專利名稱：高包封率長效神經(jīng)生長因子脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高包封率長效神經(jīng)生長因子脂質(zhì)體，屬于蛋白多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是人體神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性物質(zhì)之一，已證明確有促進(jìn)神經(jīng)突起生長和營養(yǎng)神經(jīng)的雙重作用，并能對中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷有明顯修復(fù)作用，國外兩位科學(xué)家(Levi-Montaleini和S. Cohen)因發(fā)現(xiàn)和提純NGF 于1986年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。NGF具有三種亞基(α β Y )，當(dāng)前NGF通常指具有生物活性的 β亞基，根據(jù)沉降系數(shù)也稱2. 5S NGF，分子量^KD,等電點(diǎn)9. 3，由兩條含118個(gè)氨基酸相同的單鏈組成。2001年我國在世界上首先批準(zhǔn)生產(chǎn)上市NGF肌肉注射凍干粉針劑，制劑中采用 β-NGF加入5%甘露醇和人血白蛋白保護(hù)劑，主要用于周圍神經(jīng)損傷以及視神經(jīng)病變， 多發(fā)性神經(jīng)炎、帶狀皰疹和神經(jīng)麻痹等。對老年癡呆，可明顯緩解病人的認(rèn)知記憶障礙。但因NGF不能通過血腦屏障，因此只能采取腦室注射方法。NGF在體內(nèi)外均不穩(wěn)定，體外采用凍干方法可以基本得到解決，而體內(nèi)在多種酶的作用下，NGF靜脈注射體內(nèi)的半衰期僅為9分鐘，因此NGF無論應(yīng)用于周圍神經(jīng)，還是直接應(yīng)用于中樞神經(jīng)均難于滿足臨床要求，療效也大打折扣。為了解決NGF體內(nèi)的穩(wěn)定性和通過血腦屏障這兩大難題，在國家自然科學(xué)基金立項(xiàng)資助下(批準(zhǔn)號30070901 2001. 01 2003. 12)將NGF制成脂質(zhì)體，并且采取添加長循環(huán)輔料、柔性輔料、陽離子輔料等制成荷正電的長循環(huán)柔性納米脂質(zhì)體，動(dòng)物試驗(yàn)初步證明在高劑量給藥時(shí)，具有一定的腦靶向作用。但體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果其半衰期僅為Tl/2 = 0. 22池，包封率為34%，作為實(shí)際臨床應(yīng)用尚須進(jìn)一步研究改進(jìn)。國內(nèi)有專利將NGF制成一般的長循環(huán)脂質(zhì)體，加入酶抑制劑制成脂質(zhì)體凝膠鼻噴霧劑，以期達(dá)到腦靶向作用，結(jié)果體內(nèi)半衰期由9分鐘提高到35分鐘，包封率為34%，這仍難于滿足臨床要求。國內(nèi)外也有大量研究論文及專利將肽類藥包封在脂質(zhì)體內(nèi)以達(dá)到提高體內(nèi)穩(wěn)定性的作用，但其肽類的分子量限定在IOKD以下，而通常應(yīng)用的i3-NGF(2.5SNGF)分子量為 ^KD,又因?yàn)槠渌苄噪y將其包入脂質(zhì)體中，包裹的NGF也因其水溶性容易泄漏。因其龐大的分子量，暴露在外，難以抵擋體內(nèi)酶類的攻擊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種高包封率長效神經(jīng)生長因子脂質(zhì)體。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供這種高包封率長效神經(jīng)生長因子脂質(zhì)體的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，將NGF與脂質(zhì)體活性膜材聯(lián)結(jié)后，與其他脂質(zhì)體成份用常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體。一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，將脂質(zhì)體活性膜材與脂質(zhì)體其他成分一起用常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體，加入NGF與活性膜材反應(yīng)聯(lián)結(jié)。一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，以常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體，將 NGF與脂質(zhì)體活性膜材反應(yīng)聯(lián)結(jié)，將二者加到一起孵育，利用疏水作用，將后者插入到脂質(zhì)體雙分子層中。所述長循環(huán)脂質(zhì)體的常規(guī)制備方法是成膜法、反向蒸發(fā)法、復(fù)乳法、注入法、熔融法、冷凍干燥法或離心法。所述脂質(zhì)體活性膜材可以是DSPE-PEG-MAL、DSPE_PEG_SC、DSPE-PEG-BTC，其中 PEG平均分子量是2，000 6，000?；钚猿赡げ牧峡梢允且韵氯N1) DSPE-PEG-BTC (二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇-苯并三唑磷酸酯)其中活性基因BTC可以和NGF肽鏈中的α -氨基反應(yīng)，并將二者結(jié)合起來。2)DSPE-PEG-SC(DSPE-PEG-Succinimidyl Carbonate, 二硬酯酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯)活性基團(tuán)SC與NGF肽鏈中的氨基反應(yīng)，并將二者結(jié)合起來。3) DSPE-PEG-MAL (DSPE-PEG-Maleimie，二硬酸酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺)活性基團(tuán)MAL可以和NGF肽鏈中半胱氨酸的-SH反應(yīng)，并將二者結(jié)合起來。以上反應(yīng)均在常溫下數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，隨后進(jìn)入凍干，確保NGF不被破壞。所述脂質(zhì)體的常規(guī)其他成份是磷脂、膽固醇或各種表面活性劑。所用的脂質(zhì)體活性成膜材料中含有磷脂部分(如DSPE)可以參與組成脂質(zhì)體雙分子層，所含的 PEG(PEG2000 6000)具有長鏈聚乙二醇分子，吸附大量水分子可以起屏蔽作用，阻擋體內(nèi)的吞筮細(xì)胞的吞噬作用，避免酶類對NGF的破壞。此外常規(guī)脂質(zhì)體雙分子膜層，對NGF也具有一定的保護(hù)作用。所述方法中添加凍干支持劑，通過常規(guī)凍干工藝制成前體脂質(zhì)體。所述方法中添加抗氧化劑和其他具有穩(wěn)定作用或影響釋放性能的助劑。一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，采用上述方法制備得到。可以在凍干前或以后加入酶抑制劑，增稠劑、防腐劑、支持劑，可以制成注射劑、凝膠劑、噴霧劑、溶液劑、粉針劑、 眼用鼻腔給藥或局部給藥劑型。所述制劑為靜脈注射制劑、皮下注射制劑、肌肉注射制劑、髓鞘內(nèi)注射制劑、呼吸道吸入制劑、口服制劑或外用制劑。本發(fā)明的創(chuàng)新之處還在于發(fā)現(xiàn)以上方法制備的NGF脂質(zhì)體NGF收率可達(dá)到70 %以上(相當(dāng)于包封率> 70% )，包封的NGF不能自由滲漏到外相水溶液中。如除去外水相的 NGF，則其包封率可達(dá)90%以上。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于制備NGF高包封長效脂質(zhì)體，采用先制成含活性成膜材料的空白脂質(zhì)體，再加入NGF與之反應(yīng)連接。也可制成常規(guī)的長循環(huán)脂質(zhì)體，將NGF與活性膜材結(jié)合，二者混合后，利用疏水作用后者插入前者的雙分子層中。或者先將活性膜材與NGF 結(jié)合再與其他膜材一起制備脂質(zhì)體。本發(fā)明的創(chuàng)新之處還在于如此制備的NGF高包封率的脂質(zhì)體體內(nèi)半衰期可以大大延長，以便于NGF更好的發(fā)揮對周圍神經(jīng)的再生營養(yǎng)作用，也便于NGF能更有效的通過血腦屏障。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明通過NGF分子中的-SH，-NH2與脂質(zhì)體特殊活性膜材_活性脂鍵合，大大提高了包封率，在活性酯中長鏈PEG保護(hù)下提高體內(nèi)穩(wěn)定性，解決NGF應(yīng)用的關(guān)鍵問題。本發(fā)明通過脂質(zhì)體活性膜材與NGF的鍵合可以達(dá)到90%以上的高包封率，粒度可以控制在50 IOOOnm范圍內(nèi)，并且在體內(nèi)外穩(wěn)定性均明顯提高。脂質(zhì)體的膜材為大豆磷脂，DSPE-PEG，膽固醇和其他脂質(zhì)成份，可通過薄膜分散法，加壓擠出法等脂質(zhì)體的常規(guī)制備方法制備，也可將上述方法制備的脂質(zhì)體加入適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑制成前體脂質(zhì)體凍干粉針?？捎糜陟o脈注射、肌肉注射、局部注射、霧化吸入等多種給藥方法。下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換均屬于對本發(fā)明專利權(quán)的侵犯。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1稱取卵磷脂400mg,膽固醇 80mg，DSPE-PEG 108mg, DSPE-PEG-Mal 108mg 溶于 10 20ml氯仿溶液中，得到脂質(zhì)體液在55°C水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成均勻薄膜，繼續(xù)55°C下減壓蒸發(fā)30min，除去氯仿，得到稠厚的膠壯物。加入適量硫酸銨溶液(123mm0l/L pH5. 4)，水浴冷卻超聲洗脫20分鐘，得到的脂質(zhì)體混懸液加入NGF，數(shù)量相當(dāng)DSPE-PEG-Mal摩爾數(shù)的1 1/4，室溫孵育4 10h。NGF 反應(yīng)率為 74%，平均粒徑 140nm VC = 0. 590。過膜后可得不同的粒徑范圍脂質(zhì)體。上柱分離游離的NGF，成品包封率可以更高，并不滲漏。實(shí)例2DSPE-PEG-SC 與 NGF 摩爾比為 3 1，用 pH7. 5HEPES[N_(2_ 羥乙基)哌嗪-N-2-乙磺酸]緩沖液分別溶解，前者滴加到后者的緩沖液中，4°C下溫和攪拌4h，透析純化后凍干， 得DSPE-PEG-NGF。以DSPE-PEG-NGF為膜材一部分，用實(shí)例1或其他常規(guī)方法制備脂質(zhì)體。實(shí)例3用實(shí)例1方法制備不含活性脂的普通長循環(huán)脂質(zhì)體，用實(shí)例2方法制備 DSPE-PEG-NGFJf 2者混合孵育，利用疏水性后者插入前者脂質(zhì)體的雙分子層中。實(shí)例 4稱取DSPE-PEG-BTC 和 NGF，[二者者摩爾比 O 5) 1]，分別以 4°C HEPES 緩沖液(0. Immol/mL)溶解，前者滴入后者緩沖液中，于4°C緩慢攪拌4h，用TLC或HPLC 跟蹤反應(yīng)，直到NGF完全消失，加入過量的甘氨酸經(jīng)止反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)透析純化凍干得 DSPE-PEG-NGF。稱取大豆磷脂，膽固醇，DSPE-PEG，DSPE-PEG-NGF(摩爾的比20 10 1 1)，溶于氯仿后，37°C旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)成膜，用硫酸銨緩沖液(123mm0l/L，pH5. 4)渦旋振蕩，水溶超聲，反復(fù)擠壓過200nm聚碳酯膜，即得。包封率可達(dá)80%以上。
權(quán)利要求
1.一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特性在于將NGF與脂質(zhì)體活性膜材聯(lián)結(jié)后，與其他脂質(zhì)體成份用常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體。
2.一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特性在于將脂質(zhì)體活性膜材與脂質(zhì)體其他成分一起用常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體，加入NGF與活性膜材反應(yīng)聯(lián)結(jié)。
3.一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特性在于以常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體，將NGF與脂質(zhì)體活性膜材反應(yīng)聯(lián)結(jié)，將二者加到一起孵育，利用疏水作用，將后者插入到脂質(zhì)體雙分子層中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于所述長循環(huán)脂質(zhì)體的常規(guī)制備方法是成膜法、反向蒸發(fā)法、復(fù)乳法、注入法、熔融法、冷凍干燥法和離心法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于所述脂質(zhì)體活性膜材是DSPE-PEG-MAL、DSPE-PEG-SC、DSPE-PEG-BTC，其中PEG平均分子量是2，000 6，000。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于 所述脂質(zhì)體的常規(guī)其他成份是磷脂、膽固醇或各種表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于所述方法中添加凍干支持劑，通過常規(guī)凍干工藝制成前體脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于所述方法中添加抗氧化劑和其他具有穩(wěn)定作用或影響釋放性能的助劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所述的方法制備的一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于所述制劑為靜脈注射制劑、皮下注射制劑、肌肉注射制劑、髓鞘內(nèi)注射制劑、呼吸道吸入制劑、口服制劑和外用制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及高包封率長效神經(jīng)生長因子脂質(zhì)體，屬于蛋白多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。一種高包封率長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，將NGF與脂質(zhì)體活性膜材聯(lián)結(jié)后，與其他脂質(zhì)體成份用常規(guī)方法制成長循環(huán)脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明通過NGF分子中的-SH，-NH2與脂質(zhì)體特殊活性膜材-活性脂鍵合，大大提高了包封率，在活性酯中長鏈PEG保護(hù)下提高體內(nèi)穩(wěn)定性，解決NGF應(yīng)用的關(guān)鍵問題。
文檔編號A61K38/18GK102485214SQ200910250359
公開日2012年6月6日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者于彬, 陳春園, 陳春在, 陳騏 申請人:李曉為, 陳春園