專利名稱：一種用于治療乳腺癌的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其應(yīng)用，特別涉及一種用于治療乳腺癌的融合 蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率已躍居女性惡性腫瘤第一 位，為女性的"第一殺手"。雖然，很多患者切除了原發(fā)肺瘤，并于手術(shù)后進(jìn)行了 綜合性的治療，但是許多患者最終因轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療的失敗。不同的乳腺癌可 能有不同的基因表型，而這些基因表型往往表現(xiàn)為對(duì)治療的反應(yīng)有很大差異。
Her2就是乳腺癌的典型的惡性表型基因之一，在乳腺癌中的過度表達(dá)與癌 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥呈正相關(guān)。約20-30 %的乳腺癌病人的癌組織細(xì)胞 表達(dá)這種表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體一Her2基因。雖然Her2在乳腺癌的表達(dá)率不算 高，但是陽(yáng)性的乳腺癌病例在臨床上往往表現(xiàn)預(yù)后差、發(fā)展快。這主要由于Her2 作為表皮生長(zhǎng)因子受體，具有促癌細(xì)胞生長(zhǎng)，擴(kuò)散和腫瘤血管增生等功能，因 此，Her2蛋白是乳腺癌惡化的分子標(biāo)記。
目前通過阻斷Her2受體來治療乳腺癌的途徑主要有以下幾類 1.抗Her2單克隆抗體Herceptin單抗治療能使Her2陽(yáng)性的晚期乳腺癌病 例進(jìn)入臨床緩解期，并維持18個(gè)月之久。但是由于乳腺癌細(xì)胞Her2受體是在 基因水平過量表達(dá)，而Herceptin只是通過阻斷受體蛋白起作用，新的Her2蛋 白仍在源源不斷地合成并輸送到細(xì)胞膜，補(bǔ)充喪失的受體。而且鑒于心臟毒性 和過敏反應(yīng)，單抗的用量不可能無限制地加大。另一方面，Herceptin只作用于 Her2跨膜蛋白的細(xì)胞外部分，其胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶仍可被鄰近未被阻斷的 表皮生長(zhǎng)因子受體激活來傳導(dǎo)增殖信號(hào)。2. 酪氨酸激酶抑制劑酪氨酸激酶抑制劑往往只針對(duì)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的某一 環(huán)節(jié)，而Her2信號(hào)還可以通過旁路途徑傳導(dǎo)。此外，酪氨酸激酶抑制劑不能直 接抑制過量表達(dá)的Her2基因，更不能徹底地阻斷Her2蛋白的合成。更重要的 是，酪氨酸激酶也是正常細(xì)胞所必需，使用其抑制劑干擾了很多正常組織細(xì)胞 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起多種毒副作用。因此，要進(jìn)一步擴(kuò)展抗Her2治療乳腺癌 的臨床成果，有必要發(fā)展毒性低，又能徹底抑制整個(gè)Her2跨膜蛋白表達(dá)的有效 方法。
3. 傳統(tǒng)的反義基因方法包括特異性的反義寡核苷酸和核糖酶(ribozyme) 均曾用于抑制乳腺癌細(xì)胞Her2基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。但是由于這些傳統(tǒng)的反義 基因方法抑制基因表達(dá)的效果較弱，因此不能滿足臨床應(yīng)用的需求。
由此可見，上述方法不能阻止新的HER-2蛋白的生成，而且還有嚴(yán)重的毒 副反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到很大限制。因此，開發(fā)新的高效低毒的靶向HER-2治療 方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
PLK1基因也是一個(gè)典型的腫瘤惡性表型基因，在Her2陽(yáng)性腫瘤中也呈較 高表達(dá)，在正常組織細(xì)胞中表達(dá)甚少，其與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥呈 正相關(guān)。PLKl基因與Her2雖然沒有比較直接的聯(lián)系，但都同屬惡性表型基因， 在Her2陽(yáng)性乳腺腫瘤中呈高表達(dá)。目前針對(duì)PLK1基因的主要方法是通過siRNA 下調(diào)該基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生抑制增殖和逆轉(zhuǎn)化療耐藥的效應(yīng)。
與傳統(tǒng)的抑制基因表達(dá)工具反義寡核芬酸和核糖酶比較，siRNA沉,f植因 表達(dá)的效應(yīng)要強(qiáng)大數(shù)十倍至數(shù)百倍，其抑制致病基因治療疾病的潛力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大 于傳統(tǒng)的逆基因工具。SiRNA在疾病中的應(yīng)用范圍很廣，其主要適應(yīng)癥是惡性 肺瘤和病毒感染性疾病。與其它抑制基因表達(dá)的方法比較，siRNA技術(shù)應(yīng)用于 治療惡性腫瘤的優(yōu)點(diǎn)在于特異性高、普遍性、高效性、穩(wěn)定性好、滲透性好、 安全性、簡(jiǎn)便性，且siRNA的合成相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)錢低廉，適合于大量使用。
目前用來攜帶基因物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的載體分為非病毒和病毒類，病毒載體由 于其免疫源性引起劇烈的免疫反應(yīng)和隨機(jī)插入基因組導(dǎo)致細(xì)胞癌變，都會(huì)導(dǎo)致 嚴(yán)重的后果。近幾年在美國(guó)FDA應(yīng)用病毒載體攜帶基因物質(zhì)的臨床試驗(yàn)中曾發(fā)生過嚴(yán)重事件，故暫時(shí)未能推廣應(yīng)用暫不適合于臨床應(yīng)用。非病毒栽體主要包 括多肽物質(zhì)和脂質(zhì)體，前者主要包括魚精蛋白多肽等，后者如脂質(zhì)體樣史球囊等
(liposomes),常用的基因轉(zhuǎn)染媒介，也主要是由各種脂質(zhì)體組成。但是，這些 物質(zhì)都不能選擇性地把基因物質(zhì)靶向?qū)肴橄侔┘?xì)胞內(nèi)。
Her2配基雖然能與其受體結(jié)合，但是結(jié)合后它激活受體，傳導(dǎo)增殖信號(hào)， 刺激癌細(xì)胞分裂轉(zhuǎn)移，故不是理想的靶向載體?？笻er2的單克隆抗體則不會(huì)激 活受體，但它屬于大分子蛋白，很難與抗癌藥物或基因物質(zhì)復(fù)合，而且具有很 強(qiáng)的免疫原性，引起針對(duì)抗體本身的免疫反應(yīng)，影響治療效果，故也不宜用作 生物導(dǎo)彈。
單鏈片段抗體是指通過基因重組技術(shù)，人工表達(dá)保留了與抗原特異性結(jié)合 的免疫球蛋白Fab片段中的筒要部分，由一段重鏈和一段輕鏈組成，兩鏈之間 通過短多肽鉸鏈連接。ScFv既保留了抗原識(shí)別和結(jié)合的特性，又去除了普通抗 體中免疫原性最強(qiáng)的Fc段，同時(shí)其分子小，可以與其他脂質(zhì)體或多肽重組成融 合蛋白，便于攜帶基因物質(zhì)。
開發(fā)siRNA為小分子藥物的主要障礙在于如何把小分子藥物通過細(xì)胞膜傳 遞到胞漿發(fā)揮降解靶基因mRNA的作用。許許多多的生物障礙的存在限制了 siRNA分子往細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，從而限制了 siRNA的治療效果。譬如，由于siRNA 分子較小，很快便經(jīng)由尿道排泄出體外；酶的作用導(dǎo)致siRNA分子降解或在血 清中不穩(wěn)定等都影響了 siRNA的效果?，F(xiàn)在應(yīng)用比^/"泛的轉(zhuǎn)染試劑和高壓注 射等方法雖然可以導(dǎo)入siRNA并發(fā)揮效應(yīng)，但存在損傷細(xì)胞膜和影響細(xì)胞內(nèi)環(huán) 境的副作用。目前，對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾提高其體內(nèi)穩(wěn)定性和應(yīng)用合成(納 米顆粒聚合體和脂質(zhì)體)和非合成(病毒/DNA)載體來進(jìn)行運(yùn)輸?shù)确椒ㄔ谝欢?程度上改善了 siRNA的效果。但是，限制siRNA運(yùn)輸?shù)闹T多難題并沒有得到比 較徹底的解決。siRNA能發(fā)揮良好效應(yīng)的最關(guān)鍵的是在把siRNA運(yùn)到靶組織之 前要保護(hù)好分子并保證其活性，讓siRNA分子直接結(jié)合到靶組織和有效的 siRNA分子釋放到耙組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于治療乳腺癌的
融合蛋白，所述融合蛋白為Her2單鏈片段抗體-多肽的融合蛋白，所述Her2 單鏈片段抗體能靶向乳腺癌細(xì)胞表面的Her2受體，所述多肽能攜帶siRNA。 所述的多肽包括魚精蛋白多肽。
所述的用于治療乳腺癌的融合蛋白為Her2單鏈片段抗體-魚精蛋白多肽的 融合蛋白，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，具體如下
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所述siRNA包括PLKl-siRNA，所述PLKl-siRNA能抑制肺瘤惡性表型基 因的表達(dá)。
本發(fā)明還提供了用于治療乳腺癌的融合蛋白在治療乳腺癌中的應(yīng)用。 本發(fā)明的用于治療乳腺癌的融合蛋白能攜帶PLK1 -siRNA，并特異的靶向?qū)?入Her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，Her2受體與配基或抗體結(jié)合后，可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用 循環(huán)到細(xì)胞內(nèi)。Her2受體/抗體復(fù)合物被吞入細(xì)胞后，復(fù)合體會(huì)被分離，如果 復(fù)合體同時(shí)結(jié)合了化療藥物或基因物質(zhì)，這些物質(zhì)將會(huì)被吸收并釋放到胞漿中。 因此，Her2抗體或配基攜帶的抗癌藥物只攻擊Her2高表達(dá)的癌細(xì)胞，并能順利 把藥物帶入細(xì)胞內(nèi)。治療乳腺癌可產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制乳^^癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效應(yīng)， 有望突破以往反義寡核香酸和核糖酶不盡人意的基因抑制效果，成為抗Her2治療乳腺癌的新型基因藥物。
在本發(fā)明的實(shí)施例里所述的體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用抗Her2-ScFv (F5 ) 與經(jīng)刪節(jié)的(加ncated)魚精蛋白片段融合蛋白攜帶報(bào)告基因，能大大提高報(bào)告 基因在Her2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。與同源的Her2陰性細(xì)胞比較，報(bào)告 基因表達(dá)能提高8到10倍。構(gòu)建抗F5與多肽的融合蛋白，包括Her2單鏈片段 抗體-魚精蛋白多肽的融合蛋白，其中，魚精蛋白多肽帶正電荷，能與帶負(fù)電
荷的DNA質(zhì)粒載體結(jié)合，并可濃縮這些DNA和siRNA分子，經(jīng)與癌細(xì)胞Her2 受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。siRNA與DNA都是攜帶大量負(fù)電荷的分子，也能被荷正 電的多肽濃縮。在本發(fā)明的實(shí)施例中，僅列舉Her2單鏈片段抗體-魚精蛋白多 肽的融合蛋白的用于治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)，Her2單鏈片段抗體-魚精蛋白多肽的 融合蛋白只是一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例而已，當(dāng)然不能將本發(fā)明的融合蛋白局限于此。


圖1是pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒的簡(jiǎn)圖； 圖2是Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽(F5-P)融合蛋白的Western blot 鑒定結(jié)果圖3是F5-P融合蛋白靶向輸送PLK1 -siRNA治療對(duì)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)的影響； 圖4是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療乳腺癌后治療終點(diǎn)切除腫 瘤稱重的結(jié)果圖5是F5-P融合蛋白靶向輸送PLK1 -siRNA治療對(duì)棵鼠腫瘤形成率的影響； 圖6是將經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理的各組BT 474腫瘤組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)把基
因PLK1 mRNA的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療乳腺癌后腫瘤細(xì)胞的增殖指標(biāo)變
化實(shí)驗(yàn)結(jié)杲圖8是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療乳腺癌后腫瘤細(xì)胞的凋亡指標(biāo)變 化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖9是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療乳腺癌后腫瘤細(xì)胞的PLK1基因表達(dá)的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖10是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療對(duì)荷瘤鼠生存率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖U是F5-P融合蛋白靶向輸送PLK1-siRNA治療對(duì)棵鼠肺重量的影響的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖12是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移情況的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖13是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療棵鼠后肺HPRT表達(dá)的 影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖14是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療棵鼠后肝HPRT的表達(dá) 影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。 實(shí)施例1: Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽的融合蛋白的制備 從基因文庫(kù)中查到Her2單鏈片段抗體的全長(zhǎng)序列后，用引物軟件設(shè)計(jì)相關(guān) 引物。
設(shè)計(jì)的Her2-ScFv引物 正引物Ncol為內(nèi)切酶
5 ，-GGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAG-3' 反引物Notl為內(nèi)切酶
5 ，-TTGCGGCCGCTCCGGAATTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3' 設(shè)計(jì)的魚精多肽引物 正引物Notl為內(nèi)切酶
5 ，-CCGGAGCGGCCGCAATGGCCAGGTAC AGATGCTG誦3' 反引物PpuMI作為內(nèi)切酶，終止密碼子和6個(gè)組氨酸 5，-GCCGGGTCCCAGGAAAGGATCAGATCTGCATTAATGGTGGTGGTGATGATGAGATCTGTGTCTTCTACATCTCGGTCTG-3'
通過PCR克隆相關(guān)目的片段，Her2-ScFv的PCR反應(yīng)體系1: 50ul體系 ddH20 37ul dNTP 5 ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCR緩沖液 5ul Easy pfii 1 ul 魚精多肽的PCR反應(yīng)體系2: 50ul體系 ddH20 37ul dNTP 5 ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCR緩沖液 5ul Easy pfU1 ul PCR反應(yīng)循環(huán)
預(yù)變性94°C 5min 變性94 °C 30S， 退火48.5°C 30S L 30個(gè)循環(huán)
延伸72 。C lmin 最后延伸72°C lOmin PCR產(chǎn)物酶切Her2 ScFv的PCR產(chǎn)物用Nco I和Not I內(nèi)切酶切開
50ul體系
Her2 ScFv的PCR產(chǎn)物 20 ul
ddH20 21 ul Nco I2 ul Not I2 ul 10xPCR緩沖液5ul
9Her2 ScFv的PCR產(chǎn)物酶體系在37 °C水浴4小時(shí)。 魚精多肽的PCR產(chǎn)物用Notl和PpuMI內(nèi)切酶切開
50ul體系
魚精多肽的PCR產(chǎn)物 20 ul ddH20 21 ul PpuM I 2 ul Not I 2 ul 10xBuffer 5 ul 魚精多肽的PCR產(chǎn)物酶體系在37。C水浴4小時(shí)。 pAcGP67B用Ncol和PpuMI內(nèi)切酶切開
50ul體系 pAcGP67B 20 ul ddH20 21 ul PpuM I2 ul Not I2 ul 10x緩沖液 5 ul
pAcGP67B的酶切體系在37"C水浴4小時(shí)。
將上述三個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收目的片段，將酶切鑒定片段大小正確的 PCR產(chǎn)物全部上樣1%瓊脂糖凝膠電泳;將目的DNA片段用干凈的手術(shù)刀切下， 放入1.5ml離心管，放入回收膠前離心管稱重；稱重后，在1.5ml離心管中加入 以每毫克膠加入1微升體積的膜結(jié)合溶液；60。C水浴中放置10min(至膠完全溶 解)，每2-3分鐘混勻一次(溶膠液應(yīng)與膜結(jié)合溶液顏色相同)；將柱子放樣品轉(zhuǎn) 移入柱子中(柱子的最大容量為800uL),室溫放置lmin，然后16000gxlmin離 心；取下柱子，棄流出液，將柱子放回原收集管中；加入700ul沖洗緩沖液至 收集管，室溫放置lmin,然后16000gxlmin離心；加入500ul膜洗滌液至收集 管，然后16000gxlmin離心；取下收集管，棄流出液，再次16000gxlmin離心； 將收集管放置在一支新的1.5mL離心管中，加入50uL無核酸水(或無菌H20)至膜中央，靜置片刻，然后16000gxlmin離心，收集回收質(zhì)粒DNA。 將切膠回收的目的片段進(jìn)行連接 Her2 ScFv5 ul Protamine5 ul pAcGP67B 5 ul DNA連接混合物 15 ul PCR儀上連接 16°Cxl小時(shí) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞DH5a。 在15ml試管中加入3ml LB培養(yǎng)基，從平板上挑取一單克隆接種，37°C, 250rpm，培養(yǎng)過夜，約16小時(shí)。取2ml過夜菌接入200ml新鮮的LB培養(yǎng)基， 37°C， 260rpm，培養(yǎng)，直至OD600=0.4-0.5,然后將菌液水浴30-60分鐘。4'C， 5000rpmx5min離心收集細(xì)菌，棄上清。用10ml 0.1M的CaCl2輕輕吹打，充分 懸浮，冰浴10min。 4°C， 5000rpmx5min離心，棄上清。加入2ml 0.1M的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min即感受態(tài)制備完成。
轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備1.5ml的離心管2支，水浴預(yù)冷；分別取100 ul DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，各加入10 ul連接產(chǎn)物，混合均勻；將上述混合物放置水上30 min; 將混合物轉(zhuǎn)移至42。C水浴中溫育90 sec;將混合物轉(zhuǎn)移至冰上放置2 min后， 加入800 ul的LB培養(yǎng)液，在搖床上37°C ， 150rpm培養(yǎng)60min; 4000rpmx5min 離心；棄800 ul的上清液，剩余100 ul混勻后涂LA板；先取20ul IPTG和70ul Xgal混合后涂布在LA板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，然后把上步驟剩余的100 ul菌液 混勻后涂LA板；LA板置37。C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；在過夜培養(yǎng)的LA板上^i沐 10個(gè)長(zhǎng)得比較飽滿的白色克隆，分別加入6mlLA培養(yǎng)基中，在搖床上37。C， 250卬m培養(yǎng)16h。
酶切養(yǎng)定，收集菌液離心，得到pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒。 pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒與桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞(使用 BD BaculoGold轉(zhuǎn)染試劑盒)，接種2xl06 Sf9于60mm組織培養(yǎng)皿中，初始細(xì) 胞密度應(yīng)在50-70%鋪滿。使細(xì)胞牢固貼壁(大約15min)。除去培養(yǎng)基，加入
iilml轉(zhuǎn)染緩沖液A。確認(rèn)培養(yǎng)亞的所有區(qū)域被轉(zhuǎn)染緩沖液A覆蓋，以防止細(xì)胞 干燥死亡。于一無菌15ml離心管中混合0.5嗎Baculo Gold TM線性DNA和2pg 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒(含有目的基因)?；旌衔镬o置5min后加入lml轉(zhuǎn)染緩沖液B， 混合均勻。
將lml轉(zhuǎn)染緩沖液B/DNA溶液逐滴加入組織培養(yǎng)亞，每加入2到3滴便溫 和地晃動(dòng)培^JEi以使其與轉(zhuǎn)染緩沖液A混勻。在此過程期間，應(yīng)該可以見到形 成的沉淀使得溶液呈現(xiàn)輕微乳狀。27度培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)以后，除去轉(zhuǎn)染溶 液，并力口入3ml Grace昆蟲細(xì)J包i咅養(yǎng)基(Grace's Insect Cell Culture Medium )。 5顯 和晃動(dòng)培養(yǎng)亞，然后除去培養(yǎng)基。加入3ml新鮮Grace昆蟲細(xì)胞>培養(yǎng)基(Grace's Insect Cell Culture Medium )， 27。C培養(yǎng)4-5天。4-5天后，收集上清，用其感 染更多細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，擴(kuò)增病毒后行蛋白表達(dá)。Her2單鏈片段抗體與魚精蛋 白多肽的融合蛋白在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。注意生產(chǎn)目的蛋白時(shí)，病毒MOI 應(yīng)該在3 - 10。
接種9xl06 Sf9于T75培養(yǎng)瓶中，加入至含有10ml Sf9培養(yǎng)基(含有10%胎 牛血清)。T75培養(yǎng)lf瓦置培養(yǎng)箱中27。C培養(yǎng)1小時(shí) 1小時(shí)吸去舊培養(yǎng)基換用新 鮮培養(yǎng)基，并加入高滴度的病毒液，使MOI介于5-IO之間。T75培養(yǎng)瓶置培 養(yǎng)箱中27。C培養(yǎng)72小時(shí)。72小時(shí)后把細(xì)胞和上清吸到一個(gè)離心管中，4。C， 1000g 離心10分鐘收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS加入細(xì)胞中重懸洗滌，4°C, lOOOg離心 10分鐘收集細(xì)胞。裂解所有細(xì)胞沉淀于lml裂解緩沖液10mM Tris-HCl，pH7.5，200mM Nacl,l%Triton X-100，10mM NaF/10mM焦石粦酸鈉(Sodium Pyrophosphate) /10mM焦碌酸鈉(Sodium phosphate) ， Ixphotease inhibitor cocktail.(蛋白酶抑制劑)。10000g， lOmin, 4'C離心裂解液，收集上清。
純化Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽的融合蛋白
先用3-5倍柱體積的洗脫緩沖液洗Ni - NTA瓊脂膠柱(Pierce)。待洗脫緩沖 液流盡后，加入蛋白上清液過柱，讓其緩慢流出。待上清液流盡，加入含有3-5 倍柱體積的20mM咪唑洗滌Ni - NTA柱。加入含有不同濃度的咪唑緩沖液3倍 柱體積進(jìn)行洗脫，濃度分別為lOOmM， 250mM， 500mM和1000 mM,并分別收集洗脫液進(jìn)行分析。
Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽的融合蛋白的鑒定
我們成功構(gòu)建了 Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽融合蛋白的桿狀病毒表 達(dá)載體(pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine )，質(zhì)粒圖語(yǔ)可見圖1,在sf9昆蟲細(xì)胞 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。我們把這一載體與桿狀病毒包膜質(zhì)粒DNA (BacuoGold Bright DNA， BDPharmingen公司) 一起共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，裝配病毒載體顆粒， 感染Sf9細(xì)胞，細(xì)胞裂解液過His-Tag蛋白分離柱進(jìn)行純化，表達(dá)出來的帶有6 個(gè)組氨g巴(His-Tag)的Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽融合蛋白，用抗 人IgG單抗作為一抗的Western Blot鑒定分離的融合蛋白，如圖2所示，Her2 單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽的融合蛋白經(jīng)過Westoern blot進(jìn)行鑒定圖。對(duì)照 為感染病毒的細(xì)胞裂解蛋白，而MOI-l, 3, 5, 10和15則分別是不同病毒與 細(xì)胞數(shù)量比時(shí)的結(jié)果，可以見到大小為36KD的目標(biāo)條帶，而且MOI = 5和10 時(shí)表達(dá)量較高。
結(jié)果表明用pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine質(zhì)粒和桿狀病毒可以成功的表 達(dá)出Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽這種融合蛋白。而且，在MOI-5和10， 即病毒與細(xì)胞數(shù)量比為5和10時(shí)的表達(dá)效果更好，表達(dá)出來的融合蛋白大小為 36KD。
實(shí)施例2: F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療對(duì)乳腺癌原位腫瘤生 長(zhǎng)的抑制作用
細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)接種棵鼠制作乳腺癌腫瘤原位和轉(zhuǎn)移;漠型的具體步驟如下 (其中轉(zhuǎn)移模型使用的BT 474-EGFP細(xì)胞是經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光的 EGFP并經(jīng)流式篩選的細(xì)胞抹)
1人乳腺癌細(xì)胞BT474用舍10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37°C、飽和
濕度下5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)； 2當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底95%后用0.25%胰酶消化lmin,倒置顯微鏡下見細(xì)胞間隙增
大、胞質(zhì)回縮時(shí)消化終止，吸盡棄去胰酶液；3加入少量血清培養(yǎng)液輕輕吹打沖洗掉消化液，棄去上清液；
4加入含10% FBS的培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻使其脫壁^i,制成細(xì)胞懸液，然
后分瓶再培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約95%后繼續(xù)進(jìn)行傳代擴(kuò)增； 5當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至達(dá)到接種棵鼠的細(xì)胞數(shù)量時(shí)，進(jìn)行消化細(xì)胞接種棵鼠； 6細(xì)胞消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，把細(xì)胞懸液用PBS重懸至濃度為
BT 474為5 x 107個(gè)細(xì)胞/ml 7細(xì)胞接種棵鼠將細(xì)胞懸液置水上，分別取O.l ml細(xì)胞懸液切開接種到接種
到棵鼠右側(cè)第二對(duì)乳房的脂肪墊里制作乳腺癌原位模型；接著將細(xì)胞懸液稀
釋一倍至細(xì)胞濃度為2.5xl(f個(gè)細(xì)胞/ml，吸取0.2 ml細(xì)胞懸液從尾靜脈打到
棵鼠體內(nèi)； 8每天觀察棵鼠至成瘤。
在原位接種腫瘤細(xì)胞進(jìn)入棵鼠體內(nèi)的第二天，我們按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃以1: 6的 摩爾比混合F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA、與治療組等量的用F5-P融合蛋白、 與治療組等量的PLKl-siRNA、與治療組等量的F5-P融合蛋白和陰性對(duì)照siRNA 然后置水上孵育30分鐘，隨即通過尾靜脈注射到棵鼠體內(nèi)，每周兩次。然后每 天觀察棵鼠生長(zhǎng)情況和腫瘤生長(zhǎng)情況，直至接種腫瘤細(xì)胞2-3周后可見各組腫瘤 陸續(xù)成瘤，以每周兩次的頻率測(cè)量腫瘤大小并制作生長(zhǎng)曲線。F5-P融合蛋白和 PLKl-siRNA治療組的生長(zhǎng)曲線基本沒有上升，趨勢(shì)平緩。而其他三組腫瘤生長(zhǎng) 曲線上升較快，生長(zhǎng)曲線各觀察點(diǎn)比較均有明顯差異(*，P<0.01)。(圖3)。圖 4是F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療乳腺癌后進(jìn)行大體樣本的拍照。 照片顯示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組腫瘤成瘤率低，腫瘤小，而其他 各組腫瘤較大，而且100%成瘤。
至原位接種腫瘤細(xì)胞47天后用藥物處死棵鼠，并取胂瘤和肝肺進(jìn)行后續(xù)處 理。F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組腫瘤的大小明顯低于其他各組(* ， PO.Ol)。把腫瘤組織稱重后切成兩份，其中一份液氮保存后送公司做實(shí)時(shí)定量 PCR，另一份固定后組織切片做HE染色。圖5是F5-P融合蛋白靶向輸送 PLKl-siRNA治療乳腺癌后治療終點(diǎn)切除胂瘤稱重的結(jié)果圖，可見本組腫瘤重量
14明顯低于其他各組(* , PO.01 )。
實(shí)施例3: F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療對(duì)乳腺癌原位腫瘤靶 基因表達(dá)、增殖和凋亡的影響
F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療乳腺癌腫瘤原位和轉(zhuǎn)移模型，具 體步驟如下
1從注射乳腺癌細(xì)胞第二天開始治療荷瘤鼠； 2將乳腺癌模型鼠隨機(jī)分組，每組8只裸鼠；
乳腺癌原位沖莫型鼠4組F5-P融合蛋白加PLK1 -siRNA組
單用F5-P融合蛋白組 單用PLKl-siRNA組 F5-P融合蛋白加NC-siRNA組 乳腺癌轉(zhuǎn)移沖莫型鼠4組F5-P融合蛋白加PLKl-siRNA組
單用F5-P融合蛋白組 單用PLKl-siRNA組 F5-P融合蛋白加NC-siRNA組 3以2 mg/kg的量注射siRNA,同時(shí)以1: 6的摩爾比加入F5-P融合蛋白，冰上
孵育30分鐘后通過尾靜脈注射到棵鼠體內(nèi)； 4每周注射兩次；
5于處理乳腺癌原位4莫型鼠前6小時(shí)通過腹腔注射200 ul BRDU工作液；
6于接種腫瘤后47天處理乳腺癌原位模型鼠；于接種腫瘤后60天處理乳腺癌轉(zhuǎn)
移模型鼠(有部分已于此時(shí)間點(diǎn)前死亡)； 7切除原位腫瘤和肝肺等組織，部分置于液氮中保存送吉瑪7>司<故實(shí)時(shí)定量
PCR,部分置于4%多聚甲醛中固定后送醫(yī)院做病理切片。
我們將經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理的各組BT474腫瘤組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)耙基因 PLK1 mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)選用18srRNA做內(nèi)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)杲顯示F5-P融 合蛋白和PLKl-siRNA治療組PLK1基因的表達(dá)水平明顯下降，其他三組PLK1
15基因的表達(dá)水平是其3倍以上(# ， PO.001)(圖6 )。這充分證實(shí)了 F5-P融合蛋 白靶向輸送PLKl-siRNA治療乳腺癌可以明顯下調(diào)PLK1基因mRNA的表達(dá)水 平，這可能是是其抑制腫瘤增殖的根本原因，說明了把PLK1基因作為耙基因的 強(qiáng)大治療潛能。
我們將經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理的BT 474腫瘤組織切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)^r測(cè)本研 究革巴基因PLK1的表達(dá)水平，以及肺瘤組織的增殖率和凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組PLK1基因的表達(dá)水平明顯下降，為2.37%， 而其他三組24.06%、 24.97%和22.68% ( # ， PO.001 )。我們檢測(cè)反映腫瘤組織增 殖指數(shù)的指標(biāo)BRDU和凋亡指數(shù)TUNEL的表達(dá)，可見F5-P融合蛋白和 PLKl-siRNA治療組BRDU的陽(yáng)性率只有14.50%，而其他三組分別為45.59%、 46.39%和44,90% (# ， PO.001 )。同時(shí)檢測(cè)凋亡率F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA 治療組高達(dá)14.0%,而其他三組分別為3.2%、 2.8%和3.7% (# , PO.001)(圖7 _9)。
實(shí)施例4: F5-P融合蛋白靶向輸送PLKl-siRNA治療對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移癌的抑 制作用
在接種肺瘤細(xì)胞進(jìn)入棵鼠體內(nèi)的第二天，我們按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃以1: 6的摩爾 比混合F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA、與治療組等量的用F5-P融合蛋白、與治 療組等量的PLKl-siRNA和與治療組等量的F5-P融合蛋白和Negative-control siRNA然后置水上孵育30分鐘，隨即通過尾靜脈注射到棵鼠體內(nèi)，每周兩次。 然后每天觀察和記錄棵鼠生長(zhǎng)情況和體重的變化。在觀察期間陸續(xù)有^果鼠死亡， 均行解剖取肝和肺稱重，并把組織分成兩份，其中一份液氮保存，另一份固定 后組織切片做HE染色。
在觀察終點(diǎn)前將各組存活棵鼠進(jìn)行小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)，可見F5-P融合蛋 白和PLKl-siRNA處理組棵鼠熒光較為集中，而且較少，提示轉(zhuǎn)移較少，而其 他三組棵鼠的熒光較為集中，而且較多，提示轉(zhuǎn)移為廣泛。觀察至接種腫瘤細(xì) 胞60天時(shí)用藥物處死存活棵鼠，并取肝肺稱重比較后把組織分成兩份，其中一份液氮保存后送公司做實(shí)時(shí)定量PCR，另 一份固定后組織切片做HE染色。 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定乳腺癌原位腫瘤和和肝肺情況，其具體步驟如下: 1將腫瘤和肝肺提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄。 2PCR反應(yīng)
Homo 18s rRNA基因Real-time PCR反應(yīng)#^
組分 終濃度 容積
2x Real-time PCR反應(yīng)液 1x 10^1
Homo 18s rRNA F引物(20uM) 0.08&M 0.08^1
Homo 18s rRNA R引物(20uM) 0.08岸 0.08pl
cDNA模板 一 2^1
rTaq DNA聚合酶(5U 1) 0.05 U/pl 0.2^1
dd H20 To 20^1
Homo HPRT基因Real-time PCR Reaction System反應(yīng)#^
組分 終濃度 容積
2x Real-time PCR反應(yīng)液1x 10|il
Homo HPRT F引物(20uM) 0.08pM 0.08^1
Homo HPRT R引物(20uM) 0.08|xM 0.08^1
cDNA模板 一 2^il
rTaq DNA聚合酶(5U/pl) 0.05 ， 0.2|xl
dd H20 To 20^1
反應(yīng)條件 95°C， 3 min變性； 40個(gè)循環(huán)95°C， 15 s; 620C, 40 s; 結(jié)束反應(yīng)。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
觀察終點(diǎn)時(shí)F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組存活率高，為100%,而其 他三組分別為50%、 60%和70% (見圖10)。濕肺稱重顯示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組肺重量明顯低于其他三組(P<0.05),表明肺轉(zhuǎn)移較少(見 圖11 )。肝肺切片HE染色可見F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組肺內(nèi)基本 沒有轉(zhuǎn)移，而其他三組棵鼠肝肺內(nèi)均有較多的轉(zhuǎn)移灶(圖12)。
由于人類次黃噪呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因只存在于人類，故 而常常被作為一個(gè)檢測(cè)人類肺瘤棵鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)也收集棵鼠肝肺 組織檢查，檢測(cè)HPRT在棵鼠的表達(dá)肝肺中的表達(dá)，以此監(jiān)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治療組的肺組織中有3只棵鼠檢測(cè)不 到轉(zhuǎn)移，肝組織有4只4企測(cè)不到轉(zhuǎn)移，而且有轉(zhuǎn)移的棵鼠的肺肝轉(zhuǎn)移的HPRT 明顯低于其他三組(#,P<0.001)(圖13-14)。
實(shí)施例5:免疫組織化學(xué)染色方法
具體步驟如下
l切片制備；
將腫瘤和肝肺蠟塊進(jìn)行5um連續(xù)切片，其余分別進(jìn)4亍PLKl 、 BRDU和TUNEL 染色的免疫組化檢測(cè)。
2石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后，用PBS沖洗三次，每次3分鐘。 3檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)。
4每張切片滴加1滴過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育IO分鐘。 5 PBS液沖洗三次，每次3分鐘。
6甩去多余PBS液,滴加非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育IO分鐘。
7甩去血清，滴加第一抗體(兔IgG)，置于濕盒內(nèi)，室溫下孵育60分鐘。
8 PBS液沖洗三次，每次5分鐘。
9甩去多余PBS液，滴加生物素標(biāo)記的抗體，室溫下孵育10分鐘。 10 PBS液沖洗三次，每次3分鐘。
11甩去多余PBS液，滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育IO分鐘。 12 PBS液沖洗三次，每次3分鐘。
13甩去多余PBS液，滴加DAB于顯微鏡下顯色5~10分鐘后自來水漂洗。
1814蘇木素輕度復(fù)染3 10秒,切片脫水千燥，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。 15設(shè)立對(duì)照。
每批染色均設(shè)立對(duì)照(1)陽(yáng)性對(duì)照以已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照(由試 劑公司提供)。(2)空白對(duì)照PBS液代替一抗。(3)替代對(duì)照以與第一代抗 體同種屬的非免疫動(dòng)物血清代替第一抗體。(4)組織學(xué)對(duì)照其中一張進(jìn)行HE 染色，以確保實(shí)驗(yàn)觀察的病變部位的準(zhǔn)確性和可靠性。 16結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
PLK1信號(hào)均主要位于細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性細(xì)胞。在每張切片中隨 機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)表達(dá)PLK1的陽(yáng)性細(xì) 胞占全部細(xì)胞的百分比；所有陽(yáng)性對(duì)照片結(jié)果均為陽(yáng)性；空白對(duì)照片結(jié)果均為 陰性。
BRDU和TUNEL信號(hào)主要位于細(xì)胞核呈棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性細(xì)胞。在每張 切片中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400),每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，每組計(jì)數(shù)總細(xì) 胞數(shù)不少于1000個(gè)。根據(jù)表達(dá)BRDU和TUNEL1的陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百 分比，所有陽(yáng)性對(duì)照片結(jié)果均為陽(yáng)性；空白對(duì)照片結(jié)果均為陰性。
最后統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，卡方4企驗(yàn)比較率的差異。所有統(tǒng)計(jì) 為雙側(cè)檢驗(yàn)，PO.05為差異有顯著意義。繪制生存曲線，并用Log-rank test進(jìn) 行差異檢驗(yàn)。SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本 發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而 不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。序列表
<120〉一種抑制癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡的方法及其應(yīng)用
<160>5
<210〉 1
<211〉960
<212>DNA
<213〉人工序列
<221> misc一feature
<222〉(1)".&60)
<400> 1
atggcccagg tgcagctggt gcagtctggg gc卿ggtga aaaagcccgg ggagtctctg 60 肌gatctcct gt犯gggttc tggatacagc tttaccagct actggatcgc ctgggtgcgc 120 cagatgcccg ggaaaggcct ggagtacatg gggctcatct atcctggtga ctctgacacc 180 aaatacagcc cgtccttcca aggccaggtc accatctcag tcgacaagtc cgtcagcact 240 gcctacttgc aatggagcag tctgaagccc tcggacagcg ccgtgtattt ttgtgcgaga 300 catgacgtgg gatattgcag tagttccaac tgcgcaaagt ggcctgaata cttccagcat 360 tggggccagg gcaccctggt cgtctcc tc鄉(xiāng)tggag gcggttc鄉(xiāng)cggaggtggc 420 tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg acgcagccgc cctcagtgtc tgcggcccca 480 ggacagaagg tcaccatctc ctgctctgga agcagctcca acattgggaa taattatgta 540 tcctggtacc agcagctccc aggaacagcc cccaaactcc tcatctatga tcacaccaat 600 cggcccgcag gggtccctga ccga/ttctct ggctcc犯gt ctggcacctc agcctccctg 660 gccatcagtg ggttccggtc cgaggatgag gctgattatt actgtgcctc ctgggactetc 720 accctctcgg gctgggtgtt cggcggagga accaagctga ccgtcctagg tgcggccgca 780 atggccaggt ac8gatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagac犯840 ag卿tcgca gacga鄉(xiāng)ag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gaggtgttgt 900 cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cacagatctc atcatcacca ccaccattaa 960
<210> 1 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <222>(1)...(41) <400> 2
gggCC3tggC CC3ggtgC3g CtgttgC3gt CtggggC卿g
41
<210> 1 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <222〉 (1)...(44) <400> 3
ttgcggccgc tccggaattc
acctaggacg gtcagcttgg tccc
44
<210> 1
<211>34
<212>DNA<213>人工序列 <222〉 (1)…(34) <400> 4
ccggagcggc cgcaatggcc aggtac卿t gctg 34
<210> 1 <211>79 <212>DNA <213>人工序列 <222> (1)…(79) <400> 5
gccgggtccc aggaaaggat cagatctgca ttaatggtgg tggtgatgat gagatctgtg tcttctacat ctcggtctg 79
權(quán)利要求
1、一種用于治療乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為Her2單鏈片段抗體-多肽的融合蛋白，所述Her2單鏈片段抗體能靶向乳腺癌細(xì)胞表面的Her2受體，所述多肽能攜帶siRNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述 的多肽包括魚精蛋白多肽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述 的用于治療乳腺癌的融合蛋白為Her2單鏈片段抗體-魚精蛋白多肽的融合蛋 白，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的用于治療乳腺癌的融合蛋白，其特征在 于，所述siRNA包括PLKl-siRNA,所述PLKl-siRNA能抑制腫瘤惡性表型基 因的表達(dá)。
5、 權(quán)利要求1-3之一所述的用于治療乳腺癌的融合蛋白在治療乳腺癌中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療乳腺癌的融合蛋白，該融合蛋白為Her2單鏈片段抗體-多肽的融合蛋白，Her2單鏈片段抗體能靶向乳腺癌細(xì)胞表面的Her2受體，多肽能攜帶siRNA。該多肽包括魚精蛋白多肽。siRNA包括PLK1-siRNA，PLK1-siRNA能抑制腫瘤惡性表型基因的表達(dá)。本發(fā)明的用于治療乳腺癌的融合蛋白能攜帶PLK1-siRNA，并特異的靶向?qū)際er2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，順利把藥物帶入細(xì)胞內(nèi)。治療乳腺癌可產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，有望突破以往反義寡核苷酸和核糖酶不盡人意的基因抑制效果，成為抗Her2治療乳腺癌的新型基因藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101585882SQ20091004053
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者姚燕丹, 孫天盟, 宋爾衛(wèi), 張佩琢, 均 王 申請(qǐng)人:中山大學(xué);中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司