專利名稱：：一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，屬于醫(yī)學生物
技術領域：
和實驗動物學領域。
背景技術：
：胃食管反流病(gas加esophagealrefluxdisease,GERD)是一種臨床常見的慢性、易復發(fā)的功能性胃腸病，在我國其發(fā)病率呈上升趨勢。GERD是一種多種因素造成的消化道動力障礙性疾病，其發(fā)病原因及機制尚未完全明確，因此，多年來，人們一直探索建立一種客觀的，重復性好的動物模型，以此為平臺來研究GERD的發(fā)病機理。陳瑩、王峰綜述了胃食管反流動物模型的研究現(xiàn)狀，包括破壞食管下括約肌的GERD動物模型，結扎幽門或十二指腸的GERD動物模型，食管十二指腸吻合術的GERD動物模型和食管酸灌注GERD動物模型。(陳瑩、王峰，胃食管反流動物模型的研究現(xiàn)狀，ChinJGastroenterol,2006，11(9):568-570。)該綜述中所述的制模方式多樣，但是動物模型成功的標準多局限于反流性食管炎的病理變化，而近年來，胃食管反流源性呼吸疾病，特別是"哮喘"的發(fā)病機理受到各方面的關注和研究。2007年我國汪忠鎬院士結合解放軍第二炮兵總院胃食管返流中心收治的200余例GERD患者的臨床特點，開創(chuàng)性的提出胃食管喉氣管綜合癥的概念。(汪忠鎬，劉建軍，陳秀等，胃食管喉氣管綜合癥(GELTS)的發(fā)現(xiàn)與命名，臨床誤診誤治，2007，20(5):5-9。)他在文中這樣描述此概念"由GERD引起的以咽喉部為核心的、常以呼吸道表現(xiàn)尤其是哮喘、喉氣管痙攣為突出點的、涉及呼吸和消化兩大系統(tǒng)和耳鼻口腔的一系列相應臨床癥候群(但偏偏可以沒有燒心和反酸)，姑且稱為胃食管喉氣管綜合癥(gastroesophagolarygotrachealsyndrome,GELTS綜合癥)或兩管一腔綜合癥(Twotrack-onecavitysyndrome),似不為過。"他認為GERD的臨床表現(xiàn)可以概括為三類食管性、呼吸性和口腔性。并指出喉腔不但從解剖上是聯(lián)系消化呼吸系統(tǒng)的樞紐，為GELTS綜合癥的核心器官，胃內容物經(jīng)此噴射分至口咽和氣道，而且喉腔的功能紊亂是其他食管外病變的基礎和前提，無疑此概念的提出糾正了食管外癥狀龐雜的局面，使此病有一個直接明確的概念。同時，他根據(jù)對臨床患者的觀察及自身患病診治的經(jīng)歷，進一步指3出胃食管反流源性"哮喘"并非真正的哮喘，它實為酸性內容物直接反流激惹喉氣道引起的呼吸窘迫(Zhonggaowang.Abelatedrevelation:fromgastroesophagealrefluxderivedasthmatolaryngotrachealirritationevenspasm.Frontiersofmedicineinchina.2008(2):127-129.)。(汪忠鎬。遲來的揭示從胃食管反流源性哮喘到喉氣道激惹甚至痙攣。中國醫(yī)學前沿。2008(2):127-129)。因此，反流機制對GERD源性呼吸疾患的影響值得進一步研究，而長期以來，由迷走神經(jīng)介導的反射機制在胃食管反流病引起的呼吸道疾病中的重要地位已經(jīng)確立，人們忽視反流機制在GERD源性呼吸疾病中的作用，近年來，GERD患者氣道內及肺灌洗液中胃蛋白酶的發(fā)現(xiàn)被認為是證明反流機制的有力證據(jù)，人們開始重視直接反流機制對呼吸道的影響及其內在機制，有必要建立一種適當、符合致病機理的胃食管喉氣道反流模型以提供研究平臺。啟發(fā)于上述背景，需要建立一種客觀、公認和重復性好的動物模型，為進一步明確GERD源性呼吸窘迫的病因和發(fā)病機制，以期獲得更好的臨床治療方法。本發(fā)明人前期對此進行了探索(.來運鋼，汪忠鎬，吳繼敏等。動物實驗探討胃食管喉氣管反流。中華實驗外科雜志。2008;25(10):1352-1353)。破壞大鼠的食管下括約肌，結扎阻斷幽門環(huán)，胃內注入亞甲蘭溶液，術后我們發(fā)現(xiàn)實驗組喉氣道內出現(xiàn)不同程度的藍染，結合臨床觀察，我們認為經(jīng)解剖途徑的反流機制是GERD源性呼吸疾患的重要病因之一。但是以此制備模型制備的大鼠術后生存時間過短，10組大鼠平均術后生存時間為22小時，其中一只僅為2小時。且結扎阻斷幽門環(huán)，完全封閉胃部出口，雖然可以造成胃內容物劇烈迅速的反流，但是制備方式與臨床致病因素不符，缺乏說服力。目前胃食管反流動物模型多注重于反流性食管炎的研究，對反流源性呼吸疾患缺乏探討，也沒有較為適合研究反流機制在GERD源性呼吸窘迫中作用的動物模型被報道。技術內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于將實驗動物固定于手術臺上，切開腹部并切開實驗動物的胃壁，將食管擴張器經(jīng)胃切口向賁門口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口連續(xù)全層加漿肌層縫合關閉；于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片包繞腸管外周，并縫扎固定于腸系膜，縫合腹部切口和包扎，建立胃食管喉氣管反流動物模型。4所述實驗動物為大鼠。所述切開腹部并切開實驗動物胃壁的方法是取腹正中切口，起于劍突向下長5cm，進腹顯露胃前壁，于胃食管交界下lcm無血管區(qū)縱行切開胃壁，切口長5mm。所述包繞腸管的塑膠片長為1415mm，寬為68mm。所述于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片包繞腸管外周的方法是于幽門環(huán)至幽門環(huán)遠端1.5cm之間十二指腸處用塑膠片緊貼腸管環(huán)形包繞腸管外周，形成環(huán)狀結構，包繞前該處腸管直徑為45mm，包繞后該環(huán)狀結構的直徑與包繞前該處腸管的直徑一致。所述食管擴張器為喇叭形。該食管擴張器上口直徑為3mm,下口直徑為5mm，管長為25腿。所述實驗動物還可以為兔、犬、羊或豬。食道擴張器的直徑及長度，塑膠片的具體大小可依據(jù)不同動物的實際情況給與變更，且還可利用塑膠片對相應動物腸道進行多段包繞，造成腸道不同程度的動力障礙。本發(fā)明所述的胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，可以用人造的模型動物來模擬實驗動物進行模型構建及相關研究。本發(fā)明的特點是(1)食管下括約肌功能缺損是胃食管反流的致病解剖基礎，同時食管動力異常也是重要的致病因素。對伴有呼吸癥狀的GERD患者進行食管動力測試，同時行24小時食道內PH動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)均有食道動力異常，特別是無效食管動力與食管內酸暴露總時間、臥位時間、臥位食管酸清除時間均密切相關，認為食管動力異常在伴有呼吸癥狀的GERD患者的發(fā)病機制中起重要作用。本發(fā)明的動物模型制備方法中，食管擴張器經(jīng)胃部切口置于食管腔內，長度由胃食管交界處直至食管裂孔下方，完全跨越食管下段，抵消食管下括約肌的功能，致使食管下括約肌功能喪失。同時食道下段本身管壁緊貼于擴張器外周，肌纖維被動牽拉延伸，該部食管動力功能受損，擴張器植入食管段處于無效食管動力狀態(tài)，而且食管下段是迷走神經(jīng)分布較為密集的區(qū)域，反射機制多通過胃內容物對此區(qū)域的迷走神經(jīng)激惹而發(fā)揮效應。本模型中的食道擴張器可屏蔽胃酸性內容物對食管下段部迷走神經(jīng)的刺激，完全規(guī)避反射機制對呼吸道的作用，僅就直接反流機制對呼吸道的作用進行觀察研究。同時我們也可通過改變減少擴張器的長度，不同程度去除擴張器對食管下段的屏蔽，同時觀察反射和反流機制對呼吸系統(tǒng)的雙重作用。(2)隨著對GERD研究的不斷深入，人們注意到許多GERD患者同時存在上腹脹、5早飽、噯氣、惡心、嘔吐等胃動力障礙癥狀。提示GERD患者可能存在胃運動功能受損，胃腸功能障礙是胃食管反流的重要致病因素之一。研究表明，約33%的GERD患者存在胃排空延遲。核素掃描發(fā)現(xiàn)部分GERD患者存在胃液體、固體排空延遲。并且使用促動力藥治療或抗反流手術治療后，癥狀緩解，胃排空恢復正常。對GERD病人進行餐前、餐后體表胃電圖(EGG)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)GERD患者存在餐前、餐后胃電活動異常，說明胃排空延遲與胃食管反流有關。有些收治的病人中，患者因腸系膜血管壓迫十二指腸致胃十二指腸動力障礙，胃內容物反流引發(fā)類哮喘癥狀，手術解除腸道梗阻后，患者呼吸癥狀明顯改善。本發(fā)明的動物模型制備方法中，于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片環(huán)行包裹腸管外周，未致包裹段腸腔狹窄，但實驗動物進食時，可抑制局部腸道蠕動，使胃腸排空功能障礙，而在實驗動物死亡時解剖示包裹段腸管通暢，其近段腸管及胃擴張，內含食物滯留，說明動物模型遠端腸道的制備方法可致胃腸排空障礙，從而促進胃內容物的反流。而既往反流性食管炎的動物模型制備方法中，多采用以外科手術致胃幽門、十二指腸完全或不完全梗阻，從而構成促進胃十二指腸內容物反流的重要因素。而本模型采用塑膠片包裹局部腸腔，并未引起局部腸道的機械性狹窄，保護腸腔自然通暢，但動物進食時，包裹腸管局部蠕動功能受到制約，局部食物在腸道內運行緩慢受阻，直接導致排空障礙，從而構成胃內容物的反流因素，并且可以通過調節(jié)塑膠片的寬度或采用多段腸道的包裹，從而改變被包裹腸管的長度，進而改變腸道排空障礙的程度。同時，我們的臨床觀察認為GERD患者胃腸功能障礙是胃食管反流的重要致病因素，這與本模型的制備原理相吻合。此外，本發(fā)明的動物模型中腸管的塑膠片包裹，可以根據(jù)實驗情況改變塑膠片的包裹長度或行多段腸管包裹而改變胃食管排空障礙程度。(3)與前期建立的胃食管喉氣管反流動物制備方式，即破壞大鼠的食管下括約肌，結扎阻斷幽門環(huán)，胃內注入亞甲蘭溶液的動物模型相比使用本動物模型成功制備10只大鼠，于大鼠死亡后均可以觀察到其喉氣道內有胃內容物的存在，且有氣道分泌物出現(xiàn)，說明此種制備方法是一種成功的胃食管喉氣道反流的制備方式，為進一步研究反流機制所致的GERD源性氣道炎癥提供實驗動物平臺。較前期建立的動物制備方式，動物制型成功后生存時限明顯延長，進食固體食物時最長時限可達6天，若采用液體營養(yǎng)喂食，有繼續(xù)喂養(yǎng)的可能，便于觀察病程進展。本動物模型中，通過破環(huán)食管下括約肌功能，食道蠕動功能喪失，胃腸排空障礙作為制備原理基礎，更加符合臨床實際。6下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領域公知的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。圖1:試驗組大鼠的喉氣道反流，箭頭所指為胃內亞甲蘭反流至喉氣道引起局部藍染及分泌物形成的圖2:試驗組大鼠的喉氣道反流，箭頭所指為胃內亞甲蘭反流至喉氣道引起局部藍染及分泌物形成的圖。具體實施例方式實施例l:建模實驗一.實驗動物及分組1.大鼠(Sprague-Dawley，SD),雌雄各半，體重為250-300克，由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供。共20只。詞養(yǎng)條件室溫2325。C，置大鼠不銹鋼籠具中詞養(yǎng)，每籠5只，自由攝水攝食。2.20只實驗動物采用隨機分組的方法分為兩組，實驗組和對照組，每組10只。二.模型制作實驗組術前禁食24h，不禁水。以10%水合氯醛(2.5-3ml/kg)腹腔注射法施行麻醉。動物取仰臥位，四肢及頭部固定于手術臺。術區(qū)備皮鋪巾如常規(guī)。取腹正中切口，起于劍突向下長5cm，進腹顯露胃前壁，于胃食管交界下lcm無血管區(qū)縱行切開胃壁長5mm，以上口直徑3mm，下口直徑5mm，管長25mm的喇叭形食管擴張管經(jīng)胃切口向賁門口緩緩插入食管腔(食管下段外徑2-3mm)，向上至食管裂孔下方，切口連續(xù)全層加漿肌層縫合關閉。于幽門環(huán)至幽門環(huán)遠端1.5厘米之間十二指腸處(欲包裹處腸管直徑為45mm)，緊貼腸管用長14mm，寬7mm的塑膠片環(huán)形包繞，形成環(huán)狀結構，該環(huán)狀結構的直徑與包繞前該處腸管的直徑一致，并縫扎固定于腸系膜。縫合腹部切口和包扎。對照組進腹后，簡單翻動腸管，縫合腹部切口并包扎。實施例2:建模實驗一.實驗動物及分組1.大鼠(Sprague-Dawley，SD)，雌雄各半，體重為250300克，由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供。共20只。詞養(yǎng)條件室溫2325"C,置大鼠不銹鋼籠具中飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝水攝食。2.20只實驗動物采用隨機分組的方法分為兩組，實驗組和對照組，每組10只。二.模型制作-實驗組術前禁食24h，不禁水。以10%水合氯醛(2.5-3ml/kg)腹腔注射法施行麻醉。動物取仰臥位，四肢及頭部固定于手術臺。術區(qū)備皮鋪巾如常規(guī)。取腹正中切口，起于劍突向下長5cm，進腹顯露胃前壁，于胃食管交界下lcm無血管區(qū)縱行切開胃壁長5mm，以上口直徑3mm，下口直徑5mm，管長25mm的喇叭形食管擴張管經(jīng)胃切口向賁門口緩緩插入食管腔(食管下段外徑2-3mm)，向上至食管裂孔下方，切口連續(xù)全層加漿肌層縫合關閉。于幽門環(huán)至幽門環(huán)遠端1.5厘米之間十二指腸處(欲包裹處腸管直徑為45mm)，緊貼腸管用長15mm，寬8mm的塑膠片環(huán)形包繞，形成環(huán)狀結構，該環(huán)狀結構的直徑與包繞前該處腸管的直徑一致，并縫扎固定于腸系膜。縫合腹部切口和包扎。對照組進腹后，簡單翻動腸管，縫合腹部切口并包扎。實施例3:胃食管喉氣管反流研究1.方法如實施例l所述方法構建模型后，每只大鼠均單籠放置并觀察，術后第一天禁食禁水，術后第二天給與亞甲蘭溶液(江蘇濟川制藥有限公司)，術后第三天開始給與少量顆粒鼠料。2.結果實驗組術后生存時間為3-6天，死亡解剖示IO只大鼠喉氣道不同程度輕微淡染，氣道內可見泡沫樣分泌物，其中2只大鼠喉氣道內有少量食物殘留。雙肺均未見異常。食管擴張器及塑膠片均未脫落，胃及食道不同程度藍染，胃不同程度擴張，內有食物殘留，塑膠片包裹近段腸管擴張，但包裹段腸腔通暢，鼠身均可見藍染痕跡，鼠籠底可見藍染痕跡和糞便存留。見表1對照組術后存活良好，于術后6天處死，解剖示喉氣道均未見藍染和氣道分泌物，雙肺未見異常，胃十二指腸未見異常。見表2。表l:實驗組反流結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注胃最大橫徑以胃部水平線最長距離為準，上下徑以胃食管連接部在垂直線上的最長距離為準。十二指腸直徑塑膠片包裹近端腸管外徑。第l、8只喉氣道內可觀察到少量食物殘留。表2:對照組反流結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與對照組相比，實驗組大鼠喉氣道內均可見藍染，部分大鼠氣道內可見泡沫狀分泌i物甚至胃內食物，見附圖1，2。說明實驗組食管下段植入擴張器，致使食管下括約肌功能喪失及食道動力異常，以上兩種致病因素的持續(xù)存在和作用加上胃腸排空障礙，促使實驗組中食管外直接反流達到了最大程度，胃內容物可反流至喉氣道，氣道受到反流物的侵襲激惹而使局部分泌物增多。同時也進一步說明直接反流機制是GERD源性呼吸疾患的重要機制之一。權利要求1.一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于將實驗動物固定于手術臺上，切開腹部并切開實驗動物的胃壁，將食管擴張器經(jīng)胃切口向賁門口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口連續(xù)全層加漿肌層縫合關閉；于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片包繞腸管外周，并縫扎固定于腸系膜，縫合腹部切口和包扎，建立胃食管喉氣管反流動物模型。2.根據(jù)權利要求l所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述實驗動物為大鼠。3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述切開腹部并切開實驗動物胃壁的方法是取腹正中切口，起于劍突向下長5cm，進腹顯露胃前壁，于胃食管交界下lcm無血管區(qū)縱行切開胃壁，切口長5mm。4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述包繞腸管的塑膠片長為1415mm，寬為68腿。5.根據(jù)權利要求1或2所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片包繞腸管外周的方法是于幽門環(huán)至幽門環(huán)遠端1.5cm之間十二指腸處用塑膠片緊貼腸管環(huán)形包繞腸管外周，形成環(huán)狀結構，包繞前該處腸管直徑為45mm，包繞后該環(huán)狀結構的直徑與包繞前該處腸管的直徑一致。6.根據(jù)權利要求1或2所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述食管擴張器為喇叭形。7.根據(jù)權利要求6所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述喇叭形食管擴張器上口直徑為3腿，下口直徑為5mm，管長為25mm。8.根據(jù)權利要求l所述的一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，其特征在于所述實驗動物還可以為兔、犬、羊或豬。全文摘要本發(fā)明涉及一種胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，屬于醫(yī)學生物
技術領域：
和實驗動物學領域。該胃食管喉氣管反流動物模型的制備方法，是將實驗動物固定于手術臺上，切開腹部并切開實驗動物的胃壁，將食管擴張器經(jīng)胃切口向賁門口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口連續(xù)全層加漿肌層縫合關閉；于幽門環(huán)遠端十二指腸處用塑膠片包繞腸管外周，并縫扎固定于腸系膜，縫合腹部切口和包扎，建立胃食管喉氣管反流動物模型。本發(fā)明的特點是手術操作簡單，動物術后存活時間長，制備原理更接近臨床實際，支持反流機制在GERD源性呼吸疾患中的作用。文檔編號A61B19/00GK101507659SQ20091008005公開日2009年8月19日申請日期2009年3月18日優(yōu)先權日2009年3月18日發(fā)明者吳繼敏,姜合作,建張,李建新,來運鋼,汪忠鎬,秀陳申請人:首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院