專利名稱：一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥研究領(lǐng)域,具體說(shuō)是涉及了一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法 及其用途。
背景技術(shù)：
百合為百合科植物巻丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium brownii var.或細(xì)葉百合 LiliumpmnilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神的功能，所含的百合皂甙為 其主要成分之一，但傳統(tǒng)方法分離得到的純度遠(yuǎn)低于50%，所得到的物質(zhì)除含有百合皂甙外， 絕大多數(shù)成分均是其它物質(zhì)，由于成分繁多，再加上許多成分的理化性質(zhì)相近，不使用特殊 手段很難將百合皂甙與其它成分分開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提高從百合中提取百合皂苷的純度，具體地 說(shuō)是用大孔樹(shù)脂從百合中提取純化百合皂苷的方法，及其所得到的百合提取物的用途，所得 到的含有百合皂苷的百合提取物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的癥狀的作用， 可用于人類抑郁癥的治療，以克服上述的不足。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特點(diǎn)在于
(1) 將百合制備成含有百合總皂苷的粗提物；
(2) 將百合粗提物通過(guò)填充有大孔樹(shù)脂的層析柱，用洗脫劑洗脫，收集洗脫部分，回 收洗脫劑，收取所得百合提取物，即得；
所述大孔樹(shù)脂為聚苯乙烯樹(shù)脂型大孔樹(shù)脂；所述大孔樹(shù)脂的型號(hào)是D101、SA40、HP20、 SP825、 XAD16、 XDA1、 XDA5、 LX18、 AB8、 LSA7中的一種或兩種以上的混合物；所用洗脫劑 為極性溶劑；所用洗脫劑為水和5 20BV乙醇；含有所述百合總皂苷的粗提物由下述方法 制備而成取百合藥材，用6 10倍量65% 95%乙醇70 90匸提取，濃縮或回收乙醇，得 濃縮液或繼續(xù)干燥得膏粉即得；將百合粗提物通過(guò)填充有大孔樹(shù)脂的層析柱，載樣重量比以
樹(shù)脂生藥計(jì)為0.1: 1 2:1,上樣濃度以生藥溶液重量體積比計(jì)為0. 01: 1 1: 1,
流速為1 10ml/min，用蒸餾水和乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，回收乙醇，收取所得百合 提取物，即得；百合總皂苷提取物用于制備治療抑郁癥的藥物。
有益效果本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提高從百合中提取百合皂苷的純度，使用本發(fā) 明方法制備百合皂甙方法便捷，純度可達(dá)到50%以上，成本低廉，并且易于實(shí)施，所得到的 含有百合皂苷的百合提取物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的癥狀的作用，可用 于人類抑郁癥的治療。


圖1是本發(fā)明百合總皂苷透過(guò)曲線圖2是本發(fā)明大孔樹(shù)脂吸附百合總皂苷梯度洗脫曲線；
圖3是本發(fā)明百合提取物對(duì)模型大鼠體重變化的影響曲線圖4是本發(fā)明百合提取物對(duì)模型大鼠耗食量變化的影響曲線圖
具體實(shí)施方式
-
一、將百合制備成含有百合總皂苷的粗提物
精密稱取百合藥材10.0g，分別加入10倍量8056乙醇7(TC回流提取3次，每次3h,合 并濾液，定容至500ml，合并濾液用相應(yīng)溶劑定容至500ml,精密吸取lOml蒸干，用水10ml 溶解，正丁醇15ml萃取，回收正丁醇至干，用甲醇10ml溶解，精密吸取lml蒸干，香草醛 -冰醋酸法，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。另精密吸取25ml置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中按(中 國(guó)藥典2005年版I部，附錄X A)浸出物的干燥方法操作，計(jì)算總皂苷浸出率及總皂苷純度。 結(jié)果見(jiàn)表l。
表1提取工藝試驗(yàn)結(jié)果01=6)
編號(hào)藥材重(g)總皂苷浸出 率 (%)總皂苷浸出 總皂苷純度 率 (％) 平均值(％)總皂苷純度 平均值(％)
110. 00111. 2221.39
210. 00231.2522. 43
310. 00051.2121.85 1.2321.79
410. 00041.2421.45
510.00121.2321.58
610.00181. 2322. 04
二、大孔樹(shù)脂純化工藝 1、大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理
裝柱前清洗設(shè)備及管道，以防有害物對(duì)樹(shù)脂的污染，并排凈設(shè)備的水。先在樹(shù)脂內(nèi)加入
相當(dāng)于裝填樹(shù)脂體積0.4 0.5倍的乙醇，然后將樹(shù)脂投入柱中,使其液面高于樹(shù)脂層0. 3m，浸泡24h。用2BV乙醇，以2BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡4 5h。用乙醇，以2BV/h的 流速通過(guò)樹(shù)脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，并以水按同樣的流速洗凈乙醇。樹(shù)脂 連續(xù)運(yùn)行中不必再進(jìn)行預(yù)處理，停止運(yùn)行過(guò)長(zhǎng)時(shí)間時(shí)應(yīng)考慮重新預(yù)處理。停止前要充分解吸、 洗靜，并以大于10。/。的NaCl的溶液浸泡，以免細(xì)菌污染樹(shù)脂。 2 、樣品溶液的制備
稱取百合藥材，按上述優(yōu)選的乙醇提取工藝進(jìn)行提取，濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇至 無(wú)醇味。加10倍量水混懸，高速離心，減壓抽濾。濾液另保存，備用。(濃度以生藥量計(jì)為 0. lg/m])
實(shí)施例l: 一、將百合制備成含有所述中藥有效成分的粗提物
精密稱取百合藥材10.0g，分別加入10倍量8(F。乙醇7(TC回流提取3次，每次3h，合 并濾液，定容至500ml，合并濾液用相應(yīng)溶劑定容至500ml，精密吸取10ml蒸干，用水10ml 溶解，正丁醇15ml萃取，回收正丁醇至干，用甲醇10ml溶解，精密吸取lml蒸干，香草醛 -^醋酸法，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。另精密吸取25ml置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中按(中 國(guó)藥典2005年版I部，附錄XA)浸出物的干燥方法操作，計(jì)算總皂苷浸出率及總皂苷純度。 結(jié)果見(jiàn)表1。
表1提取工藝試驗(yàn)結(jié)果(F6)
編號(hào)藥材重(g)總皂苷浸出 率 (%)總皂苷浸出 率 平均值(％)總皂苷純度 (%)總皂苷純度 平均值(％)
110.00111.2221. 39
210.00231.2522. 43
10. 00051.211.2321.8521. 79
410.00041. 2421.45
510.00121.2321.58
610.00181.2322. 04
二、大孔樹(shù)脂純化工藝
1大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理
裝柱前清洗設(shè)備及管道，以防有害物對(duì)樹(shù)脂的污染，并排凈設(shè)備的水。先在樹(shù)脂內(nèi)加入
相當(dāng)于裝填樹(shù)脂體積0.4 0.5倍的乙醇，然后將樹(shù)脂投入柱中，使其液面高于樹(shù)脂層0. 3m, 浸泡24h。用2BV乙醇，以2BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡4 5h。用乙醇，以2BV/h的 流速通過(guò)樹(shù)脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，并以水按同樣的流速洗凈乙醇。樹(shù)脂連續(xù)運(yùn)行中不必再進(jìn)行預(yù)處理，停止運(yùn)行過(guò)長(zhǎng)時(shí)間時(shí)應(yīng)考慮重新預(yù)處理。停止前要充分解吸、 洗靜，并以大于1(^的NaCl的溶液浸泡，以免細(xì)菌污染樹(shù)脂。 2樣品溶液的制備
稱取百合藥材，按上述優(yōu)選的乙醇提取工藝進(jìn)行提取，濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇至 無(wú)醇味。加10倍量水混懸，高速離心，減壓抽濾。濾液另保存，備用。(濃度以生藥量計(jì)為 0. lg/ml) 3純化工藝試驗(yàn)
精密稱取處理好的AB-8型樹(shù)脂(相當(dāng)于干樹(shù)脂2. 0g)，精密吸取樣品液40ml (0. 10g生 藥/ml)上柱，流速控制在2ml/min，吸附完全后，依次用10BV蒸餾水和20BV8(^乙醇洗脫， 收集80%乙醇洗脫部分，定容后依法測(cè)定總皂苷含量。另精密吸取一定量置干燥至恒重的蒸 發(fā)皿中，按(中國(guó)藥典2005年版I部，附錄XA)浸出物的干燥方法操作，測(cè)定浸膏的重量， 計(jì)算百合提取物純度，結(jié)果見(jiàn)表l。
表1純化工藝試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
實(shí)驗(yàn)號(hào)百合提取物純度(％)平均值(％)RSD (%)
167. 56
268.48
367. 92
67. 951.32
467. 36
566. 95
669. 46
實(shí)施例l:
按表2試驗(yàn)號(hào)采用不同試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，每次精密稱取百合藥材10. Og。
表2試驗(yàn)方法 提取溫度 溶媒倍量 提取時(shí)間 提取次數(shù)
試驗(yàn)號(hào)
(。C) (BV) (h)
1 70 6 1 1
2 70 8 2 2
3 70 10 3 3
4 80 6 2 36 80 10 1 2
7 90 6 3 2
8 90 8 1 3
9 90 10 2 1
合并濾液，用相應(yīng)溶劑定容至500ml，精密吸取10ml蒸干，用水10ml溶解，正丁醇15ml 萃取，回收正丁醇至干，用甲醇10ml溶解，精密吸取lml蒸干，香草醛-冰醋酸法，于540nra 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。另精密吸取25ml置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，按(中國(guó)藥典2005年版I 部，附錄X A)浸出物的干燥方法操作，計(jì)算總皂苷浸出率及浸膏得率。結(jié)果下表。
表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)號(hào)總皂苷浸出率(%)浸膏得率(%)
10. 479. 65
20. 569. 12
30. 7921. 75
40. 5812. 12
50. 6412. 62
60. 3615.25
70. 4614. 00
80. 3910. 87
90.6110.87
實(shí)施例2:
精密稱取百合藥材10. 0g，分別加入10倍量65%, 80%和95%乙醇7(TC回流提取3次， 每次3h，合并濾液用相應(yīng)溶劑定容至500ml，精密吸取10ml蒸干，用水10ml溶解，正丁醇 15衛(wèi)1萃取，回收正丁醇至干，用甲醇10ml溶解，精密吸取lml蒸干，香草醛-冰醋酸法，于 540nra波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。另精密吸取25ml置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，按《中國(guó)藥典》(2005 年版I部附錄XA)浸出物的干燥方法操作，計(jì)算總皂苷浸出率及總皂苷純度。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4不同乙醇濃度浸提總皂苷(n=6)
乙醇濃度(％) ii 總皂苷浸出(％) 17T^總皂苷純度(％) 8.50 21.39 38.54
實(shí)施例3:
精密稱取已處理好的DlOl、 SA40、 HP20、 SP825、 XAD16、 XDA1、 XDA5、 LX18、 AB8、 LSA7 樹(shù)脂各2.0g，分別進(jìn)行如下試驗(yàn)-
將以上樹(shù)脂分別置100ml錐形瓶中，精密加入樣品液20ml，搖床振搖24h，使達(dá)到飽和 吸附，濾過(guò)，濾液精密定容至適當(dāng)體積，測(cè)定總皂苷含量。將過(guò)濾后的樹(shù)脂另置100ml錐形 瓶中，精密加入9596乙醇50ml，搖床振搖24h，濾過(guò)，濾液定容，稀釋后測(cè)定總皂苷的含量。 按下式計(jì)算每一種樹(shù)脂靜態(tài)飽和吸附率及靜態(tài)洗脫率。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 IO種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)飽和吸附率和洗脫率結(jié)果
樹(shù)脂類型飽和吸附率(％)洗脫率《)
D1010.7313150.902488
SA400.7990360.937238
HP200.9162790.515517
SP8250.9154330.828858
XAD160.9188190.469562
XDA10.8752230.733141
XM50.8866510.866902
LX180.8185060.887365
AB80.8599860.985654
LSA70.9213580.788307
注吸附容量=(樣品液總皂苷量-未吸附量)/干樹(shù)脂重(mg/g干樹(shù)脂)
飽和吸附率(％)=(樣品液總皂苷量-未吸附量)/樣品液總皂苷量xlOO呢 洗脫率(％)=解吸附量/(樣品液總皂苷量-未吸附量^100%
實(shí)施例4:
稱取大孔樹(shù)脂5g，濕法裝柱，上樣，濃度為0. lg生藥/ml，用20ml刻度試管接漏出液， 每10ml裝1試管，接20管，取lOinl測(cè)定總皂苷的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1百合總皂苷透過(guò)曲線圖。
實(shí)施例5:
精密稱取處理好的AB-8型樹(shù)脂(相當(dāng)于干樹(shù)脂約10. Og)，精密吸取樣品液60ml上柱， 流速控制在lml/min，吸附完全后，依次用蒸餾水200ml、 10%—乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各100ml梯度洗脫。蒸餾水洗脫液先收集50ml2份，25ml4份，10%乙醇，30% 乙醇，50%乙醇，70%乙醇、95%乙醇分別收集25ml4份。依法測(cè)定百合總皂苷濃度，以容量 瓶編號(hào)為橫坐標(biāo)(X)，總皂苷濃度為縱坐標(biāo)(Y)繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖2大孔樹(shù)脂吸附百合 總皂苷梯度洗脫曲線。 實(shí)施例6:
精密稱取處理好的AB-8型樹(shù)脂(相當(dāng)于干樹(shù)脂約5.0g),精密吸取樣品液20ml上柱，流 速控制在lml/min，吸附完全后，依次用蒸餾水洗脫至無(wú)還原糖反應(yīng)，分別用100ml80%、 95% 乙醇洗脫。依法測(cè)定百合總皂苷濃度，結(jié)果見(jiàn)表6。
表680%乙醇與95%乙醇洗脫結(jié)果
洗脫乙醇濃度洗脫率(％)純度(％)
8078. 8767. 73
9582, 1762. 17
實(shí)施例7:
稱取處理好的AB-8型樹(shù)脂3份(相當(dāng)于干樹(shù)脂10. Og ),濕法裝柱，精密吸取樣品液60ml ， 以]ml/min流速上柱。吸附完全后，收集過(guò)柱液，分別以100ml， 150ml， 200ml蒸餾水洗脫， 然后分別用50%乙醇200ml (腦ml，50ml，50ml)依次洗脫，流速控制在2ml/min，按100 ml,50ml，50ml分3份收集。各部分洗脫液稀釋，定容后依法測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算各部分總 皂苷的比例。另精密吸取80y。乙醇100ml洗脫部分50ml置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，按(中國(guó) 藥典2005年版I部，附錄X A)浸出物的千燥方法操作，測(cè)定浸膏的重量，計(jì)算總皂苷純度。 結(jié)果見(jiàn)表7。
表7洗脫溶媒不同體積試驗(yàn)結(jié)果
水洗脫100ml 水洗脫150ml 水洗脫200ml
總皂苷 (mg)總皂苷 比例(％)總皂苷 含量 (mg)總皂苷 比例(％)總皂苷 含量 (mg)總皂苷 比例(％)
水洗6. 0907.9799. 603
醇洗100ml19.73175.4717.59075. 6515. 40574. 79
醇洗50ml4. 09515. 662.88312. 402. 63912.81
醇洗50ml2. 3148. 862. 77711.942. 55112.38100ml浸膏重 29.100 25.495 22.230
100ral皂苷純度
67. 80 68. 9969. 29
(%)
實(shí)施例8:
稱取處理好的AB-8型大孔樹(shù)脂6份(相當(dāng)于干樹(shù)脂2.0g),濕法裝柱，準(zhǔn)備 0. 32g/ml' 0. 16g/ml, 0. 08g/ml3種濃度的樣品液，各2份(均含總皂苷67. 59mg)上柱，完 全吸附后，樣品液濃度相同的樹(shù)脂柱按2種流速(lml/min、 3ml/min)進(jìn)行洗脫，用蒸餾水 洗脫至無(wú)還原糖反應(yīng)后，用20BV80。/。乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，依法測(cè)定總皂苷含 量。另精密吸取一定量置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，按(中國(guó)藥典2005年版I部，附錄XA) 浸出物的干燥方法操作，測(cè)定浸膏的重量，計(jì)算百合提取物得率及純度，結(jié)果見(jiàn)表8。
表8不同樣品液濃度及洗脫流速試驗(yàn)結(jié)果
濃度0. 32g/ml濃度0. 16g/ml濃度0. 08g/ml
lml/min3ml/minlml/min3ml/minlml/min3ml/min
樣品液總皂(mg)67. 5967. 5967. 5967. 5967. 5967. 59
洗脫液總皂(mg)48.6252. 5548. 5651.5048.4450, 79
總浸膏重(mg)72.6078. 5872.4876. 9572.3075. 85
百合提取物得率 (%)71.9277. 1571.8476. 1871.6675. 14
百合提取物純度 (%)66.9766. 8867.0066. 9267.0066. 96
注百合提取物得率(％)=洗脫液總皂苷/樣品液總皂苷^100%
實(shí)施例9:
百合提取物對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的影響 實(shí)驗(yàn)一 百合提取物對(duì)模型大鼠行為學(xué)的影響 1動(dòng)物
SD大鼠雄性，體重220-270g。 2方法 2.1模型制備
對(duì)照組按7只/籠,正常飲食飲水，不給任何刺激。其他五組，每籠1只伺養(yǎng)，參照Wilhier的方法,以慢性不可預(yù)見(jiàn)性的溫和刺激，配合孤養(yǎng),7種應(yīng)激因子按隨機(jī)方法在21 d內(nèi)應(yīng)用:①晝 夜顛倒(24 h );②禁食(24 h );③禁水并接受21天長(zhǎng)期應(yīng)激剌激，包括3次24小時(shí)禁食，3 次24小時(shí)禁水，3次通宵照明，3次4'C冷水游泳5分鐘，3次45'C烘箱熱烘5分鐘，3次1
分鐘夾尾，3次30分鐘高速水平振蕩。每天隨機(jī)給予一種刺激。 每種應(yīng)激的操作方法
(l)禁食24小時(shí)斷料；(2)禁水24小時(shí)斷水；(3)照明于早7: 00時(shí)將動(dòng)物放入晝夜 顛倒箱中，不開(kāi)燈使動(dòng)物處于黑暗狀態(tài)；至晚19: 00時(shí)將晝夜顛倒箱的日光燈打開(kāi)，使動(dòng) 物處于光照狀態(tài)，直至次日早7時(shí)取出；(4)冷水游泳將動(dòng)物放入盛有4'C冷水的桶中(水 深15cm)，大鼠的后足尖剛能觸及桶底，5分鐘后將動(dòng)物取出放回籠中；(5)熱烘烘箱溫度 調(diào)至45'C恒定，將動(dòng)物放入烘箱中，5分鐘后將動(dòng)物取出；(6)夾尾將大鼠放入固定籠中， 露出尾部，用止血鉗夾住距尾尖lcm處(用力不要過(guò)大，使大鼠發(fā)出哀叫聲即可)持續(xù)l分 鐘后，將大鼠拉出放回籠中；(7)振蕩將大鼠放入振蕩器中，高速水平振蕩30分鐘后取出。 2.::給藥方法
造模的同時(shí)，大鼠每天灌胃給藥。正常組、模型組灌胃蒸餾水，氟西汀組灌胃氟西汀 2mg/kg，相當(dāng)于60kg體重成人一日量的IO倍；百合提取物大劑量組灌胃48mg/kg，相當(dāng)于 60kg體重成人一日量的20倍，百合提取物中劑量組灌胃24 mg/kg，相當(dāng)于60kg體重成人一 日量的10倍，百合提取物小劑量組灌胃12mg/kg，相當(dāng)于60kg體重成人一日量的5倍。 2.2體重增長(zhǎng)值
第O周、第1周、第2周、第3周分別稱取各組大鼠的體重，以大鼠體重增長(zhǎng)值為指標(biāo) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，即體重增長(zhǎng)值=各大鼠第3周天體重-第O周體重。 2.3耗食量增長(zhǎng)值
第0周、第1周、第2周、第3周各組分別于大鼠斷食后第2日測(cè)耗食量，具體方法-. 每只大鼠給予定量的鼠糧，24h后稱剩余鼠糧的重量，耗食量=給予量-剩余量。 2.3糖水消耗實(shí)驗(yàn)
第O周、第1周、第2周、第3周分別于大鼠禁水后第2d測(cè)定大鼠蔗糖水飲用量，第3 周同時(shí)測(cè)定大鼠清水飲用量，具體方法為讓各組動(dòng)物任意飲用兩瓶不同的水其中一瓶為 含1%的蔗糖的自來(lái)水、 一瓶為自來(lái)水。測(cè)試4: 00PM至第二天8: OO自來(lái)水和蔗糖水的飲 用量(通過(guò)稱飲水瓶重量)，以蔗糖偏嗜度(sucrose preference)(蔗糖偏嗜度(％)=蔗糖水飲用量/ (蔗糖水飲用量+自來(lái)水飲用量))作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，比較各組蔗糖偏嗜度(％)的變化。
2.4敞箱試驗(yàn)(Open field)
第22d，大鼠進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)。所用敞箱〔自制)為高40cm、長(zhǎng)寬均為80cm，內(nèi)空的立 柱體，周壁為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。將單只大鼠置于光潔敞箱中央， 以動(dòng)物穿越地面方塊數(shù)作為水平活動(dòng)得分，以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分，同時(shí)觀測(cè)大鼠在中 央格停留時(shí)間、及糞便粒數(shù)，每只動(dòng)物僅進(jìn)行一次測(cè)定，每次3分鐘。 3結(jié)果
3.1體重增長(zhǎng)值的變化
表9一1 百合提取物對(duì)模型大鼠體重變化的影響
組別動(dòng)物數(shù)第o周第l周第2周第3周體重增長(zhǎng)值
正常組10262.7±22.5307.4±21.9314.2±19.5334.3±20.971.6±24.7
模型組10261.2±23.8283.5±23.3*295.8±24.7279.3±22.9"17.1土19.2"
氟西汀組10258.7±23.8268.5±19.7284.6±16.4290.3±27.232.2±9.8*
百合提取物大劑量組10259.3±23.1285.3土25.7291.4±23.3301.0土23.r41-7士15.8**
百合提取物中劑量組10259.1±21.9280.4±23.2288.7±19.2298.5士20.839.4士10.3"
百合提取物小劑量組10260.3±22.4280.7±25.12卯.2±32.8301.2±27.038.1±9.6"
A與正常組相比:P<0.05， AA與正常組相比:P<0.01; '與模型組相比:PO.05,"與模型組相比P<0.01。 注體重單位g
從表9一1可以看出，模型組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，與正常組相比，有顯著性差異(PO.Ol.): 百合提取物組能改善模型組的體重增長(zhǎng)緩慢，體重增長(zhǎng)值明顯高于模型組，與模型組相比， 有極顯著性差異(P<0.01):陽(yáng)性藥氟西汀也能增加模型大鼠的體重增長(zhǎng)，但不如百合提取物 明顯，可能與它的胃腸道反應(yīng)的副作用有關(guān)。
圖3可以看出，正常組大鼠體重不斷的增長(zhǎng)，模型組大鼠體重第1周、第2周緩慢增長(zhǎng)， 第3周體重較第2周有所下降，說(shuō)明抑郁模型大鼠較正常大鼠體重減輕百合提取物組大鼠 體重也不斷增長(zhǎng)，但增K幅度不如正常組此外，陽(yáng)性藥氟西汀組大鼠體重第1周增長(zhǎng)不明 顯，第2周、第3周體重有所增長(zhǎng)，提示，百合提取物能明顯改善抑郁模型大鼠的體重增長(zhǎng)，并呈一定的劑量依賴性。 3.2耗食量增長(zhǎng)值的變化
表9—2 百合提取物對(duì)模型大鼠耗食量變化的影響
組別動(dòng)物數(shù)第o 周第l周第2周第3周增長(zhǎng)值
正常組1015.5±4.217.5±6.119.9±19.527.5±3.012.0±4.9
模型組1015.2±2.516.6±8.117.9±6.119.4±5.34.2士7.2"
氟西汀組1016.6±3.716.1±6.018.4±3.624.7±2.68.8±3.9+
百合提取物大劑量組1016.0±1.816.0±3.622.0±2.529.8±4.013.8±5.廣
百合提取物中劑量組1015.9±4.218.2±5.221.2±3.629.3±3.413.4士5.(T
百合提取物小劑量組1016.6士2.619.0±3.221.U3.526.8±2.410.3士3.(T
A與正常組相比:PO.05,AA與正常組相比PO.01;
'與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比PO.Ol。 注耗食量單位g
從表9一2、圖4百合提取物對(duì)模型大鼠耗食量變化的影響曲線圖；可以看出，模型組大 鼠耗食量增長(zhǎng)緩慢，與正常組相比，耗食量增長(zhǎng)值有顯著性差異，PO.Ol，百合提取物能改
善模型大鼠耗食量增長(zhǎng)緩慢，耗食量增長(zhǎng)值與模型組相比，有極顯著性差異，PO.01;陽(yáng)性
藥氟西汀也能改善模型大鼠耗食量增長(zhǎng)緩慢，但效果不及百合提取物顯著。
結(jié)合百合提取物對(duì)模型大鼠體重變化的影響，可以得出，百合提取物可以增加抑郁模型
大鼠的耗食量，從而增加模型大鼠的體重；陽(yáng)性藥氟西汀增加耗食量不及百合提取物，從而
使抑郁模型大鼠的體重增加也不及百合提取物。
3.3糖水消耗實(shí)驗(yàn)
表9一3 百合提取物對(duì)模型大鼠糖水消耗量變化的影響
組別 動(dòng)物 第0周第l周 第2周 第3周 增長(zhǎng)值 數(shù)
正常組 10 78.8±10.7 85.7±10.0 81.4±4.4 92.6±4.9 13.8±12.1
模型組 10 75.3±21.5 79.0±26.5 61.5±19.2AA 66.1±14.9AA -10.4±19.6
氟西汀組 10 74.6±20.4 74.5±32.3 71.0±15.6 75.8±2.8 1.2±20.6百合提取物大劑量 10 76.8±25.0 87.4±30.2 77.5±13.4:
組
百合提取物中劑量 10 73.6±20.8 85.0±20.3 78.0±6.8"
組
百合提取物小劑量10 72.1±0.870.0±2.2 75.4±12.1'
組
A與正常組相比:P<0.05，"與正常組相比PO.01; '與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比PO.Ol。 注消耗糖水單位ml
表9一4 百合提取物對(duì)模型大鼠糖水偏嗜度的影響
組別動(dòng)物數(shù)糖水偏嗜度
正常組100.84±0.040
模型組100.75±0.065AA
氟西汀組90.84±0.043'*
百合提取物大劑量組100.863士0.099"
百合提取物中劑量組100.859士0.035"
百合提取物小劑量組90.833±0細(xì)"
A與正常組相比:PO.05, AA與正常組相比:p〈謹(jǐn); '與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比P<0.01。 注消耗糖水單位ml
從表9一3可以看出，模型組大鼠糖水消耗量從第2周開(kāi)始減少，糖水消耗增長(zhǎng)值與正
常組相比，有極顯著性差異，百合提取物有改善該癥狀的作用，但由于增長(zhǎng)值標(biāo)準(zhǔn)差較大， 除—ff合提取物小劑量外，結(jié)果無(wú)顯著性差異。
從表9一4糖水偏嗜度可以看出，模型組大鼠較正常組大鼠糖水偏嗜度降低，提示，模 型組大鼠已無(wú)喝糖水時(shí)的快感，有抑郁癥狀，百合提取物能明顯改善這種癥狀，并呈一定的 量效關(guān)系。 3.4敞箱實(shí)驗(yàn)
表9一5 百合提取物對(duì)模型大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)的影響
82.5±19.1 5.7±31.3 78.5±14.3* 4.9±20.4 88.3±7.9" 16.2±7.9組別 動(dòng)物 水平運(yùn)動(dòng)(次)垂直運(yùn)動(dòng)(次)排便粒數(shù)(粒)中央格停留時(shí)間
數(shù) (S) 正常組 7 模型組 6 氟西汀組 7 百合提取物大劑6 量組
百合提取物中劑5 量組
百合提取物小劑6 量組
A與正常組相比P<0.05， AA與正常組相比PO.01; '與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比P<0.01。
從表9—5可以看出，敞箱實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)、排便粒數(shù)均減少， 中央格停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與正常組相比，有極顯著性差異，百合提取物大劑量能明顯增 加模型大鼠的水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)、排便粒數(shù)，并能縮短中央格停留時(shí)間，與模型組相比， 有顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)二百合提取物對(duì)模型大鼠COR、 ACTH的影響 1材料 1.1試劑
水合氯醛天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20080118。 C()R放免試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)080520。 ACTH放免試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)080520。 1.2儀器
SN-695B型放免y測(cè)量?jī)x上海日環(huán)儀器一廠。 2方法
2.]血清COR的測(cè)定
大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，2ml放入未加抗凝劑的4ml離心管中，3000rpm 4c離心10min，
29.1±9.2 7.7±3.6
8.0士8.6" 2.2±2.1
18.5±6.2* 5.2±3.3
21.3士9.5' 5.9±3.2'
18.0±1.9 4.5±3.6
16.7±11.4 3.7±3.0
2.1±1.5 22±0.8
0.7士0.9" 5.5±2.3
1.7±0.5 2.4±2.1'
2.3±1.2" 1.6±0.7:
2.0±1.0' 1.7±1.1'
1.8±0.8' 1.9±1.3'取上清移入1.5ml離心管，-20°。保存，放免法測(cè)定大鼠血清COR的含量。 2.::血漿ACTH檢測(cè)
大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，3ml放入加10%EDTA-Na2+30ul，抑肽酶30ul的4ml離心 管中，3000rpm4c離心10min，取上清移入1.5ml離心管中，.2(TC保存，放免法測(cè)定大鼠血 漿ACTH的含量。 3結(jié)果
3.1百合提取物對(duì)模型大鼠血清COR的影響
表9—6百合提取物對(duì)模型大鼠COR的影響
組別動(dòng)物數(shù)COR(nmo1/1)
正常組923.4±6.3
模型組840.7士6.8"
氟西汀組831.6±5.4"
百合提取物大劑it組29.5±7.8
百合提取物中劑it組629.2±6.3**
百合提取物小劑it組730.0±6.9**
A與正常組相比:P<0.05，"與正常組相比PO.01; *與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比PO.Ol。
結(jié)果顯示，模型組大鼠血清COR水平明顯增高，與正常組相比，有顯著性差異，PO.Ol， 百合提取物能降低模型大鼠的血清COR水平，與模型組相比，有顯著性差異，PO.01;陽(yáng) 性藥氟西汀也能降低模型大鼠血清COR水平。 3.2.百合提取物對(duì)模型大鼠血漿ACTH的影響
表9一7百合提取物對(duì)模型大鼠ACTH的影響
組別
動(dòng)物數(shù) ACTH(pg/ml)
正常組 6
模型組 6
氟西汀組 7
百合提取物大劑量組 7
百合提取物中劑量組 7
33.0±9.1
84.4士15.9"
67.0±5.8**
60.2±10.6**
64.5±15.廣百合提取物小劑量組 6 65.6±8.廣
A與正常組相比:P<0.05， ^1與正常組相比:PO.01; '與模型組相比:PO.05,"與模型組相比:PO.Ol。
結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿ACTH水平明顯增高，與正常組相比，有顯著性差異，PO.Ol， 百合提取物能降低模型大鼠的血漿ACTH水平，與模型組相比，有顯著性差異，PO.01;陽(yáng) 性藥氟西汀也能降低模型大鼠血槳ACTH水平。
實(shí)驗(yàn)三百合提取物對(duì)模型大鼠CRFmRNA、 GRmRNA、 MRmRNA表達(dá)的影響 1材料 U試劑
TRNzol-A+總RNA提取試劑TIANGEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)G5411。 DEPC: AMRESCO，批號(hào)071210。
EB替代染料北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)D1210。
DNA Marker: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)G6207。
R Nasin: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED，批號(hào)H6312 。
5-First strand Buffer: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)H6121 。
DTT: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)H6118。
Rnase-freeddH20: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)G6206。
dNTP Mixture: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)G5723。
Transcript MMLV: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)H6227。
Oligo(dT): TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)G5418。
2 Taq PCR Master Mix: TIAN GEN BIOTECH COMPANY LIMITED,批號(hào)H6331。
Tr〗's-base: HOPE公司，批號(hào)080417.
乙二胺四乙酸二鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠批號(hào)20080321。
儀器
01J2003-05型立式壓力蒸汽滅菌筒上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。
恒溫干燥箱上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
FM通風(fēng)柜廣州市雄城泛美科學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。
BCD-215 KAN DL型冰箱青島海爾股份有限公司。LX-100手掌離心機(jī)江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
高速冷凍離心機(jī)1 -15k: sigma公司。
Ct:ristRVC2-18型風(fēng)機(jī)廣州東銳科技有限公司。
BS2002s電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。
V()RTEX-5 QILINBIER渦旋器江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
AL1296 DNA Engine (PCR儀)BIO-RAD公司。
Gene Quant pro (核酸領(lǐng)!j定儀)Amersham bioscience 。
磁力攪拌儀KT/C: IKA公司。
干式恒溫器K300:杭州藍(lán)焰科技有限公司。
EFS301電泳儀Amersham bioscience。
圖像捕獲系統(tǒng)VTLBER LOURMAT0614503: Amersham bioscience。 微波爐PT021 TP-6: Galanz。
1.3實(shí)驗(yàn)器具
移液槍lml、 200ul、 10ul;吸頭lml、 200ul、 20ul;吸頭臺(tái)放置lml吸頭的一個(gè)，放置 200ul和20ul的吸頭一個(gè);EP管1.5ml、 lOOul ;容量瓶1000ml;鹽水瓶100ml; 5ml離 心管(配75%乙醇用)
1.4引物合成TaKaRa Biotechnology (DaLian) Co丄td.
2方法
2.]實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
2丄1塑料制品(包括吸頭、EP管等)將塑料制品逐個(gè)浸泡于196。DEPC水中(必要時(shí)小 槍頭需要用吸管打入DEPC水)37'C過(guò)夜，然后送至高壓，后在80'C烘烤箱中烘干(或置于 37'C中8小時(shí)左右烘干)，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
2丄2玻璃制品(主要是玻璃研磨器)先泡酸過(guò)夜，沖洗干凈后，在"/。。DEPC水中泡8小 時(shí)左右，37。C烘干，用蒙錫紙包裹，24(TC烤4h。
2丄3金屬制品(鑷子等)先洗干凈，用蒙錫紙包裹，24(TC烤4h。(不需要泡DEPC水) 2.2試劑的配制與準(zhǔn)備
2.ZIDEPC水泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制1000ml雙蒸水中加lmlDEPC，放在1000ml 容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。配75X乙醇的DEPC水的配制100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC， 37。C過(guò)夜，送至高壓。
2.2.2 75%乙醇(要在抽提時(shí)現(xiàn)配)用無(wú)水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:無(wú)水乙醇=1:3)， 然后放于-2(TC備用。
2.3總RNA提取
2.3.1大鼠腦組織(測(cè)CRFmRNA取下丘腦，測(cè)GRMRmRNA去海馬)加Trizol后(lOOmg 組織/lml Trizol)，用槍頭充分吹打以使體粘稠，于旋渦混合器蝸旋30s混勻；-20°0放置5分 鐘，使其充分裂解。
2.3.2按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿(預(yù)冷)，于旋渦混合器蝸旋30s混勻；-20°0放置15分鐘。
2.3.3 4。C12000g離心15min。
2.3.4吸取上層水相，至另一個(gè)預(yù)冷的離心管中。
2.3.5加入等體積的異丙醇(預(yù)冷)混勻，室溫放置30min。
2.3.6 4。C12000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。
2.3.7加入75。/。乙醇lml (預(yù)冷)，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀。
2.3.8 4°C 12000g離心5min，盡量棄上清。
2.3.9室溫晾干或用風(fēng)機(jī)吹干。
2.3.10用30ul RNase-free H20溶解RNA樣品。
2.3.11核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度，RNA變性電泳檢測(cè)RNA的完整性。 2.4核酸濃度的測(cè)定
2.4.1吸取5ul RNA樣品，加depc水至100ul混勻后，轉(zhuǎn)入石英比色杯中。 2.4.2先用100ulDEPC水校正零點(diǎn)。
2.4.3樣品測(cè)定，選取RNA的純度在1.5-1.9之間的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)率，即 X260nmA280nm=l .5-1.9 。
2.4.4 RNA變性電泳5S條帶隱約可見(jiàn)，28S和18S條帶明亮，證明提取總RNA的完整性， 且未見(jiàn)基因組DNA污染?？捎糜赗T-PCR實(shí)驗(yàn)。
2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄
2.5.1在冰浴的無(wú)核酸酶的PCR管中加入如下反應(yīng)混合物 l-5ug總RNA;2uloligo(dT); 2uldNTP;
補(bǔ)Nasefree ddH20定容至13.5ul。
2.5.2簡(jiǎn)易離心，7(TC加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，加入以下各組分
4ul5-First strand Buffer;
lul0.1MDTT;
0.5ulRNasin;
lulTRANScript M-MLV。
2.5.3 42。C溫浴45min。
2.5.4 95。C加熱5min終止反應(yīng)。
2.5.5用Nasefree ddH20將反應(yīng)體系稀釋至50ul，取2-5ul進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 2.6引物設(shè)計(jì)、合成
2.6.1引物序列根據(jù)美國(guó)基因生物庫(kù)提供基因核酸序列，用PRIMER 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，
選取G+C含量約50的無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，相互間無(wú)同源序列兩段特異性保守序列，設(shè)計(jì)引物如下
Beta-actin-FP:5-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3
Beta-actin-RP:5陽(yáng)AAT GTC ACG CAC GATTTC CC-3擴(kuò)增片段為263bp。
CRF-FP:5-CAG AAC AAC AGT GCG GGC TCA-3
CRF-RP:5-GGA AAA AGT TAG CCG CAG CCT-3擴(kuò)增片段為365bp。
GR-FP:5-AGA AAC TTA CAC CTG GAT GAC-3
GR-RP:5-TGG AGT TCC CTT CCC TTT T-3擴(kuò)增片段為373bp。
MR-FP:5-TTC TTC CCG CTT CCATCC G-3
MR-RP:5-GGG TCT CCA CGC CAT TCT G-3擴(kuò)增片段為362bp。
2.6.2引物稀釋
首先用dd H20將引物稀釋成100uM的保存液，使用前再稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度10uM，具體方法 為:dd H20的使用量V(nl)=nmol數(shù)*10 2.7 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
2.7.1在冰浴的無(wú)核酸酶的PCR管中加入如下反應(yīng)混合物 上游引物lul下游引物lul
2求Taq酶反應(yīng)體系12.5ul
DNA產(chǎn)物2-5ul
NEsefreeddH20: 5.5-8.5ul
最終使反應(yīng)體系的體積為25ul。
2.7.2在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下
95.0。C:3min
、
95.0。C:30sec
55.0。C:30sec 35 cycles
72.0。C:45sec ' 72.0。C: 5min
2.8電泳分析
2.S.1電泳緩沖液(50*TAE)的配制 雙蒸水 200ml
Tris-base 60.5g 調(diào) 冰乙酸 14.275ml 0.5m/LEDTA 25ml 2.8.2 Loading Buffer的配制 1%溴酚藍(lán) 1.5ml 0.5。/。二甲苯青FF 3ml 0.5mol/LEDTA lOOul 99%甘油 1.5ml 雙蒸水 3.9ml 2.8.3瓊脂糖凝膠的配制
節(jié)PH至8.0， 定容至250ml。
、
共
10ml
乂
稱取瓊脂糖凝膠適量，用TAE配制成1.5M的溶液。
2.8.4用微波爐加熱瓊脂糖凝膠溶液，至凝膠沸騰，重復(fù)2-3次c
2.8.5取出，室溫放冷，加入適量EB替代液，搖勻。
2.8.9澆板，放冷，至凝膠凝固。2.8.10點(diǎn)樣，在電泳槽中進(jìn)行電泳，條件120v， 100mA，電泳40min。 2.8.11用凝膠圖像分析儀采集圖像。
2.8.12圖像分析:ImageMasterTMTotalLab Software軟件分析灰度值,以目的基因與B-actin的
灰度比值進(jìn)行組間比較。
3結(jié)果
3.1總RNA的提取
提取結(jié)果顯示，核酸純度260/280大部分均在1.5-2.0之間。 RNA變性電泳結(jié)果5s條帶清晰，18s、 28s條帶均清晰可見(jiàn)。 3.2各組灰度比值結(jié)果 3.2.1百合提取物對(duì)CRFmRNA表達(dá)的影響
表9一8百合提取物對(duì)模型大鼠CRFmRNA表達(dá)的影響
組別動(dòng)物數(shù)CRF
正常組了0.85±0.09
模型組61.06士0.48"
氟西汀組1.00±0.32*
百合提取物大劑il組0.99±0.16*
百合提取物中劑it組60.99士0.15'
百合提取物小劑lt組50.98±0.32*
A與正常組相比:P<0.05， A^與正常組相比:P〈0.01; *與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比P<0.01。
結(jié)果顯示，模型組大鼠CRFmRNA表達(dá)增高，與正常組相比，有極顯著性差異，百合提 取物能減少CRFmRNA的表達(dá)，與模型組相比，有顯著性差異，氟西汀也能較少CRFmRNA
的表達(dá)。
3.2.2百合提取物對(duì)GR、 MRmRNA表達(dá)的影響
表9一9百合提取物對(duì)模型大鼠GR、 MRmRNA表達(dá)的影響 組別 動(dòng)物 GR MR
數(shù)
正常組 8 1.039±0.07 1.031±0.03模型組 氟西汀組
百合提取物大劑量組
百合提取物中劑量組
百合提取物小劑量組 A與正常組相比:P<0.05， ^4與正常組相比:PO.01; '與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比PO.Ol。
結(jié)果顯示，模型組大鼠GR、 MRmRNA表達(dá)降低，與正常組相比，有極顯著性差異，百 合提取物能增加GR、MRmRNA的表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異，氟西汀也能增加GR、 MRmRNA的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)四百合提取物對(duì)模型大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 1材料 U試劑
5-HT: sigma公司，批號(hào)046k7(B8。
5國(guó)HIAA: sigma公司，批號(hào)046k7059。
鹽酸多巴胺上海晶純?cè)噭┯邢薰?，批?hào)200803051。
L-去甲腎上腺素上海晶純?cè)噭┯邢薰?，批?hào)200805172。
l-庚烷磺酸鈉上海晶純?cè)噭┯邢薰?，批?hào)2008050125。
3， 4-二羥基卞胺上海晶純?cè)噭┯邢薰?，批?hào)200805078。
乙二胺四乙酸二鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080321。
檸檬酸天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080411。 磷酸氫二鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080411。 1.2儀器
EsaC4-926電化學(xué)檢測(cè)器ESA Bioscience Lnc。
2方法
2.]溶液的配制
2丄1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取NE、 DA、 5-HT、 5-HIAA標(biāo)準(zhǔn)品適量，以0.1mol/lHCl 溶解，分別配成濃度為lg/L的儲(chǔ)備液，臨用前用O.l mol/LHCl稀釋濃度為0.019、0.038、0.065、
50.925士0.07"0.877±0.12
61.032士0.04'0.992±0.02
81.005士0.03"1.009±0.03
1.002士0.0r1.007士0.07'
80.973±0.060.987±0.020.3、 0.65、 L25ul/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液。
2丄2蛋白沉淀液的配制取高氯酸溶液和0.01mol/LEDTA溶液適量，用水稀釋為含高氯酸 0.〗mol/L和EDTA0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。
2丄3內(nèi)標(biāo)工作液的配制精密稱取DHBA適量，以蛋白沉淀液溶解配成濃度為3.9mg/L的內(nèi)
標(biāo)工作液。
2.::樣品的處理
取大鼠大腦皮層，加入1000ul蛋白沉淀液和50ul的內(nèi)標(biāo)工作液，冰浴下勻漿，勻漿液于 15300 r/min低溫離心30min，上清液于15000r/min再次低溫離心25min，取上清液，0.22um濾 膜過(guò)濾，進(jìn)樣檢測(cè)。
2.3色譜條件色譜柱為KromasilC18反相柱(150mmX4.6mm， 5um);流動(dòng)相為
75mmol/LNa2HP04: 150 mmoL/L枸櫞酸0.1 mol/LEDTA: 150mmol/LB7:甲醇水
80: 40: 2: 7: 32: 89，使用前經(jīng)O. 45u m微孔濾膜過(guò)濾2次，并超聲脫氣20min;流速為1.'0
ml/min;柱溫:室溫。電化學(xué)檢測(cè)為玻璃工作電極，Ag/AgCl參比電極，工作電壓為+0.25V。
進(jìn)樣量15ul。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將NE、 DA、 5-HT、 5-HIAA的各濃度標(biāo)準(zhǔn)液lml分別加入50ul的內(nèi)標(biāo)工作也，0.22um的
濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣15ul，以各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為
橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表9一10。
表9一10單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍 神經(jīng)遞回歸方程 相關(guān)系數(shù) 線性范圍
質(zhì)
DA Y=0.0032X+0.0558 0.9998 15.58-1025
C ng/ml)
NE Y=0.003X+0.02120.9995 14.82-975
(ng/ml)
5-HIAA Y=0.0052X+0.0284 0.9996 22-1760
(ng/ml)
5-HT Y=0.0044X-0.021 0.9998 11.4-750
Cng/ml)2.5精密度實(shí)驗(yàn)
以DA為例，連續(xù)進(jìn)樣5次，以DA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算RSD，結(jié)果，RSD 為2.16%， <3%，說(shuō)明儀器精密度良好。 2.6提取回收率實(shí)驗(yàn)
稱取適量的大腦皮層，加入內(nèi)標(biāo)，加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品處理方法處理，以此為分 子，稱取適量的大腦皮層，加入內(nèi)標(biāo)，按樣品處理方法處理，得到的上清液加入等量的標(biāo)準(zhǔn) 品，以此為分母，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表9一11。
表9一11提取回收率實(shí)驗(yàn)
神經(jīng)遞質(zhì)加入量(ng)回收率(％)
DA192.6
95.2
1096.3
NE193.0
94.8
1098.5
5-HIAA191.4
96.5
1099.8
5-HT193.4
96.3
1098.2
2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
取同一大鼠的大腦皮層，平均分成3份，按樣品處理方法處理，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 顯示，RSd DA=2.56%， NE=1.63%， 5-HIAA=2.28%， 5-HT=3.27%，均<5.0%，說(shuō)明該方法 重復(fù)性良好。
2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取已處理好的樣品，分別在0、 12h、 24h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9一12。
表9—12神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(單位ng/ml/g)神經(jīng)遞質(zhì)Oh12h24h
DA124.6212122.064454.57871
NE204.0404124.1638121.5152
5國(guó)HIAA623.9669575.0689560.1697
5-HT113.519892.0163240.12349
從表9—12可以看出，神經(jīng)遞質(zhì)制成樣品后不穩(wěn)定，最好在12h測(cè)完。 2.9樣品測(cè)定
表9一13各組神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定結(jié)果(單位ng/ml/g)
組別動(dòng)物數(shù)DANE5-HIAA5-HT
正常組685.4±25.5172.7±37.9122.3±56.3109.1±33.4
模型組652.0±11.4A132.8±67.5227.8±101.1A55.8±20.9A
氟西汀組681.6±19.9*181.5±66.6181.5±66.5107.7±19.5*
百合提取物大劑量組6*氺 110.6±24.9257.4±64.7**257.4±64.7118.5士53.4"
百合提取物中劑量組6104.1±30.3**161.8±85.8174.2±115.2116.5±65.7**
百合提取物小劑量組6103.1±28.3**170.9±28.2167.1±66.994.8±10.7
A與正常組相比:PO.05, ^4與正常組相比:PO.01; *與模型組相比:P<0.05，"與模型組相比PO.Ol。
結(jié)果顯示，模型組大鼠大腦皮層DA、 NE、 5-HT減少，提示抑郁癥患者單胺類神經(jīng)遞 質(zhì)功能不足，5-HIAA增高，提示5-HT已代謝成為5-HIAA，百合提取物能提高DA、 NE、 5-HT的含量，與模型組相比，有顯著性差異，陽(yáng)性藥氟西汀也能提高DA、 NE、 5-HT的含
3. 2. l迷宮實(shí)驗(yàn)
3. 2. 2懸尾實(shí)驗(yàn)
3.2.3 Open-filed行為測(cè)試
3. 2. 4蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)
3.2.5檢測(cè)如下指標(biāo)
3. 2. 5. l對(duì)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)總量的測(cè)定
高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-ECD)測(cè)定大鼠大腦前額皮質(zhì)和海馬中遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物腦內(nèi)5 —HT， 5—HIAA， NE及MAO的含量。 3. 2. 5. 2對(duì)HPA軸的影響
3.2.5.2.1促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF) mRNA的測(cè)定
(1) 大鼠斷頭處死后迅速取出全腦，在冰上迅速分離皮層與下丘腦，將每組大鼠的下丘腦及 皮層混合,用Trizol試劑盒提取皮層與下丘腦總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)。
(2) 總RNA的提取
(3) RNA純度及完整性檢測(cè)
(4) 引物設(shè)計(jì)、合成(cDNA PCR)
(5) RNA反轉(zhuǎn)錄
3.2.5.2.2血漿促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH的測(cè)定(放免法) 3. 2. 5. 2. 3血槳皮質(zhì)醇的測(cè)定(放免法)
3.2.5.2.4糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體的測(cè)定(RT-PCR法)
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具 體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明，對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明 構(gòu)思的前提下，其實(shí)施方式可以靈活多變，能夠派生許多系列方法。只是作出若干簡(jiǎn)單推演 或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書(shū)確定的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種用大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在于(1)將百合制備成含有百合總皂苷的粗提物；(2)將百合粗提物通過(guò)填充有大孔樹(shù)脂的層析柱，用洗脫劑洗脫，收集洗脫部分，回收洗脫劑，收取所得百合提取物，即得。
2、根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種用大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在 于所述大孔樹(shù)脂為聚苯乙烯樹(shù)脂型大孔樹(shù)脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種用大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在于所述大孔樹(shù)脂的型號(hào)是D101、 SA40、 HP20、 SP825、 XAD16、 XDA1、 XDA5、 LX18、 AB8、 LSA7中的一種或兩種以上的混合物；
4、 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種用大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在 于所用洗脫劑為極性溶劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在于所用洗脫劑為水和5 20BV乙醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在于 含有所述百合總皂苷的粗提物由下述方法制備而成取百合藥材，用6 10倍量65% 95% 乙醇70 9(TC提取，濃縮或回收乙醇，得濃縮液或繼續(xù)干燥得膏粉即得。
7、 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法，其特征在于將百合粗提物通過(guò)填充有大孔樹(shù)脂的層析柱，載樣重量比以樹(shù)脂:生藥計(jì)為0.1: 1 2:1，上樣濃度以生藥溶液重量體積比計(jì)為0.01: 1 1: 1，流速為1 10ml/min，用蒸餾水和乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，回收乙醇，收取所得百合提取物，即得。
8、 一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的用途，其特征在于百合總皂苷提取物用于制備治療抑郁癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥研究領(lǐng)域，具體說(shuō)是涉及了一種大孔樹(shù)脂制備百合總皂苷提取物的方法及其用途，本發(fā)明的目的是用大孔樹(shù)脂從百合中提取純化百合皂苷的方法，及其所得到的百合提取物的用途，所得到的含有百合皂苷的百合提取物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的癥狀的作用，可用于人類抑郁癥的治療，使用本發(fā)明制備百合皂甙方法便捷，純度可達(dá)到50％以上，成本低廉，并且易于實(shí)施。
文檔編號(hào)A61K36/8967GK101628075SQ20091013970
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者朱賀年, 李衛(wèi)民, 賈金良 申請(qǐng)人:包頭市千年健藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司