專利名稱：：一種低分子肝素藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗血栓藥物及其制備方法，尤其涉及一種用于非注射抗血栓藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：低分了量肝素(LowMolecularWeightHeparin)是普通肝素(UnfractionatedHeparin)通過化學(xué)分解或酶催化裂解等方法制成的分了量較小的肝素片斷，其平均分子量在20008000dal(分子量單位道爾頓)之間，且大部分在4000-6000dal之間。低分子肝素為80年代推向市場(chǎng)的新型抗血栓藥物，由法國(guó)Sanofi公司開發(fā)的低分子量肝素鈣，1986年首先在法國(guó)上市，以后陸續(xù)在比利時(shí)，德國(guó)、瑞士、西班牙等國(guó)上市。在低分子量肝素問世之前，肝素是治療與預(yù)防血栓形成及栓塞的傳統(tǒng)首選藥物。但肝素最大的副作用是出血，有時(shí)甚至可導(dǎo)致致死性顱內(nèi)出血。低分了量肝素由肝素分級(jí)或降解獲得，抗血栓作用強(qiáng)而出血副作用很小，可不斷進(jìn)行臨床監(jiān)護(hù)，半衰期長(zhǎng)，每日只注射一次，生物利和度高達(dá)98%，長(zhǎng)期使用不會(huì)引起骨質(zhì)疏松及血小板減少，而且不需要象普通肝素和華法林那樣麻煩和耗時(shí)的臨床監(jiān)護(hù)。目前市場(chǎng)上用于抗凝和抗血栓治療的肝素制劑均為注射劑，病人耐受性不好，特別是進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)的病人出院后l一2周仍需每天注射肝素，非常不便。另外，對(duì)預(yù)防靜脈栓塞的病人，靜注過高的短時(shí)血藥濃度和迅速消除的特點(diǎn)對(duì)預(yù)防療效并不有力。因此開發(fā)一種非注射肝素劑型，同時(shí)能延長(zhǎng)低分子肝素的作用時(shí)間并保持平穩(wěn)的血藥濃度成為臨床和醫(yī)藥企業(yè)長(zhǎng)期追尋的目標(biāo)。固體脂質(zhì)納米粒是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的納米級(jí)新型膠體給藥系統(tǒng)，是繼乳劑、脂質(zhì)體和聚合物納米粒之后非常具有發(fā)展前景的靶向控制釋放給藥系統(tǒng)。在公開的文獻(xiàn)報(bào)道中，固體脂質(zhì)體納米粒一般采用天然或合成的類脂材料，4如硬脂酸、卵磷脂、單苷脂等為載體，將藥物包裹于類脂核中制成固體膠粒給藥系統(tǒng)。它具有一定程度上控制藥物釋放、避免藥物泄露的特點(diǎn)，同時(shí)兼具毒性低、生物相容性好、促進(jìn)口服生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，是近年國(guó)內(nèi)外大分子或較大分子藥物口服給藥系統(tǒng)研究的重要方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種更合理、更安全的非注射緩釋型肝素藥劑及其制備方法。為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種低分子肝素藥物組合物，平均粒徑為50500nm，能在水性介質(zhì)中均勻混懸分散，該組合物的組分有(1)有效量的活性物質(zhì)低分子肝素以及未經(jīng)過裂解的肝素；(2)至少一種的固體脂質(zhì)材料；(3)表面活性劑材料；(4)液態(tài)不飽和脂肪酸。其中低分子肝素以及未經(jīng)過裂解的肝素的分子量為20008000Dal。所述的液態(tài)不飽和脂肪酸為油酸。所述的固體脂質(zhì)材料選自脂肪酸及其衍生物，可以是選自硬脂酸及其衍生物、甘油硬脂酸酯、甘油棕櫚酸酯、甘油山崳酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯中的一種或多種。其中優(yōu)選硬脂酸及其衍生物，更優(yōu)選單硬脂酸甘油酯和硬脂胺。優(yōu)選地，所述的低分子肝素納米粒的組分的重量份為硬脂胺1050份，單硬脂酸甘油酯90130份，肝素25份，油酸5份，SP認(rèn)855份。(SPAN:司盤，即失水山梨醇三油酸酯)本發(fā)明還提供了一種上述低分子肝素藥物組合物的制備方法，其可以通過下述的溶劑擴(kuò)散法制備(1)將低分子肝素、固體脂質(zhì)材料、表面活性劑以及液態(tài)不飽和脂肪酸一同溶解或熔融于有機(jī)溶劑相，(2)將有機(jī)相迅速注入低溫?cái)嚢柚械乃?，形成?fù)載藥物的脂質(zhì)納米粒分5散液，(3)通過鹽析的方法使納米粒在水相中析出，(4)高速離心分離獲得的納米粒沉淀加含表面活性劑的水溶液再分散，即得目標(biāo)的低分子肝素脂質(zhì)納米粒分散液。進(jìn)一步地其制備方法可以是(1)將低分子肝素肝素溶于適量的預(yù)熱的純化水，分別將硬脂胺、單硬脂酸甘油酯、油酸和SPAN85溶于適量的無水乙醇，將上述兩相分別加熱至60。C以上，以水相與油相比為l:4混合，形成澄清不混濁的醇溶液，(2)將上述油相迅速倒入預(yù)冷至15。C的冰水中，快速攪拌約46分鐘，形成均勻分散帶藍(lán)色乳光的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液，(3)將上述所得的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液，在磁力攪拌下加入水相重量不高于1%的氯化鈉，納米粒迅速集結(jié)絮凝，然后靜置，(4)高速離心分離上清液和沉淀，取上述沉淀，去離子水洗滌，用0.2%的poloxamer188(泊洛沙姆)水溶液再分散，輔以探頭超聲使成均勻分散的乳白色納米粒混懸液。本發(fā)明中固體脂質(zhì)材料是一類在常溫狀態(tài)下為固態(tài)的脂肪酸及其酯類材料的通稱。此類脂質(zhì)材料常用的包括硬脂酸及其酯、棕櫚酸及其酯、山崳酸及其酯、芥酸及其酯，具體來講，可以從以下產(chǎn)品中選擇硬脂酸、山崳酸、甘油硬脂酸酯、甘油棕櫚酸酯、甘油山崳酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯等。其中優(yōu)選甘油硬脂酸，更優(yōu)選單硬脂酸甘油酯。另外，脂質(zhì)材料也包括脂肪酸的其他衍生物，如硬脂酸的胺類衍生物硬脂胺。在本發(fā)明中，以脂質(zhì)/酯質(zhì)材料作為提供固體空間架構(gòu)的基質(zhì)材料，保護(hù)藥物在水性介質(zhì)中泄漏，并通過體內(nèi)的酯酶降解等方式釋放藥物，從而實(shí)現(xiàn)包含于納米粒載體中的藥物通過哺乳動(dòng)物生物膜。單硬脂酸甘油酯是含有C16—C18長(zhǎng)鏈脂肪酸與丙三醇進(jìn)行酯化反應(yīng)而制得。是一種非離子型的表面活性劑。它既有親水又有親油基因，具有潤(rùn)濕、乳化、起泡等多種功能。單硬脂酸甘油酯是食物的乳化劑和添加劑;化妝品及醫(yī)藥膏劑中用作乳化劑，使膏體細(xì)膩，滑潤(rùn);用于工業(yè)絲油劑的乳化劑和紡織品的潤(rùn)滑劑;在塑料薄膜中用作流滴劑和防霧劑;在塑料加工中作潤(rùn)滑劑和抗靜電劑，在其他方面可作為消泡劑、分散劑、增稠劑、濕潤(rùn)劑等。硬脂胺(Stearylamine)或稱十八烷基胺，由硬脂酸與氨在加熱(350°C)下進(jìn)行氨化反應(yīng)，得十八腈(硬脂腈)，再在13(TC下經(jīng)加壓(3.43MPa)用催化劑阮萊鎳催化加氫而得。屬毒性較低的胺衍生物，對(duì)粘膜有一定刺激性，少量可用于口服。硬脂胺作為一種帶正電荷的親酯性材料，在處方中的少量加入有助于提高陰電荷性的肝素分子在脂質(zhì)材料所形成的空間結(jié)構(gòu)中的穩(wěn)定性。提高藥物的包封，降低泄漏。油酸即順式-9-+八(碳)烯酸，是一種在常溫下為液態(tài)的不飽和脂肪酸。^11111"m/croewca/ww/Wowo/fl^Mgs./"f.尸/zarm，2002,242:/2/-/2S)等石開究報(bào)道在固體脂質(zhì)中混和形態(tài)相異的液體脂質(zhì)作為混合類脂基質(zhì)，以此制備得到新型SLN—納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructuredlipidcarrier,NLC)。液體脂質(zhì)的加入，可擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加納米粒結(jié)構(gòu)中不規(guī)則晶型的比例，使承載脂溶性藥物的空間容量增加，從而提高載體的載藥能力(So^o,￡.及，『/M/"g,5ar6o叫CM,eZa/.Z)eve/o/me"Zo/aco欣o〃et/re/easeybrnw/a^ow6aset/ow5ZjV失水山梨醇三油酸酯為HLB值較低的親油性非離子表面活性劑，市售產(chǎn)品又成Span系列，如Span60、Span80、Span85等。Span85為藥學(xué)上常用的非離子型表面活性劑，HLB值1.8。它具有乳化、潤(rùn)滑能力，同時(shí)還具有消泡作用。本發(fā)明中，表面活性劑的加入主要用于提高親水性藥物肝素或低分子肝素在脂質(zhì)架構(gòu)中的穩(wěn)定性，保持藥物不泄漏。本發(fā)明的低分子肝素藥物組合物是一種更合理、更安全的非注射緩釋型肝素藥劑，可通過口服攝入的方式給予包括人的哺乳動(dòng)物，具有抗凝、抗血栓的作用，病人的治療耐受性好，治療安全、方便、易于實(shí)施，更解決了一些不適于靜注病人的難題，同時(shí)能延長(zhǎng)低分子肝素的作用時(shí)間并保持平穩(wěn)的血藥濃度。圖1是本發(fā)明的低分子肝素藥物組合物實(shí)施例2的口服處方和陰性、陽性對(duì)照藥效試驗(yàn)的比較圖。其中1.陽性對(duì)照，皮注500IU/kg，n=472.陰性對(duì)照，口服生理鹽水，n=23.處方2,口服2500IU/kg，n=9具體實(shí)施例方式為讓本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，以下結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明1.實(shí)施例及理化性質(zhì)評(píng)價(jià)將低分子肝素肝素(吉派林，杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn)，活度108IU/mg)溶于少量預(yù)熱的純化水，分別將硬脂胺、單硬脂酸甘油酯(即單甘酯)、油酸和SPAN溶于適量的無水乙醇，將上述兩相分別加熱至6(TC以上，混合(V(水相:油相)=1:4)，形成澄清不混濁的醇溶液，上述油相迅速倒入預(yù)冷至1°C(15'C均可)的冰水中，快速攪拌約5分鐘，形成均勻分散帶藍(lán)色乳光的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液。各實(shí)施例處方中各原輔料的用量參考表格1(R1R4為試驗(yàn)組實(shí)施例1實(shí)施例4)。表格1:低分子肝素脂質(zhì)納米粒處方組成成分/處方R1R2R3R4硬脂胺10mg20mg30mg50mg單甘酯130mg120mg110mg90mg肝素25mg"mg"mg25mg油酸5mg5mg5mg5mgSPAN855mg5mg5mg5mg上述所得的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液，在磁力攪拌下加入水相重量不高于1%的氯化鈉，納米粒迅速集結(jié)絮凝，靜置5分鐘，高速離心(10000rpm，5°C，5分鐘)分離上清液和沉淀。取上述沉淀，去離子水洗滌3次，用0.2%的poloxamer188水溶液再分散，輔以探頭超聲(400w強(qiáng)度，4050次)使成均勻分散的乳白色納米?；鞈乙?，用于動(dòng)物給藥。8另取上述上清夜，以0.22pm微孔濾膜過濾，用去離子水稀釋，以經(jīng)典的天青A法(Heparinandrelatedsulfatedmucopolysaccharides.Methodsofbiochemicalanalysis.1977.24.203)測(cè)定上清液中藥物的濃度，計(jì)算間接包封率。藥物包封率(％)=(Wa-Ws!—Ws2)/WaX100%其中Wa:投料藥物量，Ws1:上清夜游離藥物量，Ws2:表面吸附藥物量在調(diào)鹽絮凝之前，空白或載藥納米粒的水性分散液，用去離子水稀釋成大約每lml水含有0.05mg脂質(zhì)的濃度，用Zetasizer(3000HS,MalvernInstruments,UK)測(cè)定粒徑和電位，以體積平均直徑、聚合指數(shù)和表面zeta電位表征納米粒的物理性質(zhì)。詳見表格2。表格2:低分子肝素脂質(zhì)納米粒的理化性質(zhì)和包封率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>%2.載藥脂質(zhì)納米粒的抗凝藥效評(píng)價(jià)取實(shí)施例制備的載藥脂質(zhì)納米粒再分散液R1、R2和R4的樣品，分別灌胃給予預(yù)先禁食但不禁水的小鼠，以皮下注射為對(duì)照。每組5只小鼠(購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，均為雄性，體重2025g。試驗(yàn)組給藥劑量分別1200IU/kg，皮下注射對(duì)照組劑量為600IU/kg。于給藥后10小時(shí)內(nèi)，按時(shí)間點(diǎn)自小鼠眼眶毛細(xì)管取血，進(jìn)行凝血時(shí)間的檢視(毛細(xì)管凝血法)。試驗(yàn)結(jié)果顯示(見表格3)，對(duì)照組藥物皮下給藥，迅速吸收，4h血濃降低，凝血時(shí)間慢慢縮短，5h已基本無效。吉派林說明書顯示皮下給藥的半衰期約45小時(shí)，基本與我們?cè)囼?yàn)結(jié)果吻合；試驗(yàn)組三個(gè)處方均在2h左右起效(凝血時(shí)間延長(zhǎng))，維持至68h凝血時(shí)間逐漸恢復(fù)正常，至10h全部組別凝血時(shí)間恢復(fù)正常，不過三個(gè)處方之間無顯著性差異。表格3:低分子肝素脂質(zhì)納米粒的抗凝藥效比較動(dòng)物對(duì)照組R1R2R4標(biāo)記無左耳左右耳右耳數(shù)量給藥皮下灌胃lml灌胃lml灌胃lmlOhri5"l'20"l'25"l'35"0.5h5，1'15"l'32"2'05"lh/l'20"l'33"l'46"L5h5，l'55"l'20"l'40"2h/2'40"2'50"3'15"2.5h4'10"3，20"4,24"3h/3'55"3'38"3'33"3.5h/5，4,29"4h3，30"/4'21"3'58"5hl'35"4'05"4'10"4'25"6h1，15"2'46"3'45"2'40"8h/l'45"2'53"2'25"10h/l'33"ri5"1，29注根據(jù)毛細(xì)管凝血法的判斷依據(jù)，凝血時(shí)間超過5min的均按5min計(jì)算。由于毛細(xì)管凝血法通過肉眼觀察分辨，其方法準(zhǔn)確性不高，其結(jié)果僅作為提示低分子肝素經(jīng)給藥部分?jǐn)z取進(jìn)入血液發(fā)揮抗凝藥效的參考，不能區(qū)別各處方間的優(yōu)劣以及循環(huán)系統(tǒng)中藥物的攝入水平。3.載藥脂質(zhì)納米粒的大鼠血漿Anti-FatorXa活度測(cè)定肝素和低分子肝素的抗Xa因子測(cè)定方法收載于收載于美國(guó)藥典26版、歐洲藥典4、英國(guó)藥典2000版等。我們選擇法國(guó)STAGO公司銷售的STACHROMAnti-FatorXa活度測(cè)定試劑盒，其測(cè)定原理為根據(jù)Teien文獻(xiàn)肝素和生色底物酰胺化作用。試驗(yàn)材料Sprague-Dawley雄性大鼠；2%戊巴比妥鈉；3.2%枸櫞酸鈉溶液試驗(yàn)樣品吉派林(低分子肝素注射液)，處方R2樣品(見表格1)、生理鹽水。10給藥方案(1)皮下注射(陽性對(duì)照)以吉派林人皮下給藥80IU/Kg換算，大鼠的給藥劑量約為500IU/Kg，即4.3mg/Kg或一只250g的大鼠給藥l.lmgLMWH(該批次LMWH效價(jià)為115.8anti-XaIU/mg)。(2)試驗(yàn)組口服(灌胃給藥)試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)為皮下給藥的5倍，即21mg/Kg,或250g體重5.5mg的LWMH。(3)陰性對(duì)照以生理鹽水口服作為陰性對(duì)照。血樣采取取樣量大鼠尾靜脈取血每次可取血量為0.30.5ml，試劑盒檢測(cè)需要分離的血漿100ul，因此設(shè)計(jì)每次尾靜脈取血0.3ml0.4ml，于塑料離心管。取血點(diǎn)皮下(Ohr、0.5hr、lhr、2hr、4hr、6hr);口服(Ohr、lhr、2hr、4hr、6hr、8hr)。血樣處理每次取血于含0.109M(即3.2%)枸櫞酸鈉的塑料離心管中(9份血液l份枸櫞酸鈉，即每次枸櫞酸鈉約40ul)，收集的血樣必須在l小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心分離血槳，離心要小心以減少血小板變化同時(shí)又最大程度去除血小板。離心速度3000g，時(shí)間不少于15min，溫度不高于18。C。移液槍分離取出血漿，2(TC放置最多2小時(shí)內(nèi)必須進(jìn)行分析測(cè)定；或者冷凍-2(TC下可保存一個(gè)月，待測(cè)定前30分鐘于37"C水浴中融化。血樣的效價(jià)測(cè)定照試劑盒測(cè)定說明進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果通過和對(duì)照試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)(參見附圖l)，陽性對(duì)照皮注迅速達(dá)到很高血藥濃度(實(shí)際治療有效濃度為0.2~1.0)，但藥效持續(xù)不超過8hr，且Cmax超過安全警戒的2IU/mlXa濃度，存在出血的危險(xiǎn)性；而應(yīng)用新載體技術(shù)的處方，在口服灌胃給藥后，血藥濃度平穩(wěn)持久(超過8hr)，且維持在預(yù)防和治療所需要的有效濃度區(qū)間(0.2~1.0)，相對(duì)皮注更安全可靠。權(quán)利要求1.一種低分子肝素藥物組合物，平均粒徑為50～500nm，能在水性介質(zhì)中均勻混懸分散，其特征在于該組合物的組分有(1)有效量的活性物質(zhì)低分子肝素以及未經(jīng)過裂解的肝素；(2)至少一種的固體脂質(zhì)材料；(3)表面活性劑材料；(4)液態(tài)不飽和脂肪酸。2.根據(jù)權(quán)利1所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于低分子肝素以及未經(jīng)過裂解的肝素的分子量為20008000Dal。3.根據(jù)權(quán)利1所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的液態(tài)不飽和脂肪酸為油酸。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的固體脂質(zhì)材料選自脂肪酸及其衍生物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的固體脂質(zhì)材料選自硬脂酸及其衍生物、甘油硬脂酸酯、甘油棕櫚酸酯、甘油山崳酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯中的一種或多種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的固體脂質(zhì)材料選自硬脂酸及其衍生物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的固體脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯和硬脂胺。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的低分子肝素藥物組合物，其特征在于所述的低分子肝素納米粒的組分的重量份為-硬脂胺1050份，單硬脂酸甘油酯90130份，肝素25份，油酸5份，SPAN855份。9.一種上述的低分子肝素藥物組合物的制備方法，其特征在于通過下述的溶劑擴(kuò)散法制備(1)將低分子肝素、固體脂質(zhì)材料、表面活性劑以及液態(tài)不飽和脂肪酸一同溶解或熔融于有機(jī)溶劑相，(2)將有機(jī)相迅速注入低溫?cái)嚢柚械乃?，形成?fù)載藥物的脂質(zhì)納米粒分散液，(3)通過鹽析的方法使納米粒在水相中析出，(4)高速離心分離獲得的納米粒沉淀加含表面活性劑的水溶液再分散，即得目標(biāo)的低分子肝素脂質(zhì)納米粒分散液。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的低分子肝素藥物組合物的制備方法，其特征在于(1)將低分子肝素肝素溶于適量的預(yù)熱的純化水，分別將硬脂胺、單硬脂酸甘油酯、油酸和SPAN85溶于適量的無水乙醇，將上述兩相分別加熱至60"C以上，以水相與油相比為l:4混合，形成澄清不混濁的醇溶液，(2)將上述油相迅速倒入預(yù)冷至15"C的冰水中，快速攪拌約46分鐘，形成均勻分散帶藍(lán)色乳光的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液，(3)將上述所得的載藥脂質(zhì)納米粒初分散液，在磁力攪拌下加入水相重量不高于1%的氯化鈉，納米粒迅速集結(jié)絮凝，然后靜置，(4)高速離心分離上清液和沉淀，取上述沉淀，去離子水洗滌，用0.2%的poloxamer188水溶液再分散，輔以探頭超聲使成均勻分散的乳白色納米?；鞈乙?。全文摘要本發(fā)明公開了一種低分子肝素藥物組合物及其制備方法，該組合物平均粒徑為50～500nm，能在水性介質(zhì)中均勻混懸分散，該組合物的組分有有效量的活性物質(zhì)低分子肝素以及未經(jīng)過裂解的肝素；至少一種的固體脂質(zhì)材料；表面活性劑材料；液態(tài)不飽和脂肪酸。該制備方法采用溶劑擴(kuò)散法制備。本發(fā)明的低分子肝素藥物組合物是一種更合理、更安全的非注射緩釋型肝素藥劑，可通過口服攝入的方式給予包括人的哺乳動(dòng)物，具有抗凝、抗血栓的作用。文檔編號(hào)A61K31/727GK101485678SQ20091004609公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年2月12日優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日發(fā)明者康小玉,酈小平申請(qǐng)人:上海寶龍藥業(yè)有限公司