專利名稱：高純度藜蘆胺和介芬胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)。具體涉及一種以中藥材藜蘆為原料制備高純度藜蘆胺 (Veratramine)和介芬胺(Jervine)的方法。
背景技術(shù)：
藜盧屬(VeratrumLinn.)為百合科(Liliaceae)植物，世界上約有40種，據(jù)《中 國植物志》記載中國有13個種和一個變種。中醫(yī)用藜蘆的根和根莖入藥，用于 中風(fēng)痰壅，癲癇、喉痹不通及疥癬和惡瘡。藜蘆屬植物化學(xué)成分包括甾體生物堿 類化合物、芪類化合物、二肽類、黃酮類及其它類化合物。其中生物堿是其主要 活性成分?，F(xiàn)代研究表明，藜蘆具有降血壓、抗腫瘤等作用，其中藜蘆甾體生物 堿，尤其是藜蘆胺和介芬胺為主要生理活性成分。目前，在藜蘆甾體生物堿的制 備方面，國內(nèi)外尚未見高純度藜聲胺和介芬胺的工業(yè)制備研究報道。而實驗室研 究報道，藜蘆甾體生物堿的制備方法主要有醇提取后，酸水溶解、堿沉淀法，采 用這種方法，藜蘆甾體生物堿損失極大，收率低，生產(chǎn)成本高；另一種方法是采 用醇類有機(jī)溶劑提取，濃縮后，以不同極性的有機(jī)溶劑，如氯仿、二氯甲垸、乙 酸乙酯等萃取富集，但采用此方法，有機(jī)溶劑殘留高、毒性大、操作步驟復(fù)雜， 雜質(zhì)含量高、不適宜工業(yè)生產(chǎn)操作等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計操作簡單、適 宜工業(yè)生產(chǎn)藜蘆胺和介芬胺的制備方法。
本發(fā)明提供了一種高純度藜蘆胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制備 方法。該方法包括下列步驟
(1)藜盧藥材原料的提取
藜盧藥材粉碎后，在常壓提取裝置中用60~90%乙醇回流提取三次,每次1~3小時，合并提取液過濾濃縮得濃縮液；
(2) 大孔吸附樹脂富集
濃縮液加2~5倍體積的水稀釋后,加入到大孔吸附樹脂柱上，依次以30倍體 積的去離子蒸餾水洗脫大極性雜質(zhì)，再以20倍體積的0.05~0.5%的堿性水溶液 進(jìn)行洗脫，繼以20倍體積的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色，再以70~90%的 酒精洗脫得到藜蘆總留體生物堿的洗脫液；
(3) 色譜柱純化
洗脫液減壓濃縮到無醇味，進(jìn)行色譜柱層析，流動相洗脫，薄層層析檢測， 分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液分別減壓濃縮至干，重結(jié)晶，過濾，干燥， 得到高純度藜蘆胺和介芬胺。
本發(fā)明方法所述大孔吸附樹脂柱為AB-8、 DlOl、 ZTC-1或Diaion HP20大 孔樹脂柱。
所述堿性水溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣水溶液。 色譜柱填料為硅膠、氧化鋁或反相硅膠。
色譜流動相為硅膠色譜，石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2;氧化鋁色譜，石 油醚乙酸乙酯:甲醇氨水7:5:1:0.1 3:5:1:0.1;反相硅膠色譜，甲醇水50: 50~70: 30或乙醇:水40: 60~70: 30。
重結(jié)晶溶劑為60%~100%的乙醇或甲醇溶液。
本發(fā)明用乙醇水溶液進(jìn)行提取，經(jīng)大孔吸附樹脂柱富集后，進(jìn)行柱色譜純化， 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸堿法和有機(jī)溶劑萃取法，具有自動化程度高、操作簡便、產(chǎn)率高的 優(yōu)點(diǎn)，以克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足之處，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。
大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良 好的吸附性能，近十余年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的分離和中藥新藥的開 發(fā)研制。大孔吸附樹脂是一類以吸附為特點(diǎn)，對有機(jī)物有濃縮分離作用的高分子 聚合物,在水溶液中，大孔吸附樹脂對有機(jī)物具有良好的吸附選擇性，可以固相 萃取的方法，在吸附藜蘆甾體生物堿的同時將糖類等大極性成分去除。大孔吸附 樹脂的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，對有機(jī)物的選擇性較好，不受 無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物的影響。通常，酸性化合物在堿性溶液中被解吸 附，堿性化合物在酸性溶液中被解吸附。藜蘆甾體生物堿為堿性化合物，而植物提取物中的色素成分多為酸性化合物，因此，本發(fā)明采用稀堿溶液對大孔吸附樹 脂柱洗脫，可最大限度的將色素雜質(zhì)洗脫，而藜蘆留體生物堿不受影響，提高產(chǎn) 品的純度。藜蘆甾體生物堿富集于在大孔吸附樹脂柱的70~90%乙醇洗脫部位。 繼而采用色譜方法分離純化藜蘆總甾體生物堿，硅膠色譜石油醚乙酸乙酯系 統(tǒng)；氧化鋁色譜石油醚:乙酸乙酯:甲醇:氨水系統(tǒng)；反相硅膠色譜甲醇:水、 乙醇:水混合體系。分別收集富含藜蘆胺和介芬胺的洗脫部位，經(jīng)濃縮去除有機(jī) 溶劑后，在甲醇:水、乙醇:水混合體系重結(jié)晶，過濾，可以得到高純度的藜蘆胺 和介芬胺，含量達(dá)到90~100%。本發(fā)明采用大孔吸附樹脂法富集總生物堿，可 最大限度的減少藜蘆生物堿的損失，進(jìn)一步提高產(chǎn)品收率。
本發(fā)明方法制備得到的藜蘆胺和介芬胺單體化合物純度高于98%，通過光 譜數(shù)據(jù)。H-NMR、 13C-NMR、 DEPT、 MS、 UV)，單體化合物經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)為藜 戸胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)。
具體實施例方式
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案-實施例1:
高純度藜蘆胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制備藜蘆藥材5Kg粉碎 后，在常壓提取裝置中用60%乙醇回流提取三次，每次1小時，提取液過濾減 壓濃縮至無醇味，濃縮液2倍體積的水稀釋加水稀釋后，加入AB-8大孔吸附樹 脂柱上，以150L的去離子蒸餾水洗脫，再以100L的0.05%的氫氧化鈉水溶液進(jìn) 行洗脫，繼以100L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色，再以70~卯％的酒精洗 脫藜戸生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味小體積，與200g硅膠混勻后， 進(jìn)行硅膠色譜柱層析，以石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2流動相洗脫，薄層層析 跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液減壓濃縮至干后在60%乙醇溶液中 進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥，得到純度為97%的藜蘆胺218和98%的介芬胺14.6g。 兩個化合物的鑒定數(shù)據(jù)見表。
實施例2:
藜戸藥材5Kg粉碎后，在常壓提取裝置中用75%乙醇回流提取三次，每次 2小時，提取液過濾減壓濃縮至無醇味，濃縮液4倍體積的水稀釋加水稀釋后，加入D101大孔吸附樹脂柱上，以150L的去離子蒸餾水洗脫，再以100L的0.1% 的氫氧化鉀水溶液進(jìn)行洗脫，繼以100L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色， 再以70~90%的酒精洗脫藜蘆生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味，與250g 氧化鋁混勻后，進(jìn)行氧化鋁色譜柱層析，以石油醚乙酸乙酯甲醇氨水 7:5:1:0.1 3:5:1:0.1洗脫，薄層層析跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液 減壓濃縮至干后在75%乙醇溶液中進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到純度為92%藜 蘆胺23.5g和93%的介芬胺13.3g。 實施例3:
藜蘆藥材10Kg粉碎后，在常壓提取裝置中用卯％乙醇回流提取三次，每次 3小時，提取液過濾減壓濃縮至無醇味，濃縮液5倍體積的水稀釋加水稀釋后， 加入ZTC-1大孔吸附樹脂柱上，以300L的去離子蒸餾水洗脫，再以200L的0.5% 的氫氧化鈣水溶液進(jìn)行洗脫，繼以200L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色， 再以70~90%的酒精洗脫藜蘆生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味，與400g 反相硅膠混勻后，進(jìn)行反相硅膠色譜柱層析，以甲醇水50:50-70:30洗脫，薄 層層析跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液減壓濃縮至干后在甲醇溶液 中進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到純度為96%的藜蘆胺46.4g和98%的介芬胺21.9g。
實施例4:
藜蘆藥材7,5Kg粉碎后，在常壓提取裝置中用80%乙醇回流提取三次，每 次2小時，提取液過濾減壓濃縮至無醇味，濃縮液3倍體積的水稀釋加水稀釋后， 加入DiaionHP20大孔吸附樹脂柱上，以250L的去離子蒸餾水洗脫，再以170L 的0.2%的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行洗脫，繼以170L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行 脫色，再以70~90%的酒精洗脫藜蘆生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味， 與300g硅膠混勻后，進(jìn)行硅膠色譜柱層析，以石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2洗 脫，薄層層析跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液減壓濃縮至干后在 60%甲醇溶液中進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到純度為95%的藜蘆胺32.^和96% 的介芬胺18.4g。
實施例5:
藜盧藥材20Kg粉碎后，在常壓提取裝置中用85%乙醇回流提取三次，每次 l小時，提取液過濾減壓濃縮至無醇味，濃縮液4倍體積的水稀釋加水稀釋后，加入AB-8大孔吸附樹脂柱上，以600L的去離子蒸餾水洗脫，再以400L的0.5% 的氫氧化鉀水溶液進(jìn)行洗脫，繼以400L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色， 再以70~90%的酒精洗脫藜蘆生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味，與400g 氧化鋁混勻后，進(jìn)行氧化鋁色譜柱層析，以石油醚乙酸乙酯甲醇氨水 7:5:1:0.1-3:5:1:0.1洗脫，薄層層析跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液 減壓濃縮至干后在80%甲醇溶液中進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到純度90.5%藜蘆 胺59.4g和92%的介芬胺35.2g。 實施例6:
藜戸藥材10Kg粉碎后，在常壓提取裝置中用70%乙醇回流提取三次，每次 3小時，提取液過濾減壓濃縮至無醇味，濃縮液5倍體積的水稀釋加水稀釋后， 加入Diaion HP20大孔吸附樹脂柱上，以300L的去離子蒸餾水洗脫，再以200L 的0.1%的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行洗脫，繼以200L的10~60%的乙醇溶液洗脫進(jìn)行 脫色，再以70~90%的酒精洗脫藜蘆生物堿類成分，洗脫液減壓濃縮到無醇味， 與200g反相硅膠混勻后，進(jìn)行反相硅膠色譜柱層析，以乙醇水40: 60~70: 30洗脫，薄層層析跟蹤，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液減壓濃縮至干 后在乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，干燥得到純度99%藜蘆胺21.68和98%的介芬胺 13.1g。
兩個化合物的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下 藜盧胺
白色針狀結(jié)晶，mp:214~216°C， Dragendorff試劑顯橘紅色; ESI-MS: m/z 410[M+H]+，分子式為C27H39N02; ^-NMR和13C-NMR (CDC13， <5)見Tablel。 Table 1化合物的'H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(5/ ppm, J/ Hz)XL陽SNo.<5h
11.85 (m), 1.27 (m)38.0
22.02 (m), 1.85 (m)30.4
33.51 (m)71.8
42.62 (m), 2.52 (m)44.0
143.1
65,49 (4月.O Hz)122.0
72.40 (m), 1.86 (m)31.3
82.94 (m)41.2
91.85 (m)57.0
1036.9
112.59 (m), 2.28 (m)30.5
12140.2
13-132.7
14144.0
IS6.97(d^7.0Hz)120.0
167.21 (4月8.0Hz)125.2
17142.5
182.32 (s)15.8
191.15 (s)18.8
203.58 (m)36.1
211.40 (4^8.0 Hz)19.2
222.81 (dd,風(fēng)O, 3.6 Hz)67.0
233.31 (m)70.7
242.04 (m), 1.28 (m)41.9
251.54 (m)31.9
262.95(m)，2.12(m)53.9
270.83 (d， h.O Hz)19.3
介芬胺
26
白色針晶，mp:236 238。C， Dragendorff試劑顯橘紅色;
<formula>formula see original document page 8</formula>ESI-MS給出/m/z 426 [M+H]+，分子式為C27H39N03; !H-NMR和13C-NMR (CD30D+CDC13，。見Table 2。 Table 2化合物的'H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(5/ppm， //Hz)
XL~6
No.
12.45 (m)， 1.14 (m)36.4
21.84 (m), 1.46 (m)30.1
33.38 (m)70.6
42.28 (m)， 2.08 (m)40.4
5141.6
65.30 (d,5,4 Hz)120.2
72.28 (m), 1.74 (m)30.1
81.60(m)37,4
91.64 (m)62.0
1036.2
11206.6
12136.9
13144.6
141.88 (m)44.0
151.85 (m), 1.28 (m)23.6
161.87(m)， 1.53 (m)30.1
1785.2
182,06 (s)12.2
190.93 (s)17.7
202.42 (m)39.2
210.91 (d,聲7.8 Hz)10.8
222.66(d,^3.0，3.6Hz)65.1
233.28 (m)74,8
242.14 (m)， 1.16 (m)37.7
251.45 (m)30.0
263.03諷>12.0,4.2 Hz)， 2.24 (m)53.0
270.90 (4聲7.2 Hz)17.8
權(quán)利要求
1、一種高純度藜蘆胺和介芬胺的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)藜蘆藥材原料的提取藜蘆藥材粉碎后，在常壓提取裝置中用60～90％乙醇回流提取三次，每次1～3小時，合并提取液過濾濃縮得濃縮液；(2)大孔吸附樹脂富集濃縮液加2～5倍體積的水稀釋后，加入到大孔吸附樹脂柱上，依次以30倍體積的去離子蒸餾水洗脫大極性雜質(zhì)，再以20倍體積的0.05～0.5％的堿性水溶液進(jìn)行洗脫，繼以20倍體積的10～60％的乙醇溶液洗脫進(jìn)行脫色，再以70～90％的酒精洗脫得到藜蘆總甾體生物堿的洗脫液；(3)色譜柱純化洗脫液減壓濃縮到無醇味，進(jìn)行色譜柱層析，流動相洗脫，薄層層析檢測，分別收集藜蘆胺和介芬胺部位，收集液分別減壓濃縮至干，重結(jié)晶，過濾，干燥，得到高純度藜蘆胺和介芬胺。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述步驟(1)大孔吸附樹脂柱為 AB-8、 DlOl、 ZTC-1或DiaionHP20大孔樹脂柱。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述步驟(2)堿性水溶液為氫氧化 鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣水溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述步驟(3)色譜柱填料為硅膠、 氧化鋁或反相硅膠。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述步驟(3)的流動相為硅膠色 譜，石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2;氧化鋁色譜，石油醚乙酸乙酯甲醇氨 水7:5:1:0.1-3:5:1:0.1;反相硅膠色譜，甲醇水50: 50~70: 30或乙醇:水40: 60~70: 30。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述步驟(3)采用色譜方法分離純 化藜戸胺或介芬胺，重結(jié)晶溶劑為60%~100%的乙醇或甲醇溶液;甲醇:水、乙醇: 水混合體系重結(jié)晶。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(3)得到的單體是高純度的高 純度藜蘆胺或介芬胺，含量均在90~100%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高純度藜蘆胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制備方法。該方法將藜蘆藥材原料粉碎、乙醇回流提取、大孔吸附樹脂富集、洗脫(解吸附)、濃縮得到藜蘆總甾體生物堿、柱色譜純化、重結(jié)晶、干燥制得單體成品。以本方法制成的藜蘆胺和介芬胺純度可達(dá)90％以上，本發(fā)明工藝簡便、產(chǎn)率高，宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P35/00GK101565445SQ20091005237
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者磊 單, 張衛(wèi)東, 徐?？? 李慧粱, 柳潤輝, 建 湯, 沈云亨, 娟 蘇 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)