專利名稱：橋梁分子1-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是用于抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散 的橋梁分子1-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄后的基因沉默是進(jìn)化過程中一種抵御轉(zhuǎn)錄子和RNA病毒的防御 機(jī)制，在植物和動(dòng)物分化之前就已經(jīng)出現(xiàn)。1998年華盛頓卡耐基研究院 的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello首次將雙鏈 dsRNA (double-stranded RNA)注入線蟲，結(jié)果i秀發(fā)了比正義鏈和反義 鏈的單獨(dú)注射都要強(qiáng)的基因沉默。將這種由dsRNA引發(fā)的特定基因表達(dá) 受4卬制J見象牙爾為RNA干擾4t用(RNA interference RNAi )。
RNA干擾是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是真核生物中 一種非常保守的機(jī)制，它與協(xié)同抑制、轉(zhuǎn)錄子沉默以及發(fā)育等許多重要 的生物學(xué)過程密切相關(guān)。RNA干擾依賴于小干擾RNA (Small interference RNA, siRNA)與耙序列之間嚴(yán)格的堿基配對，具有很強(qiáng)的特異性，涉及眾 多基因和蛋白復(fù)合物，構(gòu)成了一個(gè)以小RNA為核心的真核基因表達(dá)調(diào)控 系統(tǒng)，它可以在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平參與基 因表達(dá)的調(diào)節(jié)。RNA干擾技術(shù)為人們迅速、準(zhǔn)確的剖析基因的功能，分析 基因之間錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系和相互作用提供了極為有用的工具，同時(shí)也為 人們預(yù)防和治療癌癥和病毒疾病提供了新的思路，例如研究信號傳導(dǎo) 通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中降低特異性基因的表達(dá)，制作多 種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間，控制基因表達(dá)的部位，以開展基因 治療的新途徑。
惡性膠質(zhì)瘤是一類惡性程度極高的惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40 %和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性肺瘤78%。惡性膠質(zhì)瘤向周圍正常腦組織侵襲浸 潤是其致死的主要原因，盡管現(xiàn)代的診斷和治療技術(shù)已經(jīng)有了長足的發(fā) 展，其中位生存時(shí)間仍然不超過15個(gè)月。迄今為止惡性膠質(zhì)瘤侵襲浸潤 的分子機(jī)制，尚未完全明確。
橋梁分子1 (Intersectinl)又,皮《爾為EHSHl， intersectin， Dap60, Ese-1,是一種在進(jìn)化上高度保守的具有多個(gè)功能域(domain)的蛋白， 基因位于人類的第21條染色體。Intersectinl借助自身的各種功能域可 以與多種蛋白結(jié)合從而發(fā)生相互作用的特性，Intersectinl又被稱為是 一種聯(lián)結(jié)蛋白(adaptor protein )。目前的研究表明Intersectinl既能 夠參與胞吞胞吐作用又參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決惡性膠質(zhì)瘤病人腫瘤細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散問題，提供
一種intersectinl-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體。
鑒于在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)方面，Intersectinl能夠調(diào)控細(xì)胞的凋亡， Intersectinl參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的浸潤和擴(kuò)散，因此通過siRNA基因 敲除技術(shù)可以耙向抑制Intersectinl的表達(dá)，并對Intersectinl參與 的細(xì)月包;旻潤和擴(kuò)散功能產(chǎn)生抑制作用，為腫瘤的基因治療提供一種可行的技術(shù)手 段。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一革殳intersect inl-siRNA干擾序列，該片l殳能夠降低intersectinl 蛋白的表達(dá)，并對intersectinl參與的細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散功能產(chǎn)生抑制作 用，該片段見序列表l。
一種intersectinl-siRNA融合表達(dá)載體，該融合表達(dá)栽體具有抑制 惡性膠質(zhì)瘤LN- 229細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力，能夠抑制惡性膠 質(zhì)瘤LN- 229細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力，能夠降低腫瘤細(xì)胞的浸 潤和擴(kuò)散能力。
本發(fā)明的有益效果將intersectinl-siRM融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人膠 質(zhì)瘤細(xì)胞系后，能夠特異的降解與其互補(bǔ)的intersectinl mRNA，降低人 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的intersectinl的表達(dá)，而且可以有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì) 胞的遷移，粘附以及侵襲能力，具有抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散的作 用，制成藥物，可用于治療腫瘤病人。


圖1是人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染intersectinl-siRNA融合表達(dá)載體質(zhì) 4立后intersectinl蛋白表達(dá) K平；
圖2a是劃痕實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組與對照組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移情
況；
圖2b是轉(zhuǎn)染組intersectinl蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的粘附能力與對 照組細(xì)胞比較；
圖3是轉(zhuǎn)染組intersectinl蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力與 對照組細(xì)胞比較；
圖4a是粘附實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組與對照組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞粘附情
況；
圖4b是轉(zhuǎn)染組intersectinl蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的粘附能力與對 照組細(xì)胞比較；
圖5是轉(zhuǎn)染組intersectinl蛋白表達(dá)降低的細(xì)胞的侵襲能力與對照 組細(xì)胞比較。
具體實(shí)施方式
一. 實(shí)驗(yàn)材料來源
人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN - 229細(xì)胞株由美國德克薩斯大學(xué)MD Anderson 癌癥中心才是供，趨化小室購自Neuro Probe />司，EGF購自Peprotech 公司，intersectinl抗體來自于Abeam公司，G418購自Invi trogen公 司。
二. intersectinl-siRNA的設(shè)計(jì)與合成
依據(jù)Ambion />司在網(wǎng)上提供的siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異的 intersectinl-siRNA,并由上海吉瑪制藥4支術(shù)有限公司合成以下模版， 兩端分別帶有BamH I和Bbs I酶切位點(diǎn)，siRNA作用位點(diǎn):5， -GGCTGGCT TGGAGGAGAATTA- 3，。
Query 1
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三. intersectinl-siRNA融合表達(dá)載體的制備
表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo載體其結(jié)構(gòu)為線性，兩端分別為BamH I和 Bbs I酶切位點(diǎn)的粘性末端。將合成的intersectinl-siRM退火，連接 酶作用下連入pGPU6/GFP/Neo載體中，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5a，鋪平 板過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒。酶切測序驗(yàn)證插入序列。 應(yīng)用Qiagen Plasmid Maxi ^式劑盒提取純4匕intersectinl—siRNA融合表 達(dá)載體質(zhì)粒，確保無內(nèi)毒素污染，用無RNA酶水溶解載體，終濃度為 10ng/ml， -80 C凍存，備用。
陰性對照control-siRNA載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供， 含有一段與人類已知基因均不同的siRNA，在本發(fā)明中稱其為scr。
四. 融合表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞
先將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓處理，2小時(shí)后將Vg融合表達(dá)載 體與1X1()5細(xì)胞混合，采用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6小時(shí) 后換為完全培養(yǎng)液，3天后添加G418抗生素進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染不成功的細(xì) 胞由于沒有攜帶抗生素的抗性基因則逐漸死亡，剩余存活的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染 成功的細(xì)胞。針對這些存活細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選，那些能夠使 intersectinl的表達(dá)顯著降低的克隆為下面實(shí)-險(xiǎn)所用。 五.;險(xiǎn)測轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞中intersectinl的表達(dá)水平免疫印跡方法斗企測intersectinl的表達(dá)水平將對照細(xì)月包和 intersectinl-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，并應(yīng)用超 聲破碎儀輔助裂解，然后置于沸水中靜置IO分鐘。處理后的樣本進(jìn)行離 心以取出沉淀。隨后應(yīng)用蛋白定量檢測試劑盒對樣本進(jìn)行蛋白定量4企測， 然后進(jìn)行蛋白電泳，并將樣本蛋白傳遞至硝酸纖維素薄膜上，用5%煉乳 溶液進(jìn)行室溫封閉1小時(shí)，然后加入intersectinl抗體，在4 C冰箱 中靜置過夜，第二天用二抗進(jìn)行室溫孵育1小時(shí)，然后應(yīng)用ECL方法進(jìn) 行X光片曝光處理，以得到蛋白條帶。根據(jù)曝光條帶的深淺判斷蛋白的 表達(dá)量。通過此方法4企測結(jié)果，i正實(shí)了經(jīng)過intersectinl-siRNA融合表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染后調(diào)選出的細(xì)胞克隆，其intersectinl的表達(dá)量由顯著降低， 見圖1。
六. 檢測轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力
采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自主運(yùn)動(dòng)能力。劃痕
實(shí)驗(yàn)是指在單層生長的細(xì)胞中間用iopi的微量槍頭劃出粗細(xì)均勻的一條
痕跡，然后在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞向劃痕中間遷移的距離，這是^r測細(xì) 胞運(yùn)動(dòng)能力的一種重要的技術(shù)手段。根據(jù)實(shí)驗(yàn)照片，證實(shí)轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì) 瘤細(xì)胞在12小時(shí)和24小時(shí)遷移的距離比對照組有明顯降低，進(jìn)一步在 不同時(shí)間點(diǎn)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，證實(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力比對照 有明顯降低(P<0. 05)，見圖2a、圖2b，。
七. 檢測轉(zhuǎn)染后的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化能力
趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞在趨化因子的作用下，向趨化因子的方向進(jìn)行遷移 的運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，它是一種檢測細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)的重要指標(biāo)和方法。在本實(shí)驗(yàn) 中，我們應(yīng)用腫瘤細(xì)胞的 一種趨化因子表皮生長因子EGF作為誘導(dǎo)因子， 觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的趨化能力。實(shí)驗(yàn)中EGF的使用濃度為0， 1， 10， 100， 1000 ng/ml。采用Neuroprobe公司的48孔趨化小室進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。對 照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在實(shí)驗(yàn)前用無血清培養(yǎng)液饑餓3小時(shí)，然后在37 C培養(yǎng)箱中趨化3小時(shí)。趨化實(shí)驗(yàn)中用到的薄膜購自Neuroprobe公司， 并且在使用前預(yù)先用l(Vg/ml的纖維粘連蛋白進(jìn)行包被，以使細(xì)胞能夠 很好的粘附與薄膜。趨化實(shí)驗(yàn)完畢后，薄膜進(jìn)行固定和染色，然后在400 倍顯微鏡下觀察穿過薄膜的細(xì)胞數(shù)，鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì) 數(shù)并取平均值。把EGF為0 ng/ml的對照組細(xì)胞穿過薄膜的數(shù)目作為1， 其他組的數(shù)值與其細(xì)胞數(shù)的比值作為趨化指數(shù)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EGF誘導(dǎo) 的趨化運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出鐘樣趨勢，即EGF為10ng/ml為最佳的趨化濃度，濃 度過低或過高都沒有最佳效果。對照組細(xì)胞在最佳濃度的趨化因子存在 下，其趨化指數(shù)約為8，而實(shí)驗(yàn)組則只有4，兩者有顯著的差異(P〈0. 05)， 見圖3。
6八. 檢測轉(zhuǎn)然后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的粘附能力
粘附能力是腫瘤細(xì)胞侵襲浸潤的 一個(gè)先決條件，粘附能力的高低在 一定程度上決定著侵襲浸潤能力的強(qiáng)弱。取相同細(xì)胞數(shù)目的培養(yǎng)的對照
組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，分別用10 ng/m 1的EGF作為刺激因子加入到細(xì)胞懸液 中，然后把細(xì)胞種入細(xì)胞培養(yǎng)皿(內(nèi)置有預(yù)先用纖維粘連蛋白包被過的 玻片)，再分別在l分鐘，5分鐘，15分鐘，30分鐘的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行洗滌， 只有粘附在玻片上的細(xì)胞存留在培養(yǎng)皿中，沒有粘附的細(xì)胞全部被清洗 掉，然后對細(xì)胞進(jìn)行固定并進(jìn)行封片，最后用顯微鏡觀察粘附細(xì)胞的數(shù) 量。200倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并取平均值。結(jié)果表明， 轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞由于intersectinl表達(dá)的降低，粘附能力比對照組 有顯著降低，見圖4a、圖4b。
九. 檢測轉(zhuǎn)然后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力
在研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外侵襲能力的研究中，Matrigel基質(zhì)膠侵襲 實(shí)驗(yàn)通常被用來檢測肺瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)中采用24孔insert板， 內(nèi)置有8微米的薄膜，購自于Costar公司。將從sigma公司購買的 Matrigel基質(zhì)膠預(yù)先均勻涂布在薄膜上，然后將相同數(shù)目的對照組和實(shí) 驗(yàn)組細(xì)胞種于24孔insert板內(nèi)，至于37 C細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時(shí)， 實(shí)驗(yàn)完畢后，取出薄膜進(jìn)行固定和染色，計(jì)數(shù)方法與趨化實(shí)驗(yàn)相同。結(jié) 果表明，轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力與對照組有SEQUENCE LISTING
<110>天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
〈120〉 intersectinl-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體
<130〉 人
<160〉 1
〈170> Patentln version 3. 1
<210> 1
〈211〉 21
〈212〉 DNA
<213> 2 Arabystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉
<221〉 DNA
<222> (l)..加 〈223〉
<400> 1
ggctggcttg gaggagaatt a 2權(quán)利要求
1.一段橋梁分子1-siRNA干擾序列，其特征在于該片段能夠降低橋梁分子1蛋白的表達(dá)，并對橋梁分子1參與的細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散功能產(chǎn)生抑制作用，該片段見序列表1。
2. —種如權(quán)利要求1所述的橋梁分子1-siRNA融合表達(dá)載體，其特 征在于該融合表達(dá)載體具有抑制惡性膠質(zhì)瘤LN- 229細(xì)胞的體外遷移能 力，趨化能力，能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤LN- 229細(xì)胞的體外粘附能力，侵 襲能力，能夠降低腫瘤細(xì)胞的浸潤和擴(kuò)散能力。
全文摘要
本發(fā)明公開了橋梁分子1-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明合成一段橋梁分子1-siRNA干擾序列，該片段能夠降低橋梁分子1蛋白的表達(dá)，并對其參與的細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散功能產(chǎn)生抑制作用；而橋梁分子1-siRNA融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后，能夠特異的降解與其互補(bǔ)的橋梁分子1mRNA，具有抑制惡性膠質(zhì)瘤LN-229細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力，能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤LN-229細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力，能夠降低腫瘤細(xì)胞的浸潤和擴(kuò)散能力，為腫瘤的基因治療提供一種可行的技術(shù)手段。
文檔編號A61K48/00GK101560514SQ20091006784
公開日2009年10月21日 申請日期2009年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月11日
發(fā)明者麗 付, 牛瑞芳, 王冰冰, 峰 谷, 馬勇杰 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院