專利名稱：：一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于中藥生物活性成分的提取領域，涉及從植物裂葉蕁麻中用溶解、提取、萃取、離心和吸附、洗脫的分離方法制備有效植物成分。以及對前列腺等疾病有潛在的治療作用。
背景技術：
：Kraus與Wu等[1—2]從大蕁麻中鑒定出了13個木脂素類化合物(+)_新橄欖樹脂素、(-)-開環(huán)異落葉松脂素、異落葉松脂素、松醋醇、3，4-二香草基四氫吠喃、新橄欖樹脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、9_乙?；?新橄欖樹脂素、9_乙?；?新橄欖樹脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、9，9'-二乙?；?新橄欖樹脂素、9，9'-二乙酰基-新橄攬樹脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、(_)-開環(huán)異落葉松脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷、(_)-開環(huán)異落葉松脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、新橄欖樹脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷。其結構類型主要有新橄欖樹脂素及其苷類和開環(huán)落葉松脂素、落葉松脂素及其苷類，其中新橄欖樹脂素及其苷類結構如下新橄欖樹脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷9-乙?；?新橄欖樹脂素39，9—_二乙?；鵢新橄欖樹脂素、9-乙酰基-新橄欖樹脂素-4-0-P_D_葡萄糖苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(-)-開環(huán)異落葉松脂素(_)_開環(huán)異落葉松脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷異落葉松脂素有研究表明從大蕁麻根中分離到(+)_新橄欖樹脂素、(-)_開環(huán)異落葉松脂素、脫氫二松柏醇、異落葉松脂素、松脂醇和3，4_二香草基四氫呋喃，并檢驗了以上幾種物質(zhì)體外性激素結合球蛋白(SBHG)的親和作用，結果除松脂醇外，其余化合物都有親合力，其中3，4-二香草基四氫呋喃的親合作用最強，濃度為250iig/ml時抑制率為95%。提示大蕁麻根中木脂素類是治療BPH(良性前列腺增生的簡稱，下同)的活性成分之一。本發(fā)明的課題組曾對國產(chǎn)的8種蕁麻屬植物根的不同提取物進行了抗前列腺增生的生物活性篩選，結果表明滇藏蕁麻根的20%和95%乙醇提取物能顯著地抑制前列腺增生大鼠的病變組織。雖然國外報道了蕁麻中木脂素類具有一定抗Bra活性，但作用較弱，而裂環(huán)蕁麻木脂素類結構特殊，作用與陽性藥非那雄胺相當。[l]KrausR，SpitellerG.PhenoliccompoundsfromrootofUrticadioica.Phytochem，1990,29(5):1653-659.[2]Jian-linWu，NaLi，ToshiakiHasegawa，etal.BioactiveSecolignansfromP印eromiadindygulensis.J.Nat.Prod.2006，69，790-794.[3]SchottnerM，GanberD，SpitellerG.LigansfromtherootsofUrticadioicaandtheirmetabolitesbindtohumansexhormonebindingglobulia(SHBG).PlantaMedica.1997,63(6):529-532.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明/實用新型的目的在于提供一種本發(fā)明的目的是在前期研究的基礎上，為了進一步研究提取物抗前列腺增生的活性部位和作用機理，選取前列腺組織中一個關鍵酶_5a-還原酶為作用靶點，采用酶聯(lián)免疫(Enzyme-linkedi匪nospecificassayELISA)的方法，建立抑制5a-還原酶體夕卜模型，從大鼠前列腺組織中提取5a-還原酶，與底物睪酮以及供氫體NADra共同組成了一種微量反應體系，利用酶標儀檢測雙氫睪酮(DHT)的含量，以DHT的含量來判斷蕁麻提取物是否有抑制5a-還原酶的活性。本發(fā)明從裂葉蕁麻中分離得到了蕁麻裂環(huán)木脂素苷D，該成分的結構不同于上述木脂素類成分，為一種新的裂環(huán)木脂素類成分，對其抑制5a-還原酶作用研究發(fā)現(xiàn)具有較強活性，是一種潛在的抗前列腺增生藥物成分。本發(fā)明的技術方案是一種5_a還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D，其分子結<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上述的5-a還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的制備方法是以裂葉蕁麻為原料，制備步驟如下(1)將裂葉蕁麻干燥地下部分粉碎處理后，用6-8倍量質(zhì)量濃度為95%的工業(yè)乙醇回流提取，過濾后減壓濃縮；(2)將醇提取物用8-10倍量熱水混懸，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)萃余水層采用D101大孔吸附樹脂分離純化，以乙醇_水梯度(水一30%乙醇—50%乙醇一95%乙醇)洗脫，收集洗脫液；(4)乙醇洗脫液用硅膠柱色譜分離純化，采用體積比為氯仿甲醇=30:1、io:1、5:i、2:i的梯度洗脫，收集洗脫液，采用薄層色譜法(tlc)檢測將組成相同的組分進行合并；(5)步驟(4)的洗脫液經(jīng)反相硅膠柱色譜分離純化，采用體積比為甲醇水=3:7的溶液洗脫，每0.5個保留體積收集成l份，收集第20-25份洗脫液，合并濃縮后得到蕁麻裂環(huán)木脂素苷D。采用核磁共振(nmr)等波譜技術測定其結構，蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的波譜數(shù)據(jù)見表l:表1蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的^和13cnmr數(shù)據(jù)NO.D(CD3OD)23471'2'6'r2"3"4"6"r"2"'3〃'4"'6'"3',3〃-OCH34'，4〃-OCH33c180.748.041.772.956.568.6135.9113.0149.2146.6116.5121.8137.3113.5150.8149.5116.5121.2104.775.178.071.678.062.756.6,56.656.72.57，1H,成^7.3,3.33.65，1H11.8,7.44.35,m3.88,1H,必,8.8,6.73.80,lH,rf,m3.75,]H,必聲10.4,2.83.35,1H,^/，^10.3,3.86.93，1H,4/=1.96.74,1H,《/=8.16.84，IH,浙片I,1.96.94，1H，《聲2.06.90,1H,《V=8.36.99,1H，必,聲8.3,2.04.11,1H'《J:7,83.16,lH，m3.21,IH,w3.31,1H，w3.31,lH,w3.87，1H,cW,/=11.5，2.33,71,1H,必，月1.9,5.33.79，3.8，both3H,s3.84,3H,s蕁麻裂環(huán)木脂素苷D可以用于制備抗前列腺增生藥物，將有效計量的蕁麻裂環(huán)木脂素苷D與藥用載體混合并制成適當劑型的藥物。本發(fā)明的有益效果是目前前列腺增生藥物中植物藥作用弱，治療效果差，而合成藥一般副作用較強，裂環(huán)木脂素類原料為純天然植物根，安全易得，方法簡單易操作，不引入有毒物質(zhì)，成本低廉，雖來源于植物但作用較強，在抗前列腺增生藥物研究開發(fā)上具有非常重要的意義。以下用實施例對本發(fā)明作進一步的說明。具體實施方式實施例1裂葉蕁麻藥材采集自四川省阿巴州。從裂葉蕁麻中制備蕁麻裂環(huán)木脂苷C方法步驟如下(1)將裂葉蕁麻干燥地下部分粉碎處理后，用質(zhì)量濃度為95%的工業(yè)乙醇回流提取，料液比(kg/1)=1:8，提取溫度9(TC，提取時間3h，提取次數(shù)3次，合并提取液，過濾后減壓濃縮至無醇味；(2)將醇提物200g用2L熱水混懸，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取3次；(3)萃余水層萃取物30g經(jīng)D101大孔樹脂(lkg)分離，以乙醇-水梯度(水一30%乙醇一50%乙醇一95%乙醇)洗脫，收集洗脫液10L;(4)乙醇洗脫液濃縮至干得5g，以甲醇溶解后加入10g硅膠拌樣后用硅膠柱色譜(硅膠i50g)分離純化，采用體積比為氯仿甲醇=30:i、io:1、5:1、2:i梯度洗脫，收集每個比例洗脫液1L;(5)步驟(4)的洗脫液濃縮至干得lg，以甲醇溶解然后經(jīng)反相硅膠柱色譜(反相硅膠30g)分離純化，采用甲醇水=3:7梯度洗脫，每25ml收集成1份，合并15-20份洗脫液，濃縮后得到蕁麻裂環(huán)木脂素苷D120mg。實施例2測試了實施例1制得的蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的5-a還原酶抑制作用。5-a還原酶抑制作用實驗步驟如下(1)5-a還原酶的制備雄性SD大鼠3只，體重200士10g，大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，禁食不禁水過夜處死，迅速取出腹側(cè)的前列腺組織在冰臺上剪碎，用預冷的勻漿液(蔗糖0.73mol，L一1，氯化鈣1.91mmol*L—0在玻璃勻漿器中勻漿，在4"下以10000rpm低溫高速離心20min，取上清液再以16000rpm低溫高速離心30min，即得5a-還原酶提取物。采用lowry法測定蛋白含量，以酶提物中的總蛋白含量表示5a-還原酶提取物的含量，將提取物放入小離心管在-7(TC下保存，備用。(2)5a-還原酶抑制活性測定操作分兩部分完成，即①將反應成分37t:恒溫緩沖液、睪酮、實施例1制備的蕁麻裂環(huán)木脂苷C樣品、陽性對照藥、NADra及酶組織液依次加入96孔板內(nèi)，使之微量化，設置不同反應孔和對照孔板。反應溫度為37°C(相對飽和濕度)，反應時間為60min。②采用ELISA法定量測定產(chǎn)物DHT，以產(chǎn)物的生成量大小反映酶活性的強弱。受試樣品管中DHT的含量低于酶反應管中DHT含量時，則視為具有抑制5a-還原酶的活性。檢測方法及計算參照睪酮試劑盒(購于AdlitteramDiagnosticLaboratories公司)使用說明進行。所有實驗孔均為雙復孔操作。在已經(jīng)確定的反應體系基礎上，輔酶NADPH濃度為lmmolL—、睪酮濃度為0.5iimol*L—、結合睪酮試劑盒微量測定的特點，將整個反應體系的總量定為200iU。酶反應體系中各組分的原始濃度分別為緩沖溶液(PBS20mmo1L-l，蔗糖0.2mo1L一1，EDTANa21,1L—、p朋.8);NADPH濃度(20,1L—0;粗酶濃度(4.3mgm1—1);睪酮濃度(20iimolL—0;非那雄胺(1.3,1L—0。測定結果見表2:表2蕁麻裂環(huán)木脂素苷D抑制5a-還原酶作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可以看出蕁麻裂環(huán)木脂素D能顯著抑制DHT的生成，作用略低于陽性藥非那雄胺。權利要求一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D，是以三角葉蕁麻地下部分為原料，經(jīng)過醇提，醇提物熱水混懸，石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，萃余水層萃取物經(jīng)大孔樹脂分離和洗脫，以及硅膠柱色譜分離純化而得；其分子的結構式為F2009102199589C0000011.tif2.如權利要求l所述5-a還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的制備方法，其特征在于，該方法是以三角葉蕁麻為原料，其工藝步驟如下(1)將裂葉蕁麻干燥地下部分粉碎處理后，用6-8倍量質(zhì)量濃度為95%的工業(yè)乙醇回流提取，過濾后減壓濃縮；(2)將醇提取物用3-5倍量熱水混懸，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)萃余水層采用D101大孔吸附樹脂分離純化，以乙醇_水梯度(水一30%乙醇—50%乙醇一95%乙醇)洗脫，收集洗脫液；(4)乙醇洗脫液用硅膠柱色譜分離純化，采用體積比為氯仿甲醇=30:i、io:i、5:1、2:i的梯度洗脫，收集洗脫液，采用薄層色譜法(TLC)檢測將組成相同的組分進行合并；(5)步驟(4)的洗脫液經(jīng)反相硅膠柱色譜分離純化，采用體積比為甲醇水=3:7的溶液洗脫，每0.5個保留體積收集成1份，其中第20-25份洗脫液采用TLC法檢測為單一成分，合并濃縮后得到蕁麻裂環(huán)木脂素苷D。3.如權利要求l所述5-a還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D的用途，其特征在于能顯著抑制5a-還原酶作用；抑制DHT的生成，與陽性藥非那雄胺相當，對前列腺疾病有潛在的醫(yī)療用途。全文摘要一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環(huán)木脂素苷D及其制備方法與用途。是以三角葉蕁麻地下部分為原料，經(jīng)過醇提，醇提物熱水混懸，石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，萃余水層萃取物經(jīng)大孔樹脂分離和洗脫，以及硅膠柱色譜分離純化而得。蕁麻裂環(huán)木脂素苷D能顯著抑制DHT的生成，與陽性藥非那雄胺相當，對前列腺疾病有潛在的預防和治療用途。對裂環(huán)木脂素類原料為純天然植物根，安全易得，方法簡單易操作，不引入有毒物質(zhì)，成本低廉，雖來源于植物但作用較強，在抗前列腺增生藥物研究開發(fā)上具有非常重要的意義。文檔編號A61P13/00GK101717419SQ200910219958公開日2010年6月2日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權日2009年11月16日發(fā)明者馮寶民,鞠冠華申請人:大連大學