用抗兔IgG-Iinked HRPO(Donkey、Amersham公司制)。與第二抗 體的反應(yīng)結(jié)束后，再次用TBS-T溶液將膜洗滌3次，將ECL溶液添加到膜上，在薄膜上顯影。如圖4所示，由該結(jié)果可知，RVV-CN2、RVV-N25及RVV-CN5的重組病毒基因組表達(dá) 了 HCV蛋白。[實(shí)施例4]兔及小鼠中的重組痘苗病毒接種實(shí)驗(yàn)(圖5)圖5是表示HCV-RVV的體液性/細(xì)胞性免疫誘導(dǎo)功能的確認(rèn)方法的圖。將實(shí)施例1中得到的重組痘苗病毒或作為親株的LC16m8株以IX 108pfu經(jīng)內(nèi)皮 接種到雌性新西蘭白兔中后，1、2、3、4、6周后從耳靜脈采血。另外，初次接種病毒6周后再 次以IX IO8Pfu接種RVV-S。再接種后也同樣在1、2、3、4、6周后從耳靜脈進(jìn)行采血。采集 的血液全部放入真空采血管(TERUM0公司制，產(chǎn)品名-.《H ”卜II真空采血管(滅菌 品)，9mL)中，離心分離(3000rpm、20分鐘)，分離回收血清。將血清在_20°C下冷凍保存至 進(jìn)行后述的ELISA試驗(yàn)。[實(shí)施例5]對(duì)于用HCV-RVV免疫的兔血清中的HCV蛋白利用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)預(yù)先用核心(Core)蛋白及E2蛋白包被96孔板，將預(yù)先冷凍的血清樣品稀釋至 100倍并添加。室溫下靜置1小時(shí)后，將96孔板用TBS-T溶液洗滌后，在96孔板中添加抗 兔IgG-IinkedHRPO(Donkey、Amersham公司制)作為第二抗體。室溫下1小時(shí)的與第二抗 體的反應(yīng)結(jié)束后，再次用TBS-T溶液將96孔板洗滌3次，以100 μ 1/孔添加顯色液。在室 溫下靜置10-20分鐘后，用酶標(biāo)儀(Microplate Reader)測(cè)定450nm的吸光度。其結(jié)果如圖6所示，確認(rèn)接種了 RVV-CN2及RVV-CN5的兔血清對(duì)Core及E2具有 高的抗體效價(jià)的誘導(dǎo)。[實(shí)施例6]利用ELISP0T分析確認(rèn)HCV-RVV的作為疫苗的細(xì)胞性免疫誘導(dǎo)功能效果(第1 天)在96孔硝基纖維素板中，將純化抗小鼠IFN- Y抗體(R4-6A2) (1 μ g/ml) (Pharmingen)調(diào)整至最終濃度8 μ g/ml (用無(wú)菌PBS稀釋125倍)，以75 100 μ 1/孔進(jìn) 行接種，在4度下靜置一夜。(第2天)從小鼠取脾細(xì)胞，用洗滌用RPMI使其適量懸浮。洗滌用RPMI使用添加有2. 5% FCS的溶液。以1200rpm、4度離心5分鐘，收集細(xì)胞。進(jìn)行ACK處理，用洗滌用RPMI使其 適量懸浮，再次以1200rpm、4度下離心5分鐘，收集細(xì)胞。在過(guò)濾器中通入500 μ 1的洗滌 用RPMI后，通入細(xì)胞懸浮液，完全通入后用洗滌用RPMI1. 5ml洗滌。用添加有10% FCS的 RPMI洗滌1次，在H-h培養(yǎng)基中懸浮后，調(diào)整至IX 107/ml。1)H-h培養(yǎng)基添加有10% FCS的RPMI與添加有10% FCS的CLICK' S培養(yǎng)基等 量混合而成。
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2)添加有 10% FCS 的 RPMI :RPMI-1640 (SIGMA R8758)，F(xiàn)CS (終濃度 10% )，2_ 巰 基乙醇(終濃度5 μ M)，青霉素-鏈霉素(終濃度PCs :100u/ml，SM 0. lmg/ml), 7. 5 % NaHC034ml。3)添加有 10% FCS 的 CLICK' S 培養(yǎng)基CLICK' S 培養(yǎng)基(SIGMA C5572)，F(xiàn)CS (終 濃度10%)，2-巰基乙醇(終濃度5μΜ)，青霉素-鏈霉素(終濃度PCs :100u/ml,SM:0. lmg/ ml) ,7. 5% NaHC034ml。培養(yǎng)的開(kāi)始將96孔硝基纖維素板用PB SdOOyl/孔)洗滌3次后，以ΙΟΟμΙ/孔加入添 加有10% FC S的RPMI，在37度下放入CO2孵化器中1小時(shí)進(jìn)行封閉。扔掉培養(yǎng)基，由 1 Χ 106/100 μ 1/孔至0. 125X107100 μ 1/孔以2倍系列稀釋接種效應(yīng)細(xì)胞。 以100 μ 1/孔(終濃度100 μ g/ml)添加肽溶液(200 μ g/ml)，在37度下在CO2孵 化器中培養(yǎng)24小時(shí)。(第3天)扔掉培養(yǎng)基，用？83、0.05%1^擾1120(20(^1/孔)洗滌10次。將生物素標(biāo)記抗-小 鼠 IFN- y (XMG 1. 2) (0. 5mg/ml) (Pharmingen)調(diào)整至最終濃度 2 μ g/ml (用 PB S 稀釋 250 倍)，并按照100 μ 1/孔進(jìn)行添加。在4度下靜置1夜。(第4天)將96孔硝基纖維素板用PBS、0. 05% Tween20 (200 μ 1/孔)洗滌10次。將鏈霉親 合素_堿性磷酸酶(lmg/ml) (MABTECHAB)調(diào)整至最終濃度1 μ g/ml (用PBS稀釋1000倍)， 并按照100 μ 1/孔進(jìn)行添加。將所得溶液在室溫下靜置1. 5小時(shí)。將25ΧΑΡ顯色緩沖液(color development buffer) (BIO-RAD)用 DW 稀釋 25 倍，分別添力Π 1/100 量的 AP colorreagent A 和 B (BIO-RAD)，調(diào)制反應(yīng)混合物。將96孔硝基纖維素板用PBS,0. 05 % Tween 20 (200 μ 1/孔) 洗滌10次。以100 μ 1/孔添加反應(yīng)混合物，在室溫下靜置10 20分鐘。顯色，若出現(xiàn)斑 點(diǎn)(dark spot)，扔掉反應(yīng)混合物，在水中洗滌干凈。將96孔硝基纖維素板的底剝離，并干 燥，用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀(ELISP0T Reader)數(shù)出斑點(diǎn)的數(shù)目。計(jì)數(shù)的結(jié)果如圖7所示，確認(rèn)誘導(dǎo)了很強(qiáng)的細(xì)胞性免疫。[實(shí)施例6]HCV-RVV對(duì)丙型肝炎的治療效果的研究使通過(guò)Cre/loxP系統(tǒng)導(dǎo)入HCV基因的轉(zhuǎn)基因(Cre/loxP/HCV-Tg)小鼠(圖8中 “IoxP-HCV")與IFN誘導(dǎo)性的表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖8中‘‘MxCre”)交配，制作在任意 的時(shí)期開(kāi)關(guān)表達(dá)HCV基因的Tg小鼠(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg)(圖8)，進(jìn)行其病理分析。 在病理分析中，為了通過(guò)干擾素使Cre重組酶基因表達(dá)，使用作為干擾素誘導(dǎo)劑的聚肌苷 酸-胞苷酸(poly IC)。另外，圖8中，畫面A是表示利用Cre/loxP開(kāi)關(guān)系統(tǒng)的HCV基因表達(dá)的圖，畫面B 是表示IoxP-HCV轉(zhuǎn)基因小鼠與表達(dá)MxCre基因轉(zhuǎn)基因小鼠的交配的圖。作為HCV-RVV，使用主要表達(dá)HCV的結(jié)構(gòu)蛋白的RVV-CN2、表達(dá)參與復(fù)制的非 結(jié)構(gòu)蛋白的RVV-N25、表達(dá)全部蛋白的RVV-CN5 (圖1)。為了評(píng)價(jià)這些HCV-RVV的治 療效果，對(duì)3個(gè)月間持續(xù)表達(dá)HCV蛋白的Cre/loxP/HCV-MxCre Tg小鼠單次皮內(nèi)接種CN 101965396 A
說(shuō)明書
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HCV-RVV(IX 107pfu)，從接種4周后，對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行取樣(圖9)。并且，對(duì)小鼠肝臟的HCV 蛋白的表達(dá)量和形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果示于圖10中。圖10中，畫面A是表示HCV核心蛋白量(“HCV Core”)和 ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)的推移的圖，HCV核心蛋白量(“HCV Core")用棒圖表示，ALT用 線圖表示。另外，ALT是表示肝臟損傷的程度的指標(biāo)。畫面8中“(10”、“(190”、“(1180”、“(1480” 分別表示HCV基因表達(dá)前、HCV基因表達(dá)90天后、180天后、480天后的肝臟中的組織變化。Cre/loxP/HCV-MxCre Tg 小鼠的肝臟中的 HCV 蛋白(圖 10 中 “HCV Core”)沒(méi)有 完全被排除，確認(rèn)到1年以上的持續(xù)的表達(dá)，顯示出了肝臟中的炎癥、脂肪變性、纖維化等 慢性肝炎的病情(圖10)。另外，接種HCV-RVV4 周后的 Cre/loxP/HCV-MxCre Tg 小鼠肝臟中，RVV-N25 接種 組的核心蛋白表達(dá)量減少(圖11)。進(jìn)而，在RVV-N25接種組中，確認(rèn)到肝臟中的形態(tài)學(xué)的 異常(肝臟的索狀結(jié)構(gòu)(cord-like structure)、肝細(xì)胞的狀態(tài)等)的正?；?圖11)。圖 11 中，“m8，，、“CN2，，、“CN5，，、“N25，，分另U 表示 LC 16m8 株、RW-CN2、RW-CN5、 RVV-N25。畫面A表示肝臟中的HCV核心蛋白量，畫面B表示接種HCV-RVV4周后的肝臟組 織像。畫面B中，a表示HCV基因表達(dá)前的肝臟組織像，b表示接種HCV-RVV4周后的肝臟組 織像。由圖11可知，投與RVV-N25的小鼠的肝臟正?；?。因此表示，本發(fā)明的痘苗病毒具 有丙型肝炎的治療效果。產(chǎn)業(yè)上的可利用件根據(jù)本發(fā)明，可提供對(duì)丙型肝炎的預(yù)防或治療有效、且安全性高的新型重組痘苗 病毒、及含有該病毒的丙型肝炎用預(yù)防藥或治療藥(丙型肝炎的預(yù)防或治療用疫苗)。
0169]序列表自由文本0170]序列號(hào)5 合成DNA0171]序列號(hào)6 合成DNA0172]序列號(hào)7 合成DNA0173]序列號(hào)8 合成DNA0174]序列號(hào)9 合成DNA0175]序列號(hào)10合成DNA0176]序列號(hào)11合成DNA0177]序列號(hào)12合成DNA0178]序列號(hào)13合成DNA0179]序列號(hào)14合成DNA0180]序列號(hào)15合成DNA0181]序列號(hào)16合成DNA0182]序列號(hào)17合成肽0183]序列號(hào)18合成肽0184]序列號(hào)19合成肽0185]序列號(hào)20合成肽
權(quán)利要求
一種重組痘苗病毒，其包含表達(dá)啟動(dòng)子、及丙型肝炎病毒基因組的cDNA的全部或一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，痘苗病毒為L(zhǎng)C16m8株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，丙型肝炎病毒基因組的cDNA為編碼丙 型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，丙型肝炎病毒基因組的cDNA為編碼丙 型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，丙型肝炎病毒基因組的cDNA為編碼丙 型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的重組痘苗病毒，其中，丙型肝炎病毒基因組的 cDNA為以下的(a) (f)的DNA (a)由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)與由序列號(hào)1所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、且 編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的DNA，(c)由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(d)與由序列號(hào)2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、且 編碼丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA，(e)由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(f)與由序列號(hào)3所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、且 編碼丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，表達(dá)啟動(dòng)子為雜合啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒，其中，雜合啟動(dòng)子的堿基序列為以下的(a)或 (b)的 DNA (a)由序列號(hào)4所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)與由序列號(hào)4所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交、且 具有啟動(dòng)子活性的DNA。
9.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的重組痘苗病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其為丙型肝炎的預(yù)防藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其為丙型肝炎的治療藥。
全文摘要
提供一種對(duì)防止丙型肝炎感染發(fā)病具有有效性且安全性高的重組病毒、及含有該病毒的丙型肝炎病毒用疫苗。本發(fā)明的重組痘苗病毒可表達(dá)丙型肝炎病毒基因。本發(fā)明的丙型肝炎病毒疫苗含有上述本發(fā)明的重組病毒。
文檔編號(hào)A61K35/76GK101965396SQ200980107538
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者小原道法, 村井深 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu);一般財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所