專利名稱：：金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品，屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一組以長(zhǎng)期高血糖為主要特征的代謝綜合征，由于胰島素缺乏和(或)胰島素生物作用障礙導(dǎo)致糖代謝紊亂，同時(shí)伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)等代謝障礙，并可并發(fā)眼、腎、神經(jīng)、心血管等多臟器的慢性損害。1997年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)將糖尿病分為四類g卩l(xiāng)型糖尿病、2型糖尿病、其他類型糖尿病及妊娠糖尿病。2型糖尿病，占糖尿病總數(shù)的90%以上，是世界發(fā)病率和死亡率最高的三大非傳染性疾病之一，且發(fā)病率逐年上升，尤以中國(guó)、印度次大陸、非洲等發(fā)展中國(guó)家上升最為明顯。我國(guó)目前成人(25歲以上)糖尿病患病率約為2.5%，近20年來，在我國(guó)境內(nèi)開展了4次大規(guī)模人群(超過10萬人/次)的糖尿病抽樣調(diào)査，比較我國(guó)四次糖尿病普査結(jié)果顯示，目前我國(guó)糖尿病患病率的增長(zhǎng)速度大約是1980年的3倍，2型糖尿病隨年齡增長(zhǎng)而升高，年齡增大、肥胖、高血壓、體力勞動(dòng)減少是主要危險(xiǎn)因素，遺傳因素在2型糖尿病的發(fā)病中也起著重要作用。2型糖尿病其特點(diǎn)是胰島素分泌減少或胰島素相對(duì)不足及胰島素缺陷，主要并發(fā)有胰島素抵抗，大多數(shù)病人表現(xiàn)為肥胖，而肥胖又加重胰島素抵抗?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)明確，胰島素抵抗(Insulinresistance,IR)是2型糖尿病發(fā)病的重要因素和顯著特征，主要表現(xiàn)為胰島素的外周耙組織對(duì)內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性與反應(yīng)性降低，從而導(dǎo)致人體胰島素難以產(chǎn)生正常的生理效應(yīng)。胰島素抵抗不僅是2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)性因素，也是引起一系列代謝異常如代謝綜合征，從而導(dǎo)致心血管等并發(fā)癥的核心。因此針對(duì)胰島素抵抗的治療是治療糖尿病的關(guān)鍵。中藥因其降糖機(jī)理有多渠道、多途徑的特點(diǎn)，在治療糖尿病方面有極大的優(yōu)勢(shì)和潛力。文獻(xiàn)報(bào)道石斛屬植物具有降低血糖、保護(hù)和修復(fù)胰腺組織的結(jié)構(gòu)和功能，但其作用機(jī)制尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品。本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對(duì)小鼠血糖升高模型和糖尿病大鼠模型的影響，進(jìn)一步明確了其治療糖尿病的藥理作用和機(jī)制，為金釵石斛藥材的開發(fā)應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。本發(fā)明是這樣構(gòu)成的金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。所述的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。前述金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至無醇味，用酸溶液調(diào)PH至34，濾過，濾液用堿溶液調(diào)PH至IO，再用適量氯仿萃取58次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。優(yōu)選的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調(diào)PH至34，濾過，濾液用10。/。氨水調(diào)PH至10，再用適量氯仿萃取58次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。前述金釵石斛生物總堿中親脂性總生物堿的含量》60%。一種治療缺血性腦損傷的藥物制劑，是以金釵石斛生物總堿為原料藥，加入適量輔料制成的口服制劑或注射劑。所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、舌下含片或注射劑。金釵石斛具有生津益胃、清熱養(yǎng)陰的作用，本申請(qǐng)人通過對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用、作用機(jī)制等方面進(jìn)行深入細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)金釵石斛藥材中所含的生物堿成分能有效改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗，對(duì)高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖升高具有明顯降低作用，對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞有保護(hù)作用。試驗(yàn)研究的主要過程及結(jié)果如下一.實(shí)驗(yàn)材料1.動(dòng)物:雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清潔級(jí)，月齡3-4月，體重約160-180g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證SCXK-軍2007-017)。2.藥品與試劑金釵石斛生物總堿(DNLA):采用貴州遵義赤水產(chǎn)二年生金釵石斛為原藥，應(yīng)用化學(xué)提取分離生物總堿成份，提取工作于貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。鏈脲佐菌素(Str印tozotocinSTZ):Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片貴州天安藥業(yè)公司；大鼠胰島素放免試劑盒LillCO公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及引物寶生物工程(大連)有限公司；SYBR"GREENPCRMasterMix:美國(guó)ABI公司；GLUT4抗體及相關(guān)免疫組化試劑武漢博士德生物工程有限公司。3.主要器材AU2700型全自動(dòng)生化分析儀日本OLYMPUS公司；自動(dòng)放免儀中國(guó)科大中佳公司；EppendorfMastercyclerGradientPCR儀德國(guó)Eppendorf公司；icycler熒光定量PCR儀美國(guó)BI0-RAD公司；Centrifuge5417R離心機(jī)德國(guó)E卯endorf公司。二.方法與結(jié)果l.金釵石斛生物總堿(DNLA)對(duì)正常小鼠血糖的影響小鼠40只，雄性，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、DNLA低、中、高劑量組(40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg)。正常對(duì)照組灌胃給等體積蒸餾水，每天給藥一次，連續(xù)給藥7天，末次前禁食12小時(shí)，給藥后1小時(shí)，眶靜脈取血測(cè)定血糖水平。結(jié)果顯示，DNLA低、中、高劑量組對(duì)正常小鼠血糖均未見明顯影響，結(jié)果見表l。表lDNLA對(duì)正常小鼠血糖的影響組別齊U量〔nigAg)空應(yīng)血糖FBG(irarol/L)空白對(duì)照組-5.33±0.75DNLA-低劑量組405.28±1.83DNLA-中劑量組805.21±2.24DNLA-高劑量組1604.79±0.942.金釵石斛生物總堿(DNLA)對(duì)腎上腺素所致小鼠血糖的影響NIH小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型組、DNLA低、中、高劑量(40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg)組，陽(yáng)性藥(二甲雙胍:150mg/kg)組，每組10只，正常對(duì)照組和模型組均給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥7天，末次給藥后禁食12小時(shí)，給藥后l小時(shí)，正常對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水，其余各組均腹腔注射腎上腺素(20ug/kg)，注射后30min從小鼠眼眶靜脈叢取血測(cè)定血糖含量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組血糖明顯升高(P〈0.05)，與模型組比較，DNLA中、高劑量組及二甲雙胍組均不同程度地抑制腎上腺素所致的血糖升高(P〈0.05)，結(jié)果見表2。表2DNLA對(duì)腎上腺素引起小鼠血糖升高的影響組別劑量〔mgAg)血糖(mnol/L)空白對(duì)照組-5.33±0.75模型組—10.09±1.16#二甲雙胍組1506.27±0.94*DNLA-低劑量組409.57±1.85DNLA-中劑量組807.32±1.2扭DNLA-咼劑量組1606.79±0.94*與正常對(duì)照組比較ttP〈0.05，與模型組比較，*P〈0.05。3.金釵石斛生物總堿(DNLA)對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的影響3.1模型制作SD大鼠，雄性，體重160-180g，自制高糖高脂飼料(即在普通飼料中加入20%煉豬油、10%蔗糖、5%蛋黃)連續(xù)飼養(yǎng)40天，繼以小劑量鏈脲佐菌素(STZ，40mg/kg，臨用前用pH為4.4的0.lmol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液配制)溶液腹腔注射一次，于注射后第三天禁食8小時(shí)后，用血糖儀測(cè)量血糖，篩選出血糖Sll.lmmol/L者定為糖尿病大鼠。3.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥(1)空白組普通飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，繼以蒸餾水灌胃4周。(2)模型組高糖高脂飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射鏈脲佐菌素，繼以蒸餾水灌胃4周。(3)二甲雙胍組高糖高脂飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射鏈脲佐菌素，繼以二甲雙胍(100mg/kg)灌胃給藥4周。(4)DNLA低劑量組高糖高脂飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射鏈脲佐菌素，繼以DNLA(20mg/kg)灌胃給藥4周。(5)DNLA中劑量組高糖高脂飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射鏈脲佐菌素，繼以DNLA(40mg/kg)灌胃給藥4周。(6)DNLA高劑量組高糖高脂飼料喂養(yǎng)40天，腹腔注射鏈脲佐菌素，繼以DNLA(80mg/kg)灌胃給藥4周。(7)正常給藥組普通飼料喂養(yǎng)40天，繼以DNLA(80mg/kg)灌胃給藥4周。3.3觀察指標(biāo)3.3.1空腹血糖(FBG):連續(xù)灌胃給藥4w后，禁食8h，取血待血液凝固后分離血清，AU2700型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。3.3.2空腹血清胰島素(FINs):血清標(biāo)本制備方法同上，采用放射免疫法檢測(cè)。3.3.3胰島素抵抗指數(shù)(HOMA—IR):HOMA—IR=FBGXFINs/22.5。3.3.4血清游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL):血清制備方法同前，F(xiàn)FA采用酶學(xué)方法檢測(cè)；TG、CHOL采用OLYMPUSAU2700型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。3.3.5胰腺組織病理學(xué)檢査取相同部位胰腺標(biāo)本用10。/。甲醛固定48h后，石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。3.3.6肝臟組織病理學(xué)檢査取相同部位肝臟標(biāo)本用10。/。甲醛固定48h后，石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。3.3.7檢測(cè)組織中胰島素受體底物2(IRS—2)、腫瘤壞死因子a(TNF—a)、胰島素樣生長(zhǎng)因子l(IGF—1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)mRNA表達(dá)。總RNA的提取100mg組織加入500yl焦碳酸二乙酯液，室溫下靜置5min丄加500yl氯仿，振搖15sec，4°C12000rpm離心15min丄取300yl上清液加300yl異丙醇，4°C12000rpm離心10min丄棄上清液，加75%乙醇，4。C12000rpm離心5min，清洗2次丄去乙醇，空氣干燥RNA3min，加O.1%焦碳酸二乙酯水100y1RNA純化①在粗提RNA的離心管內(nèi)，加入純化液350y1+75%酒精250y1;②上柱將以上混合液體吸入RNA純化柱離心10000g/min，lmin;③沖洗75。/。酒精500ul加入柱內(nèi)，10000g/min離心lmin，重復(fù)1次。④洗脫及收集純化RNA液把純化柱移入新的離心管內(nèi)，加入焦碳酸二乙酯水100yl進(jìn)行洗脫，10000g/min離心lmin。盛于離心管內(nèi)的IOOy1水溶液即純化的RNA液待測(cè)樣品。RNA樣品的純度鑒定取20ylRNA樣品和980y1焦碳酸二乙酯水于石英比色杯中，混勻。以焦碳酸二乙酯水調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定其260nm和280nm的0D值。OD26o/OD28o>l.80認(rèn)為純度符合要求，RNA濃度^D，X40X稀釋倍數(shù)。兩步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Twost印sRT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系5XPrimeScripeTMBuffer4.0y1PrimeScripeTMRTEnzymeMix1l.Oyl01igodTPrimer(50yM)l.OylRandom6mers(100yM)l.OylTotalRNA13.Oy1總體積20y1反應(yīng)條件第一階段(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))37°CX15min第二階段(逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))85°CX5sec，4'C保持。PCR產(chǎn)物稀釋3.25倍；反應(yīng)體系iQSYBRGreenSupermix10yl模板混合液(上游、下游引物)lylcDNAtemplate4y1dddH205y1總體積20yl反應(yīng)條件第一步，95。CX8min;第二步，95°CX15sec，退火溫度X1min，第二步循環(huán)45次。引物從基因庫(kù)査出相關(guān)引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成。表3引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果分析處理(相對(duì)定量法)以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)(1)Ctaverage=(CtpCt2+Ct3)/3(重復(fù)管)(2)dCt=Ctaverage—中間值(3)基因的表達(dá)=2~(-dCt)(4)相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)3.3.8骨骼肌組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的表達(dá)免疫組織化學(xué)法。具體步驟如下(1)4um厚的石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精入水。(2)30%H202l份+甲醇99份混合，室溫20分鐘，蒸餾水洗3次。(3)抗原修復(fù)將切片浸入O.1M枸櫞酸緩沖液中(PH值6.0)，微波爐微沸后斷電，間歇IO分鐘后重復(fù)一次，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液沖洗2分鐘X3次。(4)滴加5%胎牛血清封閉液，37°C20分鐘，甩去多余液體。(5)滴加PCNA(l:50稀釋)一抗，37°C2小時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗2分鐘X3次。(6)加生物素化二抗，37°C20分鐘，磷酸鹽緩沖液洗2分鐘X3次(7)加SABC，37°C20分鐘，磷酸鹽緩沖液洗5分鐘X4次。(8)DAB顯色使用DAB顯色試劑盒，取0.85ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各l滴(50yl)，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，約35分鐘，自來水沖洗。(9)蘇木素輕度復(fù)染(2分鐘)、酒精脫水、二甲苯透明、中性膠封片，光鏡下觀察其表達(dá)變化。3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(f士s)表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Du皿ett'T3法，P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.結(jié)果4.1DNLA對(duì)正常小鼠血糖的影響(見表l)4.2DNLA對(duì)腎上腺素所致血糖升高的影響(見表2)4.3DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的影響4.3.1DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠及正常大鼠空腹血糖(FBG)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組FBG明顯升高(P〈0.05)，正常給藥組無明顯變化(P>0.05);與模型組比較，二甲雙胍組、DNLA中、高劑量組FBG均明顯降低(P〈0.05)，結(jié)果見表4。表4DNLA對(duì)糖尿病大鼠及正常大鼠FBG的影響P±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與空白組比較，P〈0.05;與模型組比較P〈0.05;與空白組比較"P>0.05。4.3.2DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠FINs、HOMA-IR的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠FINs、HOMA-IR明顯升高(P〈0.05);與模型組比較，二甲雙胍組、DNLA中、高劑量組大鼠FINs、HOMA-IR明顯降低(P〈0.05)，結(jié)果見表5表5DNLA對(duì)糖尿病大鼠血清FINs及HOMAIR的影響P±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與空白組比較，P〈0.05;與模型組比較，**P〈0.05。4.3.3DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)均明顯升高(P〈0.05);與模型組比較，二甲雙胍組、DNLA中、高劑量組則明顯降低(P〈0.05)，結(jié)果見表6。表6DN則<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與空白組比較，P〈0.05;與模型組比較，**P〈0.05。4.3.4DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟組織中胰島素受體底物2(IRS—2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子l(IGF—1)表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組肝臟組織中IRS—2、IGF—lmRNA表達(dá)減少；與模型組比較，各給藥組表達(dá)不同程度增加，結(jié)果見表7。表7DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟組織中IRS—2、IGF—1mRNA表達(dá)的<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與空白組比較，P〈0.05;與模型組比較，**P〈0.05。4.3.5DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠骨骼肌組織中腫瘤壞死因子a(TNF—a)mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組骨骼肌組織中腫瘤壞死因子a(TNF—a)mRNA表達(dá)明顯增加；與模型組比較，DNLA低、中、高劑量組和二甲雙胍組骨骼肌組織中腫瘤壞死因子a(TNF—a)mRNA表達(dá)均明顯下降，結(jié)果見表8。表8DNLA對(duì)高糖高脂加鏈脲佐素誘導(dǎo)糖尿病大鼠骨骼肌組織中TNF—(f±s)mRNA表達(dá)的影響組別TNF—ait^IA空白組51.13±5.40模型組134.22±29.65'二甲雙胍組35.16±12.09-'DNLA低劑量組71.54±29.11DNLA中劑量組化.04±6.55"DNLA高劑量組39.22±17.05"與空白組比較，求P〈0.05;與模型組比較，**P〈0.05。4.3.6DNLA脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組骨骼肌組織GLUT4表達(dá)明顯減少，與模型組比較，甲雙胍組、DNLA中、高劑量組表達(dá)明顯增加，結(jié)果見表9。表9DNLA對(duì)糖尿病大鼠脂肪組織中GLUT4mRNA表達(dá)的影響(？±s)組別GLUT4mKNA空白組432.40±87.53模型組67.30±16.10*二甲雙胍組144.29±19,DNLA低劑量組56.37±21.64DNLA中劑量組127.15±12.44**DNLA高劑量組119.55±8.82^與空白組比較，求P〈0.05;與模型組比較，**P〈0.05。4.3.7大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)改變空白組胰島呈團(tuán)索狀，境界清晰，胰島數(shù)量及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多；模型組胰島萎縮，視野中胰島數(shù)量顯著下降，體積縮小，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少；二甲雙胍組胰島萎縮、數(shù)量減少，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少；各治療組與模型組比較，胰島數(shù)量較多，體積較大，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多。4.3.8大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變肝臟組織HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞病理改變情況，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，而模型組和各給藥組大鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的脂肪變性。結(jié)果顯示DNLA各治療劑量對(duì)糖尿病大鼠肝臟脂肪變性有不同程度的保護(hù)作用。4.3.9DNLA對(duì)骨骼肌組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組及各給藥組GLUT4蛋白表達(dá)明顯減少；與模型組比較，二甲雙胍組、DNLA中、高劑量組表達(dá)均有不同程度增加。DNLA對(duì)正常大鼠血糖無明顯影響，對(duì)腎上腺素所引起的小鼠血糖升高具有明顯的抑制作用；對(duì)高糖高脂加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠血糖有明顯降低作用，其作用機(jī)制為(1)改善糖尿病大鼠胰島素抵抗降低游離脂肪酸水平，改善胰島素抵抗指數(shù)，降低TNF—amRNA表達(dá)，增加IRS—2、IGF—1、GLUT4mRNA表達(dá)，增加骨骼肌細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)；(2)對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用。DNLA還對(duì)高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟脂肪變性具有保護(hù)作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對(duì)腎上腺素所致小鼠血糖升高模型和高糖高脂加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的影響，進(jìn)一步明確了其治療糖尿病的藥理作用和機(jī)制，為金釵石斛藥材的開發(fā)應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例l:金釵石斛生物總堿的提取取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調(diào)PH至34，濾過，濾液用10。/。氨水調(diào)PH至10，再用適量氯仿萃取67次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得金釵石斛生物總堿；其中親脂性總生物堿的含量為67.8%。本發(fā)明的實(shí)施例2:金釵石斛生物總堿的提取取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調(diào)PH至34，濾過，濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至IO，再用適量氯仿萃取56次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得金釵石斛生物總堿；其中親脂性總生物堿的含量為62.4%。本發(fā)明的實(shí)施例3:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取實(shí)施例1制得的金釵石斛生物總堿提取物502000毫克、硬脂酸鎂O.10.40毫克、羧甲基淀粉鈉412毫克、微晶纖維素50100毫克，將提取物與羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸鎂，然后用沖壓裝置將顆粒壓制成片，即得治療缺血性腦損傷的片劑。該片劑口服，一日3次，每次13片本發(fā)明的實(shí)施例4:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取實(shí)施例2制得的金釵石斛生物總堿提取物502000毫克、硬脂酸鎂O.10.30毫克、羧甲基淀粉鈉412毫克、淀粉50100毫克，將提取物與羧甲基淀粉鈉、淀粉混合均勻，加入適量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，然后裝入明膠膠囊中，即得治療缺血性腦損傷的膠囊劑。該膠囊劑口服，一日3次，每次13粒。本發(fā)明的實(shí)施例5:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物1005000毫克、糊精或蔗糖110克、矯味劑和甜味劑適量，將提取物與蔗糖/糊精、矯味劑和甜味劑混合均勻，加入適量水或乙醇制成軟材，過篩制粒，干燥，整粒，分裝，即得治療缺血性腦損傷的顆粒劑。該顆粒劑口服，一日3次，每次510克。本發(fā)明的實(shí)施例6:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物1002000毫克、聚乙醇或豆油1002000毫克、助懸劑3IO毫克、乳化劑310毫克和明膠50100毫克、甘油1030毫克、純化水50100毫克及防腐劑適量，將明膠置于溶膠罐中，加入純化水，7crc下加熱使溶解，加入甘油和防腐劑，攪拌均勻，真空除去氣泡后保溫靜置，按比例將提取物與聚乙醇/豆油、乳化劑、助懸劑混合均勻，再和制備好的明膠置于旋轉(zhuǎn)壓囊機(jī)，壓制成軟膠囊，定型，干燥，即得治療缺血性腦損傷的軟膠囊。該軟膠囊口服，一日3次，每次13粒。本發(fā)明的實(shí)施例7:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物10200毫克、聚乙二醇40002040毫克、甲基硅油適量，將提取物加水制成均勻糊狀，再加入溶融的基質(zhì)(聚乙二醇4000)液，加熱熔融成澄清液體，倒入已預(yù)熱的滴丸器中，控制滴制溫度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器內(nèi)，即得治療缺血性腦損傷的滴丸劑。該滴丸劑口服，一日3次，每次1050毫克。本發(fā)明的實(shí)施例8:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物2005000毫克、羧甲基纖維素納1.5克、糖精鈉O.l克、矯味劑適量、防腐劑適量和純化水100毫升，將羧甲基纖維素納分散在熱水中，冷卻，然后與含有提取物、糖精鈉、矯味劑和防腐劑的含水混懸液混合，將溶液調(diào)配成所需體積并混合均勻，滅菌后分裝，即得治療缺血性腦損傷的糖漿劑。該糖漿劑口服，一日3次，每次510毫升。本發(fā)明的實(shí)施例9:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物502000毫克、可壓蔗糖4080毫克、硬脂酸鎂O.10.3毫克，將提取物過篩后與可壓蔗糖、硬脂酸鎂混合均勻，并用沖壓裝置壓片，即得治療缺血性腦損傷的舌下含片。該制劑含服，一日3次，每次1片。本發(fā)明的實(shí)施例10:金釵石斛生物總堿的應(yīng)用取金釵石斛生物總堿提取物102000毫克，加水至1000ml，加入O.5%活性炭，保持PH值7.0，加熱微沸15分鐘，冷卻，濾過，加注射用水至全量，罐裝，于115i:滅菌30分鐘，冷藏48小時(shí)，濾過，濾液濃縮，噴霧干燥，分裝，即得治療缺血性腦損傷的注射劑。該制劑注射用，一日3次，每次510毫升。權(quán)利要求1.金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品。2.按照權(quán)利要求l所述金釵石斛生物總堿的應(yīng)用，其特征在于所述的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。3.按照權(quán)利要求1或2所述金釵石斛生物總堿的應(yīng)用，其特征在于所述金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至無醇味，用酸溶液調(diào)PH至34，濾過，濾液用堿溶液調(diào)PH至IO，再用適量氯仿萃取58次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。4.按照權(quán)利要求3所述金釵石斛生物總堿的應(yīng)用，其特征在于所述金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調(diào)PH至34，濾過，濾液用10。/。氨水調(diào)PH至10，再用適量氯仿萃取58次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。5.按照權(quán)利要求4所述金釵石斛生物總堿的應(yīng)用，其特征在于所述金釵石斛生物總堿中親脂性總生物堿的含量》60%。6.一種治療糖尿病的藥物制劑，其特征在于它是以金釵石斛生物總堿為原料藥，加入適量輔料制成的口服制劑或注射劑。7.按照權(quán)利要求6所述治療糖尿病的藥物制劑，其特征在于所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、舌下含片或注射劑。全文摘要本發(fā)明公開了金釵石斛生物總堿在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品，所述的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對(duì)腎上腺素所致小鼠血糖升高模型和高糖高脂加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的影響，進(jìn)一步明確了其治療糖尿病的藥理作用和機(jī)制，為金釵石斛藥材的開發(fā)應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。文檔編號(hào)A61K36/8984GK101653563SQ20091030217公開日2010年2月24日申請(qǐng)日期2009年5月8日優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日發(fā)明者石京山申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院