專利名稱：金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用及產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用及產(chǎn)品， 屬于中藥技術領域。
背景技術：
阿爾茨海默病(AD)是一種與老齡化相關的疾病，是65歲以上老年人發(fā)生癡 呆的主要病因。隨著我國人口老齡化問題的出現(xiàn)，AD已成為家庭負擔和社會醫(yī)保的重要問題 。AD臨床表現(xiàn)為進行性智能減退、精神及運動障礙，主要病理特征為老年斑(SP)、神經(jīng)纖 維纏結(NFT)、血管淀粉樣變性、神經(jīng)元變性及缺失。AD是一種多因異質性疾病，確切病 因和發(fā)病機制尚不清楚?，F(xiàn)有研究表明，其發(fā)病可能涉及到基因缺陷、中樞神經(jīng)遞質紊亂、 代謝紊亂、氧化應激、神經(jīng)元凋亡、環(huán)境毒素及慢性炎癥等方面。目前，國內外對老年癡呆 尚無理想的治療方法(或藥物)， 一方面繼續(xù)深入研究AD的發(fā)病機理，另一方面根據(jù)AD發(fā)病 的網(wǎng)絡學說，結合疾病的誘因，采用自由基清除劑、抗炎藥、膽堿酯酶抑制藥、鈣阻滯藥、 興奮性氨基酸拮抗藥等進行綜合治療，以減輕癥狀或延緩病程。藥理學上， 一方面通過疾病 的基因組學、蛋白質組學研究來確認藥物的靶點，是尋找相關疾病的治療藥物的理想方法， 例如，e-淀粉樣前體蛋白(APP)降解酶的異常表達、M受體蛋白表達、NDMA受體表達等為確 定藥物作用的靶點提供了方向；另一方面，由于AD發(fā)病機制是多因素的，因此利用中草藥作 用的多耙點特點，尋找有效的AD治療藥物具有重要意義。
石斛(Dendrobium)在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中為名貴中藥材，其主要化學成分為多糖、生物堿、
氨基酸、酚類、揮發(fā)油等。石斛生物堿可引起超極化反應，并作為一種可能的e-丙氨酸或
?；撬岬霓卓箘?，具有抗腫瘤活性及免疫調節(jié)活性。有研究表明石斛提取物能顯著抑制經(jīng)過 細菌脂多糖(LPS)誘導的小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL一IO、 TNF-a、 iN0S和IL一8，但其作 用機制尚不清楚，有待進一步考察研究。金釵石斛是石斛中的一種，金釵石斛提取物可拮抗 阿托品、促進腸蠕動；降低血黏度，拮抗花生四烯酸和膠原蛋白致兔血小板凝集；有抗自由 基損傷作用；擬似單胺氧化酶抑制劑，可調節(jié)單胺類遞質。目前還沒有關于金釵石斛提取物 對老年癡呆的相關作用研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用及產(chǎn)品 。本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對神經(jīng)細胞、腦缺血模型的保護作用及對癡呆大鼠學習 記憶能力的影響，闡明了金釵石斛生物總堿治療老年癡呆的藥理作用機制，為金釵石斛藥材的進一步開發(fā)應用提供了藥理學依據(jù)。
本發(fā)明是這樣構成的金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用。 所述的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。 前述金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3
次，回收乙醇至無醇味，用酸溶液調PH至3 4，濾過，濾液用堿溶液調PH至IO，再用適量氯
仿萃取5 8次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。
優(yōu)選的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收
乙醇至無醇味，用鹽酸調PH至3 4，濾過，濾液用10。/。氨水調PH至10，再用適量氯仿萃取5
8次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。
前述金釵石斛生物總堿中親脂性總生物堿的含量》60%。
一種治療老年癡呆的藥物制劑，是以金釵石斛生物總堿為原料藥，加入適量輔料制成的 口服制劑或注射劑。
所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、舌下含片或注射劑。
金釵石斛具有生津益胃、清熱養(yǎng)陰的作用，本申請人通過對其化學成分、藥理作用、作 用機制等方面進行深入細致的研究，發(fā)現(xiàn)金釵石斛藥材中所含的生物堿成分能明顯減輕缺氧 缺糖/復氧復糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷，對大鼠急性腦缺血模型有保護作用，可以緩解LPS誘 導的大鼠神經(jīng)細胞炎癥并且改善其學習記憶能力，能夠改善LPS誘導的大鼠學習記憶功能減 退，減輕神經(jīng)細胞調亡。試驗研究的主要內容及結果如下
一.實驗內容
1.采用培養(yǎng)大鼠原代神經(jīng)細胞進行缺氧缺糖損傷，觀察了金釵石斛生物總堿對神經(jīng)原細 胞的保護作用
1 )采用MTT法觀察了金釵石斛生物總堿對缺氧缺糖致神經(jīng)細胞的損傷保護作用；
2) 采用熒光染色法、流式細胞儀從細胞形態(tài)觀察金釵石斛生物總堿對神經(jīng)原細胞凋亡 的影響；
3) 缺糖/復氧復糖對神經(jīng)細胞線粒體膜電位(麗P)的影響及金釵石斛生物總堿的作用
4) 缺氧缺糖/復氧復糖對神經(jīng)細胞內游離Ca2+的影響及金釵石斛生物總堿的作用；
5) 采用RT-PCR觀察了金釵石斛生物總堿對缺氧缺糖/復氧復糖神經(jīng)細胞凋亡基因 caspase-3禾口caspase-12的影卩向。2. 采用線拴法制造大鼠右側大腦中動脈阻塞的局灶性腦缺血模型，觀察金釵石斛生物總 堿對其損傷的保護作用
1) 測量腦梗死體積、缺血側皮質及海馬進行HE染色，觀察病理變化；
2) 組織勻漿測定MDA、 N0的含量，SOD、 NOS的活性及MDA與SOD變化；
3) 采用Real time RT-RCR的方法，觀察腦組織中caspase-3、 caspase-8 mRNA的表達。
3. 側腦室注射脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導大鼠老年癡呆的模型，觀察金 釵石斛生物總堿對脂多糖所誘導的大鼠學習記憶功能障礙的保護作用，并探討其作用機制
1) Morris水迷宮檢測大鼠的空間辨別學習記憶能力；
2) 免疫組化法檢測大腦皮層及海馬內腿C-II (OX-6) 、 TNF-a、 IL-1 P 、 S-100P、 iN0S及C0X-2的表達情況；免疫組織化學法檢測海馬內Af3 P42片斷含量，并通過BI2000圖像 分析系統(tǒng)作半定量分析；
3) Real time RT-PCR檢測海馬*APP695、 BACEl、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8、 TNF-a 、 IL-1 P 、 iNOS、 NF- k b 、及COX-2的m麗表達；
4) HE染色光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，電鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結構的改變。
4. 統(tǒng)計學處理
結果以f 士s表示，應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較用單因素方差分析結合LSD檢驗。
二、實驗結果
1.金釵石斛生物總堿(DNLA)對缺氧缺糖所致大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞損傷的影響
1) 與空白組比較，缺氧損傷后MTT吸光度值明顯下降:各模型組與同時點空白組吸光度值 比較均有顯著性差異；缺氧缺糖lh、 2h、各劑量組、缺氧4h高劑量組可提高MTT吸光度值， 與同時點模型組比較均有差異(P〈0.05);缺氧2h/復氧3h各劑量組、缺氧2h/復氧12h中、高 劑量組、缺氧2h/復氧24h高劑量組可提高MTT吸光度值，與同時點模型組比較均有差異。
2) 缺氧損傷后LDH漏出率明顯升高各模型組與同時點空白組比較均有顯著性差異，缺 氧lh中、高劑量組、缺氧2h各劑量組、缺氧4h高劑量組可降低LDH漏出率；缺氧/復氧3h中、 高劑量組、缺氧2h/復氧12h中、高劑量組、缺氧2h/復氧24h高劑量組使LDH漏出率下降，與 同時點模型組比較均有差異。
3) 缺氧缺糖2h/復氧復糖12h損傷后神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高模型組與空白組比較有顯 著性差異；金釵石斛生物總堿各劑量組均可降低細胞凋亡率，與模型組比較有差異。
4) 缺氧缺糖2h/復氧復糖12h損傷后細胞內游離鈣濃度均顯著升高模型組與空白組比較
5有顯著性差異；各劑量組可降低細胞內游離Ca」+濃度，與模型組比較均有顯著性差異。
5) 缺氧缺糖2h/復氧復糖12h損傷后麗P顯著下降，模型組與空白組比較有顯著性差異； 金釵石斛生物總堿各劑量組使麗P升高，與模型組比較均有顯著性差異。
6) Real time RT-RCR檢測結果表明，缺氧缺糖2擬復氧復糖12h損傷后casPase-3和 casPase-12表達顯著升高，模型組細胞與空白組比較有顯著性差異；金釵石斛生物總堿各劑 量組均可降低caspase-3和caspase-12的表達，與模型組比較有顯著性差異。
7) 形態(tài)學觀察缺氧損傷后細胞失去折光性，胞體輪廓模糊，突起減少或回縮、斷裂， HE檢測發(fā)現(xiàn)模型組細胞還有核固縮、濃染等現(xiàn)象，電鏡微觀結構觀察線粒體腫脹，晴斷裂、 模糊；金釵石斛生物總堿組損傷比模型組明顯減輕。
2. 金釵石斛生物總堿(DNLA)對大腦中動脈阻塞腦缺血模型的保護作用
1) 與模型組比較，DNLA高劑量組和尼莫地平組的神經(jīng)功能癥狀評分減少(P〈0.05); DNLA中、高劑量組和尼莫地平組的腦梗死體積縮小(P〈0.05);形態(tài)學觀察HE染色發(fā)現(xiàn)模型 組顳葉皮質細胞水腫、細胞間隙增寬、細胞結構受損；海馬顆粒細胞排列松散、紊亂，胞核 濃縮。高劑量組、尼莫地平組細胞損傷比模型組明顯減輕。
2) 與模型組比較，中、高劑量組和尼莫地平組的MDA、 NO的含量減少，NOS的活性降低， SOD的活性升高(P〈0.05) ， MDA與SOD的比值減少(P〈0.05);與模型組比較，中、高劑量 組和尼莫地平組均能不同程度下調caspase-3、 caspase-8 mRNA的表達(P〈0. 05)。
3. 對脂多糖誘導的大鼠老年癡呆的模型的保護作用
1) 行為學檢測結果顯示，DNLA對側腦室注射脂多糖溶液6天和13天后，與模型對照組比 較，DNLA(20mgkg—、 40mgkg—、 80mgkg—^連續(xù)灌胃給藥7天和14天可以縮短大鼠在 定位航行實驗中的逃避潛伏期及搜索距離，增加空間探索實驗中大鼠在原安全島所在象限的 搜索時間及原安全島所在象限游泳距離占總距離百分比(P〈0.05)。模型大鼠的逃避潛伏期 及搜索距離較對照組明顯延長(P〈0.01)，提示學習記憶減退；DNLA和布洛芬均能夠縮短模 型大鼠逃避潛伏期及搜索距離。
2) 免疫組化檢測結果顯示，可以降低大鼠海馬內OX-6、 TNF-a、 IL-1 {3 、 S-100 {3 、 iNOS、 C0X—2光密度值及TNF—a 、 IL一1 P 、 NF—k b、 iNOS禾口 C0X—2 mRNA的表達量；并呈齊U 量相關性和時效相關性。
3) LPS制模后7天和14天，光電鏡下觀察模型大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)神經(jīng) 細胞凋亡和壞死改變，減輕神經(jīng)細胞的凋亡和壞死。
4) Real time RT-PCR檢測結果顯示，與空白組比較，模型組海馬內A {3 P42片段的含量和APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 mRNA的表達量明顯增加；與模型組比較， DNLA (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4均可降低海馬內A {3 42片段的含量和APP哪、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 m麗的表達量，其中D亂A (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4組與布洛芬組比較差異無非常顯著性，且呈一定的劑量依賴性和時間依賴型。 三、結論
1. 金釵石斛生物總堿能明顯減輕缺氧缺糖/復氧復糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷，其作用機 制可能涉及改善能量代謝、減少凋亡、抑制細胞內ca2+超載和抑制凋亡特異性蛋白酶等多種因素。
2. 金釵石斛生物總堿對大鼠急性腦缺血模型有保護作用，其機制可能涉及減少氧自由基 的生成，抗氧化應激，降低大鼠腦內凋亡基因轉錄水平，抑制神經(jīng)細胞凋亡。
3. 金釵石斛生物總堿可以緩解LPS誘導的大鼠神經(jīng)細胞炎癥并且改善其學習記憶能力， 其作用機制可能包括l)抑制LPS激活的膠質細胞的細胞毒性反應，減少炎癥所至大鼠神經(jīng) 細胞的損傷；2)通過抑制iNOS的表達而減少NO的產(chǎn)生，以降低NO對神經(jīng)細胞的損傷；3)通 過抑制C0X-2以保護神經(jīng)細胞；4)通過抑制NF-k b的激活而阻斷NF-k b介導的信號傳導通 路，從而減輕iN0S、 C0X-2和其他誘導型基因引起的急性腦損傷。
4. 金釵石斛生物總堿能夠改善LPS誘導的大鼠學習記憶功能減退，減輕神經(jīng)細胞凋亡， 其機制可能與抑制海馬內APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3和caspase-8 mRNA的表達，降低 海馬內AI3i-42片斷含量有關。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對神經(jīng)細胞、腦缺血模型的保護作 用及對癡呆大鼠學習記憶能力的影響，明確了其治療老年癡呆的藥理作用和作用機制，為金 釵石斛藥材的開發(fā)應用提供了藥理學依據(jù)。
具體實施例方式
本發(fā)明的實施例l:金釵石斛生物總堿的提取
取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽 酸調PH至3 4，濾過，濾液用10。/。氨水調PH至10，再用適量氯仿萃取7 8次，收集氯仿層， 回收氯仿，干燥，即得金釵石斛生物總堿；其中親脂性總生物堿的含量為68.3%。
本發(fā)明的實施例2:金釵石斛生物總堿的提取
取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調PH至 3 4，濾過，濾液用氫氧化鈉溶液調PH至IO，再用適量氯仿萃取5 6次，收集氯仿層，回收 氯仿，干燥，即得金釵石斛生物總堿；其中親脂性總生物堿的含量為61.9%。
7本發(fā)明的實施例3:金釵石斛生物總堿的應用
取實施例1制得的金釵石斛生物總堿提取物50 2000毫克、硬脂酸鎂O. 1 0.40毫克、羧 甲基淀粉鈉4 12毫克、微晶纖維素50 100毫克，將提取物與羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素混 合，過篩，使其混勻，加入適量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸鎂，然后用沖壓 裝置將顆粒壓制成片，即得治療老年癡呆的片劑。該片劑口服， 一日3次，每次1 3片。
本發(fā)明的實施例4:金釵石斛生物總堿的應用
取實施例2制得的金釵石斛生物總堿提取物50 2000毫克、硬脂酸鎂O. 1 0. 30毫克、羧 甲基淀粉鈉4 12毫克、淀粉50 100毫克，將提取物與羧甲基淀粉鈉、淀粉混合均勻，加入 適量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，然后裝入明膠膠囊中，即得治療老年癡呆的膠 囊劑。該膠囊劑口服， 一日3次，每次1 3粒。
本發(fā)明的實施例5:金釵石斛生物總堿的應用
取金釵石斛生物總堿提取物100 5000毫克、糊精或蔗糖1 10克、矯味劑和甜味劑適量 ，將提取物與蔗糖/糊精、矯味劑和甜味劑混合均勻，加入適量水或乙醇制成軟材，過篩制 粒，干燥，整粒，分裝，即得治療老年癡呆的顆粒劑。該顆粒劑口服， 一日3次，每次5 10克。
本發(fā)明的實施例6:金釵石斛生物總堿的應用
取金釵石斛生物總堿提取物100 2000毫克、聚乙醇或豆油100 2000毫克、助懸劑3 IO毫克、乳化劑3 10毫克和明膠50 100毫克、甘油10 30毫克、純化水50 100毫克及防
腐劑適量，將明膠置于溶膠罐中，加入純化水，7crc下加熱使溶解，加入甘油和防腐劑，攪
拌均勻，真空除去氣泡后保溫靜置，按比例將提取物與聚乙醇/豆油、乳化劑、助懸劑混合 均勻，再和制備好的明膠置于旋轉壓囊機，壓制成軟膠囊，定型，干燥，即得治療老年癡呆
的軟膠囊。該軟膠囊口服， 一日3次，每次1 3粒。 本發(fā)明的實施例7:金釵石斛生物總堿的應用
取金釵石斛生物總堿提取物10 200毫克、聚乙二醇4000 20 40毫克、甲基硅油適量， 將提取物加水制成均勻糊狀，再加入溶融的基質(聚乙二醇4000)液，加熱熔融成澄清液體 ，倒入已預熱的滴丸器中，控制滴制溫度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝 液，收集滴丸，置干燥器內，即得治療老年癡呆的滴丸劑。該滴丸劑口服， 一日3次，每次 10 50毫克。
本發(fā)明的實施例8:金釵石斛生物總堿的應用取金釵石斛生物總堿提取物200 5000毫 克、羧甲基纖維素納1.5克、糖精鈉O. l克、矯味劑適量、防腐劑適量和純化水100毫升，將羧甲基纖維素納分散在熱水中，冷卻，然后與含有提取物、糖精鈉、矯味劑和防腐劑的含水 混懸液混合，將溶液調配成所需體積并混合均勻，滅菌后分裝，即得治療老年癡呆的糖漿劑 。該糖漿劑口服， 一日3次，每次5 10毫升。
本發(fā)明的實施例9:金釵石斛生物總堿的應用取金釵石斛生物總堿提取物50 2000毫 克、可壓蔗糖40 80毫克、硬脂酸鎂O. 1 0.3毫克，將提取物過篩后與可壓蔗糖、硬脂酸鎂 混合均勻，并用沖壓裝置壓片，即得治療老年癡呆的舌下含片。該制劑含服， 一日3次，每 次1片。
本發(fā)明的實施例10:金釵石斛生物總堿的應用取金釵石斛生物總堿提取物10 2000毫 克，加水至1000ml，加入O. 5%活性炭，保持PH值7.0，加熱微沸15分鐘，冷卻，濾過，加注 射用水至全量，罐裝，于115i:滅菌30分鐘，冷藏48小時，濾過，濾液濃縮，噴霧干燥，分 裝，即得治療老年癡呆的注射劑。該制劑注射用， 一日3次，每次5 10毫升。
權利要求
1.金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用。
2.按照權利要求l所述金釵石斛生物總堿的應用，其特征在于所述 的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。
3.按照權利要求1或2所述金釵石斛生物總堿的應用，其特征在于 所述金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次， 回收乙醇至無醇味，用酸溶液調PH至3 4，濾過，濾液用堿溶液調PH至IO，再用適量氯仿萃 取5 8次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。
4.按照權利要求3所述金釵石斛生物總堿的應用，其特征在于所述 金釵石斛生物總堿的制備方法為取金釵石斛藥材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取 3次，回收乙醇至無醇味，用鹽酸調PH至3 4，濾過，濾液用10。/。氨水調PH至10，再用適量氯 仿萃取5 8次，收集氯仿層，回收氯仿，干燥，即得。
5.按照權利要求4所述金釵石斛生物總堿的應用，其特征在于所述 金釵石斛生物總堿中親脂性總生物堿的含量》60%。
6. 一種治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于它是以金釵石斛生 物總堿為原料藥，加入適量輔料制成的口服制劑或注射劑。
7.按照權利要求6所述治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、舌下含片或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了金釵石斛生物總堿在制備治療老年癡呆的藥物中的應用及產(chǎn)品，所述的金釵石斛生物總堿是從金釵石斛中提取的親脂性總生物堿類成分。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過研究金釵石斛生物總堿對神經(jīng)細胞、腦缺血模型的保護作用及對癡呆大鼠學習記憶能力的影響，明確了其治療老年癡呆的藥理作用和作用機制，為金釵石斛藥材的開發(fā)應用提供了藥理學依據(jù)。
文檔編號A61P25/28GK101537128SQ20091030176
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月23日 優(yōu)先權日2009年4月23日
發(fā)明者石京山 申請人:遵義醫(yī)學院