專利名稱：蛇床子素在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中草藥單體蛇床子素的新用途，具體涉及蛇床子素在制備抑 制血管新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生(angiogenesis)是在原有血管結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上產(chǎn)生新血管的過程，是 細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞因子之間相互作用的結(jié)果。血管新生存在 于正常的生理過程中，例如胚胎發(fā)育過程和女性生理周期中。同時，血管新生還 存在于許多病理過程中。
血管新生是一個復(fù)雜的過程，包括五個基本過程①血管細(xì)胞分泌蛋白水 解酶降解血管基底膜；②內(nèi)皮細(xì)胞穿過基底膜遷移到血管周圍基質(zhì)；③內(nèi)皮細(xì)胞 增殖、相互黏附并連接；④形成管腔樣結(jié)構(gòu)；⑤基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞的包繞及 血管的相互吻合形成血管網(wǎng)。
上世紀(jì)70年代，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院福克曼(Folkman)提出腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依 賴于血管新生，腫瘤在沒有養(yǎng)分的供應(yīng)下，只能長到2-3立方毫米。 一旦有新生 血管與其相連，腫瘤獲得營養(yǎng)，以幾何級數(shù)迅速生長，同時腫瘤細(xì)胞還可以通過 新生血管轉(zhuǎn)移到其他器官，引起腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致人體死亡，因此，可以通過抑制 血管新生抑制腫瘤。美國食品與藥品管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)某些血管新生抑制 劑用于腫瘤臨床治療，通過抑制血管新生來抑制腫瘤以及其他相關(guān)疾病具有廣闊 的應(yīng)用前景。
抗血管生成治療與傳統(tǒng)的抗腫瘤治療相比，有以下優(yōu)點l)血管內(nèi)皮細(xì)胞 基因穩(wěn)定，因此一般難以產(chǎn)生耐藥性；2)抗瘤譜廣，不良反應(yīng)??；3)與傳統(tǒng)的 化療、放療等聯(lián)用，表現(xiàn)出較好的協(xié)同效應(yīng)。目前，血管新生抑制劑或多種類似 制劑已用于治療癌癥和在進(jìn)行臨床試驗。在諸多制劑中， 一些中草藥單體被發(fā)現(xiàn)具有抗血管新生的作用。
已公開的研究表明蛇床子素具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗肝炎、抗變態(tài)反 應(yīng)、抑制血小板聚集以及抗病毒等多種藥理活性。但是，迄今為止，還沒有關(guān)于 蛇床子素可以抑制血管新生或通過血管新生來抑制腫瘤的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供蛇床子素在制備抑制血管新生藥物中的 應(yīng)用。本發(fā)明的蛇床子素，是從傘形科植物中提取分離的純天然香豆素類化合物， 英文名稱為osthde或osthol，又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，其化學(xué)名稱為 7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，其分子式為C15H1603，分子量為244.29，其結(jié)構(gòu) 式如下
本發(fā)明公開了蛇床子素的新用途以及其在制備血管新生藥物中的應(yīng)用。實驗 表明，蛇床子素在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖實驗、遷移實驗(本專 利指Boyden小室遷移實驗)、細(xì)胞成管實驗、雞胚尿囊膜血管新生等方面均有 明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是蛇床子素在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用，尤其 是蛇床子素在抑制糖尿病綜合癥、乳腺癌、前列腺癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤、 銀屑病等血管新生性疾病方面的應(yīng)用。所述抑制血管新生藥物可以抑制腫瘤血管 新生，關(guān)節(jié)炎病變組織血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病變組織血管新生， 銀屑病病變組織血管新生，實體瘤病變組織血管新生，血管瘤，Kaposi' s肉瘤 (艾滋病患者最常見的惡性腫瘤)病變組織血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤 血液癌癥、Paget' s疾病(慢性骨瘤樣變性)血管新生。其中，所述關(guān)節(jié)炎為 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性關(guān)節(jié)炎。所述眼病為新生血管性角膜疾病，新生血管性視 網(wǎng)膜疾病，血管新生性虹膜疾病，新生血管性青光眼，新生血管性脈絡(luò)膜疾病，新生血管性結(jié)膜眼病，生成血管型白內(nèi)障，新生血管性玻璃體眼病，新生血管性 視神經(jīng)疾病。所述視網(wǎng)膜病為糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞，早產(chǎn)兒視 網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜動脈閉塞。所述脈絡(luò)膜病為濕性老年黃斑病變。所述實體瘤包 括原發(fā)性或繼發(fā)性實體瘤。所述血管瘤包括多發(fā)性血管瘤，血管母細(xì)胞瘤，良性 血管增生疾病。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案還包括含有有效量的式(I)蛇床子素以及藥學(xué)可接受 成分的組合物在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效的蛇床子素(純度298%)和藥學(xué)上允許的任意 一種輔料制成藥物組合物，也可以添加其他與蛇床子素沒有拮抗作用的其他抗血 管新生藥物。其制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于末劑、散劑、、 片劑、丸齊!J、滴齊U、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、膠囊劑、糖衣劑、口服液、注射 劑、脂質(zhì)體、舌下含片等。
為實施本發(fā)明的方法，蛇床子素可通過口服、腸胃外、吸入式噴霧或通過植 入式貯存器給藥。"腸胃外"包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈 內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸入技術(shù)?？诜捎霉腆w或 液體狀的劑量單位，如末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、 溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片等劑型進(jìn)行給藥。末劑是將本發(fā)明化合物磨成 適當(dāng)?shù)募?xì)度而制成。散劑是將本發(fā)明化合物磨成適當(dāng)?shù)募?xì)度，然后與同樣細(xì)度的 醫(yī)藥用載體(如載體、甘露糖醇之類可食性碳水化合物等)混合制成。根據(jù)需要， 也可混入矯味劑、防腐劑、分散劑、著色劑、香料等物質(zhì)。膠囊劑是將如上所述 制成粉末狀的末劑和散劑或入片劑部分所述的顆?；奈镔|(zhì)填充到如明膠膠囊 外殼中而制成。也可將潤滑劑和助流劑等混合到粉末狀物質(zhì)中，然后在膠囊中進(jìn) 行填充操作。若添加助溶劑和崩解劑等，如聚乙二醇，碳酸鈉，可改善膠囊攝取 時的藥效。


圖l:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖；
圖2a，圖2b:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移；圖3a,圖3b:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外Boyden小室遷移；圖4a，圖4b:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外成管；圖5a，圖5b:蛇床子素抑制雞胚尿囊膜新生血管的形成。以上各圖中，均以p〈0.05表示有顯著差異，其中，*， p<0.05; **， p<0.01;承氺氺，p<0.001 。
具體實施例方式
實驗例l:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖實驗
目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗采用MTS assay。 MTS assay是一種運用比色法間接測量活細(xì)胞數(shù)量的測定方法。在活細(xì)胞中，線粒體中的NADPH脫氫酶將MTS四唑鹽化合物轉(zhuǎn)變成一種溶于細(xì)胞培養(yǎng)液的有色物質(zhì)-甲瓚，其顏色深淺與細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)高度相關(guān)。通過該方法可評價藥物對細(xì)胞增殖能力的影響。
方法將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接入96孔板中(5000個/ L)，分別加入含有不同濃度蛇床子素的培養(yǎng)基作用48—72小時，然后加入顯色劑，孵育1—4小時。用酶標(biāo)儀在490nm處讀出每個孔的光吸收值。
結(jié)果與評價與對照組相比，加入蛇床子素的實驗組，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力受到抑制，說明蛇床子素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，結(jié)果見圖l。
實施例2:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外遷移實驗
目的和原理細(xì)胞遷移實驗又稱體外劃痕實驗。本實驗通過在培養(yǎng)板中長滿
的單層內(nèi)皮細(xì)胞上制造劃痕，在顯微鏡下觀察，同時記下劃痕處新遷入的內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，來評價藥物對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。
方法將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至90%左右，用移液器吸頭在每個孔中劃十字劃痕。用PBS將劃下的細(xì)胞洗去，加入含不同濃度的藥物以及VEGF的培養(yǎng)基，于37。C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至VEGF組長滿
結(jié)果與評價實驗結(jié)果如圖2a，圖2b所示，在顯微鏡下觀察拍照統(tǒng)計。其中2a為對照組；2b為含蛇床子素100微摩爾/升組。與對照組相比，加入蛇床子素后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到抑制，說明蛇床子素可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
實施例3:蛇床子素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外Boyden小室遷移實驗?zāi)康暮驮砣四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞體外Boyden小室遷移實驗采Millipore公司的Boyden培養(yǎng)小室，在生長因子的誘導(dǎo)下細(xì)胞可以穿過小室8微米的膜，此實驗可以檢測藥物對內(nèi)皮細(xì)胞穿膜能力的影響。
方法將小室置入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入明膠孵育30分鐘，30分鐘后棄去明膠，用PBS洗三遍。小室外加入含有VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，小室中接入一定數(shù)目的細(xì)胞，之后再加入不同濃度的蛇床子素藥物，在37'C， 5%0)2培養(yǎng)箱中孵育四小時。
結(jié)果與評價四小時后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，用棉棒將上層未遷移的細(xì)胞拭去，將小室浸泡在4%多聚甲醛中固定20分鐘，用PBS洗三遍吸干，蘇木精染色，用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干，顯微鏡下拍照計數(shù)。結(jié)果如圖3a，圖3b所示其中3a為對照組；3b為含蛇床子素100微摩爾/升組。與對照組比，給予蛇床子素后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穿過小室的能力受到抑制，說明蛇床子素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞穿過微孔膜的能力。
實施例4:蛇床子素抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外成管實驗
目的和原理Matrigel是從小鼠肉瘤EHS (Engkebreth-Holm-Swarm)中抽提得到的可容性基底膜抽提物，富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其主要成份是層粘連蛋白、膠原IV、硫酸肝素糖蛋白、TGF-e等。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人微管內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigel上貼附成管，可以利用人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上的這種成管特性來研究藥物對內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響。
方法將Matrigel鋪到24孔板上，于37"C， 5%0)2培養(yǎng)箱中放置30min待其多聚化。每孔加入一定量的細(xì)胞數(shù)目，再加入含有不同濃度蛇床子素的培養(yǎng)基，混勻。于37"C， 5X培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h在顯微鏡下觀察微管形成情況。每孔選擇上下左右四個不同部位，計算微管形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果與評價人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長16-18h后，單個細(xì)胞巻
7成管裝并相互連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果如圖4a，圖4b所示，其中4a為對照組；4b為含蛇床子素100微摩爾/升組。與對照組相比，給予蛇床子素之后，內(nèi)皮細(xì)胞成管過程受到影響，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說明蛇床子素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管的形成。
實施例5:蛇床子素抑制雞胚尿囊膜血管新生實驗
目的和原理雞胚尿囊膜模型目前來說，是一種較為理想的國內(nèi)外篩選血
管新生類藥物公認(rèn)的篩選模型。將含藥物的載體置于受精雞胚尿囊膜表面的無血管區(qū)，可觀察到藥物對新的微血管生成的影響。
方法將受精的雞胚置于孵化箱中孵化5天，在超凈工作臺中，用70%酒
精浸泡的棉球擦拭其表面，在雞胚卵殼鈍端(氣室端)用鑷子小心地開一個直徑
約0.5厘米的小口，通過開出的小孔觀察胚胎所在的位置，沿著相反的方向剝除
外殼，在血管稀疏的地方用鑷子撕開氣室膜露出尿囊膜。將不同量的蛇床子素分
別加到直徑大小為0.5平方毫米的經(jīng)過高壓滅菌的濾紙片(德國Whatman公司)上，再將濾紙片加在尿囊膜上無血管區(qū)，用滅菌的透明膠帶封口，放入孵育箱中繼續(xù)孵育。
結(jié)果與評價放入濾紙片的雞胚放入孵育箱中繼續(xù)孵育兩天后，揭去透明膠
帶，在顯微鏡下拍照，計算濾紙周圍2.5毫米環(huán)形范圍內(nèi)新生微血管的數(shù)量。實驗結(jié)果如圖5a，圖5b所示，5a為對照組，不加蛇床子素；5b為含蛇床子素10微克/片組。與對照組比較，加蛇床子素之后，新的微血管生成受到抑制，說明蛇床子素可以抑制雞胚尿囊膜新血管的生成。
權(quán)利要求
1.蛇床子素在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用，其中，所述蛇床子素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制血管新生藥物可抑制 腫瘤血管新生。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制血管新生藥物可抑制 病變組織血管新生。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤血管新生包括白血病、 淋巴瘤、骨髓瘤血液癌癥的血管新生，Kaposi' s肉瘤病變組織血管新生， Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血管瘤病變組織血管新生，實體瘤病變組 織血管新生，多發(fā)性血管瘤，血管母細(xì)胞瘤，良性血管增生疾病。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病變組織血管新生包括關(guān) 節(jié)炎病變組織血管新生，新生血管性眼病，銀屑病病變組織血管新生。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，含有有效量的式(I)蛇床子素 以及藥學(xué)可接受成分的組合物在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛇床子素在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。所述蛇床子素可以抑制腫瘤血管新生，關(guān)節(jié)炎病變組織血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病變組織血管新生，銀屑病病變組織血管新生，實體瘤病變組織血管新生，血管瘤，Kaposi’s肉瘤病變組織血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌癥，Paget’s疾病血管新生。還提供了含有有效量的蛇床子素以及藥學(xué)可接受成分的組合物在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/37GK101647796SQ20091005624
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者代付軍, 劉明耀, 盧彬彬, 宋雅娟, 京 張, 張曉麗, 易正芳, 力 賴 申請人:華東師范大學(xué)