專利名稱：酪蛋白或酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或空心球及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酪蛋白納米材料及其制法和在作為藥物載體中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
藥物輸送系統(tǒng)就是將藥物或者其它生物活性物質(zhì)和載體材料結(jié)合在一起使藥物通 過(guò)擴(kuò)散等方式在一定的時(shí)間內(nèi)，以某一速率釋放到環(huán)境中或者是輸送到特定靶組織，對(duì) 機(jī)體健康產(chǎn)生作用，主要由藥物和載體兩部分構(gòu)成。納米藥物載體系指溶解或分散有藥 物的各種納米粒，如納米脂質(zhì)體、聚合物納米囊、納米球、納米膠束等，通常由天然或 合成高分子材料制成。納米藥物載體制備方法較多，其中較常用的有交聯(lián)法、沉淀/凝聚 法、溶劑蒸發(fā)法、噴霧干燥法、多孔離心法、鹽析法和超聲法等。應(yīng)用這些技術(shù)制備微 球是根據(jù)材料的不同物理化學(xué)性能而實(shí)現(xiàn)的，如溫度敏感性、溶解性等，制備的粒子大 小從幾十納米到幾百微米不等。納米藥物載體的突出優(yōu)點(diǎn)在于靶向輸送藥物即控制藥
物進(jìn)入特定的靶器官或靶細(xì)胞；緩釋藥物延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間；提高制劑的穩(wěn)定性及口服 生物利用度；載體材料可生物降解并具有生物相容性。
作為藥物釋放載體的高分子材料，需要具有生物相容性和生物降解性，也就是能在
體內(nèi)降解為水、二氧化碳等小分子化合物，從而被機(jī)體代謝、吸收或排泄，對(duì)人體無(wú)毒 副作用，并且降解過(guò)程發(fā)生的時(shí)機(jī)要合適。目前正在開(kāi)發(fā)的生物降解型藥物緩釋用高分 子材料主要是合成高分子和天然高分子。合成高分子主要有聚乳酸、聚酸酐、氨基酸類 聚合物、聚磷酸酯、聚膦腈、聚碳酸酯等天然和改性天然生物。天然高分子有多糖類(如 殼聚糖、果膠質(zhì)、透明質(zhì)酸、環(huán)糊精、纖維素、海藻酸鈉、直鏈淀粉等)和蛋白質(zhì)類(如 膠原、明膠、白蛋白等)。
可生物降解并具有生物相容性的材料在現(xiàn)代藥劑學(xué)中的研究應(yīng)用，開(kāi)發(fā)出具有特殊 療效的藥物新劑型，在減輕病人的痛苦，提高生命質(zhì)量中發(fā)揮著越來(lái)越重的作用，成為 目前材料科學(xué)與藥劑學(xué)的研究熱點(diǎn)。生物可降解高分子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究十分廣泛，但 對(duì)于機(jī)體來(lái)說(shuō)，它畢竟是異物，高分子與生物體接觸時(shí)，假如材料生物相容性欠佳，生 物體就顯現(xiàn)出排斥異物的本能，會(huì)出現(xiàn)發(fā)炎、過(guò)敏等。當(dāng)血液與高分子生物材料表面接觸時(shí)，各種血漿蛋白質(zhì)隨材料表面性質(zhì)不同，會(huì)不同程度地很快吸附在異物表面，隨后 引起血小板的粘附，可能發(fā)生溶血或凝血，從而形成血栓。因此，血漿蛋白質(zhì)的選擇吸 附反映了生物材料的血液相容性。大多數(shù)生物降解聚合物，尤其是合成的高分子，降解 非常慢，降解產(chǎn)物在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，且合成高分子， 一般按重復(fù)單元，有規(guī)則連接， 更易結(jié)晶，不太利于酶的作用。另外從表面上看，天然高分子因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與人體組織更 加接近似乎更適合于作為生物醫(yī)用材料。然而天然高分子存在許多致命弱點(diǎn)，如生理活 性太強(qiáng)而受到人體排斥、難以評(píng)價(jià)其體內(nèi)降解速率、天然高分子的機(jī)械性能差。由于這 些缺點(diǎn)，限制了天然高分子的應(yīng)用。
牛奶中的蛋白主要為酪蛋白、乳清蛋白和免疫球蛋白，而其中酪蛋白(casein)占牛 奶總蛋白質(zhì)的80%左右，含有全部人體所需的氨基酸和大量免疫球蛋白，呈白色無(wú)定形 粉末或顆粒，具有吸濕性。溶于稀堿和濃酸，不溶于水和有機(jī)溶劑。酪蛋白不是單一的 蛋白質(zhì)，而是由一類在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上較近似的蛋白質(zhì)組成的，包括asl-酪蛋白，as2-酪 蛋白，P-酪蛋白和k-酪蛋白，分子量在19000-25000Da的范圍內(nèi)，這些混合物的平均等電 點(diǎn)約為4.7。它們都是鏈狀的兩親性蛋白質(zhì)，由于酪蛋白分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其可被視為由 親水性氨基酸和疏水性氨基酸所構(gòu)成的嵌段型共聚物。這四種成分的一級(jí)結(jié)構(gòu)均已被確 定，主要特點(diǎn)是有高含量的磷酸絲氨酸殘基和相當(dāng)多的脯氨酸。磷酸絲氨酸殘基結(jié)構(gòu)與 酪蛋白對(duì)鈣離子的結(jié)合能力有關(guān)，也對(duì)酪蛋白的性質(zhì)和功能具有重要的意義。牛奶中的 e-酪蛋白，具有較強(qiáng)的抗變異原機(jī)制，能減少癌變。作為藥物載體材料，酪蛋白微球 多是采用戊二醛為交聯(lián)劑制備而成(高分子通報(bào)，2006.(8). 1-9)。

發(fā)明內(nèi)容
基于酪蛋白具有良好的生物相容性和生物可降解性，不易引起機(jī)體免疫反應(yīng)，其降 解產(chǎn)物不僅能夠被人體吸收代謝，而且對(duì)人體具有治療作用和營(yíng)養(yǎng)功效等特點(diǎn)，本發(fā)明 以酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米球或空心納米球及其純的酪蛋白的納米球或空心納米 球做為藥物載體裝載藥物，特別是裝載順鉑等抗癌藥物。
本發(fā)明的目的是
1. 提供一種可生物降解且生物相容性很好的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米球或空 心納米球。
2. 將上述納米粒子用戊二醛或鈣鹽交聯(lián)，然后若將該納米微球在pH-3的水中透析
5可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米球或空心納米球；若將該納米微球在 pH=7的水中透析可以得到純的酪蛋白的納米球或空心納米球。
3. 提供一種上述各種納米微球的制法。
4. 將上述各種納米微球做為藥物載體裝載順鉑等抗癌藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球，它由酪蛋白和聚丙烯酸的 復(fù)合物組成，納米微球或納米空心球的平均粒徑分別為170-480nm和360-500nm，其中 復(fù)合微球中聚丙烯酸的百分含量為75%-85%。改變制備條件，可以得到粒徑可控，形貌 可調(diào)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球。
上述的納米微球可以用戊二醛或鈣鹽交聯(lián)，得到在酸性和堿性環(huán)境下都穩(wěn)定的交聯(lián) 酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球。
一種交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，它由交聯(lián)的酪蛋白組成，納米微球或納 米空心球的平均粒徑分別為240-480nm和490-500nm。
上述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球或交聯(lián)酪蛋白的納米微球 或納米空心球，所述的酪蛋白還可以是asl-酪蛋白或p-酪蛋白。
一種上述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，它包括如下步驟
步驟1.在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入50ml蒸餾水，0.1克酪蛋白和0.5-0.75克丙烯
酸，攪拌，然后加熱到70-9(TC，
步驟2.待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入
0.0125-0.0187克過(guò)硫酸鉀，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)
色，
步驟3.撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾，用pH=3的水作透析介質(zhì)透析，得到 平均粒徑為170-320nm的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球，其中復(fù)合微球中聚丙烯 酸的含量百分含量為75%-85%。它可以放在4'C冰箱中保存。
上述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，所述的步驟1中，可以添加0.25-0. 5克丙酸，同時(shí)使步驟2中加入過(guò)硫酸鉀的質(zhì)量與丙烯酸的質(zhì)量比小于等于0.025。添加 丙酸主要是為了改善酪蛋白的水溶性。
一種上述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，它是將上述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球加入50-75yL質(zhì)量百分濃度為25%的戊二醛或鈣鹽 交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，在pH-3的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù) 合物的納米微球。
上述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，所述的鈣鹽可以是碳酸轉(zhuǎn)、 硫酸鈣或磷酸鈣。
一種上述的交聯(lián)酪蛋白納米微球的制法，它是將上述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合 物的納米微球加入50-75 y L質(zhì)量百分濃度為25%的戊二醛或0.04-0.06g 二水硫酸轉(zhuǎn)交 聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)，然后過(guò)濾，將交聯(lián)后的納米微球體系調(diào)節(jié)pH至7，再在pH-7 的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白納米微球。
一種上述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球的制法，它包括如下步驟
步驟1，.在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入50ml蒸餾水，0.1克酪蛋白、0.5-0.75克丙烯 酸和0.2-0.4克丙酸，攪拌，然后加熱到70-卯。C，
步驟2'.待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入 過(guò)硫酸鉀，過(guò)硫酸鉀加入的質(zhì)量與丙烯酸的質(zhì)量比為0.03-0.05，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系 顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，
步驟3'.撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾，用分析純的鹽酸和蒸餾水調(diào)制pH4 的透析介質(zhì)透析，得到平均粒徑為360-370nm的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心微 球，其中復(fù)合空心微球中聚丙烯酸的含量百分含量為75%-85%。它可以放在4'C冰箱中 保存。
一種上述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球的制法，它是將上述制得的 酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球加入50-75 UL質(zhì)量百分濃度為25%的戊二醛或 0.04-0.06g二水硫酸鈣交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，在pH-3的水中透析得到交 聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球。
一種上述的交聯(lián)酪蛋白納米空心球的制法，它是將上述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù) 合物的納米空心球加入50-75 P L質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度為25%的戊二醛或0.04-0.06g 二水硫 酸鈣交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)，然后過(guò)濾，將交聯(lián)后的納米微球體系調(diào)節(jié)pH至7，再 在？1€=7的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白納米空心球。
本發(fā)明中用于制備納米微粒的酪蛋白也可以用asl-酪蛋白或p-酪蛋白代替。 本發(fā)明的納米微?？梢宰鰹樗幬锏妮d體，特別是可以作為抗腫瘤藥物的載體。 做為藥物的載體，它可以在本發(fā)明的各種微粒中加入要負(fù)載的順鈾等抗癌藥物，經(jīng)37'C振蕩數(shù)小時(shí)，即可得到包裹有藥物的納米微球。
本發(fā)明交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，具有良好的生物相容性和生物可降解 性，不易引起機(jī)體免疫反應(yīng)，其降解產(chǎn)物不僅能夠被人體吸收代謝，而且對(duì)人體具有治 療作用和營(yíng)養(yǎng)功效等特點(diǎn)，因此可以作為藥物的載體。


圖1為各實(shí)施例所得的納米微球的粒徑分布統(tǒng)計(jì)圖，其中圖l-l 圖1-5分別是實(shí) 施例1,實(shí)施例7所得的未交聯(lián)的復(fù)合納米微球，實(shí)施例12所得的未交聯(lián)的復(fù)合納米空 心球，實(shí)施例15，實(shí)施例16所得的未交聯(lián)的復(fù)合納米微球。圖2是實(shí)施例1的未交聯(lián) 的復(fù)合納米微球的透射電鏡照片。
圖3是實(shí)施例12的未交聯(lián)的復(fù)合納米空心球的電鏡照片，其中圖3-l 圖3-3分別 是透射電鏡圖，切片透射電鏡圖，掃描電鏡圖。
圖4為實(shí)施例12所得的納米微球的紅外光譜圖，其中圖4-1,圖4-2是實(shí)施例12 分別在pH-3的水中透析得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球和在p1^7的 水中透析得到的純交聯(lián)酪蛋白納米空心球。
圖5是實(shí)施例13的未交聯(lián)的復(fù)合納米空心球的切片透射電鏡圖。
圖6是實(shí)施例15的未交聯(lián)的復(fù)合納米微球的透射電鏡照片。
圖7是實(shí)施例16的未交聯(lián)的復(fù)合納米微球的透射電鏡照片。
圖8是實(shí)施例17的藥物釋放曲線。
圖9是實(shí)施例18的藥物釋放曲線。
圖10是實(shí)施例19的藥物釋放曲線。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例h
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、然后加熱到 卯t:，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱源、 停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、用分析純的鹽酸和蒸餾水調(diào)制pH-3的透析介質(zhì)透析，每次加 水250ml，換水20次，透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得到復(fù)
8合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4r保存，平均粒徑為170nm，粒徑分布見(jiàn)圖1-1， 透射電鏡照片見(jiàn)圖2。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫 酸鈣0.04g交聯(lián)，在40。C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，再用分析純的鹽酸和蒸餾水調(diào)制pH-3 的透析介質(zhì)透析(下同)，每次加水250ml，換水20次，pH=3的水中透析數(shù)天，可以 得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.39克，平均粒徑為200nm，復(fù)合微球 中聚丙烯酸的含量為81%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH-7的水中透析可 以得到不是復(fù)合的、純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.065克，平均粒徑為240nm。
實(shí)施例2:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.6g、然后加熱到 90°C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 0.015g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱 源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得 到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4t:保存。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分 數(shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納 米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.52克， 平均粒徑為210nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為85%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7， 再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.068克，平均粒徑為 250nm。
實(shí)施例3:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.12g酪蛋白、丙烯酸0.6g、然后加熱到 卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 0.015g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱 源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得 到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4t;保存。取出上述液體，加入60ul質(zhì)量百分 數(shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.06g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納 米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.6克， 平均粒徑為l卯nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為82c/。;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7， 再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.098克，平均粒徑為 240nm。
9實(shí)施例4:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、然后加熱到 80°C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱源、 停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得到復(fù) 合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微 球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.39克，平 均粒徑為200nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為82%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7， 再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.063克，平均粒徑為 270nm。
實(shí)施例5:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、然后加熱到 90°C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 0.015g,隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱 源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得 到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分 數(shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納 米微球在pH-3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.41克， 平均粒徑為210nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為83%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7， 再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.059克，平均粒徑為 270腦。
實(shí)施例6:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、然后加熱到 90°C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入過(guò)硫酸鉀 O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此時(shí)，撤去熱源、 停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得到復(fù) 合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入60ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.06g交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微 球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.40克，平均粒徑為180nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為83%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH=7， 再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.066克，平均粒徑為 270謡。
實(shí)施例7:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g， 然后加熱到9(TC，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存，平均粒徑為200nm，粒 徑分布見(jiàn)圖1-2。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣 0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微球在p1^3的水中透析可以得 到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.41克，平均粒徑為220nm，復(fù)合微球中 聚丙烯酸的含量為82%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7，再在pH-7的水中透析可以 得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.068克，平均粒徑為280nm。
實(shí)施例8:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.6g、丙酸03g， 然后加熱到9(TC，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀0.015g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入40ul 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾， 若將該納米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微 球0.54克，平均粒徑為230nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為85%;若將該納米微球 體系調(diào)節(jié)pH-7，再在pH-7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.061克， 平均粒徑為2卯nm。 實(shí)施例9:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.4g， 然后加熱到卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入40ul 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾， 若將該納米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微 球0.43克，平均粒徑為230nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為84%;若將該納米微球 體系調(diào)節(jié)pt^7，再在pH-7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.065克， 平均粒徑為290nm。 實(shí)施10:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.12g酪蛋白、丙烯酸0.6g、丙酸0.3g， 然后加熱到9(TC，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀0.015g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。取出上述液體，加入60ul 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.06g交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾， 若將該納米微球在pH-3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微 球0.63克，平均粒徑為240nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為83%;若將該納米微球 體系調(diào)節(jié)pH=7,再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.099克， 平均粒徑為310nm。
實(shí)施例U-
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g, 然后加熱到80'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4t:保存。取出上述液體，加入40ul 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾， 若將該納米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微 球0.41克，平均粒徑為240nm,復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為82%;若將該納米微球 體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.067克， 平均粒徑為300nm。
實(shí)施例12:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g，然后加熱到9(TC，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀0.015g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單
體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4t;保存。經(jīng)該納米粒子切片的透 射電鏡證實(shí)為空心結(jié)構(gòu)，平均粒徑為360nm，粒徑分布見(jiàn)圖1-3，電鏡照片見(jiàn)圖3。取 出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25M的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在40°C 反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該空心納米微球在pl^3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白 -聚丙烯酸復(fù)合物的空心納米微球0.38克，平均粒徑為360nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的 含量為81%，其紅外光譜見(jiàn)圖4-l;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH二7，再在pH-7的水中 透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的空心納米微球0.064克，平均粒徑為490nm，其紅外光 譜見(jiàn)圖4-2。 實(shí)施例13:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g， 然后加熱到卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀0.012g，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存。經(jīng)該納米粒子切片的透 射電鏡證實(shí)為空心結(jié)構(gòu)，其電鏡照片見(jiàn)圖5。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在40'C反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該空心納 米微球在pH^的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的空心納米微球0.39 克，平均粒徑為370nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為80%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié) pH=7，再在pH-7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的空心納米微球0.061克，平均 粒徑為500nm。 實(shí)施例14:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g， 然后加熱到卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4X:保存。取出上述液體，加入60ul 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛或二水硫酸鈣0.06g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微球在pH=3的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微 球0.43克，平均粒徑為230nm,復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為82%;若將該納米微球 體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH=7的水中透析可以得到純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球0.069克， 平均粒徑為2卯nm。 實(shí)施例15:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08g asl-酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g, 然后加熱到卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存，平均粒徑為320nm，粒 徑分布見(jiàn)圖l-4，電鏡照片見(jiàn)圖6。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二 醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微球在pH=3 的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.35克，平均粒徑為 350nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為79%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH=7 的水中透析可以得到純的交聯(lián)asl-酪蛋白的納米微球0.064克，平均粒徑為470nm。
實(shí)施例16:
在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入40ml蒸餾水、0.08gp-酪蛋白、丙烯酸0.4g、丙酸0.2g， 然后加熱到卯'C，待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加 入過(guò)硫酸鉀O.Olg，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，此 時(shí)，撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析以除去體系的無(wú)機(jī)鹽小分子及未反應(yīng)的單 體，即可得到復(fù)合納米微球，所得納米粒子放入冰箱4'C保存，平均粒徑為320nm，粒 徑分布見(jiàn)圖l-5，電鏡照片見(jiàn)圖7。取出上述液體，加入40ul質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%的戊二 醛或二水硫酸鈣0.04g交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，若將該納米微球在pH=3 的水中透析可以得到交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球0.38克，平均粒徑為 360nm，復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量為82%;若將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH=7 的水中透析可以得到純的交聯(lián)(3-酪蛋白的納米微球0.065克，平均粒徑為480nm。
實(shí)施例17:
將實(shí)施例1得到的在pH=7的水中透析過(guò)的純的交聯(lián)酪蛋白的納米微球加入O.Olg 順鉑，37'C下攪拌72小時(shí)。取部分載藥體系在400000個(gè)重力下高速離心，收集上層清 液。用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定清夜中的Pt離子的濃度，可計(jì)算出順鈾
14的i^藥率和包覆率分別約為8%和70%。并最終在生理鹽水中測(cè)定其藥物釋放曲線，其 藥物釋放曲線見(jiàn)圖8。 實(shí)施例18:
將實(shí)施例7得到的在p^7的水中透析過(guò)的純的酪蛋白的納米微球加入0.01g順鉬， 37。C下攪拌72小時(shí)。取部分載藥體系在400000個(gè)重力下高速離心，收集上層清夜。用 電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定清夜中的Pt離子的濃度，可計(jì)算出順鉑的載藥 率和包覆率分別約為9%和80%。并最終在生理鹽水中測(cè)定其藥物釋放曲線，藥物釋放 曲線見(jiàn)圖9。
實(shí)施例19:
將實(shí)施例12得到的在pH-7的水中透析過(guò)的純的酪蛋白的納米微球加入0.01g順鈾， 37'C下攪拌72小時(shí)。取部分載藥體系在400000個(gè)重力下高速離心，收集上層清夜。用 電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定清夜中的Pt離子的濃度，可計(jì)算出順鉑的載藥 率和包覆率分別約為8%和60%。并最終在生理鹽水中測(cè)定其藥物釋放曲線，藥物釋放 曲線見(jiàn)圖10。
權(quán)利要求
1.一種酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球，其特征是它由酪蛋白和聚丙烯酸的復(fù)合物組成，納米微球或納米空心球的平均粒徑分別為170-480nm和360-500nm，其中復(fù)合微球中聚丙烯酸的百分含量為75％-85％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米微球，其特征是它是用戊二醛或鈣鹽交聯(lián)，得到的 在酸性和堿性環(huán)境下都穩(wěn)定的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球。
3. —種交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，其特征是它由交聯(lián)的酪蛋白組成， 納米微球或納米空心球的平均粒徑分別為240-480nm和490-500nm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球 或交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，其特征是所述的酪蛋白是asl-酪蛋白或p-酪蛋白。
5. —種制備權(quán)利要求1所述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的方法，其特征是它包括如下步驟步驟1.在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入50ml蒸餾水，0.1克酪蛋白和0.5-0.75克丙烯 酸，攪拌，然后加熱到70-90。C，步驟2.待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入 0.0125-0.0187克過(guò)硫酸鉀，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán) 色，步驟3.撤去熱源、停止攪拌、然后冷卻、過(guò)濾，再透析，得到平均粒徑為170-320nm 的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球，其中復(fù)合微球中聚丙烯酸的百分含量為 75%-85%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，其特征是 所述的步驟1中，添加0.25-0.375克丙酸，同時(shí)使步驟2中加入過(guò)硫酸鉀的質(zhì)量與丙烯 酸的質(zhì)量比小于等于0.025。
7 —種制備權(quán)利要求2所述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的方法，其 特征是:它是將權(quán)利要求5或6所述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球加入50-75 u L質(zhì)量百分濃度為25%的戊二醛或鈣鹽交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾，在pH=3 的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球的制法，其特征是所述的鈣鹽是碳酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈣。
9. 一種制備權(quán)利要求3所述的交聯(lián)酪蛋白納米微球的制法，其特征是它是將權(quán)利 要求1所述的制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球加入50-75 P L質(zhì)量百分濃度為 25%的戊二醛或0.04-0.06g 二水硫酸鈣交聯(lián)，在40。C反應(yīng)24小時(shí)，然后過(guò)濾，將該納 米微球體系調(diào)節(jié)pH=7，再在pH=7的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白納米微球。
10. —種制備權(quán)利要求1所述的的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球的方法，其 特征是它包括如下步驟步驟l，.在100ml的三口燒瓶?jī)?nèi)加入50ml蒸餾水，0.1克酪蛋白、0.5-0.75克丙烯 酸和0.2-0.4克丙酸，攪拌，然后加熱到80-90。C，步驟2'.待酪蛋白全部溶解后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，等體系里的空氣全部排除后，加入 過(guò)硫酸鉀，過(guò)硫酸鉀加入的質(zhì)量與丙烯酸的質(zhì)量比為0.03-0.05，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系 顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色直至乳藍(lán)色，步驟3'.撤去熱源、停止攪拌、冷卻、過(guò)濾、透析，得到平均粒徑為360-370nm 的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球，其中復(fù)合微球中聚丙烯酸的含量百分含量為 75%-85%。
11. 一種制備權(quán)利要求2所述的交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球的方法， 其特征是它是將上述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球加入50-75 ixL質(zhì)量 百分濃度為25%的戊二醛或0.04-0.06g 二水硫酸鈣交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)然后過(guò)濾， 在pH-3的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球。
12. —種制備權(quán)利要求3所述的交聯(lián)酪蛋白納米空心球的方法，其特征是它是將 權(quán)利要求10所述制得的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米空心球加入50-75 PL 質(zhì)量百分 數(shù)濃度為25M的戊二醛或0.04-0.06g二水硫酸鈣交聯(lián)，在4(TC反應(yīng)24小時(shí)，然后過(guò)濾， 將該納米微球體系調(diào)節(jié)pH-7，再在pl^7的水中透析得到交聯(lián)酪蛋白納米空心球。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5-12任一所述的制備酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或空心 球、或交聯(lián)的酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或空心球、或者交眹的交聯(lián)酪蛋白納 米微球或空心球的方法，其特征是用于制備納米微粒的酪蛋白用asl-酪蛋白或p-酪蛋 白代替。
14. 權(quán)利要求3或4所述的酪蛋白納米微球或納米空心球在作為藥物載體中的應(yīng)用。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的在作為藥物載體中的應(yīng)用，其特征是在作為抗腫瘤藥 物的載體中的應(yīng)用。
全文摘要
一種酪蛋白-聚丙烯酸復(fù)合物的納米微球或納米空心球，它由酪蛋白和聚丙烯酸的復(fù)合物組成，納米微球或納米空心球的平均粒徑為170-370nm，以及一種交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，它由交聯(lián)的酪蛋白組成，納米微球或納米空心球的平均粒徑為240-500nm。本發(fā)明交聯(lián)酪蛋白的納米微球或納米空心球，具有良好的生物相容性和生物可降解性，不易引起機(jī)體免疫反應(yīng)，其降解產(chǎn)物不僅能夠被人體吸收代謝，而且對(duì)人體具有治療作用和營(yíng)養(yǎng)功效等特點(diǎn)，因此可以作為藥物的載體。本發(fā)明公開(kāi)了它們的制法。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101648022SQ20091018460
公開(kāi)日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者劉成杰, 蔣錫群 申請(qǐng)人:南京大學(xué)