專利名稱：血管發(fā)生抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制血管發(fā)生或治療病理性新血管形成如哮喘、關(guān)節(jié)炎、癌癥和 黃斑變性的組合物和方法。
背景技術(shù)：
病理性新血管形成是如濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病增殖性視網(wǎng)膜病 變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和哮喘的疾病的關(guān)鍵成分。其還在腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散中起重 要作用。新血管形成由促血管發(fā)生因子和抗血管發(fā)生因子的精巧平衡調(diào)節(jié)。已知血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是新血管形成必需的。已顯示通過(guò)VEGF拮抗劑抑 制或降低VEGF活性在AMD，關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型和多種腫瘤模型中抑制新血管形成。抑制或降 低VEGF活性的VEGF拮抗劑包含但不限于VEGF抗體、可溶性受體、受體融合蛋白質(zhì)、肽和小 分子。已顯示VEGF-Rl(Flt-l)和VEGF-R2 (KDR)蛋白質(zhì)以高親和力結(jié)合VEGF。Flt_l和 KDR在其胞外區(qū)都具有7個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域。已顯示結(jié)構(gòu)域2是VEGF結(jié)合必需的。全長(zhǎng)、可溶 性受體(結(jié)構(gòu)域1-7)和結(jié)構(gòu)域1-3各自與IgG Fc的融合蛋白可有效地結(jié)合VEGF。然而， Fc與Ig-樣結(jié)構(gòu)域2單獨(dú)融合不能結(jié)合VEGF，Ig-樣結(jié)構(gòu)域1和2也如此。Davis-Smyth， 1996。因此，Ig-樣結(jié)構(gòu)域1和3似乎需要與結(jié)構(gòu)域2 —起進(jìn)行有效的VEGF結(jié)合。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)具有式X-Y-Z。X包含選 自胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本上由5-25個(gè)氨基 酸殘基的多肽組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是式X-Y-Z的多肽。X包含選自胞外受體、抗體可變區(qū)、 細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本上由提供5-25個(gè)氨基酸殘基的空間間隔 (seperation)的接頭部分組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是式X-Y-Z的融合蛋白質(zhì)。X包含選自胞外受體、抗體可變 區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本上由5-25個(gè)氨基酸殘基的多肽組成。Z 是抗體分子的Fc部分。還提供式X-Y-Z的融合蛋白質(zhì)。X包含選自胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化 因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本上由提供5-25個(gè)氨基酸殘基的空間間隔的接頭部分組成。 Z是抗體分子的Fc部分。本發(fā)明的另一個(gè)方面是多聚化多肽X的方法。通過(guò)多肽Y將多肽X連接至多肽Z 形成多肽XYZ。X包含選自胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。 Y基本上由5-25個(gè)氨基酸殘基的多肽組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。形成的多肽XYZ
多聚化。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供多聚化多肽X的方法。通過(guò)Y部分將多肽X連接至 多肽z形成聚合物XYZ。X包含選自胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本上由提供5-25個(gè)氨基酸殘基的空間間隔的接頭部分組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。這樣形成的多肽XYZ多聚化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供核酸分子。該核酸分子編碼包含VEGF-Rl (Flt-I) 的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、接頭和多聚化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO 2、8、21、23和25的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)包含 VEGF-Rl(Flt-I)的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、接頭和多聚化結(jié)構(gòu)域。該融合蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO :2、8、21、23 和 25 的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供體外方法。將核酸分子遞送至分離的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。該核酸分子編碼包含VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、接頭和多聚化結(jié)構(gòu)域的融 合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)包含選自SEQ IDN0:2、8、21、23和25的序列。該融合蛋白質(zhì)的表 達(dá)由啟動(dòng)子控制。形成表達(dá)融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是遞送融合蛋白質(zhì)至哺乳動(dòng)物的方法。將表達(dá)該融合蛋 白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送至哺乳動(dòng)物。細(xì)胞表達(dá)和分泌該融合蛋白質(zhì)，從而向哺乳動(dòng)物供 給該融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)包含VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、接頭和多聚化結(jié) 構(gòu)域。該融合蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID N0:2、8、21、23和25的序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面是向哺乳動(dòng)物供給融合蛋白質(zhì)的方法。將包含 VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、接頭和多聚化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)遞送至哺乳動(dòng)物。該 融合蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID N0:2、8、21、23和25的序列。備選地，可以將編碼所述融合蛋 白質(zhì)的核酸構(gòu)建體遞送至哺乳動(dòng)物，從而由該哺乳動(dòng)物表達(dá)該融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用VEGF拮抗劑治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的改進(jìn)方法，所述 拮抗劑包含但不限于本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。該改進(jìn)包含提供對(duì)治療眼部疾病有效的VEGF 拮抗劑的降低的量?？梢酝ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)或基因治療或其組合施用VEGF拮抗劑。降低的量可 以在哺乳動(dòng)物中保持至少6個(gè)月，例如至少9個(gè)月或至少1年。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，降低的量可以是約100pg/ml至約100 μ g/ml、Ing/ ml 至約 95 μ g/ml、10ng/ml 至約 85 μ g/ml、100ng/ml 至約 75 μ g/ml、約 100ng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 10 μ g/ml 或約 1 μ g/ml 至約 4 μ g/ml。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施 用編碼VEGF拮抗劑的核酸。在一些實(shí)施方案中，按約100pg/ml至約100 μ g/ml、約lng/ml 至約 95 μ g/ml、約 10ng/ml 至約 85 μ g/ml、約 lOOng/ml 至約 75 μ g/ml、約 100ng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 10 μ g/ml 或約1 μ g/ml至約4 μ g/ml的治療有效量表達(dá)VEGF拮抗劑，以治療眼部疾病。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約2xl06至約2X1012drp的治療有效量對(duì)哺乳動(dòng)物施用編碼VEGF拮抗劑的病毒載體。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是每單位劑量約2xl07至約2110"(1印、約2xl08至 約 2xl01Qdrp。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約0. Img至約50mg(優(yōu)選約0. Img至約5mg,例如約0. Img至約lmg、約0. Img至約0. 5mg和約0. lmg至約0. 25mg)的治療有效量對(duì)哺乳動(dòng)物施用可溶性VEGF受體或變體?？扇苄?VEGF受體或其變體包含但不限于本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可溶性VEGF受體是FLT1D29GLYFC(SEQ IDN0. 1或2)或 D2-9GLY-CH3(SEQ ID NO. 22 或 23)。在一些實(shí)施方案中，可溶性VEGF受體的治療有效量是約0. lmg至約25mg、約 0. lmg至約10mg、約0. 5mg至約5mg或約0. 5mg至約2. 5mg?？梢苑磸?fù)施用可溶性VEGF受 體或其變體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物的 患病眼施用編碼本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的VEGF拮抗劑的核酸以治療眼部疾病，其中VEGF拮 抗劑按約lOOng/ml至約75ii g/ml的治療有效量表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括遞送編碼式 X-Y-Z的VEGF拮抗劑的核酸至哺乳動(dòng)物的患病眼，其中VEGF拮抗劑按約lOOng/ml至約 75ug/ml的治療有效量在患病眼的變移上皮細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括通過(guò)玻璃體內(nèi) (intravitreal)注射(例如中央玻璃體注射)遞送編碼式X-Y-Z的VEGF拮抗劑的核酸至 哺乳動(dòng)物的患病眼，其中VEGF拮抗劑按約lOOng/ml至約75 y g/ml的治療有效量表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑按約100pg/ml至約100 y g/ml、lng/ml至約 95 u g/ml、10ng/ml 至約 85 u g/ml、100ng/ml 至約 50 u g/ml、約 1 u g/ml 至約 25 u g/ml、約 1 U g/ml至約15 u g/ml、約1 ii g/ml至約10 u g/ml或約1 ii g/ml至約4 u g/ml的治療有效 量表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼VEGF拮抗劑的核酸是病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 病毒載體是AAV，例如AAV2。在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑在哺乳動(dòng)物中表達(dá)至少6個(gè)月，例如至少9個(gè)月 或1年。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約2xl06至約2xl012drp的治療有效量對(duì)哺乳動(dòng)物的患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是每單位劑量約2xl07至約ZxlO^drp或約2xl08 至約 2xl010drpo在一些實(shí)施方案中，施用第二 VEGF拮抗劑。第二 VEGF拮抗劑可以是融合多肽，其 包含融合至IgG重鏈分子的VEGF受體，優(yōu)選融合至IgG的Fc或CH3的VEGF-R1，更優(yōu)選融 合至Fc或CH3的VEGF-R1的結(jié)構(gòu)域2?？梢允褂媒宇^(例如9Gly)連接VEGF受體和IgG 結(jié)構(gòu)域。第二 VEGF拮抗劑可以是VEGF抗體，例如貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗 (ranibizumab)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物的 患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗劑，其中VEGF拮抗劑為每單位劑量約0. lmg至約50mg的
治療有效量。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是約0. lmg至約25mg、約0. lmg至約10mg、約 0. 5mg 至約 5mg 或約 0. 5mg 至約 2. 5mg。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是降低接受眼部基因治療的哺乳動(dòng)物眼內(nèi)渾濁(haze)的方 法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物(例如在眼內(nèi))施用包含不超過(guò)總病毒殼體90%的空病毒殼體 的基因治療病毒體。在一些實(shí)施方案中，空病毒殼體不超過(guò)總病毒殼體的80%、70%、60%或50%。在 一些實(shí)施方案中，基因治療病毒體基本上無(wú)空病毒殼體。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒體是AAV病毒體，例如AAV2病毒體。在一些實(shí)施方案中，眼部疾病選自濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性AMD)、黃斑水 腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
為本領(lǐng)域提供了治療血管增殖和炎癥相關(guān)疾病的方法和物質(zhì)(agent)的本發(fā)明 的這些和其他實(shí)施方案將在后面更詳細(xì)地描述。相對(duì)于蛋白質(zhì)的天然形式，該物質(zhì)提供提 高的穩(wěn)定性和生物利用率。附圖簡(jiǎn)述

圖1. D2-9Gly_Fc構(gòu)建體中的9-Gly接頭的柔性區(qū)。通過(guò)Karpus和Schultz (1985) 法預(yù)測(cè)的相對(duì)柔性顯示，與不包含9-Gly接頭的D2-Fc構(gòu)建體相比，D2_9Gly-Fc蛋白質(zhì)中 的作為一個(gè)區(qū)域的聚甘氨酸九聚體(9-Gly)接頭(氨基酸94-103)具有高于平均值的柔性 (> 1)。兩種融合蛋白質(zhì)都包含相同氨基酸序列(框內(nèi))SP-信號(hào)肽(氨基酸-24至-1)、 Flt-I結(jié)構(gòu)域2 (氨基酸1至93)和IgGl-Fc殘基(244個(gè)氨基酸)。箭頭表示用SignalPV2. 0 程序(Nielsen等，1997)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)。圖2. D2-9Gly-Fc對(duì)D2_Fc的生物學(xué)活性。293細(xì)胞生長(zhǎng)于饑餓培養(yǎng)基(M199+5% FCS)，并用包含CMV啟動(dòng)子控制下的D2-9Gly-Fc和D2_Fc表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。72小時(shí) 后收集條件培養(yǎng)基(CM)。將HUVEC用含VEGF(10ng/mL)的饑餓培養(yǎng)基接種于96孔板中 (2E3細(xì)胞/孔)，24小時(shí)后加入50ul含VEGF (10ng/mL)的CM。將對(duì)照(+/-VEGF)與來(lái)自 對(duì)照pEGFP(Clontech ；pEGFP攜帶野生型綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的紅移變體，該變體已針 對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更亮的熒光和更高的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CM孵育。用50ng Flt-I-IgG重組蛋白質(zhì)(R&DSystems)處理陽(yáng)性對(duì)照。處理后3天用CellTiter 96 AQuews 試劑(Promega)對(duì)HUVEC的增殖進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定三次的兩次實(shí)驗(yàn)的OD49tl 的平均值的平均值。圖3. D2-9Gly-Fc和D2_Fc的蛋白質(zhì)印跡分析。與在還原凝膠中的遷移相比，在非 還原凝膠中遷移時(shí)，D2-9Gly-Fc和D2_Fc蛋白質(zhì)的大小似乎都是兩倍大。表達(dá)D2_9Gly-Fc 和D2-Fc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，來(lái)自條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS電泳分離，并轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。用山羊抗-人抗-IgGl Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗體探測(cè)印跡。圖4.包含9Gly接頭和VEGF Ex3的sFlt-Ι雜合蛋白質(zhì)。D2_9Gly-Ex3/CH3與之 前構(gòu)建的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較。三種蛋白質(zhì)都包含F(xiàn)lt-I結(jié)構(gòu)域2的相同的氨基酸序列，其 由Flt-I信號(hào)肽的24個(gè)氨基酸和Flt-I結(jié)構(gòu)域2的93個(gè)氨基酸組成。D2-9Gly-Ex3/CH3 包含9Gly接頭的9個(gè)氨基酸、VEGF Ex3的14個(gè)氨基酸和人IgGl重鏈Fc的CH3區(qū)的120 個(gè)氨基酸。圖 5. D2-9Gly-Ex3/CH3 對(duì) D2_9Gly_Fc 的生物學(xué)活性。與對(duì)照蛋白質(zhì) D2_9Gly_Fc 和D2-Fc相比，蛋白質(zhì)D2-9Gly-Ex3/CH3 (其中結(jié)構(gòu)域2通過(guò)9Gly接頭和VEGF Ex3連接至 CH3區(qū))也有效地抑制VEGF-依賴的HUVEC增殖。用50ng重組Flt-l-IgG (R&D Systems)作為對(duì)照。圖 6.比較 D2-(Gly4Ser)3_Fc 與 D2_9Gly-Fc 和 D2_9Gly_Ex3/CH3 的蛋白質(zhì)活性的 HUVEC增殖測(cè)定。圖7.蛋白質(zhì)印跡。來(lái)自用表達(dá)(l)D2-9Gly-Fc、(2)D2-(G4S)3_Fc 和(3)EGFP 蛋白 質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(15ul CM)的蛋白質(zhì)(非還原或還原)通過(guò)SDS電 泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用山羊抗-人IgGl Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗體探測(cè)印跡。圖8.有/無(wú)9Gly接頭或VEGF Ex3的蛋白質(zhì)的組合。三種有或無(wú)9Gly接頭和/ 或VEGF Ex3的新蛋白質(zhì)D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2_Ex3/CH3的結(jié)構(gòu)比較。圖9.用具有9Gly、Ex3和CH3組合的Flt_l (D2)構(gòu)建體進(jìn)行的HUVEC增殖測(cè)定。 包含蛋白質(zhì)D2-Ex3/CH3、D2_9Gly_CH3和D2-CH3的來(lái)自293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(5ul)與 D2-9Gly-Fc 和 D2_9Gly_Ex3/CH3 比較。圖 10.蛋白質(zhì)印跡。用表達(dá)(l)D2-9Gly_Fc、(2)D2_9Gly_CH3 (52/26kDa)禾P (3) D2-CH3 (50/25kDa)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。來(lái)自293細(xì)胞條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)(15ul CM, 非還原和/或還原)通過(guò)SDS電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用抗-人VEGF-R1HRP綴合物 (R&D Systems)探測(cè)印跡。圖11. VEGF “體外”結(jié)合測(cè)定。將包含已知濃度的D2-9Gly_Fc和Fit-ID(1_3)對(duì) 照可溶性受體(濃度為0. 29至150pM)的來(lái)自293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基連續(xù)稀釋，并與10pM VEGF混合。然后通過(guò)ELISA測(cè)量未結(jié)合的VEGF的量。D2_9Gly-Fc以高于其他所有構(gòu)建體 的親和力結(jié)合VEGF?！皀”代表獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)染和結(jié)合測(cè)定)的次數(shù)。圖12.用BIAcore儀器通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量可溶性Flt_l構(gòu)建體的結(jié)合動(dòng) 力學(xué)。將sFlt-1構(gòu)建體固定于傳感芯片，按0. 2至15nM的濃度范圍注入VEGF165。用BIA Evaluation程序評(píng)估傳感圖(sensorgram)，測(cè)定速率常數(shù)Ka和Kd，并從Kd/Ka = KD的比計(jì) 算解離常數(shù)(Kd)。越低的Kd表示越好的親和力。圖13A-13C。圖13A顯示具有多種接頭的Flt_l構(gòu)建體的表達(dá)水平。圖13B顯示 具有多種接頭和IgGlFc的CH3部分的Flt-1構(gòu)建體的二聚化或多聚化。非還原和還原條件 間的差異表明蛋白質(zhì)已多聚化。圖13C顯示在VEGF存在下的HUVEC增殖測(cè)定中，存在于條 件培養(yǎng)基中的Flt-1構(gòu)建體的抑制性生物活性。每種構(gòu)建體顯示接近于無(wú)VEGF下的HUVEC 增值水平的抑制活性。圖14.用視網(wǎng)膜新血管形成(NV)的鼠的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(0IR)模型，對(duì)小鼠眼 部施用Flt-1構(gòu)建體之一，并測(cè)定新血管形成。將小鼠暴露于高氧條件。測(cè)定治療眼中新 血管形成事件的數(shù)目，與同一動(dòng)物的未治療眼中的事件比較。若新血管形成事件降低超過(guò) 50 %，則認(rèn)為該動(dòng)物是“反應(yīng)者”。圖15.原位雜交測(cè)定顯示AAV2-SFLT1D29GLYFC在一組動(dòng)物中的表達(dá)水平和定位。發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，無(wú)結(jié)構(gòu)域1和3的Flt-1 Ig-樣結(jié)構(gòu)域2能夠有效地結(jié)合VEGF， 并抑制VEGF-依賴的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。可以通過(guò)接頭將結(jié)構(gòu)域2共價(jià)連接至多聚化結(jié)構(gòu)域。 接頭一般是多肽鏈。鏈的長(zhǎng)度可以是6、7、9、11、13、15或更多個(gè)氨基酸殘基，但一般是5至 25個(gè)殘基。取決于長(zhǎng)度和側(cè)鏈組成，接頭可以具有但不需具有高于平均值的柔性?？梢杂?本領(lǐng)域已知的算法計(jì)算柔性。多聚化結(jié)構(gòu)域是多聚體蛋白質(zhì)中促進(jìn)亞基形成例如二聚體、三聚體、四聚體等的那些部分。適用于有效結(jié)合VEGF和/或抑制VEGF-依賴的內(nèi)皮細(xì)胞增 殖的重組蛋白質(zhì)選自SEQ ID NO :2、8、21、23和25。此外，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，多聚化結(jié)構(gòu)域和接頭可以與多種其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部 分一起使用，以誘導(dǎo)多聚化。這類蛋白質(zhì)可以是僅在多聚化時(shí)結(jié)合配體或受體的蛋白質(zhì)，或 可以是多聚化時(shí)其結(jié)合親和力增強(qiáng)的蛋白質(zhì)。適用于多聚化的蛋白質(zhì)包含胞外受體(包含 其部分)、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子。適合的蛋白質(zhì)包含酪氨酸激酶受 體和絲氨酸蘇氨酸激酶受體。胞外受體的具體實(shí)例包含EGF受體、G蛋白偶聯(lián)受體、FGF受 體、Fc受體、T細(xì)胞受體等?？贵w可變區(qū)的實(shí)例包含F(xiàn)ab、F(ab’)2*ScFv。細(xì)胞因子的實(shí) 例包含 GM-CSF、IL-1 a、IL-1 3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、 IL-18、IL-21、IL-23、IFN-a、IFN_3、IFN_ y、MIP_1 a、MIP_1 3、TGF_3、TNFa 和 TNF-3。 趨化因子的實(shí)例包含 BCA-1/BLC、BRAK、趨化因子 CC-2、CTACK、CXCL-16、ELC、ENA、ENA-70、 ENA-74、ENA-78、嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(Eotaxin)、Exodus-2、CXXXC 趨化分子、GCP-2、 GRO、GRO a (MGSA)、GR0-旦、GR0- y、HCC-1, HCC-4, 1-309, IP-10, I-TAC, LAG-1, LD78-旦、 LEC/NCC-4、LL-37、淋巴細(xì)胞趨化蛋白(Lymphotactin)、MCP、MCAF(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MDC、MDC、MDC-2、MDC-4、MEC/CCL28、MIG、MIP、MIP-1 a、MIP-1 旦、MIP-1 8、MIP-3/ MPIF-1、MIP-3 a、MIP-3bet、MIP-4 (PARC)、MIP-5、NAP-2、PARC、PF-4、RANTES、RANTES-2、 SDF-la、SDF-10、TARC和TECK。生長(zhǎng)因子的實(shí)例包含人雙調(diào)蛋白、人血管發(fā)生蛋白質(zhì)、 人ACE、人血管生成素、人血管位蛋白(Angiopoietin)、人制管張素、人3動(dòng)物纖維素、 人 BMP、人 BMP-13/CDMP-2、人 BMP-14/CDMP-1、人 BMP-2、人 BMP-3、人 BMP-4、人 BMP-5、人 BMP-6、人BMP-7、人BMP-8、人BMP-9、人集落刺激因子、人flt3_配體、人G-CSF、人GM-CSF、 人M-CSF、人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、人Cripto-1、人Cryptic、人ECGF、人EGF、人EG-VEGF、人促 紅細(xì)胞生成素、人胎球蛋白、人FGF、人FGF-1、人FGF-10、人FGF-16、人FGF-17、人FGF-18、 人 FGF-19、人 FGF-2、人 FGF-20、人 FGF-3、人 FGF-4、人 FGF-5、人 FGF-6、人 FGF-7/KGF、人 FGF-8、人FGF-9、人FGF-酸性、人FGF-堿性、人⑶F_ 11、人⑶F_ 15、人生長(zhǎng)激素釋放因子、人 HB-EGF、人調(diào)蛋白、人HGF、人IGF、人IGF-I、人IGF-II、人抑制素、人KGF、人LCGF、人LIF、人 混合生長(zhǎng)因子(Human Miscellaneous Growth Factor)、人MSP、人肌肉生長(zhǎng)抑制素(Human Myostatin)、人肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子、人制癌蛋白M、人PD-ECGF、人PDGF、 人PDGF (AA同型二聚體)、人PDGF (AB異源二聚體)、人PDGF (BB同型二聚體)、人PDGF (CC同 型二聚體)、人PIGF、人PIGF、人PIGF-1、人PIGF-2、人SCF、人SMDF、人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人 SCGF- a、人SCGF-0、人血小板生成素、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、人TGF-a、人TGF-0和人VEGF。Flt-1受體蛋白質(zhì)具有包含7個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域的胞外部分。這些結(jié)構(gòu)域定位于 Genbank 檢索號(hào) P17948(也見(jiàn) SEQ ID NO :15)的氨基酸殘基編號(hào) 32. . . 123、151. . . 214、 230. . . 327,335. . . 421,428. . . 553,556. . . 654 和 661. . . 747。殘基編號(hào) 1-26 包含信號(hào)肽。 Flt-1蛋白質(zhì)由Genbank檢索號(hào)NM_002019(SEQ ID NO 14)所示DNA序列編碼?？梢园幢绢I(lǐng)域已知使用多聚化結(jié)構(gòu)域?？梢允褂肐gGl或IgG2 A重鏈的Fc部分 的序列，例如單獨(dú)使用CH3(氨基酸371-477)或使用CH2和CH3結(jié)構(gòu)域(247-477) 二者。 Ig分子的Fc部分是通過(guò)用木瓜蛋白酶切割全抗體分子獲得的部分。也可以用其他方法獲 得這些部分。IgGl入重鏈蛋白質(zhì)序列見(jiàn)Genbank檢索號(hào)Y14737和SEQ ID N0:10?？梢允?用例如來(lái)自其他IgG類型和來(lái)自IgA、IgM、IgD或IgE抗體的其他Fc區(qū)。還可以使用VEGF的多聚化區(qū)。編碼VEGF的DNA序列顯示于Genbank檢索號(hào)NM_003376和SEQ ID NO :11。 VEGF的氨基酸序列顯示于Genbank檢索號(hào)CAC19513和SEQ ID NO :12。由VEGF外顯子 3 (VEGFEx3)編碼的VEGF的多聚化區(qū)(SEQ ID NO 13)大致處于VEGF蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 12)的氨基酸殘基75-88。多聚化結(jié)構(gòu)域可以引起單體融合蛋白質(zhì)的至少5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、75%、80 %、85%、90%或95%在非變性聚丙烯酰胺凝膠上以適合于 多聚體的速率遷移。糖基化可以影響蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移。雖然在此顯示具體的序列， 但也可以使用諸如等位變體的變體。這類變體一般與所公開(kāi)的序列具有至少85%、90%、 95%、97%、98%或 99%的同一性。如本文所示，可以用例如還原和非還原凝膠測(cè)定多聚化。還可以通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì) 對(duì)其配體/受體的提高的親和力來(lái)測(cè)定多聚化。在這一點(diǎn)上，可以使用BiaCore 表面等離 振子共振測(cè)定法。這些測(cè)定法通過(guò)測(cè)量靠近傳感芯片表面的水性層中折射率的變化來(lái)檢測(cè) 物質(zhì)變化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任意方法來(lái)檢測(cè)多聚化。本發(fā)明的接頭部分可以包含例如5-100個(gè)氨基酸殘基、5-75個(gè)氨基酸殘基、5_50 個(gè)氨基酸殘基、5-25個(gè)氨基酸殘基、5-20個(gè)氨基酸殘基、5-15個(gè)氨基酸殘基、5_10個(gè)氨基酸 殘基、5-9個(gè)氨基酸殘基。有用的接頭的實(shí)例包含gly9 (SEQ ID NO :27)、glu9 (SEQ ID NO 28)、ser9(SEQ ID NO 29), gly5cyspro2cys (SEQ ID NO :30)、(gly4ser) 3 (SEQ ID NO :31)、 SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO :32)、ProSerCysValProLeuMetAr gCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO 13), GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID NO: 26)，和Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID N0:34)?？梢允?用的其他多肽接頭包含不同長(zhǎng)度(包含5、7或30個(gè)殘基)的聚甘氨酸。此外，F(xiàn)lt-I的其 他部分可以用作接頭，例如Flt-I的結(jié)構(gòu)域3。見(jiàn)SEQ ID N0:15。也可以從其他聚合物產(chǎn) 生接頭部分，例如聚乙二醇。這類接頭可以具有10-1000、10-500、10-250、10-100或10-50 個(gè)乙二醇單體單位。適合的聚合物應(yīng)具有與適當(dāng)范圍的氨基酸殘基所占據(jù)的尺寸相似的尺 寸。一般尺寸的聚合物提供約10-25埃的空間?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。雖然可以通過(guò)合成或 通過(guò)連接產(chǎn)生的部分來(lái)產(chǎn)生這類蛋白質(zhì)，但也可以使用重組產(chǎn)生?？梢杂弥亟MDNA的標(biāo)準(zhǔn) 工具產(chǎn)生融合基因序列?？梢詫⑷诤匣蛐蛄胁迦胼d體(例如病毒或質(zhì)粒載體)進(jìn)行融合 基因序列的復(fù)制?？梢栽谌诤匣蛏嫌我朐谧罱K受體細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子序列。所使 用的啟動(dòng)子可以是組成型、誘導(dǎo)型或阻抑型啟動(dòng)子。每種類型的實(shí)例為本領(lǐng)域公知?？梢酝?過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法將載體引入宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物。可以使用的適合的載體包含腺 病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(Ientivirus)和質(zhì)粒。若載體是病毒載體且載體已 包裝，則可以用病毒體感染細(xì)胞。若使用裸DNA，則可以使用適合于具體宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或 轉(zhuǎn)化方法?？梢允褂美镁酆衔镱悺⒅|(zhì)體或納米球的裸DNA制劑進(jìn)行融合基因遞送?？?以用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以是對(duì)技術(shù)人員方便的任意細(xì)胞?？梢允褂?的示例性細(xì)胞類型包含細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可以按方便 選擇許多組織類型的細(xì)胞。可以使用的示例性細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì) 胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。這些細(xì)胞可以用來(lái)在體外產(chǎn)生 蛋白質(zhì)，或者可以遞送至包含人類的哺乳動(dòng)物，以在體內(nèi)產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)。這種遞送方 法是遞送核酸至哺乳動(dòng)物、遞送病毒載體至哺乳動(dòng)物和遞送融合蛋白質(zhì)至哺乳動(dòng)物外的另一種選擇。蛋白質(zhì)或核酸的組合物可以在載體中，例如緩沖液、水性或親脂載體、無(wú)菌或非無(wú)菌、熱原性或非熱原性載體。非熱原性載體用于可注射制劑。制劑可以是液體或固體，例如 凍干的。制劑可以作為氣霧劑施用。組合物可以包含一種或多種融合蛋白質(zhì)，或一種或多 種核酸，或融合蛋白質(zhì)和核酸二者。組合物中的融合蛋白質(zhì)或核酸可以是同型的，這種情況 下將形成同型多聚體蛋白質(zhì)，或者它們?cè)诮M合物中是異源的，這種情況下形成異源多聚體 蛋白質(zhì)。在異源多聚體的情況中，X部分在融合蛋白質(zhì)間一般不同，但Z部分在融合蛋白質(zhì) 間是相同的?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法向細(xì)胞或哺乳動(dòng)物宿主提供融合蛋白質(zhì)?？梢詫?蛋白質(zhì)遞送至細(xì)胞或宿主。可以對(duì)細(xì)胞或宿主施用核酸?？梢詫?duì)細(xì)胞或宿主施用轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞。在后一種情況中，希望得到具有相同遺傳背景的細(xì)胞，以降低移植排斥。適合遞送至哺乳類宿主動(dòng)物的細(xì)胞包含來(lái)自任意器官、腫瘤或細(xì)胞系的任意哺乳 動(dòng)物細(xì)胞類型。例如，可以使用人、鼠、山羊、綿羊、牛、狗、貓和豬的細(xì)胞。適用的細(xì)胞類型非 限制性地包含成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞。遞送融合蛋白質(zhì)或編碼融合蛋白質(zhì)的核酸的方法包括表達(dá)融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞的 遞送、融合蛋白質(zhì)的遞送和編碼融合蛋白質(zhì)的核酸的遞送。通過(guò)例如注射法、導(dǎo)管插入法或 內(nèi)窺鏡法，可以將融合蛋白質(zhì)、細(xì)胞或核酸直接遞送至所希望的器官或腫瘤。還可以通過(guò)靜 脈內(nèi)、支氣管內(nèi)、瘤內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、局部、皮下、經(jīng)皮或口服遞送融合蛋白質(zhì)、細(xì)胞或核 酸?？梢杂行е委煹牟∪税加袧裥阅挲g相關(guān)性黃斑變性、糖尿病增殖性視網(wǎng)膜病變、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎、哮喘和癌癥的病人。治療將改善癥狀和/或疾病標(biāo)志 和/或疾病嚴(yán)重度。當(dāng)遞送至眼睛的前部或中央玻璃體腔(mid-vitreous space)中時(shí)，編碼分泌蛋白 質(zhì)的基因治療病毒載體(例如AVV2)轉(zhuǎn)導(dǎo)眼中的變移上皮細(xì)胞(例如在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 中)。前房中可獲得產(chǎn)生自轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)。因此，可以通過(guò)玻璃體內(nèi)的病毒基因遞 送治療眼睛前部的疾病。這類前眼疾病(front eye disease)的實(shí)例包含但不限于干眼綜 合癥、Sjogren's綜合癥、葡萄膜炎、角膜血管發(fā)生、角膜移植排斥。分泌蛋白質(zhì)的實(shí)例包含 但不限于 sFLTl、IL-10、ILlRa、IL18bp、可溶性PDLl-Ig、CTLA4-Ig、可溶性 TNFR-Ig、可溶性 IL-17R和可溶性IL23R?？梢砸匀我庀Ｍ妮d體將核酸遞送至哺乳動(dòng)物，尤其是遞送至人類。這些載體包 含病毒或非病毒載體，包含腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和 質(zhì)粒載體。示例性病毒類型包含HSV(單純皰疹病毒)、腺病毒、AAV(腺伴隨病毒)、HIV(人 免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)?？梢砸蕴峁┳銐蛴行У?遞送水平的任意希望的形式遞送核酸，包含以病毒顆粒形式、以脂質(zhì)體形式、以納米顆粒形 式和絡(luò)合至聚合物類遞送?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)和核酸治療的組合。例如，可以對(duì)病人施用本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。 若觀察到良好的反應(yīng)，則可以為了長(zhǎng)期作用施用編碼該融合蛋白質(zhì)的核酸分子。備選地，可 以同時(shí)或近乎同時(shí)施用蛋白質(zhì)和核酸。在另一種選擇中，可以施用配體的抗體或融合蛋白 質(zhì)，隨后或同時(shí)施用受體的抗體或融合配偶體。另一種選擇使用核酸的組合，其中一種核酸編碼抗體，另一種核酸編碼融合蛋白質(zhì)?？梢耘c本發(fā)明的Flt-I構(gòu)建體(無(wú)論是蛋白質(zhì)形 式或核酸形式)組合使用的一些抗體是貝伐單抗和蘭尼單抗，二者均針對(duì)VEGF。這些抗體 分別對(duì)治療癌癥和黃斑變性尤其有用。
除非另作說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)(包含重組技 術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中闡述透 徹，如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989) ；Current Protocols In Molecular Biology(F. M. Ausubel 等 編 輯，1987) ；Oligonucleotide Synthesis (Μ· J. Gait 編輯，1984) ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編輯，1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc. ) ；Handbook Of Experimental Immunology(D. M. Wei&C. C. Blackwell 編輯)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. M. Miller & Μ· P. Calos H 1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等編輯，1994) ；Current Protocols In Immunology (J. Ε· Coligan 等編輯， 1991) ；Antibodies :A Laboratory Manual (Ε· Harlow 禾口 D. Lane 編輯(1988))；禾口 PCR 2 :A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 編輯(1995))。如本文所用，本發(fā)明的VEGF拮抗劑的“降低的量”指VEGF拮抗劑的局部濃度(哺 乳動(dòng)物體內(nèi))。對(duì)相同的疾病指征，當(dāng)其低于市售“參考VEGF拮抗劑”的局部濃度時(shí)，認(rèn)為 局部濃度是降低的量。例如，“降低的量”可以是參考VEGF拮抗劑的局部濃度的90%、75%、 50%、25%、10%或5%。作為實(shí)例，蘭尼單抗(Lucentis)是市售抗-VEGF抗體形式的VEGF 拮抗劑，用于治療AMD。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明用VEGF拮抗劑治療AMD時(shí)，該VEGF拮抗劑的降低的 量定義為局部濃度，該濃度低于對(duì)眼部施用抗體后蘭尼單抗的局部濃度。據(jù)估計(jì)，單劑量后 蘭尼單抗在眼內(nèi)的局部濃度是約100yg/ml。因此，根據(jù)本發(fā)明按降低的量提供用來(lái)治療 AMD的VEGF拮抗劑，即低于100yg/ml的局部濃度，例如處于或低于95 μ g/ml、85 μ g/ml、 75μ g/ml、50y g/ml、25y g/ml、15y g/ml、10y g/ml 或 5μ g/ml。本發(fā)明的 VEGF 拮抗劑是 蛋白質(zhì)時(shí)，其可以通過(guò)蛋白質(zhì)或基因治療提供。如本文所用，“參考VEGF拮抗劑”指市售VEGF拮抗劑。只要參考VEGF拮抗劑拮抗 VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，其可以是任何形式。例如，參考VEGF拮抗劑可以是融合蛋白質(zhì)或諸如VEGF 抗體的其他類型的分子。至少約50% -99%或更多存在于貯存物中的病毒體是具有包裝基因組的病毒體 (例如AAV載體顆粒)時(shí)，包含病毒載體顆粒(包裝基因組)的病毒體的貯存物或制劑(例 如基因治療病毒體)“基本上無(wú)”空病毒殼體。優(yōu)選地，載體顆粒包含至少約75-85wt%、 更優(yōu)選約90wt%的病毒體存在于貯存物中，甚至更優(yōu)選至少約95wt%、或甚至99wt%或更 多的病毒體存在于貯存物中，或這些范圍間的任意整數(shù)的病毒體存在于貯存物中。因此，當(dāng) 約40 %至約1 %或更少、優(yōu)選約25 %至約15 %或更少、更優(yōu)選約10 %或更少、甚至更優(yōu)選約 5%至約或更少產(chǎn)生的貯存物包含空病毒殼體時(shí)，貯存物基本上無(wú)空病毒殼體。可以按 例如美國(guó)專利號(hào)7，261，544(在此以其整體引入作為參考)所述制備基本上無(wú)空病毒殼體 的病毒體。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)量空病毒殼體，例如Progen病毒殼體酶聯(lián)免疫吸 附測(cè)定法?；蜻f送載體可以是可攜帶插入的多核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的任意分子?；蜻f送 載體的實(shí)例是脂質(zhì)體；生物相容性聚合物類，包含天然聚合物類和合成聚合物類；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金屬顆粒；細(xì)菌；病毒，如桿狀病毒、腺病毒和反轉(zhuǎn)錄 病毒；噬菌體；黏端質(zhì)粒；質(zhì)粒；真菌載體；和已描述了其在多種真核和原核宿主中的表達(dá)， 且可以用于基因治療以及簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)表達(dá)的本領(lǐng)域常用的其他重組載體。如本文所用，基因遞送、基因轉(zhuǎn)移等術(shù)語(yǔ)是指不考慮用于引入的方法，將外源多核 苷酸(有時(shí)稱為“轉(zhuǎn)基因”)引入宿主細(xì)胞。這類方法包括多種公知的技術(shù)，如載體介導(dǎo)的 基因轉(zhuǎn)移(通過(guò)例如病毒感染/轉(zhuǎn)染，或多種其他基于蛋白質(zhì)或基于脂質(zhì)的基因遞送復(fù)合 物)以及促進(jìn)“裸”多核苷酸遞送的技術(shù)(如電穿孔、“基因槍”遞送和多種用于多核苷酸引 入的其他技術(shù))。引入的多核苷酸可以穩(wěn)定地或瞬時(shí)地保持在宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定保持通常 需要所引入的多核苷酸包含與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制起點(diǎn)或整合入宿主細(xì)胞的復(fù)制子，如染 色體外復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或核染色體或線粒體染色體。如本領(lǐng)域已知和本文所述，已知 許多載體能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、門靜脈內(nèi)(intraportal)或其他給藥途徑遞送，將外源多核 苷酸插入載體，如腺病毒、部分刪除的腺病毒、完全刪除的腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、反轉(zhuǎn) 錄病毒、慢病毒、裸質(zhì)粒、質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物等?？梢栽诒景l(fā)明的方法和組合物中使用的 表達(dá)載體包含例如病毒載體。在體內(nèi)和離體條件下，最常用的基因治療給藥方法之一是用 病毒載體遞送基因。已知許多病毒物種，并已為基因治療的目的研究了許多病毒物種。最 常用的病毒載體包含衍生自腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)和反轉(zhuǎn)錄病毒(包含慢病毒，如人免 疫缺陷病毒(HIV))的病毒載體。腺病毒是無(wú)包膜的核DNA病毒，具有約36 kb的基因組，已通過(guò)經(jīng)典遺傳學(xué)和 分子生物學(xué)中的研究良好地對(duì)其進(jìn)行了表征(Hurwitz，Μ. S.，Adenoviruses Virology, 第 3 版，F(xiàn)ields 等編輯，Raven Press,紐約，1996 ；Hitt, Μ. M.等，Adenovirus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T.編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約1999)。病毒基因分為涉及兩類時(shí)序病毒蛋白質(zhì)產(chǎn)生的早期(命名 為E1-E4)和晚期(命名為L(zhǎng)1-L5)轉(zhuǎn)錄單位。這些事件的分界是病毒DNA復(fù)制。根據(jù)包含 紅血細(xì)胞凝集、致癌性、DNA和蛋白質(zhì)氨基酸的組成和同源性，以及抗原關(guān)系的性質(zhì)，將人腺 病毒劃分為許多血清型(約47種，相應(yīng)地編號(hào)并劃分為6個(gè)組:A、B、C、D、E和F)。重組腺病毒載體用作基因遞送載體具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包含對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞都具 有向性、最小的致病潛力、復(fù)制達(dá)到高效價(jià)用于載體貯存物制備的能力和攜帶大的插入片 段的潛力(Berkner, K. L.，Curr. Top. Micro. Immunol. 158 :39_66，1992 Jolly, D.，Cancer Gene Therapy 1 :51_64 1994)。已將多種腺病毒基因序列缺失的腺病毒載體設(shè)計(jì)為利用所 希望的腺病毒特征，這些特征使其成為遞送核酸至受體細(xì)胞的適合載體。具體而言,假腺病毒載體(pseudoadenoviral vectors) (PAV)(也稱為 “gutless 腺病毒”或微型腺病毒載體)是衍生自腺病毒基因組的腺病毒載體，其包含病毒基因組復(fù) 制和包裝所需的最少限度的順式作用核苷酸序列，且其可以包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因(參 見(jiàn)涉及假腺病毒載體(PAV)和產(chǎn)生PAV的方法的美國(guó)專利號(hào)5，882，877，其在此引入作為 參考)。已將PAV設(shè)計(jì)為利用所希望的腺病毒特征，這些特征使其成為基因遞送的適合載 體。雖然通過(guò)缺失對(duì)病毒生長(zhǎng)可有可無(wú)的區(qū)域，腺病毒載體一般可以攜帶大小至多為8kb 的插入片段，但是用包含大部分病毒編碼序列缺失的腺病毒載體(包含PAV)可以達(dá)到最 大載量。見(jiàn) Gregory 等的美國(guó)專利號(hào) 5，882，877 ；Kochanek 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :5731-5736，1996 ；Parks 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 13565-13570，1996 ；Lieber 等，J. Virol. 70 =8944-8960,1996 ；Fisher 等，Virology 217 11~22,1996 ；美國(guó)專利號(hào) 5，670, 488 ； 1996年10月24日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)W096/33280 ； 1996年12月19日公開(kāi)的 PCT公開(kāi)號(hào)W096/40955 ； 1997年7月19日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)W097/25446 ； 1995年11月9 日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)W095/29993 ； 1997年1月3日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)W097/00326 ；Morral 等，Hum. Gene Ther. 10 :2709_2716，1998。這類可以容納至多約36kb外源核酸的PAV是有 利的，因?yàn)閮?yōu)化了載體的載量，而降低了宿主對(duì)載體產(chǎn)生免疫應(yīng)答或產(chǎn)生復(fù)制型病毒的潛 力。PAV載體包含5'反向末端重復(fù)(ITR)和3' ITR核苷酸序列，其包含復(fù)制起點(diǎn)、PAV基 因組包裝所需的順式作用核苷酸序列，且可以容納一個(gè)或多個(gè)具有適當(dāng)調(diào)節(jié)元件(例如啟 動(dòng)子、增強(qiáng)子等)的轉(zhuǎn)基因。另外，部分刪除的腺病毒載體提供了部分刪除的腺病毒(稱為“DeAd”)載體，其中 從載體上刪除病毒復(fù)制所需的大部分腺病毒早期基因，并將這些基因在條件啟動(dòng)子的控制 下置于生產(chǎn)者細(xì)胞的染色體內(nèi)。置于生產(chǎn)者細(xì)胞中的可刪除的腺病毒基因可以包含ElA/ E1B、E2、E4(只需將0RF6和0RF6/7置入細(xì)胞)、pIX和pIVa2。還可以從載體刪除E3，但 由于其不是載體產(chǎn)生所需的，所以在生產(chǎn)者細(xì)胞中可以省略。載體中存在腺病毒晚期基因 (通常在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的控制下)，但可以用條件啟動(dòng)子替換MLP。適用于DeAd載體和生產(chǎn)者細(xì)胞系的條件啟動(dòng)子包含具有以下特征的條件啟動(dòng) 子非誘導(dǎo)狀態(tài)下低的基礎(chǔ)表達(dá)，以使細(xì)胞毒性的或抑制細(xì)胞的病毒基因不以對(duì)細(xì)胞有害 的水平表達(dá)；誘導(dǎo)狀態(tài)下高水平表達(dá)，以產(chǎn)生足夠量的病毒蛋白質(zhì)來(lái)支持載體的復(fù)制和組 裝。適用于DeAd載體和生產(chǎn)者細(xì)胞系的優(yōu)選的條件啟動(dòng)子包含基于免疫抑制劑Π(506和 瑞帕霉素的二聚體劑(dimerizer)基因控制系統(tǒng)、蛻皮素基因控制系統(tǒng)和四環(huán)素基因控 制系統(tǒng)。Abruzzese 等，Hum. Gene Ther. 1999 10 1499-507 中所述的 GeneSwitch 技術(shù) (Valentis,Inc. ,Woodlands,TX)也可以用于本發(fā)明，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。部分 刪除的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步描述于W099/57296中，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。腺伴隨病毒(AAV)是單鏈人DNA細(xì)小病毒，其基因組大小為4. 6kb。AAV基因組包 含兩個(gè)主要的基因r印基因，其編碼r印蛋白質(zhì)(Itep 76, Rep 68, Rep 52和R印40)；和 cap基因，其編碼AAV復(fù)制、拯救、轉(zhuǎn)錄和整合，而cap蛋白質(zhì)形成AAV病毒顆粒。AAV因其依 賴于腺病毒或其他輔助病毒(例如皰疹病毒)供給允許AAV進(jìn)行生產(chǎn)性感染(即在宿主細(xì) 胞中繁殖其自身)的必需基因產(chǎn)物而得名。在無(wú)輔助病毒的情況下，AAV作為原病毒整合入 宿主細(xì)胞的染色體，直至為輔助病毒(通常是腺病毒)超感染宿主細(xì)胞所拯救(Muzyczka， Curr. Top. Micor. Immunol. 158 :97_127，1992)。對(duì)AAV作為基因轉(zhuǎn)移載體的興趣產(chǎn)生自其幾種獨(dú)特的生物學(xué)特征。AAV基因組的 兩端都是稱為反向末端重復(fù)(ITR)的核苷酸序列，其包含病毒復(fù)制、拯救、包裝和整合所需 的順式作用核苷酸序列。由rep蛋白質(zhì)反向介導(dǎo)的ITR的整合功能允許AAV基因組感染 后在無(wú)輔助病毒的情況下整合入細(xì)胞染色體。病毒的這一獨(dú)特特性與在基因轉(zhuǎn)移中的AAV 使用相關(guān)，因?yàn)槠湓试S包含目的基因的重組AAV整合入細(xì)胞基因組。因此，通過(guò)使用rAAV 載體可以達(dá)到穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，這是許多基因轉(zhuǎn)移目標(biāo)的理想結(jié)果。此外，很好地確定了 AAV的整合位點(diǎn)并已將其定位于人的19號(hào)染色體(Kotin等，Proc. Natl. Acad. Sci. 87 2211-2215，1990)。整合位點(diǎn)的這種可預(yù)測(cè)性降低了隨機(jī)插入細(xì)胞基因組的事件的危險(xiǎn)，這些事件可以激活或失活宿主基因或間斷編碼序列，這是可以限制整合AAV的載體的使用的 結(jié)果，在rAAV載體的設(shè)計(jì)中去除這個(gè)基因可以產(chǎn)生已用rAAV載體觀察到的改變的整合模 式(Ponnazhagan 等，Hum Gene Ther. 8 :275_284，1997)。用AAV進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移有其他優(yōu)勢(shì)。AAV的宿主范圍廣。此外，不同于反轉(zhuǎn)錄病毒， AAV可以感染休眠細(xì)胞和分裂細(xì)胞。同時(shí)AAV尚未與人類疾病相關(guān)聯(lián)，消除了反轉(zhuǎn)錄病毒衍 生的基因轉(zhuǎn)移載體已出現(xiàn)的許多顧慮。產(chǎn)生重組rAAV載體的標(biāo)準(zhǔn)方法需要協(xié)調(diào)一系列細(xì)胞內(nèi)事件用包含兩側(cè)有AAV ITR序列的目的轉(zhuǎn)基因的rAAV載體基因組轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、通過(guò)編碼反向所需的AAV rep和 cap蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和用輔助病毒感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)供給反向所需的非 AAV 輔助病毒功能(Muzyczka, N.，Curr. Top. Micor. Immunol. 158 :97_129，1992)。腺病毒 (或其他輔助病毒)的蛋白質(zhì)激活A(yù)AV r印基因的轉(zhuǎn)錄，然后r印蛋白質(zhì)激活A(yù)AV cap基因 的轉(zhuǎn)錄。然后cap蛋白質(zhì)利用ITR序列來(lái)將rAAV基因組包裝入rAAV病毒顆粒。因此，包 裝的效率部分地由足量結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的可獲得性，以及rAAV載體基因組中所需的任意順式 作用包裝序列的可接近性決定。反轉(zhuǎn)錄病毒是常見(jiàn)的基因遞送工具(Miller，Nature (1992) 357 :455_460)。反轉(zhuǎn) 錄病毒載體遞送非重排的單拷貝基因進(jìn)入廣泛的嚙齒類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人的體細(xì)胞的 能力使反轉(zhuǎn)錄病毒載體非常適合用于轉(zhuǎn)移基因至細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄病毒是其中病毒基因組是RNA的RNA病毒。當(dāng)用反轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞 時(shí)，基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為非常有效地整合入所感染細(xì)胞染色體DNA的DNA中間體。這種整 合的DNA中間體稱為原病毒。原病毒的轉(zhuǎn)錄和組裝為感染性病毒發(fā)生在存在適合的輔助病 毒的情況下，或發(fā)生在包含能夠在無(wú)污染輔助病毒同時(shí)產(chǎn)生的情況下殼體化的適當(dāng)序列的 細(xì)胞系中。若用適當(dāng)?shù)妮d體通過(guò)共轉(zhuǎn)染提供用于殼體化的序列，則重組反轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生 不需要輔助病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組和原病毒DNA具有3個(gè)基因gag、pol和env，其兩側(cè)是兩個(gè)長(zhǎng) 末端重復(fù)(LTR)序列。gag基因編碼內(nèi)部的結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、病毒殼體和核病毒殼體)蛋白質(zhì)； pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)；env基因編碼病毒的包膜糖蛋白。5' LTR 和3' LTR促進(jìn)病毒體RNA的轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷化。LTR包含病毒復(fù)制必需的所有其他順式作 用序列。慢病毒具有包含vit vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx (在HIV-I、HIV-2和/或SIV 中)的其他基因。與5' LTR相鄰的是基因組反轉(zhuǎn)錄必需的序列(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))和 病毒RNA有效病毒殼體化進(jìn)入顆粒必需的序列(Psi位點(diǎn))。若病毒殼體化(或?qū)⒎崔D(zhuǎn)錄病 毒RNA包裝入感染性病毒體)必需的序列從病毒基因組缺失，則結(jié)果是阻止基因組RNA病 毒殼體化的順式缺陷。但是，產(chǎn)生的突變體仍然能夠指導(dǎo)所有病毒體蛋白質(zhì)的合成。慢病毒是復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒，除共有的反轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pol和env外，其還 包含具有調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)功能的其他基因。如在潛伏性感染的過(guò)程中，較高的復(fù)雜性使慢病毒 能夠調(diào)節(jié)其生活周期。人免疫缺陷病毒(HIV) (AIDS的致病因子)是典型的慢病毒。在體 內(nèi)，HIV可以感染幾乎不分裂的終端分化細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在體外，HIV可以 感染單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophag, MDM)的原代培養(yǎng)物，以及通 過(guò)用阿非科林(aphidicolin)或γ輻射處理阻斷在細(xì)胞周期中的HeLa-CcM或淋巴細(xì)胞。 細(xì)胞的感染依賴于HIV預(yù)整合復(fù)合物通過(guò)靶細(xì)胞核孔的活躍核轉(zhuǎn)運(yùn)。用靶細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)裝置，通過(guò)復(fù)合物中多個(gè)部分冗余的分子決定因素的相互作用發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)。已鑒定的決定因素 包含gag基質(zhì)(MA)蛋白質(zhì)中的功能性核定位信號(hào)(NLS)、親核的病毒體相關(guān)蛋白質(zhì)、vpr和 gag MA蛋白質(zhì)C端的磷酸酪氨酸殘基。反轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)基因治療的用途描述于例如美國(guó)專利 6，013，516和美國(guó)專利5，994，136，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。遞送DNA至細(xì)胞的其他方法不使用病毒進(jìn)行遞送。例如，可以用陽(yáng)離子型兩親性 化合物遞送本發(fā)明的核酸。因?yàn)樵O(shè)計(jì)用來(lái)促進(jìn)生物學(xué)活性分子的細(xì)胞內(nèi)遞送的化合物必須 與非極性和極性環(huán)境二者相互作用(例如在質(zhì)膜、組織液、細(xì)胞內(nèi)區(qū)室和生物學(xué)活性分子 自身之內(nèi)或之上)，所以一般將這類化合物設(shè)計(jì)為包含極性和非極性結(jié)構(gòu)域二者。這兩類結(jié) 構(gòu)域都具有的化合物可以稱為兩親物，已公開(kāi)用于促進(jìn)這種細(xì)胞內(nèi)遞送(無(wú)論用于體外或 體內(nèi)應(yīng)用)的許多脂質(zhì)和合成脂質(zhì)符合這一定義。這類兩親物中尤其重要一類是陽(yáng)離子型 兩親物。一般而言，陽(yáng)離子型兩親物具有能夠在生理PH或生理pH附近成為帶正電荷的極 性基團(tuán)，本領(lǐng)域?qū)⑦@一特性理解為在確定兩性物如何與多種類型的生物學(xué)活性(治療性) 分子(包含例如帶負(fù)電荷的多核苷酸，如DNA)相互作用中很重要。包含陽(yáng)離子型兩親性化合物的組合物對(duì)基因遞送的用途描述于例如美國(guó)專 利 5，049，386、美國(guó) 5，279，833、美國(guó) 5，650，096、美國(guó) 5，747，471、美國(guó) 5，767，099、美 國(guó) 5，910，487、美國(guó) 5，719，131、美國(guó) 5，840，710、美國(guó) 5，783，565、美國(guó) 5，925，628、美 國(guó) 5，912，239、美國(guó) 5，942，634、美國(guó) 5，948，925、美國(guó) 6，022，874、美國(guó) 5，994，317、美國(guó) 5，861，397、美國(guó) 5，952，916、美國(guó) 5，948，767、美國(guó) 5，939，401 和美國(guó) 5，935，936 中，其公開(kāi) 內(nèi)容在此引入作為參考。此外，可以用“裸DNA”遞送本發(fā)明的核酸。遞送非感染性、非整合DNA序列的方法 描述于美國(guó)專利5，580，859、美國(guó)5，963，622、美國(guó)5，910，488，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參 考，所述DNA序列編碼有效連接至啟動(dòng)子的所希望的多肽或肽，不結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)、 病毒顆粒、脂質(zhì)體制劑、帶電脂質(zhì)和磷酸鈣沉淀劑。已報(bào)道了組合病毒和非病毒成分的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。Cristiano等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 11548 ；Wu 等(1994) J. Biol. Chem. 269 11542 ；Wagner 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 6099 ；Yoshimura等(1993) J. Biol. Chem. 268 2300 ；Curiel 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8850 ;Kupfer 等(1994)Human Gene Ther. 5 1437 ；和Gottschalk等(1994) Gene Ther. 1 :185。在大多數(shù)情況下，已將腺病毒整合入基 因遞送系統(tǒng)以利用其內(nèi)體水解(endosomolytic)特性。已報(bào)道的病毒和非病毒成分的組合 一般涉及共價(jià)連接腺病毒至基因遞送復(fù)合物或未結(jié)合的腺病毒與陽(yáng)離子脂(DNA復(fù)合物) 的共內(nèi)化。對(duì)于遞送DNA和蛋白質(zhì)至眼部，一般是局部施用。這具有限制所需施用的DNA量 和限制系統(tǒng)性副作用的優(yōu)勢(shì)?？梢允褂迷S多可能的遞送模式，其包含但不限于通過(guò)基因 槍在角膜上局部施用、結(jié)膜下注射、前房?jī)?nèi)注射、經(jīng)滴眼液滴至角膜、經(jīng)termporal Iimbus 注射入前房、基質(zhì)內(nèi)注射、與電脈沖組合的角膜應(yīng)用、角膜內(nèi)注射、視網(wǎng)膜下注射、玻璃體內(nèi) 注射(例如前部、中央或后部玻璃體注射)和眼內(nèi)注射。備選地，可以在離體條件下轉(zhuǎn)染 或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞并通過(guò)眼內(nèi)移植遞送。見(jiàn)Auricchio，Mol. Ther. 6 =490-494,2002 ；Bennett, Nature Med. 2 649-654,1996 ；Borras, Experimental Eye Research 76:643-652,2003; Chaum, Survey of Ophthalmology 47 449-469,2002 ；Campochiaro, Expert Opinions inBiological Therapy 2 537-544(2002) ；Lai, Gene Therapy 9:804 813,2002 ；Pleyer, Progress inRetinal and Eye Research,22 :277_293,2003?？梢栽诰唧w疾病的適合的動(dòng)物模型中測(cè)試多種已提出的治療劑和給藥法的效果。 例如，可以按 Smith，Investigative Ophthalmology & VisualScience，35 :101_111，1994 中所述，在小鼠的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中測(cè)試早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。小鼠中激光誘導(dǎo)的 脈絡(luò)膜新血管形成可以用作發(fā)生于如年齡相關(guān)性黃斑變性的疾病的人脈絡(luò)膜新血管形成 (CNV)的模型。已在靈長(zhǎng)類、大鼠類、小型豬類和兔類中發(fā)展了 CNV的其他模型。已在遺傳缺 陷小鼠中發(fā)展了年齡相關(guān)性黃斑變性的小鼠模型。單核細(xì)胞趨化蛋白-1或C-C趨化因子受 體-2缺陷的小鼠發(fā)展出年齡相關(guān)性黃斑變性的特征。Ambati，Nature Med. 9 :1390_1397， 2003。對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明VEGF拮抗劑(蛋白質(zhì)或基因治療)的適合劑量將 取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重度和進(jìn)程，施用VEGF拮抗劑是為了預(yù)防性目的或治 療性目的、既往治療、臨床病史和對(duì)VEGF拮抗劑的應(yīng)答和主治醫(yī)生的判斷。VEGF拮抗劑適 合于一次或在一系列治療中對(duì)病人施用。在組合治療方案中，按治療有效量或協(xié)同量施用 本發(fā)明的組合物。如本文所用，治療有效量是這樣的量，VEGF拮抗劑和一種或多種其他治 療劑共同施用、或施用本發(fā)明的組合物，導(dǎo)致目標(biāo)疾病或病癥的降低或抑制。治療協(xié)同量是 協(xié)同地或顯著地降低或消除與具體疾病相關(guān)的狀態(tài)或癥狀必需的VEGF拮抗劑和一種或多 種其他治療劑的量。取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，可以如此施用VEGF拮抗劑，使所提供的局部濃度為 約 100pg/ml 至約 100 μ g/ml、lng/ml 至約 95 μ g/ml、lOng/ml 至約 85 μ g/ml、lOOng/ml 至約 75 μ g/ml、約 lOOng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ ml、約1 μ g/ml至約10 μ g/ml或約1 μ g/ml至約4 μ g/ml。當(dāng)通過(guò)病毒體通過(guò)基因治療遞 送VEGF拮抗劑時(shí)，劑量可以是每單位劑量約2xl06至約2xl012、約2xl07至約ZxIO11cIrP或 約2xl08至約ZxliTdrp。當(dāng)通過(guò)蛋白質(zhì)治療施用VEGF拮抗劑時(shí)，劑量可以是每單位劑量約 0. Img 至約 50mg、約 0. Img 至約 25mg、約 0. Img 至約 IOmgJA 0. Img 至約 5mg、約 0. Img 至 約 4mg、約 0. Img 至約 3mg、約 0. Img 至約 2. 5mg、約 0. Img 至約 2mg、約 0. Img 至約 1. 5mg、 約 0. Img 至約 lmg、約 0. Img 至約 0. 75mg、約 0. Img 至約 0. 5mg、約 0. Img 至約 0. 25mg、約 0. 25mg至約5mg、約0. 5mg至約5mg、約Img至約5mg、約1. 5mg至約5mg、約2mg至約5mg、 約2. 5mg至約5mg、約0. 5mg至約5mg或約0. 5mg至約2. 5mg。本發(fā)明的VEGF拮抗劑可以作為單劑量施用或反復(fù)施用。對(duì)于數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi) 反復(fù)施用，取決于病癥，治療持續(xù)至發(fā)生所希望的疾病癥狀的抑制。通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法 監(jiān)測(cè)本發(fā)明治療的進(jìn)展。動(dòng)物或病人對(duì)VEGF拮抗劑發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)，必要時(shí)，可嘗試通過(guò)例如使用可獲得 的免疫抑制劑來(lái)降低免疫應(yīng)答(炎癥和/或渾濁或抗體)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案 使用基因治療時(shí)，降低空病毒病毒殼體的數(shù)目有助于降低免疫應(yīng)答。根據(jù)一些實(shí)施方案，降 低針對(duì)病毒載體的免疫應(yīng)答有助于提高VEGF拮抗劑(例如D29GLYFC)的表達(dá)，并因此增強(qiáng) VEGF拮抗劑的治療效果。盡管已就具體實(shí)施例(包含當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施本發(fā)明的模式)描述了本發(fā)明，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，存在上述系統(tǒng)和技術(shù)的多種變化和變換，如所附權(quán)利要求中所闡明，這些變化和變換也在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。本文公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)明確引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生兩個(gè)構(gòu)建體第一個(gè)是D2-9Gly_Fc，包含聚甘氨酸九聚體(9Gly)接頭；第二 個(gè)是D2-Fc，除9Gly接頭外具有相同的序列(圖1)。我們用序列分析程序MacVector 6. 5. 1. (IBI，New Haven, CT)的 Protein Analysis Toolbox分析了 D2_9Gly_Fc和D2_Fc蛋白質(zhì)的氨基酸序列。通過(guò)Karpus和 Schultz (1985) Naturwiss, 72 212~213的柔性預(yù)測(cè)方法，將D2_9Gly-Fc序列中的聚甘氨酸 九聚體接頭鑒定為具有高于平均值的柔性。在D2-Fc序列中未檢測(cè)到這種區(qū)域(圖1)。實(shí)施例2我們通過(guò)柔性聚甘氨酸九聚體接頭測(cè)試了分離的連接至IgGl Fc區(qū)的Flt-I Flt-I Ig-樣結(jié)構(gòu)域2(D2-9Gly-Fc)。D2_9Gly-Fc融合蛋白質(zhì)能夠有效地結(jié)合VEGF和抑 制VEGF依賴的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖。見(jiàn)圖2。相反，當(dāng)Flt-I Ig-樣結(jié)構(gòu)域2 直接連接至IgGl重鏈(Fe)形成D2-Fc時(shí)，僅觀察到最小限度的VEGF結(jié)合。見(jiàn)圖2。通過(guò) IgGl Fc的二聚化和柔性接頭的插入都顯示促進(jìn)VEGF結(jié)合至Flt-I結(jié)構(gòu)域2。通過(guò)蛋白質(zhì) 印跡分析確認(rèn)了二聚體形式在D2-9Gly-Fc和D2_Fc 二者中的存在。見(jiàn)圖3。實(shí)施例3通過(guò)玻璃體內(nèi)注射對(duì)新生(PO)或1日齡(Pl)C57BL/6小鼠施用AAV載體(lx IO8 至Ix IO9顆粒于0.0005mL體積中)。通過(guò)將P7仔鼠和它們的哺育母鼠暴露于高氧條件 5天，降低了 C57BL/6小鼠中的視網(wǎng)膜新血管形成(NV)。仔鼠在P12回到室內(nèi)空氣并在 P17(峰值 NV 的時(shí)間)進(jìn)行安樂(lè)死。(Smith LEH, Weslowski Ε、McLellan A、Kostyk SK、 D'AmatoR、Sullivan 禾口 D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse. Invest Opth Vis Sci. 1994;35:101-111)。按5微米間隔對(duì)整個(gè)石蠟包埋的眼部進(jìn)行連續(xù)橫切。 通過(guò)計(jì)數(shù)每100微米采集的切片中內(nèi)界膜內(nèi)部的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目來(lái)確定NV的程度。將編碼抗血管發(fā)生劑的AAV載體處理的動(dòng)物群體與編碼無(wú)關(guān)轉(zhuǎn)基因的載體或不 編碼轉(zhuǎn)基因的載體處理的動(dòng)物群體進(jìn)行比較。將每只處理的眼中內(nèi)皮細(xì)胞核的平均數(shù)與每 一動(dòng)物的未處理的對(duì)側(cè)眼進(jìn)行比較。實(shí)施例4D2-9Gly_Ex3/CH3 的產(chǎn)生已顯示Flt-I的結(jié)構(gòu)域2是VEGF165結(jié)合必需的。但是，已表明Flt-I結(jié)構(gòu)域2不 能單獨(dú)結(jié)合VEGFA。(Davis-Smyth等，1996)。當(dāng)作為二聚體存在時(shí)，VEGF A通過(guò)允許配體 誘導(dǎo)的受體二聚化的可能機(jī)制的酸性殘基(成熟蛋白質(zhì)的氨基酸63-67)結(jié)合Flt-I (Keyt 等，1996)。因此，將Flt-I結(jié)構(gòu)域2的二聚化用作恢復(fù)Flt-I結(jié)構(gòu)域2與VEGFA結(jié)合的策略。 與IgG重鏈片段融合可以用于蛋白質(zhì)的二聚化(Davis-Smyth等，1996)。我們?cè)诖吮砻鳎?VEGF A (SEQ ID NO 12)的氨基酸75-88 (即 PSCVPLMRCGGCCN ;SEQ ID NO 13)提高了 sFlt-1 雜合蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
首先，改造了三種雜合蛋白質(zhì)D2-9Gly-Fc、D2-Fc和 D2-9Gly_Ex3/CH3(圖 4)。三 種雜合蛋白質(zhì)都包含與D2-9Gly-Fc相同的Flt_l結(jié)構(gòu)域2。用不含聚甘氨酸九聚體(9Gly) 接頭的D2-Fc未觀察到VEGF結(jié)合。第三種蛋白質(zhì)D2-9Gly-Ex3/CH3包含聚甘氨酸九聚體 (9Gly)接頭和 VEGF 的多聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸 PSCVPLMRCGGCCN ；SEQ IDNO 13 ；VEGF Ex3)， 但其還包含人IgGl重鏈Fc的CH3區(qū)(SEQ ID NO 10的氨基酸371-477)。蛋白質(zhì)D2-Fc在HUVEC增殖測(cè)定中不顯示有效的抑制活性(圖5)，暗示其不能有 效地結(jié)合VEGF165。但是，第三種蛋白質(zhì)D2-9Gly-Ex3/CH3 (其包含通過(guò)9Gly接頭和VEGF165 的二聚化區(qū)(Ex 3) 二者融合至CH3區(qū)的Flt-I結(jié)構(gòu)域2)在VEGF依賴的HUVEC增殖測(cè)定 中確實(shí)表現(xiàn)抑制活性(圖5)。這暗示這種雜合蛋白質(zhì)能有效地結(jié)合VEGF165。實(shí)施例5在Flt-I D2構(gòu)建體中使用接頭(Gly4Ser)3之前已描述了使用幾種聚甘氨酸接頭來(lái)改進(jìn)蛋白質(zhì)特征(Mouz等， 1996 ；Qiu等，1998)。對(duì)下一種構(gòu)建體，我們使用了另一種類型的接頭，十五聚體 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3(Huston 等，1988)。產(chǎn)生了 D2-(Gly4Ser) 3_Fc 蛋白質(zhì)，其包含 Flt-I結(jié)構(gòu)域2、(Gly4Ser) 3接頭和人IgGl重鏈的Fc區(qū)。進(jìn)一步在HUVEC增殖測(cè)定中表征了 D2-(Gly4Ser)3-Fct5如通過(guò)HUVEC增殖的抑制 所測(cè)量，D2-(Gly4Ser)3-Fc 的生物學(xué)活性類似于 D2_9Gly-Fc 和 D2-9Gly-Ex3/CH3 (圖 6)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和與D2-9Gly_Fc比較進(jìn)一步表征了 D2_ (Gly4Ser) 3_Fc構(gòu)建體 (圖9)。兩種構(gòu)建體都是大部分以二聚體形式存在，分離還原樣品后檢測(cè)了單體形式。實(shí)施例69Gly或VEGF Ex3在Flt_l (D2)構(gòu)建體中的作用為了研究9Gly接頭或VEGF 二聚化序列Ex3對(duì)可溶性受體VEGF結(jié)合的作用，產(chǎn)生 了另外三種構(gòu)建體D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2_Ex3/CH3 (圖8)。產(chǎn)生了所有三種構(gòu)建體， 且與之前的所有構(gòu)建體一樣，也將它們置于CMV啟動(dòng)子的控制下。在HUVEC增殖測(cè)定中評(píng) 估它們的VEGF封閉活性(圖9)。包含IgGl CH3區(qū)的蛋白質(zhì)的HUVEC增殖測(cè)定已顯示，與親本D2-9Gly_Ex3/CH3蛋 白質(zhì)相比，D2-9Gly-CH3 (無(wú)Ex3)和蛋白質(zhì)D2_Ex3/CH3 (無(wú)9Gly接頭)具有相似的VEGF阻 斷潛能。但是，蛋白質(zhì)D2-CH3顯示為它們中最弱的VEGF抑制物(圖9)。對(duì)D2-9Gly-Ex3/CH3、D2_9Gly_CH3 和 D2_Ex3/CH3 和 D2-CH3，來(lái)自轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞 的條件培養(yǎng)基的Flt-I酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定數(shù)據(jù)已顯示相似的Flt-I水平(70-90ng/ml)，活 性最低的D2-CH3形式略高( 150ng/ml)。D2_9Gly-CH3和D2-CH3構(gòu)建體的蛋白質(zhì)印跡 (圖10)顯示非還原條件下以二聚體形式為主。實(shí)施例7D2-9Gly-Fc比所有構(gòu)建體更好地結(jié)合VEGFVEGF結(jié)合測(cè)定允許我們?cè)跓o(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中比較我們的可溶性VEGF受體的相對(duì)VEGF 結(jié)合親和力。簡(jiǎn)言之，將包含已知濃度的可溶性受體(濃度在0.29_150pM的范圍內(nèi))的條件培 養(yǎng)基連續(xù)稀釋并與IOpM VEGF混合。然后通過(guò)ELISA測(cè)量未結(jié)合的VEGF的量。在0. 001 至約0. 2pM的受體濃度，D2-9Gly-Fc以高于其他所有構(gòu)建體結(jié)合VEGF的親和力結(jié)合VEGF。D2-CH3具有最低的結(jié)合VEGF的親和力(圖11)。實(shí)施例8AAV2-SFLT1D29GLYFC基因組成分由兩個(gè) AAV2 ITR和 SFLT1D29GLYFC表達(dá)盒組成。 用雜合雞β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SFLT1D29GLYFC的表達(dá)，該啟動(dòng)子由CMV IE增強(qiáng)子、雞 β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和部分屬于β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄本的94bp的外顯子1的片段組成。雜合 雞肌動(dòng)蛋白/兔球蛋白內(nèi)含子也是CBA啟動(dòng)子的部分，其包含許多隱藏的轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合位點(diǎn)。多聚腺苷化區(qū)域獲自SV40病毒基因組。分別將測(cè)試樣AAV2-SFLT1D29GLYFC 和 AAV2 載體對(duì)照、含 0. 014%Tween 20 的 磷酸緩沖鹽溶液(批號(hào)NBR 15045-108)配制為聚丙烯管中的貯存冷凍液和預(yù)先配置的水 溶液。制備測(cè)試樣和載體樣，以產(chǎn)生處于適合濃度的給藥溶液，以在所希望的劑量體積達(dá)到 預(yù)定劑量。當(dāng)將其通過(guò)玻璃體內(nèi)注射進(jìn)入食蟹猴(cynomolgus monkey)眼部時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，如 在房水和玻璃體液中所測(cè)量，AAV2-sFLT1D29GLYFC(2x108、2x109和2xl01Q于50ul劑量體積 中)產(chǎn)生劑量依賴的SFLT1D29GLYFC表達(dá)，且這些水平在施用AAV載體后持續(xù)至少一年。我們?cè)诜侨遂`長(zhǎng)類動(dòng)物(NHP)中進(jìn)行了激光-CNV實(shí)驗(yàn)，并顯示在這種NHP模型 中，SFLT1D29GLYFC非常有效地抑制脈絡(luò)膜新血管形成。在一組實(shí)驗(yàn)中，將2xl08和2xl09載 體顆粒注射入前部/中央玻璃體腔導(dǎo)致劑量依賴的表達(dá)，但未在這組實(shí)驗(yàn)中觀察到功效。 當(dāng)將2X101(lsFLTlD29GLYFC注射入中央玻璃體腔(中央玻璃體注射)時(shí)，其在所注射的眼內(nèi) 表達(dá)(例如，顯示mRNA表達(dá)的變移上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，且在房水中測(cè)量到治療 有效量lllng/ml、277ng/ml、885ng/ml、967ng/ml、l，057ng/ml 和 1，584ng/ml。玻璃體液中 的水平約比房水中高三倍。這些濃度在抑制激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)中有效。 圖15顯示另一組接受2X101QSFLT1D29GLYFC的動(dòng)物中表達(dá)的定位。在高劑量組中觀察到了輕度或中度玻璃體混濁，其在大部分動(dòng)物中隨時(shí)間流逝 而消除。雖然在一些動(dòng)物中觀察到存在抗AAV的T細(xì)胞應(yīng)答，但沒(méi)有檢測(cè)到抗轉(zhuǎn)基因 的T細(xì)胞應(yīng)答。接受對(duì)照AAV2病毒體的動(dòng)物也在高劑量下出現(xiàn)渾濁，這表明混濁不是 由轉(zhuǎn)基因sFLT引起，而是由病毒病毒殼體引起。對(duì)玻璃體混濁評(píng)分，并與Nussenblatt 等(1985，0pthalmology92 467)開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)比較。在一些帶有玻璃體混濁的動(dòng)物(用 AAV2-SFLT1D29GLYFC或用對(duì)照病毒體)中觀察到了炎癥變化，其由trabeclar meshwork和 前房角中的淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞、玻璃體中的炎癥細(xì)胞或視網(wǎng)膜中的血管周淋巴管組成。未 觀察到組織破壞或重建。炎癥持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的動(dòng)物具有最低的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在另一組動(dòng)物中，沒(méi)有動(dòng)物在房水或血清中具有預(yù)存的AAV效價(jià)。針對(duì)sFLTOl蛋 白質(zhì)，以及抗sFLTOl抗體和載體AAV2的抗體，對(duì)血清和房水和玻璃體液進(jìn)行評(píng)估。使用這 種測(cè)定法，在此研究的整個(gè)過(guò)程中，在一些動(dòng)物(包含載體對(duì)照組中的一些動(dòng)物)中觀察到 時(shí)斷時(shí)續(xù)的不一致的陽(yáng)性。血清中未發(fā)現(xiàn)針對(duì)sFLTOl的抗體。血清中具有抗AAV2效價(jià)的 動(dòng)物存在劑量和時(shí)間依賴的增加。房水效價(jià)最高的動(dòng)物具有最低的表達(dá)，房水效價(jià)最低的 動(dòng)物具有最高的表達(dá)。針對(duì)其他臨床指征、定性的食物消耗、體檢、體重、眼科檢查、熒光素血管造影術(shù)、 視網(wǎng)膜電描記術(shù)、張力測(cè)量法中的變化，對(duì)一些動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估。結(jié)束后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行全面尸 體剖檢，收集和保存組織。處理來(lái)自對(duì)照和高劑量猴的組織并進(jìn)行鏡檢。未觀察到對(duì)視網(wǎng)膜電活性的影響。對(duì)一些動(dòng)物，在AAV2-SFLT1D29GLYFC后 11 周施用蘭尼單抗(2xl08、2xl09和 2xl01Q 的劑量)，未觀察到不良反應(yīng)。參考文獻(xiàn)Davis-Smyth 等 EMBO J. ，15，1996,4919Huston，J. S.等(1991)Methods Enzymol. 203,46-88Huston, J. S.等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85，5879-5883.Johnson，S.等(1991)Methods Enzymol. 203,88-98Karpus, P. A.等(1985) Naturwiss.，72，212—213.Keyt，B. A.等(1996) J.Biol· Chem. 271 :5638_5646.Kortt, A.A.等(1997)Protein Engng，10，423-433.Lee，Y_L.等(1998)Human Gene Therapy，9，457-465Mouz N.等(1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA，93，9414—9419.Nielsen 等(1997)Protein Eng. ，10，1Qiu, H.等(1998) J. Biol. Chem. 273 :11173_11176.
權(quán)利要求
治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法，所述方法包括以約2x108至約2x1010drp的治療有效量對(duì)所述哺乳動(dòng)物的患病眼施用編碼VEGF拮抗劑的病毒載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒載體是AAV載體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述AAV載體是AAV2。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重鏈分子 的VEGF受體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl(FLT-I)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl的IgG-樣結(jié)構(gòu)域2(FLT-1D2)。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的Fc部分。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的CH3部分。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述VEGF受體通過(guò)氨基酸接頭融合至所述IgG重鏈分子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述氨基酸接頭是9Gly接頭。
11.權(quán)利要求4的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或FLT-1D2-9GLY-CH3。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)玻璃體內(nèi)注射對(duì)患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)中央玻璃體注射對(duì)患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑表達(dá)于患病眼的變移上皮細(xì)胞中。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達(dá)至少6個(gè)月。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達(dá)至少1年。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述眼部疾病選自濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性AMD)、 黃斑水腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
18.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包含施用第二VEGF拮抗劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第二VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重 鏈分子的VEGF受體。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述蛋白質(zhì)是VEGF抗體。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述VEGF抗體是貝伐單抗或蘭尼單抗。
22.治療哺乳動(dòng)物眼部疾病的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物的患病眼施用編碼 VEGF拮抗劑的核酸，其中所述VEGF拮抗劑以約lOOng/ml至約1，500ng/ml的治療有效量表 達(dá)，以治療所述眼部疾病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述病毒載體是AAV載體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述AAV載體是AAV2。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重鏈分 子的VEGF受體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl(FLT-I)。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl的IgG-樣結(jié)構(gòu)域 2(FLT-1D2)。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的Fc部分。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的CH3部分。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述VEGF受體通過(guò)氨基酸接頭融合至所述IgG重鏈分
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述氨基酸接頭是9Gly接頭。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或 FLT-1D2-9GLY-CH3。
33.權(quán)利要求22的方法，其中通過(guò)玻璃體內(nèi)注射對(duì)患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)中央玻璃體注射對(duì)患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
35.權(quán)利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑表達(dá)于患病眼的變移上皮細(xì)胞中。
36.權(quán)利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達(dá)至少6個(gè)月。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達(dá)至少1年。
38.權(quán)利要求22的方法，其中所述眼部疾病選自濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性 AMD)、黃斑水腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
39.權(quán)利要求22的方法，其進(jìn)一步包含施用第二VEGF拮抗劑。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述第二VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重 鏈分子的VEGF受體。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述蛋白質(zhì)是VEGF抗體。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述VEGF抗體是貝伐單抗或蘭尼單抗。
43.降低接受用于眼部的AAV基因治療的哺乳動(dòng)物眼內(nèi)渾濁的方法，所述方法包括對(duì) 所述哺乳動(dòng)物施用基因治療AAV病毒體，其包含不超過(guò)總病毒殼體90%的空病毒殼體。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述基因治療AAV病毒體包含不超過(guò)總病毒殼體80%、 70 %、60 %或50 %的空病毒殼體。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述基因治療AAV病毒體基本上無(wú)空病毒殼體。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述AAV是AAV2。
全文摘要
本發(fā)明提供包含功能性多肽、接頭和IgG重鏈分子的融合蛋白質(zhì)，以及編碼此類蛋白質(zhì)的載體，用于抑制具有與新血管形成相關(guān)的病理病癥的個(gè)體中的血管發(fā)生。具體而言，本發(fā)明提供編碼融合VEGF拮抗劑的載體來(lái)治療哺乳動(dòng)物眼部疾病，所述VEGF拮抗劑包含融合至IgG重鏈分子的VEGF受體。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK101951925SQ200980105936
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者A·斯卡里, S·沃茲沃思 申請(qǐng)人:建新公司