專利名稱：基因活化鈦材及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鈦材及其制備方法。
背景技術(shù)：
鈦材是常用的醫(yī)用金屬材料，由于其良好的生物相容性和機(jī)械性能，早在20世 紀(jì)中期就被用于醫(yī)用領(lǐng)域，并于70年代作為植入材料開始獲得廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù) 和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，鈦材在人體植入體、替代裝置和人體器官等方面的應(yīng)用獲得了重大突 破，主要是用作牙科植入體、人工關(guān)節(jié)及牙齒植入支架等(Mater Sci Forum， 2003 ;416 : 669-674.) CJ Mater Chem 2004 ;14 :2282-2290)。 鈦材屬于生物惰性生物材料，一方面，材料表面的生物惰性賦予鈦材良好生物
相容性。但是另一方面，這種惰性也使得鈦材的應(yīng)用受到了挑戰(zhàn)，因?yàn)槎栊缘拟伈谋砻?br> 與骨的結(jié)合是一種機(jī)械鎖合方式，植入后組織反應(yīng)表現(xiàn)為非特異性和隨機(jī)性(Biomed
Pharmacother，2006，60(8) :365-369)，使得鈦材植入體不能與骨組織形成牢固的、長(zhǎng)期穩(wěn)
定的結(jié)合，容易引發(fā)炎癥、移位等問題，導(dǎo)致植入失敗。因此，如何使鈦材表面具有生物活
性，改善鈦材的生物相容性和骨的結(jié)合能力，是鈦材研究設(shè)計(jì)中的首要問題。 目前，為提高鈦材表面生物活性，主要使用的是表面涂層、生化修飾等方法。研究
較多的涂層技術(shù)是在鈦材表面進(jìn)行羥基磷灰石涂層。在鈦材表面形成一層生物活性的羥
基磷灰石可以提高鈦材種植體的表面活性。早在1991年，L. L. Hench等證實(shí)鈦材表面的羥
基磷灰石涂層能加強(qiáng)鈦植入體與宿主骨之間的固定作用，促使骨細(xì)胞向植入體生長(zhǎng)(J Am
Ceram Soc 1991;74:1485-1510.)。而生化修飾是獲得具有活性的鈦材表面的另一有效途
徑。Le Gui 1 lou-Buf f e 1 loD等證實(shí)經(jīng)RGD修飾的鈦材表更有利于成骨細(xì)胞的粘附、鋪展、分
化已經(jīng)存活等生物學(xué)行為(Tissue Eng Part A. 2008， 14(8) :1445-55)。 這些方法在一定程度上改善了鈦材的生物相容性和骨結(jié)合能力，但是這些方法仍
不能使鈦材具有良好的骨誘導(dǎo)性能，鈦材難以主動(dòng)的與機(jī)體結(jié)合并調(diào)控骨細(xì)胞粘附、增值、
遷移及分化等生物行為，使得鈦材無法具有與骨組織發(fā)生良好骨結(jié)合的能力。 殼聚糖是甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙?；玫降囊环N天然陽離子多糖(pKa = 6.3)，具有可
降解性、良好的生物相容性及一定的抗菌等優(yōu)異性能，廣泛應(yīng)用于組織工程、藥物釋放等領(lǐng)
域。pEGFP-hBMP2質(zhì)粒是一種重組質(zhì)粒，可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋
白，綠色熒光蛋白用來監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率，骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)骨源性
細(xì)胞向骨細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)骨生成。殼聚糖與質(zhì)粒pEGFP-hBMP2形成的多層膜可以在生理?xiàng)l
件下發(fā)生降解，使得質(zhì)粒DNA或殼聚糖-質(zhì)粒DNA顆粒在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生，維持質(zhì)粒DNA
的濃度。生長(zhǎng)在這種基因活化的鈦材表面的細(xì)胞(如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)吸收復(fù)合顆粒后，
在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)使質(zhì)粒DNA持續(xù)表達(dá)并合成功能蛋白——骨形態(tài)發(fā)生蛋白，原位誘導(dǎo)骨髓
基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的生成，賦予鈦材主動(dòng)與骨組織發(fā)生良好的骨結(jié)合能力。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種基因活化鈦材，具有良好的生物相容性 及骨誘導(dǎo)性能，能夠提高宿主骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，有效地調(diào)控基因釋放并增強(qiáng)細(xì)胞活力，誘導(dǎo) 骨細(xì)胞的生成，從而使鈦材本體能夠主動(dòng)與骨組織發(fā)生良好結(jié)合。 本發(fā)明所述的基因活化鈦材，包括鈦材本體，鈦材本體表面由內(nèi)向外依次間隔覆 有pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層形成活化層。 進(jìn)一步，所述鈦材本體由醫(yī)用鈦材制得，所述活化層中pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼 聚糖層的總層數(shù)為9-21層。 本發(fā)明的目的之二是提供制備所述基因活化鈦材的方法，包括如下步驟(l)將所 述鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；
(2)將步驟(1)所得鈦材本體浸入含有質(zhì)粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液中 10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (3)將步驟(2)所得鈦材本體浸于殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘后，用去離子水 浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需基因活化鈦材。 進(jìn)一步，所述聚乙烯亞胺溶液中所含組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為氯
化鈉100-150mM和聚乙烯亞胺2-5mg/ml ; 進(jìn)一步，所述含有質(zhì)粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質(zhì)粒濃度為 0. l_lmg/ml ; 進(jìn)一步，所述殼聚糖的乙酸溶液中，乙酸質(zhì)量百分比為1_3%，殼聚糖濃度為 3_5mg/ml。 本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明的基因活化鈦材具有良好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性能，能夠提高宿主骨細(xì) 胞的轉(zhuǎn)染率并有效調(diào)控基因釋放和增強(qiáng)細(xì)胞活力，誘導(dǎo)骨細(xì)胞的生成，從而使鈦材本體能 夠主動(dòng)與骨組織發(fā)生良好結(jié)合，非常適合臨床應(yīng)用。 本發(fā)明所述的制備基因活化鈦材的方法利用殼聚糖分子與質(zhì)粒DNA之間的靜電 作用使殼聚糖層與質(zhì)粒pEGFP-hBMP2層在鈦材表面依次沉積，不僅操作簡(jiǎn)單，成本低廉， 而且實(shí)施容易，制得的基因活化鈦材能有效誘導(dǎo)骨源細(xì)胞向骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并與骨組織牢固 的、長(zhǎng)期穩(wěn)定的結(jié)合，本發(fā)明方法非常適合用于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。 本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進(jìn)行闡述，并 且在某種程度上，基于對(duì)下文的考察研究對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可 以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。


附圖為實(shí)施例所得基因活化鈦材進(jìn)行表面誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過程中，堿性磷酸酶的檢測(cè)結(jié)果，圖中，1-孔板，2-表面涂覆脂質(zhì)體2000的孔板，3-表 面涂覆脂質(zhì)體2000的鈦材，4-實(shí)施例所得基因活化鈦材，5-殼聚糖/DNA層狀組裝修飾的 鈦材；白色框?yàn)榧?xì)胞在第七天時(shí)產(chǎn)生堿性磷酸酶的總量，黑色框?yàn)榈谑奶鞎r(shí)細(xì)胞產(chǎn)生磷 酸酶的總量。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，所選實(shí)施例僅為了
說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例 ①將鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10分鐘，然后用去離子水浸泡1分鐘，再將 所得鈦材浸入含有質(zhì)粒pEGFP-hBMP2的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中20分鐘，然后用去離子水 浸泡1分鐘；最后將鈦材浸于殼聚糖的乙酸溶液中，10分鐘后，用去離子水浸泡1分鐘；
②重復(fù)步驟①的操作直至在鈦材外表面形成pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層總 層數(shù)為15層的活化層，得所需基因活化鈦材。所述聚乙烯亞胺溶液以100-150mM氯化鈉溶 液為溶劑，溶液中聚乙烯亞胺濃度為2-5mg/ml 本實(shí)施例所述聚乙烯亞胺溶液中所含組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為氯
化鈉150mM和聚乙烯亞胺5mg/ml，所述磷酸鹽緩沖液中pEGFP-hBMP2質(zhì)粒濃度為lmg/ml，
所述殼聚糖乙酸溶液中，乙酸質(zhì)量百分比為1 % ，殼聚糖濃度為5mg/ml 。 本實(shí)施例中，聚乙烯亞胺溶液中，氯化鈉濃度為100-150mM、聚乙烯亞胺濃度
為2-5mg/ml均可，含有pEGFP-hBMP2質(zhì)粒的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 4、質(zhì)粒濃度為
0. l-lmg/ml均可，殼聚糖乙酸溶液中，乙酸質(zhì)量百分比為l-3X、殼聚糖濃度為3-5mg/ml均可。 本實(shí)施例中，活化層中pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層總層數(shù)不低于五層皆可， 原因在于總層數(shù)大于5層的活化層，其結(jié)構(gòu)才較為完善；殼聚糖與質(zhì)粒pEGFP-hBMP2形成的 多層膜可以在生理?xiàng)l件下發(fā)生降解，使得質(zhì)粒DNA(既質(zhì)粒pEGFP-hBMP2)或殼聚糖-質(zhì)粒 DNA顆粒在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生，并維持一定濃度，鈦材表面經(jīng)殼聚糖與質(zhì)粒DNA層狀自組 裝修飾后，生長(zhǎng)在這種基因活化鈦材表面的細(xì)胞(如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)能夠吸收質(zhì)粒DNA 或復(fù)合顆粒并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)使質(zhì)粒DNA持續(xù)表達(dá)并合成功能蛋白——骨形態(tài)發(fā)生蛋白，原 位誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的生成，賦予鈦材主動(dòng)與骨組織發(fā)生良好的骨結(jié)合，使 用者可以根據(jù)需要限定鈦材本體表面活化層的總層數(shù)，以實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間內(nèi)質(zhì)粒DNA的持續(xù) 釋放，活化層總層數(shù)以9-21層最佳，原因在于9層以上的質(zhì)粒DNA層數(shù)是能夠確保質(zhì)粒DNA 的總含量，達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放的目的，但過多層數(shù)可能導(dǎo)致質(zhì)粒DNA在特定時(shí)間段釋放 過量或難于控制。 所述基因活化鈦材制備方法中，鈦材本體在聚乙烯亞胺溶液、磷酸鹽緩沖液以及 殼聚糖的乙酸溶液中的浸泡時(shí)間可分別為10-20分鐘，但并不表示本發(fā)明方法中，各溶液 浸泡階段的時(shí)間局限于10-20分鐘，浸泡的目的在于使質(zhì)粒層及殼聚糖層能夠依次間隔附 著于鈦材本體的外表面，由于同層介質(zhì)(聚陰離子或聚陽離子)的同性電荷排斥，理論上傾 向于形成單層結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間長(zhǎng)，可使聚陰離子或聚陽離子層形成更充分，對(duì)鈦材表面覆蓋 更完整，形成的覆蓋層更平整，浸泡時(shí)間以質(zhì)粒DNA層或者殼聚糖層能夠完整覆蓋鈦材表 面形成單層結(jié)構(gòu)即可。 本實(shí)施例中，各溶液對(duì)鈦材的浸泡結(jié)束后，皆需采用去離子水進(jìn)行浸泡洗滌，各階 段去離子水浸泡的次數(shù)均以1-3次為宜、去離子水浸泡時(shí)間均以每次l-3min為宜，原因在 于浸泡的主要目的是移除在同一層中可能形成雙層或多層聚陰離子或聚陽離子，以免它
5們導(dǎo)致后面鋪層結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，但浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，則可能導(dǎo)致已形成的多層結(jié)構(gòu)解離。
結(jié)果驗(yàn)證 將本實(shí)施例所得基因活化鈦材進(jìn)行表面誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的鑒定 操作如下采用密度梯度離心法和差時(shí)貼壁法培養(yǎng)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，將 MSCs分別接種到孔板、表面涂覆脂質(zhì)體2000的孔板、表面涂覆脂質(zhì)體2000的鈦材、殼聚糖 /pGB修飾的基因活化鈦材以及殼聚糖/DNA層狀自組裝修飾的鈦材表面，細(xì)胞接種密度為 40000 cells/cm2 ;用DMEM培養(yǎng)基加10% (w/v)的新生牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液一次； 細(xì)胞在基因活化鈦材表面接種分別培養(yǎng)7和14天后，以0. 25%胰酶消化，收集細(xì)胞，用1% Triton-X100裂解細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中堿性磷酸酶的表達(dá)量。 結(jié)果如附圖，從圖可知，細(xì)胞在基因活化鈦材的表面，第7天及14天產(chǎn)生堿性磷酸 酶的量均高于其它對(duì)照組，說明該基因活化的鈦材能夠更有利于促進(jìn)間充干細(xì)胞向成骨細(xì) 胞的分化。 最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較 佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種基因活化鈦材，其特征在于包括鈦材本體，鈦材本體表面由內(nèi)向外依次間隔覆有pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層形成活化層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因活化鈦材，其特征在于所述鈦材本體由醫(yī)用鈦材制得， 所述活化層中pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層的總層數(shù)為9-21層。
3. 制備權(quán)利要求1所述的基因活化鈦材的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將所述鈦材本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(2) 將步驟(1)所得鈦材本體浸入含有質(zhì)粒pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液中10-20分 鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(3) 將步驟(2)所得鈦材本體浸于殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡 1-3次，每次1-2分鐘；(4) 依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需基因活化鈦材。
4. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述聚乙烯亞胺溶 液中所含組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為氯化鈉100-150mM和聚乙烯亞胺2-5mg/ ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述含有質(zhì)粒 pEGFP-hBMP2的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質(zhì)粒濃度為0. l-lmg/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備基因活化鈦材的方法，其特征在于所述殼聚糖的乙酸 溶液中，乙酸質(zhì)量百分比為1_3%，殼聚糖濃度為3-5mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因活化鈦材，包括鈦材本體，鈦材本體表面由內(nèi)向外依次間隔覆有pEGFP-hBMP2質(zhì)粒層和殼聚糖層形成活化層，所述基因活化鈦材具有良好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性能，能夠提高宿主骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率并有效調(diào)控基因釋放和增強(qiáng)細(xì)胞活力，誘導(dǎo)骨細(xì)胞的生成，從而使鈦材本體能夠主動(dòng)與骨組織發(fā)生良好結(jié)合；本發(fā)明還提供了制備所述基因活化鈦材的方法，利用殼聚糖分子與質(zhì)粒DNA之間的靜電作用使殼聚糖層與質(zhì)粒pEGFP-hBMP2層在鈦材表面依次沉積，不僅操作簡(jiǎn)單，成本低廉，而且實(shí)施容易，制得的基因活化鈦材能有效誘導(dǎo)骨源細(xì)胞向骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并與骨組織牢固的、長(zhǎng)期穩(wěn)定的結(jié)合，適合用于產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。
文檔編號(hào)A61L27/34GK101745150SQ200910250890
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者羅忠, 胡燕, 蔡開勇 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)