專(zhuān)利名稱(chēng)：：二氫楊梅素在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是涉及二氫楊梅素醫(yī)藥新用途，特別是涉及作為防治腫瘤放化療的不良反應(yīng)和毒副作用、預(yù)防腫瘤發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移、防治腫瘤治療中的并發(fā)性感染疾病等藥物。
背景技術(shù)：
：二氫楊梅素(dihydromyricetin)，又稱(chēng)蛇葡萄素，學(xué)名為3，5，7，3',4'，5'—六羥基黃酮。二氫楊梅素是一種已知的化合物，文獻(xiàn)WalterKarrarr，BirkhauserVerlagundStuttgart(1958),P.652，NO:1640公布了其結(jié)構(gòu)式為:申請(qǐng)?zhí)?3123879公開(kāi)了含有二氫楊梅素和楊梅素的組合物在制備廣譜抗病毒藥物和制備提高免疫力藥物中的用途；申請(qǐng)?zhí)?00410052153公開(kāi)了蛇葡萄素在制備血管生成抑制劑的藥物中的應(yīng)用；申請(qǐng)?zhí)?00410062289公開(kāi)了蛇葡萄素在制備與醛糖還原酶相關(guān)疾病的藥物中的用途；申請(qǐng)?zhí)?3114133公開(kāi)了蛇葡萄素在制備防治艾滋病藥物中的應(yīng)用；申請(qǐng)?zhí)?0117225蛇葡萄素在制備抗白血病和抗鼻咽癌藥物中的應(yīng)用。但上述專(zhuān)利申請(qǐng)未公丌二氫楊梅素在抑制和清除自由基的化學(xué)損傷而防治機(jī)體的化學(xué)毒害、預(yù)防突變和繼發(fā)性腫瘤發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移，也未公開(kāi)二氫楊梅素防治腫瘤放化療治療的不良反應(yīng)、預(yù)防腫瘤治療并發(fā)性感染等疾病的藥物及保健食品中的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外抗腫瘤的臨床藥物中，主要包括細(xì)胞毒類(lèi)藥物、激素類(lèi)藥物和生物靶向治療藥，其中的細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物包括作用與DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物(如絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑等)、影響核酸合成的藥物(如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巰嘌呤等)、作用于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物(如放線菌素D、平陽(yáng)霉素等)、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制藥(如羥喜樹(shù)堿、拓?fù)涮婵档?、作用于微管蛋白的藥物(長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等)等，這些化療藥物往往對(duì)腫瘤患者產(chǎn)生諸多嚴(yán)重不良反應(yīng)，包括骨髓抑制、白細(xì)胞降低、心肌毒性、肝功能損傷、免疫力低下、抵抗力降低易引發(fā)細(xì)菌和病毒性感染、細(xì)胞突變和繼發(fā)性腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移等。在腫瘤的放療治療中，由于輻射對(duì)機(jī)體產(chǎn)生顯著傷害，也引發(fā)了腫瘤患者的多方面的不良反應(yīng)?；熕幬锖?放療可以抗腫瘤，但本身都或多或少產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，也難以控制和消除不良反應(yīng)，尤其是機(jī)體突變和繼發(fā)性腫瘤等。放化療治療中，化療藥物在體內(nèi)引發(fā)自由基，或本身能轉(zhuǎn)化為自由基形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)，攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子，破壞這些大分子的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，致使大分子的功能被損害或逐漸失活；由于大分子蛋白的功能失活、核酸(DNA和脂A)的線性結(jié)構(gòu)斷裂，導(dǎo)致基因突變發(fā)生，細(xì)胞修復(fù)功能?chē)?yán)重下降，基因突變的累積將引發(fā)新的繼發(fā)性腫瘤；器官應(yīng)急反應(yīng)機(jī)能和細(xì)胞逆境修復(fù)能力降低、化學(xué)毒副作用的累積將導(dǎo)致組織和器官傷害如骨髓抑制與白細(xì)胞低下導(dǎo)致免疫力下降而并發(fā)性感染難以控制、毛囊和真皮層損傷而導(dǎo)致脫發(fā)或皮疹，消化道和消化器官往往更易受到細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物的毒性作用，引發(fā)厭食、嘔吐、惡心、體力嚴(yán)重下降等。腫瘤患者一般免疫力低下，對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)急反應(yīng)和毒性作用的修復(fù)的能力也很低，因此腫瘤臨床治療中迫切需要既能預(yù)防腫瘤發(fā)生、控制腫瘤進(jìn)展和腫瘤轉(zhuǎn)移，又能控制、減輕或防治腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)，本身卻很少產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)或毒副作用的新型防治腫瘤藥物。而本發(fā)明中提供的二氫楊梅素作為防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物，又能抗腫瘤、預(yù)防細(xì)胞突變和繼發(fā)性腫瘤與腫瘤轉(zhuǎn)移、感染、或骨髓抑制。-
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供二氫楊梅素在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用。其化療優(yōu)選為細(xì)胞毒類(lèi)藥物化療。所述細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物優(yōu)選為作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物、作用于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制藥或作用于微管蛋白的藥物。所述作用于核酸合成的藥物為氟尿嘧啶。所述作用于微管蛋白的藥物為長(zhǎng)春新堿或紫杉醇。所述作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物為環(huán)磷酰胺、絲裂霉素或順鉑。所述防治腫瘤放化療不良反應(yīng)為骨髓抑制、血細(xì)胞降低、細(xì)胞突變、脫發(fā)或繼發(fā)性腫瘤。所述腫瘤放化療不良反應(yīng)為乳腺癌、宮頸癌或腸癌放化療不良反應(yīng)，二氫楊梅素與化療藥物聯(lián)合用藥提高腫瘤治療療效。所述二氫楊梅素與化療藥物聯(lián)合用藥是指用藥學(xué)上可接受的輔料制備的貼劑、軟膏劑、凝膠劑、軟膠囊劑或栓劑。所述藥物為用藥學(xué)上可接受的輔料制備的口服固體制劑、口服液體制劑、注射液、凍干粉針劑或大輸液劑型。本發(fā)明創(chuàng)造性發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素清除自由基、抑制自由基反應(yīng)鏈，從而預(yù)防、控制或消除化學(xué)藥物和輻射對(duì)組織細(xì)胞和器官的傷害或毒害，也發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素抗突變和抑制腫瘤基因表達(dá)和引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而防治腫瘤發(fā)生、防治繼發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移，還發(fā)現(xiàn)二氫楊梅4素抑制病毒轉(zhuǎn)染而防治感染。因此，二氫楊梅素作為防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物，抑制和減輕化學(xué)傷害、防治致突變劑的損害而預(yù)防基因突變或繼發(fā)性腫瘤，將與放化療聯(lián)合用藥而實(shí)現(xiàn)防治腫瘤放化療不良反應(yīng)和預(yù)防腫瘤發(fā)生。絕大多數(shù)腫瘤患者死亡的直接原因并非腫瘤本身，而是腫瘤放化療的不良反應(yīng)及并發(fā)性感染等。因此，腫瘤臨床治療的目標(biāo)是，結(jié)合切除手術(shù)，通過(guò)藥物治療，有效控制和消除腫瘤，降低放化療治療中的不良反應(yīng)，消除腫瘤治療中的并發(fā)癥，提高患者的生存質(zhì)量和遠(yuǎn)期療效。二氫楊梅素集多種藥理與藥效作用于一身的多功能的特點(diǎn)是目前腫瘤臨床治療中單一藥物所不具備的，將使得它在腫瘤治療中得到廣泛應(yīng)用。圖1為二氫楊梅素對(duì)正常血紅蛋白的保護(hù)以及對(duì)TBHP引起的高鐵血紅蛋白生成的抑制作用圖。圖2a為用DMPO(0.1mol/L)捕集的Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥基自由基的ESR波譜。圖2b為體系中加入二氫楊梅素對(duì)該體系產(chǎn)生的羥基自由基的ESR波譜。圖3a為用DMPO捕集的光照核黃素/EDTA)體系產(chǎn)生的0—2自由基的ESR特征波譜。圖3b為體系中加入二氫楊梅素對(duì)該體系產(chǎn)生的0—2自由基的ESR特征波譜。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，通過(guò)下面的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)該理解這些實(shí)施例只是說(shuō)明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:從顯齒蛇葡萄植物中提取與純化制備二氫楊梅素將顯齒蛇葡萄植物的幼嫩葉、或嫩芽、或幼嫩葉和嫩芽混合物l公斤，按l:81:12的重量比(原料水)加入水，浸泡30分鐘-4小時(shí)后，加熱至沸騰，保溫提取3060分鐘，趁熱過(guò)濾或離心分離，收集提取液；再次按l:51:8的重量比(原料水)加入水，加熱至沸騰，保溫提取2040分鐘，趁熱過(guò)濾或離心分離，合并收集提取液；濃縮提取液至原體積的20%50%，加入食用酒精至乙醇濃度為40%75%，加熱至沸騰后保溫1060分鐘，稍微冷卻后，過(guò)濾或離心除去沉淀，回收乙醇或直接將濾液冷卻靜置12天，收集沉淀(干燥沉淀物即得顯齒蛇葡萄植物總黃酮提取物，或二氫楊梅素的粗提取物)。將沉淀以l:510的重量比水加熱溶解，冷卻靜置12天獲得二氫楊梅素的結(jié)晶物，分離純化二氫楊梅素；再對(duì)結(jié)晶物加適量水熱溶，冷卻靜置12天獲得二氫楊梅素的重結(jié)晶物；經(jīng)24次重結(jié)晶即可純化制備含量超過(guò)99%以上的二氫楊梅素。實(shí)施例2:二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)確證實(shí)施例1制備的二氫楊梅素。(1)核磁共振分析核磁共振檢測(cè)儀器為IN0VA500超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀。經(jīng)過(guò)核磁共振氫譜、碳譜、DEPT譜、gCOSY譜、gHMQC譜、gHMBC譜檢測(cè)分析，確定其與3，5,7'3，,4，，5，-六羥基2，3雙氫黃酮醇的結(jié)構(gòu)相符。①氫譜、gCOSY譜譜寬6711.4Hz(13ppm)gC0SYi普:i普寬4598.2X4598.2Hz;數(shù)據(jù)點(diǎn)2048X256。表l、1H核磁共振譜數(shù)據(jù)及分析譜峰序號(hào)化學(xué)位移S(ppm)裂分峰數(shù)耦合常數(shù)質(zhì)子數(shù)COSY相關(guān)峰4.40dd10.5，614.90，5.69bcd4.905.695.855.90dddd10.562211114.404.405.905.85f6.40s2gh8.118.81ss12i10.74brs1j11.86s1②碳譜、DEPT譜、gHMQC譜、gHMBC譜i普寬:30911.9Hz(240卯m)gCOSY譜:i普寬4598.2X4598.2Hz;數(shù)據(jù)點(diǎn)2048X256表2、13C核磁共振譜數(shù)據(jù)及分析備注3位CH2位CH3位CH8位CH6—位CH2—/6—位CH4'位0H375'位OH7位0H5位OH譜峰序號(hào)ABCDEFGHI化學(xué)位移5(ppirO71.5583.1594.8595.84100.38106.85127.02133.36145.60性J162.40K163.23166.69M197.40(DEPT)ddddsdsssssss碳原子數(shù)備注11111211211113位CH2位CH8位CH6位CHl(T位C2'(6')位CHr位cf位c3、(5、)位C9位C5位C7位C4、位C二0(2)二氫楊梅素的質(zhì)譜分析檢測(cè)儀器為VGZAB-HS色質(zhì)聯(lián)用儀。二氫楊梅素的測(cè)定分子量為321M/Z，與理論分子量及相關(guān)碎片峰相一致-(3)紫外光譜分析二氫楊梅素在甲醇中的紫外吸收峰為Al=292ran，X2=208nm。實(shí)施例3:二氫楊梅素對(duì)過(guò)氧化特丁垸(T朋P)引起的高鐵血紅蛋白生成的抑制作用1、實(shí)驗(yàn)方法將壓積紅細(xì)胞加入雙蒸水，制成1%紅細(xì)胞的完全溶血液，分別加入各樣品組分37。C溫孵30min,加入TBHP使其終濃度達(dá)到250uM，繼續(xù)溫孵30min，測(cè)定OD咖檢測(cè)高鐵血紅蛋白含量的相對(duì)變化。高鐵蛋白生成抑制率的計(jì)算生成抑制率二(氧化損傷組OD柳,-樣品組0D6:W)/(氧化損傷組0D6:,-對(duì)照組ODJ。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果TBHP在水相中逐漸釋放出HA，HA被游離的或血紅素中結(jié)合的鐵催化，通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子和羥基自由基。正常紅細(xì)胞血紅蛋白的a、e肽鏈的最大光吸收值分別在540、577nm，當(dāng)紅細(xì)胞受到TBHP的氧化攻擊后，部分氧合血紅蛋白迅速轉(zhuǎn)換成高鐵血紅蛋白，在630nm附近有最高吸收峰。如圖1所示，在TBHP的作用下，氧合血紅蛋白(其最大吸收峰在540nm和575nm處)被破壞，部分被轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白(其最大吸收峰在630nm處)。而二氫楊梅素加入到紅細(xì)胞的完全溶血液中后，TBHP對(duì)氧合血紅蛋白的破壞和高鐵血紅蛋白的促進(jìn)生成都受到了抑制作用，氧合血紅蛋白的吸收峰升高，而高鐵血紅蛋白的吸收峰降低。如表3所示，二氫楊梅素的添加量與其對(duì)高鐵血紅蛋白生成的抑制作用呈正相關(guān)且量效關(guān)系明顯。表3、二氫楊梅素對(duì)TBHP引起的高鐵血紅蛋白生成的影響二氫楊梅素(lig/ml)高鐵血紅蛋白生成抑制率(％)109.12017.34030.78036.2實(shí)施例4、ESR技術(shù)檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)自由基的清除作用ESR技術(shù)是研究自由基和抗氧化劑最直接最有效的方法。為了檢測(cè)和辨認(rèn)短壽命自由基，需將一不飽和的抗磁性物質(zhì)一自由基捕集劑，加入反應(yīng)體系，捕捉瞬時(shí)自由基，從而可以得到能用ESR波譜儀在常溫下檢測(cè)到的壽命較長(zhǎng)的自由基。1.材料和方法材料DMP0(5，5-imethyl-1-pyrroline-l-oxide)在使用前用活性炭提純，提純后無(wú)雜質(zhì)ESR信號(hào)。丙酮、乙酸乙酯、核黃素、二苯基苦基苯肼(DPPH)等試劑均為分析純。二氫楊梅素為分離純化制備。ESR測(cè)試使用Brucker200型ESR波譜儀，測(cè)試條件為X波段，微波功率20譜，調(diào)制100kHz，調(diào)幅O.lmT，掃寬20mT，中心磁場(chǎng)324.5mT,室溫下檢測(cè)。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生0H自由基，用DMPO捕集0H自由基反應(yīng)體系共50yL，pH=7.4，其中含有O.04MDMPO、0.01%H202、0.025mMFeS04、樣品溶液或PBS(磷酸鹽緩沖7液PH=7.4)5uL，迅速混勻，吸入石英毛細(xì)管中，記錄一分鐘時(shí)的ESR波譜。光照核黃素產(chǎn)生02—自由基,DMPO捕集CV自由基。反應(yīng)體系共30uL，pH二7.4，其中含有0.08MDMPO、0.3M核黃素、5mMEDTA鈉鹽、2mMDETAPAC、樣品或PBS5uL，迅速混勻，吸入石英毛細(xì)管中，光照90秒后，進(jìn)行測(cè)試。2.結(jié)果由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的ESR波譜(圖2a)是由4條譜線組成高度比為1:2:2:1的典型圖譜(g-2.0045，aN=aH=l.49mT)。加入二氫楊梅素對(duì)波譜信號(hào)的超精細(xì)分裂常數(shù)和g值沒(méi)有影響，隨著二氫楊梅素濃度的增加，其ESR信號(hào)強(qiáng)度遞減(圖2b)。故用波譜信號(hào)第二峰的峰對(duì)峰高度h(mm)表示ESR信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。在Fenton反應(yīng)體系中，加入不同濃度的二氫楊梅素對(duì)該體系產(chǎn)生的羥基自由基進(jìn)行了清除，清除后的ESR波譜如圖所示。加入不同濃度的二氫楊梅素后,ESR信號(hào)強(qiáng)度明顯減小，而且具有明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)(表4)。圖3a、圖3b所示，用DMPO捕集光照核黃素/EDTA體系產(chǎn)生的0—z自由基的ESR波譜是由12條譜線組成的典型圖譜(aN-1.42mT，aBH=l.12mT，aCH=0.13mT)。加或不加二氫楊梅素對(duì)波譜信號(hào)的超精細(xì)分裂常數(shù)沒(méi)有影響，僅信號(hào)強(qiáng)度不同。加入不同濃度的二氫楊梅素后，其中(b)(c)(d)的波譜峰高顯著降低，隨著樣品濃度的增加，清除0—2自由基的效果也越來(lái)越明顯。在樣品濃度為100ug/mL時(shí)，己將產(chǎn)生的(T自由基100%清除。表4、ESR法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)自由基的清除能力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注清除率可以用某樣品濃度的峰高除以對(duì)照的峰高計(jì)算。峰高的計(jì)算方法羥基自由基取第二峰的高度，超氧自由基取第一峰，DPra取第3峰。二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基。二氫楊梅素能夠清除超氧自由基、羥基自由基和含氮自由基，是由于他本身的分子結(jié)構(gòu)，不僅可螯合消除金屬離子作為自由基鏈反應(yīng)的引發(fā)劑，阻止和抑制自由基的產(chǎn)生，而且可以清除、捕集自由基使其反應(yīng)鏈中斷，在機(jī)體中的細(xì)胞及其生化代謝反應(yīng)中發(fā)揮抗氧化作用，以此廣泛地參與、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體，發(fā)揮其藥理與藥效作用。自由基是許多化學(xué)物質(zhì)和輻射對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生傷害或毒害的主要原因。自由基對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷、對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的分子構(gòu)象實(shí)施非特異性氫抽提和化學(xué)加成而形成高分子自由基，這些高分子自由基將和其他的蛋白質(zhì)高分子形成高分子聚合物或?qū)е潞怂峋€性分子斷裂，從而破壞高分子的結(jié)構(gòu)及功能。實(shí)施例5、二氫楊梅素對(duì)H202誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的抑制作用Hela細(xì)胞以含10%滅活的新生牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素以及含2mmol/ml谷氨酸鹽的DMEM培養(yǎng)基，在5%C02、37°C、相對(duì)濕度95%條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞單層生長(zhǎng)、當(dāng)瓶底細(xì)胞的覆蓋度達(dá)90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q液一次，僅指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞密度至2XlOVml，以每孔100ul接種于96孔培養(yǎng)板，37°C、5%0)2條件培養(yǎng)24小時(shí)。加入二氫楊梅素使其終濃度分別為5ug/ml、10ug/ral和15ug/ml。溫育30分鐘后Hela細(xì)胞中加入不同劑量的HA作為氧化損傷劑；在各個(gè)不同的H2(V濃度下，H202都能顯著降低Hela細(xì)胞的活力。當(dāng)^02的濃度等于或低于1.2mM時(shí)，二氫楊梅素處理組相對(duì)于不加二氫楊梅素組，Hela細(xì)胞活力大多得到顯著增高且增高程度與二氫楊梅素的終濃度呈正相關(guān)(表5)。表5、二氫楊梅素對(duì)HA誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞氧化損傷的影響H202(慮)不同濃度的二氫楊梅素(ug/ml)的細(xì)胞相對(duì)活力010150100±1.:32101.35±4.3799.29±1.3097.74±3.660.281.84±2,.6794.42±4.7995.21土1.57'95.62±2.15'0.458.09±1,.8177.32±2.18'83.47±1.39'90.37±3.14'0.636.77±2,.2058.23±4.31'60.44±4.14'71.38±1.63'1.220.01±2,■4221.81±1.3736.39±3.19'40.97±2.65'2.417.81±1.■0518.03±4.9118.35±2.8418.12±3.76實(shí)施例6、二氫楊梅素對(duì)骨髓抑制小鼠模型的藥效試驗(yàn)1、材料和方法環(huán)磷酰胺；二氫楊梅素。昆明鼠，1822g，30只，812周齡。雌雄不拘，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。造模方法環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，0.2ml/次，每日一次，連續(xù)三次。動(dòng)物分組與處理10只/組，①造模組環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，連續(xù)三次。②正常對(duì)照組在其它組注射環(huán)磷酰胺時(shí)注射生理鹽水0.2nil/次。③二氫楊梅素組環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每閂一次，連續(xù)三次。按照二氫楊梅素120mg/kg每天灌胃一次，連續(xù)10天。觀察體征變化。9在最后一次二氫楊梅素后的次日處理動(dòng)物進(jìn)行觀察。采用尾靜脈采血，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。小鼠處死后，取出股骨，剔除肌肉和結(jié)締組織，剪開(kāi)股骨兩頭，用6號(hào)針頭以RPMI1640液沖出骨髓細(xì)胞，檢測(cè)骨髓有核細(xì)胞數(shù)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果二氫楊梅素對(duì)環(huán)磷酰胺的骨髓抑制有顯著的保護(hù)作用(表6),環(huán)磷酰胺組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比明顯減少，而二氫楊梅素加速損傷骨髓造血功能的恢復(fù)。表6、各組外周血象與體征變化組別wbc(xio7l)rbc(x10'2/L)plt(xio'7U有核細(xì)胞數(shù)(x106/L)體重抑制(%)皮毛脫落正常對(duì)照組5.4±0.94.6±0.77.35±0.1132.08±0.14—極少造模組2.7±0.63.0±0.62.45±0.1011.2±0.37.2多，易脫落二氫楊梅素組4.3土0，4.68±0.123*1.85±0.14*1.5極少實(shí)施例7、二氫楊梅素的抗突變作用1、實(shí)驗(yàn)方法環(huán)磷酞胺(Cyclophosphamide簡(jiǎn)稱(chēng)CP)、絲裂霉素C(Mitomyein簡(jiǎn)稱(chēng)MMC)，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-nltro-N-nitrosogua-nidine簡(jiǎn)稱(chēng)MNNG)，秋水仙堿。(1)小白鼠骨髓pce微核試驗(yàn)將nih小白鼠隨機(jī)分成5組，即一個(gè)陰性對(duì)照組，3個(gè)二氫楊梅素試驗(yàn)組和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組小鼠每日每只ig0.3ml生理鹽水，3個(gè)二氫楊梅素給藥組分別以20、40和60mg/kg的二氫楊梅素劑量ig小鼠給藥，給藥至第7天的同時(shí)腹腔注射100mg/kg劑量的CP，24h后再以相同劑量的CP腹腔注射小鼠，6h后處死小鼠。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠僅ig生理鹽水，腹腔注射CP的時(shí)間、劑量既處理與給藥組一致。制備小鼠骨髓細(xì)胞微核玻片標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)總數(shù)和含微核的PCE數(shù)，當(dāng)1個(gè)PCE中出現(xiàn)2個(gè)以上微核均按1個(gè)細(xì)胞計(jì)，并按下列公式計(jì)算各組微核細(xì)胞率(mncf):腦cf-(含微核的pce數(shù)/觀察到的pce總數(shù))x1000%。(2)小鼠骨髓細(xì)胞染色體崎變(ca)試驗(yàn)動(dòng)物分組及二氫楊梅素劑量均與"小鼠骨髓細(xì)胞pce微核試驗(yàn)"相同，所不同的是在給藥第7天的同時(shí)給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠均腹腔注射1次2mg/kg劑量的MMC，在處死小鼠前3h再腹腔注射4mg/kg劑量的秋水仙堿溶液進(jìn)行預(yù)處理，按常規(guī)法制備骨髓細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本。每一實(shí)驗(yàn)組鏡檢觀察500-1000個(gè)中期細(xì)胞分裂相，記錄染色體畸變細(xì)胞數(shù)和畸變類(lèi)型，主要觀察染色單體斷裂，無(wú)著絲粒染色體斷片和環(huán)狀染色體等，然后計(jì)算各組的畸變細(xì)胞率^含CA的細(xì)胞數(shù)/觀察的分裂中期細(xì)胞數(shù)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果10(1)二氫楊梅素對(duì)由CP誘發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞微核的抑制作用二氫楊梅素對(duì)由CP誘發(fā)的小鼠骨髓PCE微核的抑制效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，高、中和低3個(gè)劑量的二氫楊梅素抗突變?cè)囼?yàn)組CP誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞MNCF顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組，二氫楊梅素試驗(yàn)組對(duì)由CP誘發(fā)的MNCF的抑制率分別為68.5%，61.0%和42.6%(抑制率=[(陽(yáng)性對(duì)照組的顧C(jī)T一試驗(yàn)組的MNCF)/陽(yáng)性對(duì)照組的薩CF]X100%)，在所測(cè)的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。(2)二氫楊梅素對(duì)由醒c誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞cA的抑制作用二氫楊梅素試驗(yàn)組的CA細(xì)胞率(CAF)與應(yīng)C陽(yáng)性對(duì)照組的CAF比較，均達(dá)顯著性差異(P<0.05)，低、中和高3個(gè)劑量的二氫楊梅素抗突變?cè)囼?yàn)組對(duì)由應(yīng)C誘發(fā)的CAF的抑制率分別為65.1%，56.8%和49.1%，低劑量二氫楊梅素試驗(yàn)組對(duì)CA的抑制效應(yīng)略高于高劑量組，劑量與效應(yīng)關(guān)系呈負(fù)相關(guān)性。二氫楊梅素的抗突變作用表明其具有抑制致癌物的作用，即具有抗致癌和抗致突變作用，從而預(yù)防機(jī)體細(xì)胞發(fā)生突變和癌變。目前腫瘤的發(fā)生大多為致突變化學(xué)物質(zhì)造成機(jī)體損傷、或誘導(dǎo)細(xì)胞突變和癌變，因此，二氫楊梅素具有預(yù)防腫瘤發(fā)生、預(yù)防癌癥患者在長(zhǎng)期化療中的繼發(fā)性腫瘤、控制和減少高致癌條件下的癌變形成等藥效作用。實(shí)施例8、二氫楊梅素對(duì)荷瘤小鼠輻射損傷的保護(hù)作用1、實(shí)驗(yàn)方法NIH小白鼠；二氫楊梅素。(1)二氫楊梅素對(duì)NIH小白鼠輻照的影響NIH小白鼠6-7周齡，每組10只，，雌雄兼用，分組包括①正常對(duì)照組飲服生理鹽水；②照射組60CoY射線照射；③照前飲服O.1%二氫楊梅素生理鹽水溶液，照后不服二氫楊梅素；④照后灌胃(ig)100mg/kg;⑤照后ig200mg/(bwd)生血寶。照射前7d均自由飲服。照射前7d均自由飲服，照射后7d每天ig.100tng/kg，第10天股動(dòng)脈取血，計(jì)數(shù)冊(cè)C和RBC，再將各組鼠處死后計(jì)數(shù)胸腺和脾臟指數(shù)。照射:60Co源由華南農(nóng)大輻照中心提供，Y射線一次性照射，總吸收劑量為4.5Gy,吸收劑量率為0.97Gy/min。(2)二氫楊梅素對(duì)荷瘤小鼠輻照的影響18周齡的小鼠，體重2224g，隨機(jī)分成6組，每組10只，A組:CK;B組:荷瘤；C組荷瘤+二氫楊梅素+照射；D組荷瘤+照射+二氫楊梅素；E組荷瘤+照射；F組荷瘤+二氫楊梅素。飼養(yǎng)7d后，除A組外其余按移植性腫瘤研究法接種。5ml—次性注射器抽取S180腹水癌小鼠腹水，生理鹽水稀釋5倍后，每只小鼠注射0.3ml(A組除外)。第2天開(kāi)始，C組和F組小鼠每天ig.二氫楊梅素，劑量為100/kg。15d后，C、D和E組進(jìn)行60CoY射線照射，吸收劑量為100cGy。照射后對(duì)D組小鼠ig二氫楊梅素(劑量同上)，C組則停止ig.二氫楊梅素。再經(jīng)15d后，脫頸處死，解剖，按前述方法檢測(cè)紅11細(xì)胞、白細(xì)胞、免疫器官指數(shù)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)二氫楊梅素對(duì)免疫器官輻射損傷影響Y射線照射后，小鼠胸腺和脾臟嚴(yán)重?fù)p傷。小鼠在受照前或后二氫楊梅素ig胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組。(2)二氫楊梅素對(duì)小鼠造血功能的影響輻照前ig.二氫楊梅素組和輻照后ig.二氫楊梅素組小鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞均明顯高于照射組(表7)。表明二氫楊梅素對(duì)輻照所致的血象損傷具有明顯的防護(hù)效應(yīng)。表7、二氫楊梅素對(duì)輻照小鼠血象的作用處理組紅細(xì)胞(Xl(f7L)白細(xì)胞(xio7l)①9.53±0.857.35±0.59②4.45±0.75#1.89±0.53#③5.68±0.45*4.35±0.52*④7.51±0.57**5.10±0.85**7.95±0.55**6.16±0.55**注與照射組比較*P<0.05,**p<0.01;與對(duì)照組比較#卩<0.01(3)二氫楊梅素對(duì)荷瘤小鼠照射的影響小鼠血象和體重增重的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。與A組比較，荷瘤小鼠的3種生理指標(biāo)均低于生理鹽水對(duì)照組，受照射各組的指標(biāo)達(dá)到顯著性水平，說(shuō)明小鼠荷瘤后，體質(zhì)下降,受照后下降更明顯。F組3種生理指標(biāo)均高于B組,說(shuō)明二氫楊梅素對(duì)荷瘤小鼠的生活質(zhì)量具有一定的保障。C、D、F組的白細(xì)胞水平都高于E組,且達(dá)到顯著水平,說(shuō)明二氫楊梅素對(duì)小鼠白細(xì)胞的照射損傷具有顯著的保護(hù)作用。二氫楊梅素也促進(jìn)了小鼠的體重的恢復(fù)。表8、二氫楊梅素對(duì)輻照小鼠血象的作用處理組紅細(xì)胞(x白細(xì)胞(X107L)體重平均增重(g)10'2/l)A5.53±0.40眾5.45±1.25眾5.90±0.82眾#B2.45±1.25*tt2.89±1.13*#1.51±0.95眾#▲C3.68±1.15眾*4.35±0.52眾#3.45±0.82眾#▲D3.01±0.78*4.10±0.85眾#2.12±0.87*眾E3.55±0.55眾3.46±0.85#▲2.45±1.32*AF3.98±0.55眾4.60±0.55眾2.89±1.51*眾12與B組比較眾p<0.01;與E組比較ttp〈0.01;與C組比較Ap〈0.01荷瘤小鼠免疫器官實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表9)表明，B組小鼠荷瘤后每克脾臟、胸腺的細(xì)胞數(shù)和脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于A組空白對(duì)照。C、D和F組荷瘤小鼠的4種指標(biāo)均高于B組荷瘤小鼠，且差異顯著。說(shuō)明二氫楊梅素能夠維持荷瘤小鼠的免疫細(xì)胞的增殖生長(zhǎng),并且接近正常水平。C、D的4種指標(biāo)均高于E組，除D的每克胸腺細(xì)胞數(shù)外,其他都達(dá)到顯著水平，表明二氫楊梅素在腫瘤的輻射治療中保持機(jī)體免疫功能具有顯著藥效作用。表9、二氫楊梅素對(duì)輻照小鼠血象的作用處理器官指數(shù)(mg/10g體重)免疫器官細(xì)胞數(shù)(Xl(f個(gè)/g)組,脾胸腺脾胸腺A4.53±0.40☆2.65±0.20☆1.73±0.20眾#1.71±0.19眾B2.41±0.75*1.72±0.53*0.73±0.35*0.80±0.41*C4.08±0.55☆*2.96±0.42☆1.56±0.33眾#2.15±0.582眾#D4.59±0.88☆*2.31±0.55☆1.49±0.39眾#1.47±0.47*眾E2.65±0.55*▲2.49±0.75☆0.87±0.1.25±0.72眾AF4.38±0.75眾#4.60±0.55☆1.86±0.15眾#2.02±0.51眾#注與對(duì)照組比較*p<0.05，與B組比較眾p<0.01;與E組比較弁p〈o.oi;與c組比較ikix:o.oi本試驗(yàn)研究表明二氫楊梅素具有抑制輻射對(duì)免疫細(xì)胞和免疫器官的損傷與毒害作用，這對(duì)于腫瘤放療治療的機(jī)體保護(hù)、減輕和控制化療中的不良反應(yīng)與骨髓抑制、提高機(jī)體免疫力的藥效作用。實(shí)施例9、二氫楊梅素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞及移植瘤的抑制和凋亡作用1、實(shí)驗(yàn)方法人宮頸癌HeLa細(xì)胞；BALB/c-nu裸鼠。二氫楊梅素。RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶(EDTA)美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司,噻唑藍(lán)(MTT)染液為北京中山公司產(chǎn)品。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒為BenderMedsystem公司產(chǎn)品。(1)二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制與凋亡作用宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于135%C02、37°C、95%飽和濕度的恒溫密閉孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。3d傳代1次。在0—80ng/ml二氫楊梅素濃度遞增時(shí)，多孔板培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡作用。(2)二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞移植瘤的抑制作用BALB/c-nu裸鼠，4-6周齡，18-22g，雌性，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌Hela細(xì)胞(1X107ml)，在無(wú)菌條件下于裸鼠背側(cè)近右后肢處皮下接種，0.2ml/只。接種后第14天可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤呈菜花狀，色紅，質(zhì)硬，可活動(dòng)，腫瘤長(zhǎng)至約50-80mm3，時(shí)開(kāi)始抑瘤實(shí)驗(yàn)。裸鼠皮下接種腫瘤6d后，32只小鼠皮下移植處均成瘤，將小鼠隨機(jī)分成4組。對(duì)照組，生理鹽水O.5ml/只；二氫楊梅素組，60mg/kg,1次/天，ipO.5ml;5-Fu組，30mg/kg，ip，1次/4d，共6次；二氫楊梅素-5-Fu組，30mg/kg，1次/天，ipO.5ml，5-Fu，30mg/kg，ip，l次/4d，共6次。腹腔注射給藥，連續(xù)用藥24d，每只小鼠注射液體量相等,均為0.4mL，第26天處死全部小鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。抑瘤率測(cè)定按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥;接種后每2天測(cè)量1次小鼠皮下腫瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積[V-(aXb2)/2]，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。接種后第26天脫頸椎處死小鼠，完整剝離腫瘤稱(chēng)重,.計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(1-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)X100°/。。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制與凋亡作用二氫楊梅素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖具有極顯著的抑制作用(表10)。表IO、二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞活性的抑制作用一仏始泰^,，、細(xì)胞活力的抑制率-氫楊梅素(lig/ml)(%)00—109.91一2016.2—4041.660肌0以AnnexinV-PI雙標(biāo)染色流式細(xì)胞儀分析二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡表明，不同濃度的二氫楊梅素作用宮頸癌HeLa細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高，隨二氫楊梅素濃度加大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡率明顯增高，與對(duì)照組相比具有極顯著差異性。二氫楊梅素誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯的藥物濃度依賴(lài)性，在同一時(shí)間段，隨藥物濃度的增加細(xì)胞凋亡率增加，兩者呈正相關(guān)(PO.Ol)。同一濃度不同時(shí)間段(24,48，72h)細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，80tig/ml濃度二氫楊梅素作用72h后的凋亡率最高，已經(jīng)超過(guò)70%。(2)二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞移植瘤的抑制作用接種宮頸癌HeLa瘤細(xì)胞后，成瘤率為100%。各組皮下移植瘤的體積逐漸增大，腫瘤成局部結(jié)節(jié)狀生長(zhǎng)，接種后的第1~6天，移植瘤生長(zhǎng)速度基本相同，但隨后對(duì)照組移植瘤生長(zhǎng)明顯快于其他給藥組。26d后，二氫楊梅素處理組腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量均低于對(duì)照組(PO.Ol)，而與治療對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(PX).05)，表明二氫楊梅素對(duì)宮頸癌具有顯著抗腫瘤作用(表ll)。表ll、二氫楊梅素對(duì)宮頸癌增殖的抑制作用處理組動(dòng)物數(shù)瘤體重(g)抑制率(％)體征變化陰性對(duì)照81.351±0.373/皮毛脫落少二氫楊梅素80,492±0.112*63.5*皮毛脫落少5-Fu80.417逸121*69.1*皮毛脫落較多二氫楊梅素-5-Fu組80.345±0.113*74.5*皮毛脫落少*P<0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。實(shí)施例10、二氫楊梅素對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用1、實(shí)驗(yàn)方法材料健康雌性純種裸鼠BALB/c(nu/nu)，4~6周齡，重1320g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。5-氟尿嘧啶(5-Fu);Ki67、BcI-2抗體及相關(guān)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。原位凋亡檢測(cè)試劑inSituCellDeathDetection(Podkit),購(gòu)自Roche公司。人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231;二氫楊梅素。人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液，活細(xì)胞濃度為lX107/ml。SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在每只裸鼠右胸乳腺脂墊內(nèi)接種細(xì)胞懸液0.2ml/只(含細(xì)胞數(shù)2乂106個(gè))，4周左右形成明顯可見(jiàn)的移植瘤，32只荷瘤鼠隨機(jī)分組用藥。動(dòng)物分組及用藥①對(duì)照組8只，丙二醇0.1ml/只，ip,共15d;0.9%NS，0.1ml/只，ip，共5d。②二氫楊梅素組8只，二氫楊梅素60mg/(kg'd),溶于0.1ml丙二醇中，ip，共15d;0.9%NSO.lml/只，ip，共5d。③5-Fu組8只，5-Fu30mg/(kgd)，溶于0.9%NS0.1ml，ip，共5d;丙二醇O.Iml/只，ip，共15d。④二氫楊梅素+5-Fu組8只，二氫楊梅素60mg/(kgd)，溶于0.1ml丙二醇中，ip，共]5d;5-Fu30mg/(kgd)溶于0.9%NS0.1ml中，ip，共5d。抑瘤率觀察每隔2d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑(a)、橫徑(b)，計(jì)算腫瘤體積，平均瘤體積氣aXb2)/2，并繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，完整剝?nèi)∧[瘤，稱(chēng)量瘤重。按以下公式計(jì)算藥物的抑瘤率抑瘤率氣l-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%。Ki67、Bcl-2表達(dá)的檢測(cè)Ki67抗原采用SP法免疫組化染色，陽(yáng)性細(xì)胞胞核染成棕黃色。按，下述計(jì)算Ki67指數(shù)(Ki67-LI):低倍下(X100倍)確定有代表性的Ki67染色陽(yáng)性5個(gè)視野，高倍下(X400倍)每個(gè)視野數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，其中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比即為Ki67-LI。Bcl-2采用SP法免疫組化染色，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染成棕黃色。按下述進(jìn)行結(jié)果判定:觀測(cè)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，其陽(yáng)性率<10%為(-)，陽(yáng)性率10%25%15為(十)，陽(yáng)性率25%50%為(+十)，陽(yáng)性率>50%為(+++)。陰性對(duì)照均用PBS代替第一抗體。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于裸鼠乳腺脂墊，4周左右形成明顯可見(jiàn)移植瘤，呈分葉狀或結(jié)節(jié)狀生長(zhǎng)。用藥期間，裸鼠無(wú)死亡。二氫楊梅素組、5-Fu組、二氫楊梅素+5-Fu組抑瘤率分別為41.5%、44.6%、50.3%，以聯(lián)合用藥組腫瘤生長(zhǎng)受抑制最明顯(表12)。表12、二氫楊梅素對(duì)人乳腺瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二氫楊梅素對(duì)移植瘤細(xì)胞增殖的影響在光鏡下觀察腫瘤組織，對(duì)照組移植瘤細(xì)胞仍保持培養(yǎng)狀態(tài)下癌細(xì)胞原有的異型性，形狀不規(guī)則，核大深染，核異型，可見(jiàn)異常核分裂相。二氫楊梅素用藥組腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度退行性變，部分腫瘤組織出現(xiàn)明顯壞死。Ki67免疫組化顯示Ki67抗原表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色染色。對(duì)照組Ki67-LI高于二氫楊梅素組、5-Fu組、二氫楊梅素+5-Fu組,有顯著性差異(PO.01)(表13)，表明二氫楊梅素用藥組腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制,結(jié)合光鏡分析，二氫楊梅素對(duì)腫瘤細(xì)胞也有一定直接細(xì)胞毒性作用。表13、藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*P<0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組；AP<0.05，5-Fu和二氫楊梅素處理組間。二氫楊梅素對(duì)移植瘤細(xì)胞凋亡的影響Timd法檢測(cè)，在熒光顯微鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞呈黃綠色熒光細(xì)胞,細(xì)胞體積縮小皺縮,治療組較對(duì)照組凋亡細(xì)胞明顯增多。光鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞核染成棕黃色。結(jié)果表明二氫楊梅素組、5-Fu組、二氫楊梅素+5-Fu組凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組(PO.Ol)，二氫楊梅素+5-Fu組明顯高于二氫楊梅素組、5-Fu組(P0.05)。二氫楊梅素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而聯(lián)合用藥，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)。乳腺癌組織中Bcl-2免疫組化檢測(cè)結(jié)果Bcl-2蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞漿，二氫楊梅素組、5-Fu組、二氫楊梅素+5-Fu組明顯低于對(duì)照組(P0.05)，表明二氫楊梅素可抑制bci-2基因的蛋白表達(dá)(表13)。_表13、各組乳腺癌組織Bcl-2蛋白表達(dá)Bcl-2表達(dá)陰性對(duì)二氫楊梅素5-Fu二氫楊梅素照十5隱Fu一1+3767++412+++1實(shí)施例11、二氫楊梅素對(duì)親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移基因骨涎蛋白表達(dá)的抑制作用丄、實(shí)驗(yàn)材料與方法MDA-MB-231-B0細(xì)胞MEM培養(yǎng)液干粉，Gibco公司，胎牛血清。設(shè)置對(duì)照組和二氫楊梅素處理組；對(duì)照組為含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)MDA-MB-231-B0細(xì)胞，二氫楊梅素處理組是在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入20mg/L的二氫楊梅素。其余操作相同。免疫組化法檢測(cè)乳腺癌腫瘤細(xì)胞骨涎蛋白(BSP)蛋白的表達(dá)。制備MDA-MB-231-B0細(xì)胞爬片，釆用常規(guī)免疫組化SP法檢測(cè)BSP的表達(dá)。待細(xì)胞在載玻片上的融合度達(dá)到7590%，用0.01mol/L的PBS沖洗玻片3次，1W。甲醛固定30min。0.01mol/L的PBS洗滌，3%的H202甲醇溶液室溫下孵育10min，0.01mol/L的PBS洗滌，在蠟筆所畫(huà)的范圍內(nèi)滴一滴試劑B(正常非免疫動(dòng)物血清)，室溫孵育lOrnin，加經(jīng)1:200稀釋的50yl—抗(鼠抗hBSP)，室溫放置6090min，對(duì)照組僅加抗體稀釋液，0.01mol/L的PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(羊抗鼠IgG)，室溫孵育lOmin，O.01mol/L的PBS洗滌，滴加1滴試劑D(鏈霉菌抗生素-過(guò)氧化物酶溶液)，室溫孵育10min，O.Olmol/L的PBS洗滌，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗，乙醇梯度脫水，透明劑處理2X10min，樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為BSP表達(dá)陽(yáng)性。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論通過(guò)免疫組化法檢測(cè)BSP蛋白的表達(dá)，親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MM-MB-231-BO胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒，表明MDA-MB-23卜BO細(xì)胞表達(dá)BSP。而二氫楊梅素處理的細(xì)胞胞質(zhì)中均無(wú)棕色顆粒，提示細(xì)胞BSP表達(dá)呈陰性。骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，主要分布在礦質(zhì)化的組織中，由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞表達(dá)和分泌。已有研究報(bào)道乳腺癌細(xì)胞中增加BSP的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。BSP陽(yáng)性癌細(xì)胞脫離血循環(huán)進(jìn)入骨髓腔，黏附定位于骨礦質(zhì)化基質(zhì)的表面，BSP的RGD序列與aVP3結(jié)合，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞和骨小梁的黏附，活化破骨細(xì)胞產(chǎn)生溶骨性骨吸收，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示二氫楊梅素可抑制乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移。實(shí)施例12、二氫楊梅素對(duì)人腸癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤增殖抑制作用1、實(shí)驗(yàn)方法人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系l(WO細(xì)胞；二氫楊梅素。細(xì)胞培養(yǎng)lovo細(xì)胞以含10%滅活的新生牛血清、雙抗的1640培養(yǎng)基，在5%C02、1737°C、相對(duì)濕度95%條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞單層生長(zhǎng)、當(dāng)瓶底細(xì)胞的覆蓋度達(dá)90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。以指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在0—120ixg/ml二氫楊梅素濃度遞增時(shí)，多孔板培養(yǎng)lovo細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察二氫楊梅素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株kwo在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液。SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，腹背側(cè)部皮下注射含5xl()S癌細(xì)胞的懸液0.5ml，成瘤后用組織塊套管針?lè)ㄆは乱浦矠閷?shí)體瘤。將人結(jié)腸癌皮下移植的裸鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，雌雄各半。(1)模型組(陰性對(duì)照)，生理鹽水0.5ml/只灌胃；(2)二氫楊梅素組，以80mg/kg灌胃；(3)5-Fu組(陽(yáng)性對(duì)照)，以5-Fu30mg/kg腹腔注射；(4)二氫楊梅素-5-Fu組，以二氫楊梅素40mg/kg灌胃、并以5-Fu30mg/kg腹腔注射。在移植后第6天開(kāi)始給藥，5-Fu組給藥1次/d，共用6天后停藥，二氫楊梅素組給藥1次/d,共6周，對(duì)照組給予生理鹽水。停藥后24h處死，剝離腫瘤塊稱(chēng)重，觀察抗腫瘤作用。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(O二氫楊梅素對(duì)腸癌細(xì)胞的抑制和凋亡作用lovo細(xì)胞在二氫楊梅素終濃度為20、40、60、80ug/ml時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降且各濃度下細(xì)胞活力與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(P〈0.01)(表14)。AnnexinV-PI雙標(biāo)染色流式細(xì)胞儀分析二氫楊梅素對(duì)lovo細(xì)胞凋亡的影響不同濃度的二氫楊梅素作用k)vo細(xì)胞72h后，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高，隨二氫楊梅素濃度加大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡率明顯增高，與對(duì)照組相比具有顯著差異性。表14、二氫楊梅素對(duì)腸癌Iovo細(xì)胞凋亡的影響(-x士s)二氫楊梅素(ug/ml)細(xì)胞抑制率(％)細(xì)胞凋亡率(％)101.8±0.3l.O土O.1204.4±0.51.7±0.34017.0±1.27.7±0.38047.5±0.528.7±0,8，87.5±1.548.7±0.8二氫楊梅素誘導(dǎo)人腸癌lovo細(xì)胞具有明顯的藥物濃度依賴(lài)性，在同一時(shí)間段，隨藥物濃度的增加細(xì)胞凋亡率增加,兩者呈正相關(guān)(PO.Ol)。同一濃度不同時(shí)間段細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。120ug/m濃度二氫楊梅素作用72h后的凋亡率達(dá)到了48.7%。(2)二氫楊梅素對(duì)腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤增殖抑制作用在光鏡下觀察腫瘤組織，對(duì)照組移植瘤細(xì)胞仍保持培養(yǎng)狀態(tài)下癌細(xì)胞原有的異型性，形狀不規(guī)則，可見(jiàn)異常核分裂相。二氫楊梅素給藥組腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度退行性變，部分腫瘤組織出現(xiàn)明顯壞死，表明二氫楊梅素對(duì)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖顯著的抑制作用(表15)。18表15、二氫楊梅素對(duì)腸癌腫瘤增殖的抑制作用處理組動(dòng)物數(shù)瘤體重(g)抑制率(％)陰性對(duì)照80.951±0.473/二氫楊梅素80.312±0.151*67.3*5-Fu80.277±0.142*70.8*二氫楊梅素-5-Fu組80.205±0.122*77.8*P<0.01，相對(duì)于陰性對(duì)照組。實(shí)施例13、二氫楊梅素的抑菌作用觀察1、材料供試細(xì)菌枯草芽孢桿菌(Ssci77〃s5〃M77i5)金黃色葡萄球菌(5Y邵力y/。c。ce〃,sa"re〃5)沙門(mén)氏菌(&^/3<9/7￡>7(k;力力月市炎雙球菌(尸"e咖ocoeci/50大腸桿菌(&c/erj.c/u'<3co7i)綠膿桿菌(/^e〃ctawo朋s3er柳'"。幼)普通培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來(lái)水(或蒸餾水)1000ml，調(diào)Ph7.2-7.4(固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂)。用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)。加富培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)基的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中加5%的無(wú)菌小牛血清。用于培養(yǎng)肺炎雙球菌。2、對(duì)幾種細(xì)菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定取20ml三角瓶分別編組編號(hào)，除第1瓶外，每一瓶加入3ml培養(yǎng)液；第1瓶?jī)?nèi)加入含有二氫楊梅素培養(yǎng)液6ml，吸取3ml加到第2瓶?jī)?nèi)，充分混勻后，吸出3ml到第3管，依次遞增稀釋到第6瓶，第6管充分混勻后吸出3ml混合液棄去。每一瓶?jī)?nèi)分別加入菌懸液50iU(菌液濃度為106-107個(gè)/)111)，搖勻后置37'C搖床培養(yǎng)24h，取出觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照設(shè)置一瓶培養(yǎng)。從細(xì)菌生長(zhǎng)少(培養(yǎng)不渾濁)各瓶，繼續(xù)培養(yǎng)一天后，取培養(yǎng)菌液涂布瓊脂平板培養(yǎng)基，經(jīng)37'C培養(yǎng)后觀察有無(wú)生長(zhǎng)加以判斷。以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的二氫楊梅素最高稀釋度為最低抑菌濃度(MIC)，以仍沒(méi)有菌生長(zhǎng)的二氫楊梅素最大稀釋度為最低殺菌濃度(MBC)3、測(cè)定結(jié)果二氫楊梅素對(duì)幾種細(xì)菌均有抗菌作用(表16),最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定結(jié)果表明二氫楊梅素對(duì)這些細(xì)菌均有殺菌能力。表16、二氫楊梅素對(duì)幾種細(xì)菌均有抗菌作用細(xì)菌MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)枯草芽孢桿菌1.01.019金黃色葡萄球菌0.500.50沙門(mén)氏菌1.02.0大腸桿菌0.501.0綠膿桿菌0.500.50肺炎雙球菌0.501.0實(shí)施例14、二氫楊梅素對(duì)小鼠CC14慢性損傷肝炎的治療作用1、材料和方法動(dòng)物18-22g雌性BALB/C小鼠，隨機(jī)分組。禁食6小時(shí)后，按0.5ml/kg體重腹腔注射CCL(10%石蠟油溶液)，每周二次，共八次。實(shí)驗(yàn)分為三組，二氫楊梅素組按120呢/kg體重每閂灌胃，正常對(duì)照組及損傷對(duì)照組給與相應(yīng)的生理鹽水。最后一次給藥第三天殺鼠，取血測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血清白蛋白(g/L)。同時(shí)取肝大葉相同部位的一小塊肝組織，用10%福爾馬林固定后，做病理切片檢查。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果CC14染毒組，肝小葉周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見(jiàn)纖維組織增生，小葉中心大部肝細(xì)胞壞死明顯，部分肝細(xì)胞脂肪變，空泡樣變明顯二氫楊梅素治療組的肝組織學(xué)改變與CC14染毒組有明顯不同，多數(shù)視野未見(jiàn)肝纖維組織增生和明顯肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脂肪樣變性較輕。血清酶學(xué)及血清白蛋白檢查結(jié)果(表17)，表明二氫楊梅素對(duì)CCl4慢性損傷小鼠有顯著的保護(hù)作用。表17、二氫楊梅素對(duì)CCV優(yōu)性損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和血清白蛋白的影響(Xts,n=10)ALT(U/100ml)血清白蛋白(g/L)處理正常對(duì)照組29.7土2.0348.53土6.33CCl4組105.95土8.3633.22土4.31CCL+二氫楊梅素40.64土7.26**41.54土6.18****P<0.01與CCL,組比較。CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活，聲稱(chēng)三氯甲基自由基(CC1:，')，通過(guò)氫的吸附而攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，CC1"繼而與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，CCl.,還可抑制細(xì)胞膜和微粒體膜上鈣離子泵的活性，使鈣離子內(nèi)流增加，從而引起細(xì)胞屮毒死亡。二氫楊梅素可以改善慢性肝損害肝組織空泡樣變性、肝脂肪化和纖維化的形態(tài)學(xué)改變，明顯降低血清中肝轉(zhuǎn)氨酶和提升血清中白蛋白的含量，保護(hù)肝功能。實(shí)施例15、二氫楊梅素片劑的制備片劑配方二氫楊梅素30-80%,藥用淀粉2—10%，乳糖10%—60%，阿斯巴甜0.2-1%、硬脂酸鎂0.5-1%將100目過(guò)篩的二氫楊梅素lOOOg和乳糖lOOOg干粉混合，過(guò)80目篩2-3次；加適量的蒸餾水，將藥用淀粉60g加熱糊化后、噴灑入混合干粉中，并不斷攪拌均勻，制粒，過(guò)16目篩后烘干；按照干粒重量加入100目過(guò)篩的阿斯巴甜0.5%和硬脂酸鎂0.5%,混勻，壓片。片硬度為0.9-1.2kg，片重為0.5-1.0g/片。實(shí)施例16、二氫楊梅素膠囊的制備膠囊劑配方二氫楊梅素30-80%，藥用淀粉5—30%，乳糖0%—60%,硬脂酸鎂0.5-1%。將二氫楊梅素1000g、藥用淀粉100g、乳糖200g的干粉混合，過(guò)80目篩2-3次；加適量的蒸餾水，將適量藥用淀粉加熱糊化后、噴灑入混合干粉中，攪拌均勻，制粒，過(guò)16-24目篩后烘干；按照干粒重量加入硬脂酸鎂0.5%，混勻。填充膠囊，粒重0.25-0.75g/粒。實(shí)施例n、二氫楊梅素貼劑的制備將生橡膠100g切成條狀，用壓膠機(jī)壓成網(wǎng)狀膠片，去靜電、放冷，浸入汽油中約24小時(shí)，使其充分溶脹，再移入配料鍋內(nèi)攪拌約3小時(shí)，依次加入松香80g、氧化鋅80g、羊毛脂15g、凡士林15g、液體石蠟10g，混勻，加入二氫楊梅素100g，攪勻，經(jīng)80目銅絲篩網(wǎng)濾過(guò)，進(jìn)行涂膏，切段，蓋襯，切塊，制成1000貼，即得二氫楊梅素貼劑。2權(quán)利要求1、二氫楊梅素在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述化療為細(xì)胞毒類(lèi)藥物化療。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物為作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物、作用于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制藥或作用于微管蛋白的藥物。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述作用于核酸合成的藥物為氟尿嘧啶。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述作用于微管蛋白的藥物為長(zhǎng)春新堿或紫杉醇。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物為環(huán)磷酰胺、絲裂霉素或順鈾。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述防治腫瘤放化療不良反應(yīng)為骨髓抑制、血細(xì)胞降低、細(xì)胞突變、脫發(fā)或繼發(fā)性腫瘤。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤放化療不良反應(yīng)為乳腺癌、宮頸癌或腸癌放化療不良反應(yīng)，二氫楊梅素與化療藥物聯(lián)合用藥提高腫瘤治療療效。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述二氫楊梅素與化療藥物聯(lián)合用藥是指用藥學(xué)上可接受的輔料制備的貼劑、軟膏劑、凝膠劑、軟膠囊劑或栓劑。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫楊梅素在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用藥學(xué)上可接受的輔料制備的口服固體制劑、口服液體制劑、注射液、凍干粉針劑或大輸液劑型。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)二氫楊梅素在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用。該應(yīng)用具體用于制備防治腫瘤放療與化療中的不良反應(yīng)、防治骨髓抑制、脫發(fā)、抗突變與防治繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生和防治腫瘤轉(zhuǎn)移，作為防治乳腺癌、宮頸癌和腸癌等藥物。本發(fā)明創(chuàng)造性發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素清除自由基、抑制自由基反應(yīng)鏈、二氫楊梅素抗突變和抑制腫瘤基因表達(dá)和引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而防治腫瘤發(fā)生、防治繼發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移以及防治感染。因此，二氫楊梅素作為防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物，抑制和減輕化學(xué)傷害、防治致突變劑的損害而預(yù)防基因突變或繼發(fā)性腫瘤，將與放化療聯(lián)合用藥而實(shí)現(xiàn)防治腫瘤放化療不良反應(yīng)和預(yù)防腫瘤發(fā)生。文檔編號(hào)A61K31/352GK101485655SQ20091003715公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年2月12日優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日發(fā)明者張曉元,勇郭申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)