專利名稱：一種攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)療器械，具體的說，涉及一種攜載細(xì)胞外基質(zhì) 的醫(yī)療器械及其制備方法。
背景技術(shù)：
1987年，希格沃特(Sigwart)等首次將血管內(nèi)金屬支架用于冠狀 動脈，這為治療血管堵塞性疾病提供了良好的途徑。然而血管支架內(nèi) 再狹窄一直是影響經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)療效的主要原因。隨 著2004年強(qiáng)生Cypher雷帕霉素藥物支架和2005年波士頓科學(xué)公司的 Taxus紫杉醇藥物支架的上巿，藥物洗脫支架將支架內(nèi)再狹窄率從金 屬裸支架時代的30 %降低到10 %以下。
然而隨著藥物支架研究的深入和應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大以及積累 病例的逐步增加，人們對其使用應(yīng)更趨理性，對其目前存在的問題也 有了清醒的認(rèn)識。第一代藥物洗脫支架所攜帶的藥物，雷帕霉素、紫 杉醇以及它們的類似物能夠很好地抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，降低支 架內(nèi)再狹窄，但同時，也抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，損害了內(nèi)皮， 因此延遲了支架表面的內(nèi)皮化，從而增加了支架血栓的發(fā)生。同時第 一代藥物洗脫支架攜載藥物的聚合物基質(zhì)的長期存在可能導(dǎo)致過敏 和炎癥反應(yīng)。
生理學(xué)和病理學(xué)研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有以下功能①減少 血管通透性，調(diào)節(jié)組織與血液的物質(zhì)交換，防止血漿成分和血液細(xì)胞 無序地侵入；②抗血栓作用，平衡抗血液凝固纖溶系統(tǒng)和抗血小板機(jī) 能，維持血液的流動性；③調(diào)節(jié)血管平滑肌功能，合成和分泌調(diào)節(jié)血
管平滑肌舒張和收縮的相關(guān)因子；④抑制血管壁細(xì)胞的游走和增殖。
因此，更多研究集中在支架植入術(shù)后如何加速支架內(nèi)皮的修復(fù)方面。分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究結(jié)果表明，血管內(nèi)皮的修復(fù)有以下
兩種途徑(1)周圍內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，(2)內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管
損傷處的歸巢、分化和增殖。由此，理論上促進(jìn)支架植入后內(nèi)皮的修
復(fù)有以下幾種方法(l)提供更適應(yīng)內(nèi)皮增殖和遷移的支架表面，如 在支架涂覆內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)，膠原蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、 非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖和彈性蛋白。這些蛋白涂層改善 了支架表面的細(xì)胞相容性和生物相容性，從而加速支架表面內(nèi)皮修 復(fù)，可能降低支架植入后的炎癥、纖維化副作用，降低支架晚期血栓 發(fā)生率。(2)通過在支架表面固定一些特異性捕獲內(nèi)皮袓細(xì)胞的物質(zhì)， 如單克隆抗體CD31、 CD34、 CD133、生物多肽RGD,加速內(nèi)皮祖細(xì) 胞在支架表面的歸巢、分化和增殖。這兩種方法是目前分子生物學(xué)和 細(xì)胞生物學(xué)上對內(nèi)皮修復(fù)最直接的影響因素，從理論上說應(yīng)該是最有 可能在臨床上觀察到效果的加速內(nèi)皮修復(fù)的因素。
其中，細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌合成，位于細(xì)胞外部，構(gòu)成結(jié)締 組織，不僅具有連接、支持、保水、抗壓及保護(hù)的物理作用，而且對 細(xì)胞形狀、結(jié)構(gòu)、功能、存活、增殖、分化、遷移等一系列生命現(xiàn)象 具有全面的影響，主要表現(xiàn)在(l)影響細(xì)胞的存活、生長與死亡； (2)決定細(xì)胞的形狀；(3)控制細(xì)胞的分化；細(xì)胞通過與特定的細(xì) 胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。(4)參與細(xì)胞的遷移；細(xì)胞外基質(zhì)可 以控制細(xì)胞遷移的速度與方向，并為細(xì)胞遷移提供腳手架。因此，在 支架表面涂覆適合血管內(nèi)皮生長的基質(zhì)被認(rèn)為是一種理想的促進(jìn)內(nèi) 皮修復(fù)的方式。
但是細(xì)胞外涂層支架的實現(xiàn)在技術(shù)上存在不少難題1)雖然細(xì) 胞外基質(zhì)的構(gòu)成主要是由膠原蛋白、層粘連蛋白組成，但是其蛋白的 不同亞型和不同構(gòu)成可能會定向分化不同的細(xì)胞，因此如何找到適合 內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的細(xì)胞外基質(zhì)成為關(guān)鍵因素；2)如何將適合內(nèi) 皮細(xì)胞增殖和遷移的細(xì)胞外基質(zhì)牢固固定在支架表面，這也成為這一技術(shù)能否實現(xiàn)的關(guān)鍵因素。
Nexeon MedSystems公司的PROTEX支架釆用在細(xì)胞外基質(zhì)和支 架之間設(shè)置一層不可降解高分子材料，然后釆用化學(xué)接枝的方法固定 細(xì)胞外基質(zhì)涂層，這種方法雖然可行，但是增加了一層不可降解高分 子載體，可能在機(jī)體引起炎癥，并增加機(jī)體的負(fù)擔(dān)；而且并沒有給出 攜帶的細(xì)胞外基質(zhì)的種類，
另外現(xiàn)有細(xì)胞外基質(zhì)涂層支架從理論上只是關(guān)注了內(nèi)皮修復(fù)這 一因素，而較大程度的忽視了抑制內(nèi)膜增生這一關(guān)鍵因素，而這正是 第一代藥物洗脫支架成功應(yīng)用于臨床的主要原因。因此，如果細(xì)胞外 基質(zhì)涂層支架能夠結(jié)合第一代藥物洗脫支架抑制內(nèi)膜增生的優(yōu)勢，即 在細(xì)胞外基質(zhì)涂層的基礎(chǔ)上同時結(jié)合抑制平滑肌細(xì)胞增生的藥物，有 可能在充分發(fā)揮細(xì)胞外基質(zhì)涂層支架快速內(nèi)皮化優(yōu)勢的同時發(fā)揮抑 制內(nèi)膜增生的作用。
綜上所述，如何選擇合適的細(xì)胞外基質(zhì)，如何將有效量的細(xì)胞外 基質(zhì)牢固負(fù)載在支架表面安全輸送到血管病變部位，就成為制約這一 技術(shù)應(yīng)用于臨床的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供 一種攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械及其制備 方法。
本發(fā)明所述的攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械，包括醫(yī)療器械本體、 涂敷在醫(yī)療器械本體表面的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)層，其中所 述細(xì)胞外基質(zhì)可以選用膠原蛋白、層粘連蛋白、非膠原糖蛋白、氨基 聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白，以及培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理獲得 內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)中的一種或者幾種。
本發(fā)明所述的攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械還包括涂敷在醫(yī)療器 械本體表面的藥物構(gòu)成的藥物層。
所述藥物層可以位于細(xì)胞外基質(zhì)層的內(nèi)部、與細(xì)胞外基質(zhì)層完全重合或部分重合，或與細(xì)胞外基質(zhì)層分列醫(yī)療器械本體的血管腔惻和
近血管壁側(cè)；
所述細(xì)胞外基質(zhì)優(yōu)先釆用膠原蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白，當(dāng)釆用膠 原蛋白和層粘連蛋白時，膠原蛋白和層粘連蛋白組合的最優(yōu)比例為
0.01~100: l(質(zhì)量比)。由于個體內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移速度有所差 別，也可以將不同配方的膠原蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白涂覆在支架或在 塑料表面，然后在經(jīng)過不同配方處理的表面種植人血管內(nèi)皮細(xì)胞，根 據(jù)人血管內(nèi)皮細(xì)胞在表面的增殖和遷移情況，優(yōu)選出最適合特定個體 的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的比例。
優(yōu)選以下復(fù)合物層粘連蛋白-l和膠原蛋白I、層粘連蛋白-5和膠 原蛋白I，以及培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理獲得內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)。
所述培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理獲得細(xì)胞外基質(zhì)是現(xiàn)有的組 織工程化細(xì)胞外基質(zhì)的制備方法，該方法是組織工程常用的方法，簡 述如下通過組織工程、細(xì)胞生物學(xué)的手段，將體外培養(yǎng)的人血管內(nèi) 皮細(xì)胞與分離、提取的動物源性細(xì)胞外基質(zhì)混合構(gòu)成組織工程化細(xì)胞 外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，人血管內(nèi)皮細(xì)胞仍然 繼續(xù)增殖，吸收動物源性細(xì)胞外基質(zhì)，合成并重新分泌細(xì)胞外基質(zhì)成 分。待細(xì)胞外基質(zhì)改建完成后，破除(如利用凍融，破膜等方法)人 血管內(nèi)皮細(xì)胞，獲得細(xì)胞外基質(zhì)。采用該方法制備的細(xì)胞外基質(zhì)可以 為內(nèi)皮細(xì)胞生長代謝提供非常適合細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，特別適合血管內(nèi) 皮細(xì)胞增殖和遷移。
所述藥物包括抗炎性免疫抑制劑、抗增殖藥物、抗細(xì)胞遷移藥物、 冠脈內(nèi)皮化藥物、多肽藥物，包括西羅莫司、他克莫司、艾羅莫司、 免疫抑制劑ABT-578、地塞米松、咪唑立賓、雷帕霉素、紫杉醇、放 線菌素、血管肽、長春新堿及其衍生物、他汀類藥物、2-氯去氧腺苷、 三氧化二砷(As203)、核酶、巴馬司他、溴氯哌喹酮、C-蛋白酶抑制 劑、普羅布可、雌二醇類的一種或者多種。優(yōu)選雷帕霉素和/或艾羅
7莫司。
所述涂敷是將細(xì)胞外基質(zhì)采用光化學(xué)偶聯(lián)、微孔物理吸附和/或 靜電吸附、等離子體化學(xué)接技、靜電紡方法中的一種或多種固定在醫(yī) 療器械本體表面。優(yōu)選微孔物理吸附和/或靜電吸附的方式。
所述的醫(yī)療器械是指血管支架、合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo) 管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、PFO隔膜封閉器 械、血管夾、動脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、 房室吻合分流、大動脈血管瘤移植物器械、靜脈瓣、血管接合夾、留 置式動脈導(dǎo)管、血管護(hù)鞘等醫(yī)療器械中的一種或上述多種醫(yī)療器械的 組合。所述醫(yī)療器械優(yōu)選表面具有載藥孔洞的醫(yī)療器械。更優(yōu)選表面
具有納米孔洞的醫(yī)療器械，納米孔洞的尺寸優(yōu)選10-800nm。
所述醫(yī)療器械優(yōu)選支架，更優(yōu)選表面具有載藥孔洞的支架。更優(yōu) 選表面具有納米孔洞的支架，納米孔洞的尺寸優(yōu)選10-800nm。
本發(fā)明還提供的所述攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械的制備方法
1) 在醫(yī)療器械本體表面采用化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕、微弧氧化 方法制備孔洞；
2) 利用孔洞的物理吸附固定適量的細(xì)胞外基質(zhì)(參考專利《藥 物洗脫器械用納米級孔洞藥物釋放結(jié)構(gòu)及其制備方法》， 200610168125.0 ),或釆用靜電作用和孔洞吸附雙重作用的方法或者 僅采用靜電作用的方法在醫(yī)療器械本體表面固定適宜量的細(xì)胞外基 質(zhì)(參考專利《一種在醫(yī)療器械表面固定抗體的方法》，申請?zhí)?200710107643.6)。
所述的利用靜電作用攜載細(xì)胞外基質(zhì)的方法為將表面帶正電并 有孔洞的金屬醫(yī)療器械浸沒在含有細(xì)胞外基質(zhì)的溶液中，利用細(xì)胞外 基質(zhì)在緩沖溶液中呈負(fù)電性的特性，通過正負(fù)電荷相吸的靜電吸附效 應(yīng)吸附到器械本體的表面和孔洞中，通過物理效應(yīng)來固定細(xì)胞外基 質(zhì)。所述細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原蛋白、層粘連蛋白、非膠原糖蛋白、氨 基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白以及按照現(xiàn)有組織工程方法制備的內(nèi)皮
細(xì)胞外基質(zhì)，其中優(yōu)選層粘連蛋白-l和膠原蛋白I、層粘連蛋白-5和膠
原蛋白I的復(fù)合物以及按照組織工程方法制備的內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)。
對本發(fā)明所述的含有藥物層和細(xì)胞外基質(zhì)層的醫(yī)療器械來說，其 制備方法可以是在現(xiàn)有的藥物洗脫醫(yī)療器械表面再涂覆一層促進(jìn)內(nèi) 皮化的細(xì)胞外基質(zhì)涂層；也可以在醫(yī)療器械本體的表面的不同位置分 別涂敷藥物層和細(xì)胞外基質(zhì)層，如分別在醫(yī)療器械本體的表面的血管
腔側(cè)和近血管壁側(cè)分別涂敷藥物層和細(xì)胞外基質(zhì)層；當(dāng)然也可以先涂
敷藥物，再涂敷細(xì)胞外基質(zhì)，使藥物層和細(xì)胞外基質(zhì)層部分或完全重 合。
所述現(xiàn)有的藥物洗脫醫(yī)療器械包括具有不可降解載藥涂層的藥 物洗脫醫(yī)療器械、可降解載藥涂層的藥物洗脫醫(yī)療器械、無載體藥物 涂層醫(yī)療器械和全降解藥物洗脫醫(yī)療器械。
具體的說，攜載藥物和細(xì)胞外基質(zhì)醫(yī)療器械的制備方法主要包括
以下幾個步驟
1) 攜載藥物可參考現(xiàn)有的制備藥物洗脫器械的制備方法① 利用載體攜載藥物；②將醫(yī)療本體表面釆用化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕、 微弧氧化方法制備孔洞，然后利用孔洞的物理吸附和/或電性作用固 定藥物；優(yōu)選方法②；
2) 攜載細(xì)胞外基質(zhì)釆用光化學(xué)偶聯(lián)、微孔物理吸附和/或靜電 吸附、等離子體化學(xué)接枝、靜電紡方法中的一種或多種在藥物洗脫醫(yī)
療器械的表面涂敷細(xì)胞外基質(zhì)涂層；對表面具有載藥孔洞的醫(yī)療器 械，優(yōu)選利用微孔物理吸附和/或靜電吸附固定細(xì)胞外基質(zhì)。
其中所述載體包括不可生物降解載體，如聚甲基丙烯酸丁酯、聚 乙烯乙烯醋酸共聚物、乙烯或醋酸乙烯共聚物、聚丙烯或聚丙烯腈共 聚物、聚5己內(nèi)酯；可生物降解載體，如乙交酯、丙交酯、5-己內(nèi)酯的均聚物或共聚物中的一種及其與多官能團(tuán)氨基酸的共聚物、聚乳 酸、甲殼質(zhì)、殼聚糖、膠原蛋白。
其中所述藥物包括抗炎性免疫抑制劑、抗增殖藥物、抗細(xì)胞遷移 藥物、冠脈內(nèi)皮化藥物、多肽藥物，包括西羅莫司、他克莫司、艾羅
莫司、免疫抑制劑ABT-578、地塞米松、咪唑立賓、雷帕霉素、紫杉 醇、放線菌素、血管肽、長春新堿及其衍生物、他汀類藥物、2-氯去 氧腺苷、三氧化二砷(As203)、核酶、巴馬司他、溴氯哌喹酮、C-蛋 白酶抑制劑、普羅布可、雌二醇類的一種或者多種。優(yōu)選雷帕霉素和 /或艾羅莫司。
主要的制備方法主要是將載體和藥物按照不同比例需要溶解在 有機(jī)溶劑中(如四氫^^喃、丙酮)，然后釆用浸涂、噴涂、靜電噴涂 等方式涂覆在醫(yī)療器械本體表面形成藥物洗脫醫(yī)療器械。
特別的，本發(fā)明提出一種細(xì)胞外基質(zhì)涂層載藥醫(yī)療器械，醫(yī)療器 械本體的血管腔側(cè)涂覆固定細(xì)胞外基質(zhì)涂層，醫(yī)療器械血管壁側(cè)涂覆 抗平滑肌增殖藥物。該種方式充分發(fā)揮了藥物洗脫醫(yī)療器械抑制醫(yī)療 器械內(nèi)再狹窄的優(yōu)勢，也最大限度利用了細(xì)胞外基質(zhì)涂層促進(jìn)內(nèi)皮修 復(fù)的優(yōu)勢，為本發(fā)明專利的最優(yōu)組合(具體見附圖l)。
醫(yī)療器械血管腔側(cè)涂覆固定細(xì)胞外基質(zhì)可以采用光化學(xué)偶聯(lián)、微 孔物理吸附和/或靜電吸附、等離子體化學(xué)接技、靜電紡方法連接。 在該發(fā)明專利中優(yōu)選微孔物理吸附和/或靜電吸附的方式(在醫(yī)療器 械表面釆用化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕、微弧氧化方法在醫(yī)療器械本體表 面制備孔洞，然后利用孔洞的物理吸附固定細(xì)胞外基質(zhì))；醫(yī)療器械 血管壁側(cè)涂覆的藥物，可以采用不可降解生物載體、可降解生物載體 等方式攜載，也可以采用在醫(yī)療器械本體表面直接致孔，通過孔洞方 式攜載。
本發(fā)明所述的細(xì)胞外基質(zhì)涂層載藥醫(yī)療器械是在現(xiàn)有藥物洗脫 醫(yī)療器械的基礎(chǔ)上制備而成，在保留藥物洗脫醫(yī)療器械抗再狹窄優(yōu)勢的同時加速其表面內(nèi)皮化。
本發(fā)明所述的攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械，可促進(jìn)血管的內(nèi)皮化；與藥物共同作用，既可降低再狹窄率，還可加速表面內(nèi)皮化。
而且本發(fā)明的攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械可不含載體，利用表面具有孔洞的醫(yī)療器械，釆用靜電吸附和微孔物理吸附效應(yīng)在器械本體表面直接涂覆具有治療有效量的細(xì)胞外基質(zhì)(以及藥物)，其具有以
下優(yōu)點1)減小了植入該醫(yī)療器械后引起的炎癥及副作用；2)采用
微孔或者靜電吸附方式固定的細(xì)胞外基質(zhì)相對牢固，能夠耐受支架植入過程中高速冠脈血流的沖擊，從而能夠使治療有效量的細(xì)胞外基質(zhì)達(dá)到血管病變位置，從而達(dá)到靶向輸送或局部定位細(xì)胞外基質(zhì)的目的。


圖i為本發(fā)明專利的最優(yōu)組合支架示意圖2為本發(fā)明實施例i結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖3為本發(fā)明實施例2結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖4為本發(fā)明實施例3結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖5為本發(fā)明實施例4結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖6為本發(fā)明實施例5結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖7為本發(fā)明實施例6結(jié)構(gòu)示意圖的橫截面剖視圖。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如物特別指明，實施例中使用的試劑、細(xì)胞外基質(zhì)來源于來自美國sigma公司。實施例l
制備攜載細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白1)的支架，其橫截面剖視圖如圖2所示
(1)將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為
ii75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在4(TC,干燥60分鐘后取出。
(2)將支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白I (濃度為150Mg/mL，溶劑為12MHC1)，同時加入lmL的層粘連蛋白l(濃度為10jag/mL ，溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 ), 4'C振搖lh后，取出。
(3 )將涂覆有膠原蛋白I和層粘連蛋白l的支架放置在紫外固化投光射燈DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去離子水沖洗干燥，于室溫下晾干。實施例2
制備細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白5)涂層支架，其橫截面剖視圖如圖3所示
(1) 將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在4(TC，干燥60分鐘后取出。然后將支架放置在~38%的鹽酸腐蝕12小時后，將支架本體作為陽極與脈沖電源的正極連接，鈦金屬片作為陰極與脈沖電源的負(fù)極連接，將支架本體與陰極金屬片同時置于為28%的鹽酸中，電流設(shè)定為20A,頻率為2000赫茲，時間為5分鐘，在316L金屬裸支架本體表面制備孔洞。
(2) 將支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白5 (濃度為150Mg/mL,溶劑為12MHC1),同時加入lmL的層粘連蛋白l(濃度為10iag/mL ,溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 ), 4X:振搖lh后，取出后，于室溫下晾干。實施例3
制備一種細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白1)載藥(雷帕霉素)涂層支架，其橫截面剖視圖如圖4所示
(1)將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在40°C，干燥60分鐘后取出。
(2 )將0.8g聚乳酸加入10ml四氫吹喃溶液中，待溶解后加入0.2g雷帕霉素，然后噴涂于支架本體的表面，空氣中固化60min，使支架的雷帕霉素載藥量達(dá)到1.2jag/mm2 。
(3) 然后將制備好的藥物支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白I (濃度為150Mg/mL,溶劑為12MHC1),同時加入lmL的層粘連蛋白1 (濃度為10 ug/mL ，溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 ), 4。C振搖lh后，取出。
(4) 將涂覆有膠原蛋白I和層粘連蛋白l的支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s,然后用去離子水沖洗干燥，于室溫下晾千即得。
實施例4
制備細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白5)載藥(雷帕霉素)涂層支架，其橫截面剖視圖如圖5所示
(1) 將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在40°C,干燥60分鐘后取出。然后將支架放置在~38%的鹽酸腐蝕12小時后，將支架本體作為陽極與脈沖電源的正極連接，鈦金屬片作為陰極與脈沖電源的負(fù)極連接，將支架本體與陰極金屬片同時置于為28%的鹽酸中，電流設(shè)定為20A，頻率為2000赫茲，時間為5分鐘，在316L金屬裸支架本體表面制備孔洞。
(2) 將0.2§雷帕霉素加入101111四氫呋喃溶液中,將配制好的雷帕霉素藥物在室溫條件下分散均勻，然后噴涂于支架本體的表面，空氣中固化60min;使支架的雷帕霉素載藥量達(dá)到2.2 ia g/mm2 ，制備出
無載體藥物洗脫支架。
(3) 然后將制備好的無載體藥物洗脫支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白I (濃度為150jug/mL,溶劑為12MHC1),同時加入lmL的層粘連蛋白1 (濃度為10jug/mL ，溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 ), 4"C振搖lh后，取出。
(4)將涂覆有膠原蛋白I和層粘連蛋白l的無載體藥物洗脫支架支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去離子水沖洗干燥，于室溫下晾干即得。實施例5
制備細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白1 )和藥物(艾羅莫司)聯(lián)合支架，其橫截面剖視圖如圖6所示
(1) 將316L不銹鋼棵支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在40°C，干燥60分鐘后取出。
(2) 將0.8g聚乳酸加入10ml四氫呋喃溶液中，待溶解后加入0.2g艾羅莫司，用球囊保護(hù)帶有孔洞的支架本體的血流側(cè)表面，并將配制好的艾羅莫司藥物在室溫條件下分散均勻，然后噴涂于支架本體的血管側(cè)表面，空氣中固化60min;使支架的艾羅莫司載藥量達(dá)到2.2 ]ag/mm2 ，制備出預(yù)留出血流側(cè)表面的艾羅莫司藥物洗脫支架。
(3) 然后將制備好的藥物支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白I (濃度為150jag/mL，溶劑為12MHC1)，同時加入lmL的層粘連蛋白1 (濃度為10 |ug/mL ,溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 )， 4"C振搖lh后，取出。
(4) 將涂覆有膠原蛋白I和層粘連蛋白l的支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去離子水沖洗干燥，于室溫下晾干即得。
實施例6
制備細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白I和層粘連蛋白5 )和藥物(雷帕霉素)聯(lián)合支架，其橫截面剖視圖如圖7所示
(1) 將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設(shè)定在40°C，干燥60分鐘后取出。然后將支架放置在~38%的鹽酸腐蝕12小時后，將支架本體作為陽極與脈沖電源的正極連接，鈦金屬片作為陰極與脈沖電源的負(fù)極連接，將支架本體與陰極金屬片同時置于為28%的鹽酸中，電流設(shè)定為20A,頻率為2000赫茲，時間為5分鐘，在316L金屬裸支架本體表面制備孔洞。
(2) 將0.2g雷帕霉素加入10ml四氫呋喃溶液中，將配制好的雷帕霉素藥物在室溫條件下分散均勻，用球囊保護(hù)帶有孔洞的支架本體
的血流惻表面，并將配制好的雷帕霉素藥物在室溫條件下分散均勻，然后噴涂于支架本體的血管側(cè)表面，空氣中固化60min;使支架的雷帕霉素載藥量達(dá)到2.2jag/mm2 ，制備出預(yù)留出血流側(cè)表面的雷帕霉素藥物洗脫支架。
(3) 然后將制備好的預(yù)留出血流側(cè)表面的雷帕霉素藥物洗脫支架放入5mL玻璃試管中(l個支架對應(yīng)l個試管)，然后向玻璃試管中加入lmL膠原蛋白I (濃度為150ng/mL,溶劑為12MHC1)，同時加入lmL的層粘連蛋白l (濃度為10pg/mL ，溶劑為0.1MCBC緩沖液，pH9.0 ), 4'C振搖lh后，用去離子水沖洗干凈，取出。于室溫下晾干即得。
實施例7內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備
(1 )基質(zhì)蛋白的提取，取豬新鮮心臟血管，絞成肉泥，3倍Tris-HCl緩沖液攪拌12小時，離心棄上清，將沉淀物用3%的冰醋酸萃取24小時后離心棄上清，將沉淀物溶解于含有1.5 mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液中20小時，離心棄沉淀，在上清液中加入NaCl至終濃度2.5mol/L，鹽析20小時，離心棄沉淀，沉淀物用0.1%冰醋酸溶解后透析純化，冷凍干燥后備用。
15(2) 將按照(1)制備的基質(zhì)蛋白用0.1%的醋酸溶液配制成5%
的溶液，再按體積的10%加入胎牛血清和10mg/mL的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2 7.4;加入人血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液，使終濃度為106個細(xì)胞/mL，培養(yǎng)4天，然后將細(xì)胞-基質(zhì)蛋白培養(yǎng)物置于培養(yǎng)皿中的不銹鋼支架上，繼續(xù)加入培養(yǎng)液后培養(yǎng)，待不銹鋼支架上爬滿細(xì)胞后進(jìn)行破細(xì)胞處理。
(3) 將爬滿細(xì)胞的不銹鋼支架在-196'C放置30分鐘后取出置于4。C中，如此反復(fù)三次，最后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，徹底去除細(xì)胞后，即得內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)支架。
權(quán)利要求
1、一種攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械，包括醫(yī)療器械本體、涂敷在醫(yī)療器械本體表面的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)層，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)是膠原蛋白、層粘連蛋白、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白，以及培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理獲得的內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)中的一種或者多種。
2、 如權(quán)利要求l所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述醫(yī)療器械還包括涂敷在醫(yī)療器械本體表面的藥物構(gòu)成的藥物層。
3、 如權(quán)利要求2所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述藥物層位于 細(xì)胞外基質(zhì)層的內(nèi)部、與細(xì)胞外基質(zhì)層完全重合或部分重合，或與細(xì) 胞外基質(zhì)層分列醫(yī)療器械本體的血管腔側(cè)和近血管壁側(cè)。
4、 如權(quán)利要求書l中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述細(xì)胞外 基質(zhì)為膠原蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白和/或培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理 獲得的內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)。
5、 如權(quán)利要求書4中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述膠原 蛋白和層粘連蛋白為以下復(fù)合物層粘連蛋白-1和膠原蛋白I;層粘 連蛋白-5和膠原蛋白I。
6、 如權(quán)利要求書2中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述藥物包 括抗炎性免疫抑制劑、抗增殖藥物、抗細(xì)胞遷移藥物、冠脈內(nèi)皮化藥 物、多肽藥物；為西羅莫司、他克莫司、艾羅莫司、免疫抑制劑 ABT-578、地塞米松、咪唑立賓、雷帕霉素、紫杉醇、放線菌素、血 管肽、長春新堿及其衍生物、他汀類藥物、2-氯去氧腺苷、三氧化二 砷(As203)、核酶、巴馬司他、溴氯哌喹酮、C-蛋白酶抑制劑、普羅 布可、雌二醇類的一種或者多種；優(yōu)選雷帕霉素和/或艾羅莫司。
7、 如權(quán)利要求書l中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述涂敷是 釆用光化學(xué)偶聯(lián)、微孔物理吸附和/或靜電吸附、等離子體化學(xué)接枝、 靜電紡方法中的一種或多種將細(xì)胞外基質(zhì)固定在醫(yī)療器械本體表面；優(yōu)選微孔物理吸附和/或靜電吸附的方式。
8、 如權(quán)利要求書1-7任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述 的醫(yī)療器械是指血管支架、合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、PFO隔膜封閉器械、血管夾、動脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合 分流、大動脈血管瘤移植物器械、靜脈瓣、血管接合夾、留置式動脈 導(dǎo)管、血管護(hù)鞘等醫(yī)療器械中的一種或上述多種醫(yī)療器械的組合。
9、 如權(quán)利要求書8中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述醫(yī)療器械是表面具有載藥孔洞的醫(yī)療器械。
10、 如權(quán)利要求書8或9中所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述醫(yī)療器械為支架。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜載細(xì)胞外基質(zhì)的醫(yī)療器械及其制備方法。包括醫(yī)療器械本體、涂敷在醫(yī)療器械本體表面的細(xì)胞外基質(zhì)層，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)是膠原蛋白、層粘連蛋白、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白，以及培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞然后去細(xì)胞處理獲得內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)中的一種或者多種。本發(fā)明所述的醫(yī)療器械，本體表面的細(xì)胞外基質(zhì)能夠耐受血流以及其他體液的沖刷，通過緩慢釋放促進(jìn)血管的內(nèi)皮化；如果與藥物共同作用，既可降低再狹窄率，還可加速表面內(nèi)皮化，提高治療效果；本發(fā)明的制備方法簡單，可不含載體，采用靜電和/或微孔吸附原理，直接在本體表面涂覆細(xì)胞外基質(zhì)，因此可避免載體帶來的炎癥等副作用。
文檔編號A61F2/02GK101548916SQ200910083518
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者余占江, 張正才, 朱華剛, 邱笑違, 陳韻岱 申請人:樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司