專利名稱：一種重組腺病毒的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制劑，尤其涉及一種重組腺病毒的制劑。
技術(shù)背景
重組腺病毒作為基因治療領(lǐng)域常用的復(fù)制載體，臨床用藥要求其在保存、運(yùn)輸及 使用過程中保持完整的二十面體病毒殼體結(jié)構(gòu)，維持較高的活病毒數(shù)量和感染復(fù)制能力。 然而，腺病毒在高溫、低PH、氧化等條件下極不穩(wěn)定，容易降解。例如，US7202078公開了下 述技術(shù)內(nèi)容，當(dāng)重組腺病毒濃度高于lE12vp/ml時，病毒顆粒通常會聚集成絲狀，引發(fā)衣殼 蛋白裂解，致使感染活性降低。
在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，傳統(tǒng)方法主要選擇在_80°C -20°C的低溫條件下保存和運(yùn) 輸重組腺病毒藥物，雖然這種方法能夠比較有效地保持腺病毒的結(jié)構(gòu)和活性，但由于需要 采用大量的用于保持低溫的材料和設(shè)備，導(dǎo)致這種保存和運(yùn)輸?shù)某杀靖甙?，且操作存在諸 多不便，并存在較大風(fēng)險(xiǎn)。
鑒于這些原因，研究者開始考慮從制劑角度提高用于基因治療的重組腺病毒貯存 的穩(wěn)定性，開發(fā)能在2 8°C甚至25°C下較好地保持腺病毒活性的制劑。
例如，US6689600、US723539UUS20080107631A 公開了包括 Tris 緩沖液、甘油、甘 露醇、蔗糖、MgCl2、吐溫-80的重組腺病毒制劑，這些制劑能在2-8°C保存濃度為lEllvp/mL 的腺病毒，并維持其6個月的穩(wěn)定性，但沒有考察該制劑是否可以保存lE12vp/mL及更高濃 度腺病毒的穩(wěn)定性。
又如，US7456009和US7351415公開了由Tris緩沖液、非離子表面活性劑吐 溫-80、二價陽離子MgCl2、糖類、NaCl、EDTA或無水乙醇組成的制劑，該制劑能在2_8°C較好 保存ΙΕΙΟνρ/rmL腺病毒的活性，也但沒有描述該制劑可以保存lE12vp/mL及更高濃度腺病 毒的穩(wěn)定性。
又如，US2006/0205080A、CN101163794A 公開 了包含 Tris 緩沖液、甘氨酸、 MgCl2，及丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氫呋喃乙二醇醚等組成的制劑，該制劑用于保存 lE12vp/mL腺病毒，可以較好地保持腺病毒的活性。
可見，這些現(xiàn)有技術(shù)公開的改良制劑通過優(yōu)化重組腺病毒制劑的組成，在較大程 度上，改善了腺病毒的保存濃度和保存溫度。但是，這些改良制劑尚不能用于保存濃度高于 2E12vp/ml的腺病毒制劑，且在2_8°C條件下，不能在較長時間內(nèi)O年以上)保持制劑中重 組腺病毒的活性。而臨床上為了提高療效，需要濃度不低于2E12vp/ml的重組腺病毒制劑。 因此，如何進(jìn)一步改良重組腺病毒制劑的組成，來改善該制劑的穩(wěn)定性及保存濃度、保存溫 度和保存時間，成為一個亟待解決的技術(shù)問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于，提供一種能夠在較高溫度下、較長時間內(nèi) 保存高濃度重組腺病毒的藥物組合物。本發(fā)明組合物不僅提高了制劑中重組腺病毒的穩(wěn)定高濃度重組腺病毒制劑的穩(wěn)定性，并延長了其保存時間。本發(fā)明目的在于 提供一種重組腺病毒制劑，所述制劑含有重組腺病毒、Tris緩沖液、丙二醇和精氨酸。
進(jìn)一步，所述iTris緩沖液的濃度為ImM-lOOmM，優(yōu)選為5mM-50mM，更優(yōu)選為10mM。
進(jìn)一步，所述丙二醇的濃度為5W/V% -20W/V%，優(yōu)選為10W/V% _15W/V%。
進(jìn)一步，所述精氨酸的濃度為50mM-250mM，優(yōu)選為100mM-200mM，更優(yōu)選為150mM。
進(jìn)一步，所述制劑中還含有抗氧化劑。其中，優(yōu)選所述的抗氧化劑選自亞硫酸鈉、 硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、硫代水楊酸、半胱氨酸鹽酸鹽、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或 硫代葡萄糖的任一種或其組合，更優(yōu)選為谷胱甘肽。
進(jìn)一步，所述谷胱甘肽的濃度為5mM-100mM，優(yōu)選為10mM-50mM，更優(yōu)選為20mM。
進(jìn)一步，所述制劑中還含有抗氧增效劑。其中，優(yōu)選所述的抗氧增效劑為枸櫞酸 鈉、琥珀酸鈉或次磷酸鈉的任一種或其組合，更優(yōu)選為枸櫞酸鈉。
進(jìn)一步，所述枸櫞酸鈉的濃度為5mM-100mM，優(yōu)選為10mM-50mM，更優(yōu)選為30mM。
進(jìn)一步，本發(fā)明的制劑由重組腺病毒、IOmM的1^化，101八％丙二醇和IOOmM的精 氨酸組成，用HCl調(diào)節(jié)ρΗ7· 4-8. 6。
進(jìn)一步，本發(fā)明的制劑由重組腺病毒、IOmM的Tris，101八％丙二醇、IOOmM的精氨 酸、20mM的谷胱甘肽組成，用HCl調(diào)節(jié)pH7. 4-8. 6。
進(jìn)一步，本發(fā)明的制劑由重組腺病毒、IOmM的1^8，101八％丙二醇、IOOmM精氨 酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸櫞酸鈉組成，用HCl調(diào)節(jié)pH7. 4-8. 6。
為此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組腺病毒制劑，所述制劑含有重組腺病毒、 I-IOOmMTris緩沖液、保護(hù)劑。其中，所述的保護(hù)劑選自多羥基化合物或二甲基亞砜的任一 種或其組合，優(yōu)選多羥基化合物選自丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400的任一種或其組合，更 優(yōu)選為丙二醇，最優(yōu)選濃度為5-20W/V%的丙二醇。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組腺病毒制劑，所述制劑含有重組腺病毒、 I-IOOmMTris緩沖液、5-20W/V%的丙二醇、氨基酸類化合物。其中，優(yōu)選所述的氨基酸類化 合物選自甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、蛋氨酸或脯氨酸的任一種或其組合，更優(yōu)選為精 氨酸，最優(yōu)選濃度為50-250mM的精氨酸。
本發(fā)明的另一目的在于提供了一種重組腺病毒制劑，所述制劑含有重組腺病毒、 I-IOOmMTris緩沖液、5-20W/V%的丙二醇、精氨酸、抗氧化劑。其中，優(yōu)選所述的抗氧化劑選 自亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、硫代水楊酸、半胱氨酸鹽酸鹽、二硫代甘醇酸、硫脲、硫 代山梨醇或硫代葡萄糖的任一種或其組合，更優(yōu)選為谷胱甘肽，最優(yōu)選濃度為5-100mM的 谷胱甘肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供了一種重組腺病毒制劑，所述制劑含有重組腺病毒， I-IOOmMTris緩沖液，5-20W/V%的丙二醇、50-250mM精氨酸、5-100mM的谷胱甘肽、抗氧增 效劑。其中，優(yōu)選所述的抗氧增效劑為枸櫞酸鈉、琥珀酸鈉或次磷酸鈉的任一種或其組合， 更優(yōu)選為枸櫞酸鈉，最優(yōu)選濃度為30mM的枸櫞酸鈉。
進(jìn)一步，本發(fā)明制劑的組成為，含有I-IOOmM的Tris緩沖液、5-20W/V%的丙二醇、 50-250mM的精氨酸、5_100mM的谷胱甘肽、5_100mM的枸櫞酸鈉。
進(jìn)一步，本發(fā)明的制劑組成為，含有IOmM的1Tris緩沖液、10W/V%的丙二醇、IOOmM 的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸櫞酸鈉。
本發(fā)明制劑主要應(yīng)用于保存基因治療的重組腺病毒，還可應(yīng)用于保存任何野生型 重組腺病毒或其他用途的重組腺病毒。具體地說，包括所有利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的復(fù)制 缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或動物的野生型腺病毒或其突變腺病毒。
采用國際通用的TCID50法檢定的病毒滴度值和紫外法檢定的病毒顆粒數(shù)之比值 (即比活度)來評價本發(fā)明的重組腺病毒的穩(wěn)定性。
本發(fā)明采用TCID50方法測定重組腺病毒滴度，其原理是將經(jīng)過系列稀釋的病毒 樣品感染293細(xì)胞，將每個稀釋度所感染一定數(shù)量的細(xì)胞孔培養(yǎng)10天，在顯微鏡下觀察各 細(xì)胞孔中的細(xì)胞狀況，統(tǒng)計(jì)病變細(xì)胞孔，利用TCID50計(jì)算公式，計(jì)算病毒滴度。
TCID50/ml = 10_[^d(s_0-5)]+b
其中，L 為最低稀釋度的對數(shù)；d 為稀釋對數(shù)之間的差；s 為病變陽性孔比率之 和；b 為病毒接種量，換算為每毫升體積的倍數(shù)的對數(shù)。
本發(fā)明采用分光光度法檢測腺病毒的顆粒數(shù)，其原理是理論上，野生型5型腺病 毒的成分是87%蛋白質(zhì)和13%DNA。因此，腺病毒顆粒的濃度可直接用紫外分光光度計(jì) 測量。蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸殘基在277nm處有紫外吸收，而雙鏈線性DNA在^Onm有 最大吸收值。本法采用含有0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)的制劑緩沖液，將病毒衣殼分 解成蛋白質(zhì)和DNA，再利用雙鏈線性DNA在260nm處具有最大吸收值，在有去垢劑時，顆粒 濃度與^Onm吸光值成比例，用分光光度計(jì)于^Onm處測定供試品的吸光度值，采用公式 (1AU = 1. lX1012VP/mL)計(jì)算病毒顆粒數(shù)。測試病毒顆數(shù)的適用范圍為，供試品病毒顆粒 數(shù)彡 2Χ10"νΡ/ιΛ。
本發(fā)明重組腺病毒穩(wěn)定性的判斷指標(biāo)為比活度，即病毒比活度=病毒滴度/病毒 顆粒數(shù)X 100%。
國家藥品食品監(jiān)督管理局(SFDA)在《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo) 原則》中規(guī)定，臨床重組腺病毒比活度應(yīng)高于3. 3%;張曉志等(《中華醫(yī)學(xué)雜志》，2004年， 第84卷第10期)，在“重組腺病毒臨床級基因治療制品的質(zhì)量控制”中提到，評價腺病毒制 劑的穩(wěn)定性時，制劑中腺病毒的比活度應(yīng)該大于3. 3%。
除非另有說明，本發(fā)明所述百分含量均為重量體積百分比。
本發(fā)明所用的對照制劑為“ARCA”，為US 2006/0205080Α, CN200680013299所公開 的通常用于保存腺病毒的制劑緩沖液，包含IOmM的1^化、1%甘氨酸、11111的1%(12、5(%蔗 糖、0. 05%的吐溫-80。
本發(fā)明的重組腺病毒的制備方法可以采用本領(lǐng)域通常的重組腺病毒制備方法所 得，一般來說包括細(xì)胞復(fù)蘇、種子細(xì)胞制備、病毒感染、擴(kuò)增、細(xì)胞裂解、澄清過濾、濃縮換 液、原液制備等過程
本發(fā)明的重組腺病毒制劑的制備方法可以采用本領(lǐng)域通常制備重組腺病毒的方 法，一般來說包括如下步驟將原液進(jìn)行換液、檢測濃度、用配比好濃度的制劑輔料來稀釋、 除菌、分裝得到成品。
本發(fā)明的另一目的在于提供重組腺病毒制劑用于制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的重組腺病毒制劑具有下述優(yōu)點(diǎn)
1)本發(fā)明的重組腺病毒制劑能夠在較高溫度甚至25°C )下保存較高濃度 的重組腺病毒，甚至是濃度高于2E12vp/mL的重組腺病毒。5
2)本發(fā)明的制劑具有很好的穩(wěn)定性，能夠在2_8°C下較長時間內(nèi)保存較高濃度的 重組腺病毒，24個月內(nèi)仍能較好保存2E12vp/mL重組腺病毒。


圖1在2_8°C條件下，2E12vp/mL重組腺病毒保存在本發(fā)明的重組腺病毒制劑中， 在O-M個月的比活度變化，所述的重組腺病毒制劑的組成為，有IOmM的Tris緩沖液、IOff/的丙二醇、IOOmM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸櫞酸鈉。
圖2在2_8°C條件下，本發(fā)明制劑與參比制劑用于保存2E12vp/mL重組腺病毒，其 比活度隨時間的變化情況。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合實(shí)施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方 案，并非限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。
實(shí)施例IdH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響
為了研究pH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響，在25°C條件下，我們研究了 ρΗ6· 8-8. 6范圍內(nèi)，ρΗ值分別為6. 8、7. 2、7. 4、7. 6、7. 8、8. 2、8. 6時，ρΗ值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響。
通過檢測制劑中重組腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了 ρΗ值對制 劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表1。
表IpH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒的藥物制劑，所述制劑含有重組腺病毒、TriS緩沖液、丙二醇和精氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒藥物制劑，所述Tris緩沖液的濃度為 ImM-lOOmM，優(yōu)選為 5mM-50mM，更優(yōu)選為 10mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒制劑，所述丙二醇的濃度為5W/V%-20W/V%，優(yōu) 選為 10W/V% -15W/V%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒制劑，所述精氨酸的濃度為50mM-250mM，優(yōu)選為 100mM-200mM，更優(yōu)選為 150mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的重組腺病毒制劑，所述制劑中還含有抗氧化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組腺病毒制劑，所述的抗氧化劑選自亞硫酸鈉、硫代硫酸 鈉、谷胱甘肽、硫代水楊酸、半胱氨酸鹽酸鹽、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄 糖的任一種或其組合，優(yōu)選為谷胱甘肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組腺病毒制劑，所述谷胱甘肽的濃度為5mM-100mM，優(yōu)選為 10mM-50mM,更優(yōu)選為 20mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的重組腺病毒制劑，所述制劑中還含有抗氧增效劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組腺病毒制劑，所述的抗氧增效劑為枸櫞酸鈉、琥珀酸鈉 或次磷酸鈉的任一種或其組合，優(yōu)選為枸櫞酸鈉。
10.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的重組腺病毒制劑用于制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒的制劑，所述制劑含有重組腺病毒、Tris緩沖液、丙二醇和精氨酸；另外，制劑還可以含有抗氧化劑如亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、硫代水楊酸、半胱氨酸鹽酸鹽、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一種或其組合；該制劑還可以含有抗氧增效劑為枸櫞酸鈉、琥珀酸鈉或次磷酸鈉的任一種或其組合。本發(fā)明制劑可以在2-8℃長期保存重組腺病毒。
文檔編號A61K48/00GK102028954SQ20091016781
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者楊艷艷, 郭勇 申請人:成都康弘生物科技有限公司