bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備及其應(yīng)用，制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的原料為包括大豆卵磷脂、膽固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。本發(fā)明的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包封率高、穩(wěn)定性好，對(duì)治療牽張性脊髓損傷具有較好的療效。
【專利說明】bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]牽張性脊髓損傷是脊柱矯形手術(shù)的常見并發(fā)癥，在早期使用的Harrington、Luque、Dick和Cotrel-Dubousset等脊柱矯形復(fù)位手術(shù)中時(shí)有發(fā)生。隨著Q)、TSRH等三維矯形器械及誘發(fā)電位術(shù)中監(jiān)護(hù)的相繼應(yīng)用，脊柱側(cè)凸畸形矯正的手術(shù)適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，效果也越來越好。但隨之而來的醫(yī)源性牽張性脊髓損傷仍然是個(gè)嚴(yán)重的問題。因此，各種原因造成的脊柱過度牽拉并由之引發(fā)的脊髓牽張性損傷逐漸被關(guān)注。目前對(duì)牽張性脊髓損傷的治療效果和預(yù)后均不夠理想，主要是因?yàn)闋繌埿约顾钃p傷后的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)其認(rèn)識(shí)還不夠全面、深入。因此，尋求新的、更加有效的治療方法，以及更透徹地闡明牽張性脊髓損傷所涉及的復(fù)雜機(jī)制，更有效地評(píng)估牽張性脊髓損傷后處理手段的正確性是目前的研究熱點(diǎn)。
[0003]脊髓損傷的治療至今是個(gè)難題，如何有效地治療脊髓損傷并促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)，一直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修復(fù)脊髓損傷，是該領(lǐng)域最具潛力的研究方向之一。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)總族，是一種具有廣泛生物學(xué)活性的肽類生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)起源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種細(xì)胞的增殖與分化，因而在胚胎發(fā)育、血管形成、創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用，其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尤為突出。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是近年來被關(guān)注程度較高的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用包括促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和存活。在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，bFGF以劑量依賴方式促進(jìn)多種神經(jīng)元再生并延長(zhǎng)存活時(shí)間，且在體內(nèi)能促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生[8_9]^FGF幾乎存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有組織中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后它可能被釋放。近期研究表明，脊髓損傷可明顯增加損傷后神經(jīng)元bFGFmRNA的表達(dá)，并且bFGF主要在脊髓中間神經(jīng)元和前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)，其表達(dá)的高峰出現(xiàn)于損傷后I~7天，此后開始逐漸下降[1°]。提示bFGF可能對(duì)損傷神經(jīng)元有保護(hù)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，bFGF對(duì)多種體外培養(yǎng)的神經(jīng)元都具有營(yíng)養(yǎng)作用，可以促進(jìn)突起生長(zhǎng)和神經(jīng)元的成活，有中樞性的神經(jīng)元，包括皮層、海馬、丘腦、脊髓等的神經(jīng)元；也有周圍性神經(jīng)元，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)和睫狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。其中中樞神經(jīng)元較多，說明bFGF對(duì)中樞神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用較強(qiáng)。Kojima[11]等研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后早期連續(xù)給予外源性bFGF可以對(duì)脊髓損傷區(qū)域起到明顯的保護(hù)作用，促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。但bFGF如何保護(hù)脊髓組織，其間的信號(hào)傳遞通路及存在哪些調(diào)控因素，值得研究。bFGF對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響機(jī)理也尚待研究。
[0004] 脊髓損傷及其繼發(fā)性病理生理反應(yīng)可直接導(dǎo)致神經(jīng)功能損害，引起組織器官功能障礙，致殘率非常高。對(duì)其研究的難題之一就是如何建立一個(gè)可以確實(shí)模擬實(shí)際損傷情況、定量的、可重復(fù)性的動(dòng)物模型，使其病理過程能恰如其分地復(fù)制到模型動(dòng)物身上，應(yīng)用于脊髓損傷后的研究。目前關(guān)于脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究多以誘發(fā)電位來判斷和評(píng)價(jià)脊髓神經(jīng)功能的變化，誘發(fā)電位檢測(cè)的解剖生理學(xué)基礎(chǔ)與脊髓的病理改變密切相關(guān)，為臨床上如何防止?fàn)繌埿约顾钃p傷提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床脊柱手術(shù)中脊髓功能監(jiān)護(hù)提供了有益的參考。當(dāng)脊髓受到牽張性損害時(shí)，有學(xué)者主張以Pl波幅降低50%作為臨界線[21_24]。Fehlings等[25_26]觀察脊髓運(yùn)動(dòng)、感覺誘發(fā)電位和脊髓血流變化，以了解牽張性脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)束和感覺傳導(dǎo)束軸突功能的改變與脊髓血流變化的相互關(guān)系。線性判斷分析結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)、感覺誘發(fā)電位振幅的衰減與脊髓損傷程度和脊髓損傷血流量遞減有明顯關(guān)聯(lián)，并且認(rèn)為脊髓損傷程度和損傷部位血流量的下降存在線性關(guān)系(r = -0.89)。目前，一些實(shí)驗(yàn)研究試圖解釋牽張性脊髓損傷機(jī)制，包括脊髓機(jī)械性牽張損傷、脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腫脹和活性胺類或血管收縮因子的釋放等，認(rèn)為牽張性脊髓損傷應(yīng)是綜合因素所致，但確切機(jī)制仍不十分清楚。
[0005]相關(guān)的問題還在于，血液循環(huán)中的大分子藥物(主要為蛋白質(zhì)及肽類)一直被認(rèn)為是無法通過血腦(脊髓)屏障的，即使藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)也達(dá)不到有效劑量。bFGF分子量較大(18KDa)，難以通過血腦屏障。且bFGF本身對(duì)熱、酸和有機(jī)溶劑均不穩(wěn)定，56°C作用5min或酸性條件下(pH = 2.0)作用2h可失活。在體內(nèi)復(fù)雜內(nèi)環(huán)境下半衰期很短，僅3~5分鐘即在生物體內(nèi)被迅速滅活而無法達(dá)到治療目的[14]。目前尚無使用bFGF的具體方案，其使用劑量和療程也有待作進(jìn)一步研究。因此，bFGF必須經(jīng)過加工修飾，以延長(zhǎng)bFGF在血漿中的存留時(shí)間，從而增加bFGF透過血腦屏障的量，其中脂質(zhì)體包裹bFGF是一種有希望的解決方法。
[0006]脂質(zhì)體(liposomes)或稱類脂小球、脂囊泡,是一種定向藥物載體,屬于祀向給藥系統(tǒng)的一種類似微型膠囊的新劑型。脂質(zhì)體形狀為球形，直徑大小約為幾十納米到幾十微米。然而，如何制備具有較高包封率、穩(wěn)定性好的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，以提高其在治療牽張性脊髓損傷的療效是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種穩(wěn)定性和包封率高的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案。
[0008]本發(fā)明一方面涉及一種bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的原料為包括大豆卵磷脂、膽固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的原料重量配比為15-25:4-6:1.5-2.5:
0.1 ;優(yōu)選為 20:5:2.2:0.I。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體通過如下的步驟制備得到:
[0011](I)用茄形瓶稱取大豆卵磷脂、膽固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000以及bFGF，加入氯仿使之完全溶解；
[0012](2)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法抽去溶液中的氯仿，在茄形瓶瓶底以及內(nèi)壁形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜；
[0013](3)真空干燥器內(nèi)放置過夜；
[0014](4)加入10%的蔗糖溶液作為保護(hù)劑，使用恒溫空氣搖床，在25°C、300rpm、4h的條件下，使脂質(zhì)膜充分水化；[0015](5)水化后通過0.22 μ m聚碳酸酯膜整粒5次，即得到包載bFGF的脂質(zhì)體；
[0016](6) sephadexG-50葡聚糖凝膠預(yù)先用10%鹿糖平衡過夜,將制得的脂質(zhì)體通過葡聚糖凝膠柱分離除去游離的bFGF。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體平均粒徑介于190-250nm之間，ζ電位為_20mV以下。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體能夠在4°C能穩(wěn)定存放I個(gè)月以上。
[0019]本發(fā)明另一方面還涉及上述bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在治療牽張性脊髓損傷中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】:
[0020]實(shí)施例1
[0021]1.薄膜分散法制備bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體 [0022](I)用爺形瓶稱取20mg SPC (大豆卵磷脂)、5mg Chol (膽固醇)、2.2mgDSPE-PEG2000 ( 二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000) UOOyg bFGF,加入氯仿使之完全溶解(所用器具均先在紫外燈下輻射滅菌)；
[0023](2)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法抽去溶液中的氯仿，在茄形瓶瓶底以及內(nèi)壁形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜；
[0024](3)真空干燥器內(nèi)放置過夜；
[0025](4)加入10%的蔗糖溶液作為保護(hù)劑，使用恒溫空氣搖床，在25°C、300rpm、4h的條件下，使脂質(zhì)膜充分水化；
[0026](5)水化后通過0.22 μ m聚碳酸酯膜整粒5次，即得到包載bFGF的脂質(zhì)體；
[0027](6) sephadexG-50葡聚糖凝膠預(yù)先用10%鹿糖平衡過夜,將制得的脂質(zhì)體通過葡聚糖凝膠柱分離除去游離的bFGF。
[0028]bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的外觀、色澤及穩(wěn)定性
[0029]制備的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液樣本呈半透明混懸液狀，溶液均勻、無任何沉淀及漂浮顆粒物。將得到的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液樣本(粒徑=194.8nm, ζ -電位=-24.78mV)放置于4°C恒溫冰箱進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，并測(cè)定放置I月后的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液樣本的粒徑。結(jié)果顯示:在4°C冰箱放置I月后，bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液樣本能保持較好的穩(wěn)定性，溶液未發(fā)生明顯沉淀。且脂質(zhì)體的粒徑測(cè)定表現(xiàn)出較好的一致性(粒徑=204.6nm, ζ -電位=_21.92mV)，與剛制備出的樣本相比并無明顯差異。
[0030]bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包封率的測(cè)定
[0031]bFGF酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)方法的建立
[0032](I) 一抗?jié)舛鹊暮Y選:
[0033]固定二抗?jié)舛龋瑢?duì)一抗?jié)舛?000ng/ml, 500ng/ml進(jìn)行篩選。用ρΗ9.6的包被液將 bFGF 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下濃度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、
3.125ng/ml、l.5625ng/ml、0.78125ng/ml，依次加入 96 孔板中，每孔 100 μ 1，4°C下包被過夜；用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ 1，洗板2次；每孔加入300 μ 11 % BSA封閉液，約封閉2h ;用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ 1，洗板2次；將兩種濃度的一抗加入96孔板中，每孔加Λ 100 μ 1，37°C放置2h ;用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ 1，洗板2次；每孔加入800ng/ml的二抗，37°C放置Ih ;分別用PBS洗滌液、超純水洗板2次，每孔加入100 μ I反應(yīng)液，37°C反應(yīng)30min ;每孔加入50 μ IH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)板測(cè)得熒光。
[0034](2) 二抗?jié)舛鹊暮Y選
[0035]固定一抗?jié)舛?對(duì)二抗?jié)舛?00ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml進(jìn)行篩選。用pH9.6的包被液將 bFGF 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下濃度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml,3.125ng/ml、l.5625ng/ml、0.78125ng/ml，依次加入 96 孔板中，每孔 100μ 1，4°C 下包被過夜；用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ 1，洗板2次；每孔加入300 μ 11 % BSA封閉液，約封閉2h ;用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ I，洗板2次；將500ng/ml的一抗加入96孔板中，每孔加入100 μ 1，37°C放置2h ;用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ 1，洗板2次。將三種濃度的二抗分別加入96孔板中，37°C放置Ih ;分別用PBS洗滌液、超純水洗板2次，每孔加入100 μ I反應(yīng)液，37°C反應(yīng)30min ;每孔加入50 μ IH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)板測(cè)得熒光。
[0036]ELISA法測(cè)定bFGF脂質(zhì)體包封率
[0037](I)取留樣脂質(zhì)體和過柱后的脂質(zhì)體各30 μ 1，按一下步驟平行操作:用PBS稀釋液稀釋至300 μ 1，加入氯仿900 μ I,混合均勻；4°C 8000rpm離心20min,取水相40 μ I,用ρΗ9.6的包被液定容至2ml ；
[0038](2)用ρΗ9.6的包被液將bFGF標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下濃度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml ;將 bFGF 標(biāo)準(zhǔn)品、留樣脂質(zhì)體和過柱后的脂質(zhì)體依次加入96孔板中，每孔100μ 1，4°C下包被過夜；
[0039](3)用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ I，洗板2次；
[0040](4)每孔加入300 μ 11 % BSA封閉液，約封閉2h ；
[0041 ] (5)用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ I，洗板2次；
[0042](6)用ρΗ7.4的PBS將一抗配至500ng/ml的濃度，每孔加入100 μ I的一抗，37°C放置2h ；
[0043](7)用PBS洗滌液洗板，每孔300 μ I，洗板2次；
[0044](8)用ρΗ7.4的PBS將二抗配至800ng/ml的濃度，每孔加入100 μ I的二抗，37°C放置Ih ；
[0045](9)分別用PBS洗滌液、超純水洗板2次，每孔加入100 μ I反應(yīng)液，37°C避光顯色反應(yīng)30min ；
[0046](10)每孔加入50 μ IH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)板測(cè)得熒光光密度(0D值)。
[0047]得出由濃度-OD值繪制得到bFGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù):
[0048](I)包封率=[(投入藥量一液體介質(zhì)中游離的藥量)/總投入藥量]X100%
[0049]投入藥量一液體介質(zhì)中游離的藥量=被包封藥量,即貨包
[0050]總投藥量即W總
[0051]包封率=(W包/W總)X100%。
[0052](2)過柱前bFGF脂質(zhì)體樣品(即為包含游離bFGF的樣品)，測(cè)定的OD值為0.351，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知脂質(zhì)體中bFGF含量為17.54ng/ml ；
[0053](3)過柱后bFGF脂質(zhì)體樣品(即為已經(jīng)過濾出游離bFGF后的樣品)，測(cè)定的OD值為0.21，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知脂質(zhì)體中bFGF含量為10.233ng/ml ；[0054](4) bFGF脂質(zhì)體的包封率:
[0055]包封率=(W包 /W 總)X100%= (10.233/17.54) X 100% = 58.3%
[0056]2.bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體對(duì)大鼠牽張性脊髓損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
[0057]將168只SPF級(jí)健康Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為4組:
[0058]適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為4組。每組造模后又分6h, ld,3d, lw,2w,4w,6w七個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只大鼠。動(dòng)物分組情況:
[0059]假手術(shù)組(Sham組)42只，麻醉后手術(shù)行椎板切除，在椎旁安放脊柱撐開器，但不撐開，不造成脊髓損傷。
[0060]牽張性脊髓損傷組(tractive spinal cord injury,TSCI組)42只,手術(shù)行椎板切除，在椎旁安放脊柱撐開器，撐開至SEPPl波幅下降至正常波幅的70%，持續(xù)lOmin，損傷脊髓，不用藥物治療。
[0061]牽張性脊髓損傷后蛛網(wǎng)膜下腔灌注bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組(bFGFlong-circulating liposome by subarachnoid space infus1n, bFGF+LCL SSI 組)42 只，椎板切除后脊柱撐開至SEP Pl波幅下降至正常波幅的70%，持續(xù)lOmin，造成脊髓損傷，蛛網(wǎng)膜下腔置管每日灌注bFGF脂質(zhì)體20 μ g/Kg體重，連續(xù)7日。
[0062]牽張性脊髓損傷后尾靜脈注射bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組(bFGF long-circulatingliposome by inject1n through vena caudal is, bFGF+LCLIV 組)42 只，椎板切除后脊柱撐開至SEPPl波幅下降至正常波幅的70%，持續(xù)lOmin，造成脊髓損傷，然后每日經(jīng)尾靜脈注射bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體20 μ g/Kg體重，連續(xù)7日。
[0063]每組42只大鼠。Sham組只切除椎板，但是不牽拉脊髓。TSCI組、bFGF+LCL IV組、bFGF+LCL SSI組，以自行設(shè)計(jì)制造的大鼠脊柱撐開器造成牽張性脊髓損傷，牽張至SEP Pl波幅下降至正常水平的70%，維持1min。bFGF+LCL IV組在術(shù)后即刻、術(shù)后第I~6d，共7次經(jīng)大鼠尾靜脈注入bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(20ug/Kg體重)；bFGF+LCL SSI組在術(shù)后即刻、術(shù)后第I~6d，共7次經(jīng)大鼠背部導(dǎo)管將bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(20ug/Kg體重)注入蛛網(wǎng)膜下腔。分別在術(shù)后ld，lw，2w，3w，4w，6w六個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每組隨機(jī)選取6只大鼠應(yīng)用改良Gale聯(lián)合功能評(píng)分法(ICBS)進(jìn)行功能評(píng)分。每組分別在術(shù)后6h，Id, 3d，lw, 2w, 4w六個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)選取6只大鼠行4%多聚甲醛心臟灌注固定，處死并取損傷區(qū)脊髓組織，分別行HE染色、尼氏染色、免疫組織化學(xué)染色和TUNEL法標(biāo)記。觀察并比較牽張性脊髓損傷后脊髓組織大體情況和Fas-L、TNF-a、Caspase-3、Bcl_2、Bax、p53的陽(yáng)性細(xì)胞比率以及脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)(Al)。采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)Al與Fas_L、TNF- a、Caspase-3,Bcl-2、Bax、p53之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。
[0064] 結(jié)果:在術(shù)后Id、lw、2w、3w、4w、6w,每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行ICBS評(píng)分。各組大鼠IcUlw時(shí)ICBS評(píng)分未見明顯差異(P>0.05);從2w開始，bFGF+LCLIV組與bFGF+LCLSSI組評(píng)分明顯高于TSCI組(P〈0.05)，而bFGF+LCLIV組在2w~6w4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分優(yōu)于bFGF+LCLSSI組，具有顯著性差異(P〈0.05)。免疫組織化學(xué)染色和TUNEL標(biāo)記的結(jié)果。A.損傷組與治療組比較:bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體治療組在傷后Id~4w各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Al以及Fas_L、Caspase-3、Bax、p53的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于損傷組，Bcl-2的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于損傷組，二組之間有顯著性或者非常顯著性差異(P〈0.05，或P〈0.01);以上指標(biāo)在傷后6h均無顯著性差異。治療組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞率在傷后6h~Iw各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯低于損傷組，二者之間有顯著性或者非常顯著性差異(P〈0.05，*P〈0.01)，傷后2w、4w無顯著性差異。B.兩治療組比較:bFGF+LCL IV組的Al以及Fas_L、Caspase-3, Bax、p53的陽(yáng)性細(xì)胞率在傷后Id~2w低于bFGF+LCL SSI組，存在顯著性差異(P〈0.05);傷后6h、4w無顯著性差異；bFGF+LCLIV組的Bcl-2在傷后3d~2w高于bFGF+LCL SSI組，存在顯著性差異(P〈0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異；bFGF+LCL IV組的TNF-α在傷后6h~3d低于bFGF+LCL SSI組，存在顯著性差異(p〈0.05),其余時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異。經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)驗(yàn)證,各組Al與Fas_L、Caspase-3,Bax,p53,Bcl-2的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上存在較高的相關(guān)性；與了即-(!無明顯相關(guān)性。
[0065]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的原料為包括大豆卵磷脂、膽固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述的原料重量配比為15-25:4_6:.1.5-2.5:0.1 ;優(yōu)選為 20:5:2.2:0.I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體通過如下的步驟制備得到: (1)用茄形瓶稱取大豆卵磷脂、膽固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000以及bFGF，加入氯仿使之完全溶解； (2)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法抽去溶液中的氯仿，在茄形瓶瓶底以及內(nèi)壁形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜； (3)真空干燥器內(nèi)放置過夜； (4)加入10%的蔗糖溶液作為保護(hù)劑，使用恒溫空氣搖床，在25°C、300rpm、4h的條件下，使脂質(zhì)膜充分水化； (5)水化后通過0.22 μ m聚碳酸酯膜整粒5次，即得到包載bFGF的脂質(zhì)體； (6)sephadexG-50葡聚糖凝膠預(yù)先用10%蔗糖平衡過夜，將制得的脂質(zhì)體通過葡聚糖凝膠柱分離除去游離的bFGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體平均粒徑介于190-250nm之間，ζ電位為_20mV以下。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體能夠在4°C能穩(wěn)定存放I個(gè)月以上。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在治療牽張性脊髓損傷中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的bFGF長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在制備治療牽張性脊髓損傷藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK104027308SQ201410249731
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月7日
【發(fā)明者】劉雷, 黃澤宇, 裴福興, 宋躍明 申請(qǐng)人:劉雷