專利名稱：：一種雙特異性寡肽-力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型抗腫瘤靶向藥物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的多發(fā)病和常見(jiàn)病，已經(jīng)位居人類(lèi)疾病中三大主要死亡原因之首。傳統(tǒng)的腫瘤化學(xué)治療，由于靶向性不明確、選擇性不強(qiáng)、特異性不高和極易產(chǎn)生耐藥等，導(dǎo)致其存在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)損害正常組織細(xì)胞，影n^^說(shuō)壬n/上左甘B楚4;l11^Sliir^處、te;i^rnilTTT古日B接鉢仆&的^,B.t縣宮坫肺癇始;T^'t:j/J/v<-'J"—ij/yj、j，vri_jutu1.ji丄iH/J7、j'j夕u"i^i、-"乂uiu/jnji/-j_'i—j■/山,h"的效果。在靶向性治療中，單克隆抗體發(fā)揮了重要的作用，然而單抗存在對(duì)實(shí)體腫瘤滲透能力差的缺點(diǎn)。因此，采用小分子寡肽配體取代單抗的作用，已成為靶向藥物的一個(gè)發(fā)展方向。表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(或稱HER1)、HER2、HER3和HER4都是跨膜受體酪氨酸激酶家族(ErbB)的成員。該家族成員有著相似的結(jié)構(gòu)，均由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域組成。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，可導(dǎo)致受體發(fā)生同二聚化或異二聚化，從而激活受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而活化一系列的胞內(nèi)信號(hào)通路，最終促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增值、分化和遷移。EGF是EGFR的天然配體，以EGF或抗EGFR的單克隆抗體為導(dǎo)向分子構(gòu)成的融合蛋白，能夠通過(guò)EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而進(jìn)入EGFR表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮特異性殺傷作用。EGF由53個(gè)氨基酸組成，與受體結(jié)合的區(qū)段位于其C環(huán)。HER2目前還未發(fā)現(xiàn)其天然配體，但在發(fā)生二聚化時(shí)，它是其他受體優(yōu)先選擇的對(duì)象。ErbB受體家族與人類(lèi)癌癥的關(guān)系非常密切，尤其是EGFR和HER2。ErbB受體發(fā)生改變的腫瘤通常更具有侵襲性，而且病人往往也預(yù)后不良。例如在25-30%的乳腺癌中HER2基因呈高表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌和頭頸部腫瘤中EGFR大量表達(dá)或發(fā)生突變等，這就使得EGFR和HER2成為很有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)。目甜臨床使用的靶向ErbB受體的藥物主要可分為兩類(lèi)一類(lèi)是單克隆抗體，用于結(jié)合受體的胞外結(jié)構(gòu)域；另一類(lèi)是小分子的酪氨酸激酶抑制劑，其機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)。這些藥物單獨(dú)使用或者與其他化4療藥物聯(lián)合應(yīng)用均獲得了較好的療效，但耐藥性問(wèn)題仍然比較突出。研究顯示，EGFR和HER2是協(xié)同發(fā)揮作用的，共同導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞的癌變，而單獨(dú)的任何一個(gè)受體都不足以引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。另一些研究也表明，在其他受體配基存在的情況下，靶向于某一ErbB受體的抗腫瘤藥物的效果會(huì)被抵消。此外，一些臨床甜的體內(nèi)外研究也顯示，對(duì)ErbB受體的雙重抑制要比單獨(dú)靶向一個(gè)受體的抗腫瘤效果好。力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)也稱C-1027，是從我國(guó)湖北省潛江縣土壤中分離得到的一株鏈霉菌(5^eptomycesg/o^s;on^，菌種保藏號(hào)CGMCCNo.0704)產(chǎn)生的烯二炔類(lèi)抗生素，是迄今報(bào)道過(guò)的對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的大分子肽類(lèi)抗腫瘤抗生素。體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)表明，LDM對(duì)小鼠結(jié)腸癌26有非常顯著的療效，對(duì)人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種人移植瘤均有較好療效[中國(guó)抗生素雜志1994，19(2):164-168]。LDM由輔基蛋白(LDP)和烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(AE)兩部分組成，發(fā)色團(tuán)是力達(dá)霉素分子的活性部分，輔基蛋白對(duì)發(fā)色團(tuán)起穩(wěn)定保護(hù)作用。LDM的發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白系通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，因而可在體外將其拆分與重建。LDM以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，成為構(gòu)建新型導(dǎo)向藥物的理想"彈頭"[中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院報(bào)2001，23(6):563-567]。小型化和高效化，是解決當(dāng)前單抗治療劑所遇難點(diǎn)的重要途徑。本發(fā)明的目的，是以靶向EGFR和HER2的兩個(gè)寡肽Ec、Hr為導(dǎo)向分子，以LDM為"彈頭"，制備雙特異性強(qiáng)化融合蛋白。該強(qiáng)化融合蛋白在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤療效顯著。本發(fā)明所說(shuō)的雙靶點(diǎn)強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，迄今為止尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明提供的雙靶點(diǎn)強(qiáng)化融合蛋白，是由分別靶向EGFR和HER2的兩個(gè)寡肽分子、力達(dá)霉素輔基蛋白以及力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)組成，其中兩個(gè)導(dǎo)向寡肽分別位于力達(dá)霉素輔基蛋白的兩側(cè)。為了避免各分子之間空間結(jié)構(gòu)的相互干擾，在導(dǎo)向分子和力達(dá)霉素輔基蛋白之間設(shè)計(jì)了(G4S)2的柔性連接肽；為了使融合蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)，在其N(xiāo)水端還加入了pelB信號(hào)肽。靶向EGFR的導(dǎo)向短肽采用了EGFC環(huán)(22個(gè)氨基酸殘基，GenBank序列號(hào)AAS83395)，靶向HER2的導(dǎo)向短肽選擇了經(jīng)過(guò)分子進(jìn)化的抗HER2抗體C6.5重鏈的CDR3區(qū)(20個(gè)氨基酸殘基)[SchierR.等J.Mol.Biol.1996,263(4):551-567]。本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白編碼基因全長(zhǎng)為612bp，編碼204個(gè)氨基酸，融合蛋白分子量為19.3kD，其基因編碼序列和氨基酸序列如序列表所示。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下歩驟1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-五c-丄D尸-Z/r的構(gòu)建含有力達(dá)霉素輔基蛋白的重組質(zhì)粒pEFL由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(菌種保藏號(hào)CGMCCNo.0960)，pMD18-T載體購(gòu)于大連i生物公司，大腸桿菌菌株DH5a購(gòu)自北京博大泰克公司，pET30a表達(dá)載體以及大腸桿菌菌株BL2kto/M(DE3)均購(gòu)自Novagen公司。靶向EGFR和HER2的寡肽Ec和Hr(分別是EGFC環(huán)的22個(gè)氨基酸殘基、抗HER2抗體C6.5重鏈CDR3區(qū)的20個(gè)氨基酸殘基)、柔性連接肽(G4S)2以及pelB信號(hào)肽[RathoreD.等，F(xiàn)EBSLetters,1996，392(3):259-262]均根據(jù)其氨基酸序列反推出DNA序列，并參考了大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，人工合成了上述寡肽的基因片段，作為PCR的引物，PCR引物由上海生工公司合成。采用PCR技術(shù)分別克隆得到基因片段和份基因片段，并在基因的N末端引入pelB信號(hào)肽序列；將基因與i^尸-Z/r基因進(jìn)行重疊拼接PCR，得到五c-丄D尸-份基因，將此基因片段插入到pET30a表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體pET-5c-LD尸-Z^。2.融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將表達(dá)載體pET-￡c-ZXP-//r轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL2btor(DE3)中，得到轉(zhuǎn)化菌株，命名為pET-Ec-LDP-Hr，于2008年12月31R提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)CGMCCNo.2846。加入異丙基-^D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)8小時(shí)后，按pET系統(tǒng)操作手冊(cè)(Novagen公司)分別制備全細(xì)胞組分、培養(yǎng)液上清組分、周質(zhì)腔組分、細(xì)胞質(zhì)可溶性組分、包涵體組分，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析融合蛋白的定位情況。結(jié)果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr主要以可溶性形式存在于周質(zhì)腔中。3.融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化采用滲透壓震驚法提取大腸桿菌周質(zhì)腔中的蛋白。由于pET載體帶有六聚組氨酸標(biāo)簽，融合蛋白的純化采用親和層析方法，使用GE公司的HisTrapN產(chǎn)柱，按照GE公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。4.融合蛋白Ec-LDP-Hr的生物學(xué)活性測(cè)定主要采用ELISA法、流式細(xì)胞技術(shù)6和免疫熒光技術(shù)，分析融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和活性。5.強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備融合蛋白Ec-LDP-Hr與力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)AE以1:3的比例，在體外進(jìn)行分子組裝，得到強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr匿AE6.強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的生物學(xué)活性分析主要采用MTT法，檢測(cè)強(qiáng)化融合蛋白對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷活性以及在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型中，觀察強(qiáng)化融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性。發(fā)明效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于，所說(shuō)強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE穩(wěn)定性好，可以使用基因工程手段進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵制備。該強(qiáng)化融合蛋白以兩個(gè)寡肽作為導(dǎo)向分子，分子量小(僅為19.3KDa)、免疫原性小、穿透性強(qiáng)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力明顯優(yōu)于LDM以及單特異性的強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-AE和LDP-Hr-AE;體內(nèi)試驗(yàn)也顯示了良好的抗腫瘤療效，是一種新型、高效、小型抗腫瘤靶向藥物，具有良好的應(yīng)用甜景。圖1:重組質(zhì)粒pMD-fc-丄P/5-//r的構(gòu)建示意圖圖2:重組質(zhì)粒pET-Ec-丄D尸-份的限制性內(nèi)切酶分析其中l(wèi).DNAMarkerDL15000;2.pET30a質(zhì)粒；3.pET-￡c-Hr質(zhì)粒；4.pET30a/AWel+loI;5.pET匿五c層mP-份/MM+勘I;6.DNAMarkerDL2000。圖3:融合蛋白Ec-LDP-Hr表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析其中l(wèi).分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa);2.IPTG誘導(dǎo)后五.co"總蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)前五.co/Z總蛋白；4.誘導(dǎo)后培養(yǎng)液上清組分；5.誘導(dǎo)前培養(yǎng)液上清組分；6.誘導(dǎo)后五.co"周質(zhì)腔組分；7.誘導(dǎo)前E.co/Z周質(zhì)腔組分；8.誘導(dǎo)后Eco/Z細(xì)胞質(zhì)可溶組分；9.誘導(dǎo)前KCO"細(xì)胞質(zhì)可溶組分；10.誘導(dǎo)后五.CO"細(xì)胞質(zhì)包涵體組分;11.誘導(dǎo)前細(xì)胞質(zhì)包涵體組分。圖4:融合蛋白Ec-LDP-Hr經(jīng)N卩+親和層析純化的SDS-PAGE分析其中1.分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa);2.未上柱的周質(zhì)腔總蛋白；73.樣品上柱后未與N產(chǎn)柱結(jié)合的雜蛋白；4.用結(jié)合緩沖液洗脫下的雜蛋白；5.用洗滌緩沖液洗脫下的雜蛋白；6-13.用洗脫緩沖液洗脫下的目的蛋白。圖5:經(jīng)N嚴(yán)親和層析純化的融合蛋白Ec-LDP-Hr的HPLC純度分析圖6:融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的免疫結(jié)合活性分析其中*—SK-OV-3;余一A431;*—SK-BR陽(yáng)3;楊一MCF-7;&—NIH3T3。圖7:融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞的免疫熒光化學(xué)分析圖8a:融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3細(xì)胞EGFR受體結(jié)合特異性分析其中l(wèi).PBS對(duì)照；2.融合蛋白與抗EGFR抗體混合物；3.抗EGFR抗體。圖8b:融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3細(xì)胞HER2受體結(jié)合特異性分析其中l(wèi).PBS對(duì)照；2.融合蛋白與抗HER2抗體混合物；3.抗HER2抗體。圖9:強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE體外組裝的HPLC分析圖10a:強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE對(duì)SK-0V-3細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中LDM;*—Ec-LDP-iir-AE;—Ec-LDP-AE;一LDP-Hr-AE。圖10b:強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中*一LDM;*—Ec-LDP-HKAE;Ec-LDP-AE;—LDP-Hr-AE。圖10c:強(qiáng)化融合蛋白對(duì)A431細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中*一LDM;*—Ec-LDP-Hr-AE;o—Ec墨LDP-AE;—LDP-Hr-AE。圖10d:強(qiáng)化融合蛋白對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中*一LDM;蕃一Ec-LDP畫(huà)Hr-AE;—Ec-LDP-AE;—LDP-Hr-AE。。圖10e:強(qiáng)化融合蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中*一LDM;尋一Ec-LDP陽(yáng)Hr-AE;—Ec-LDP-AE;*—LDP-Hr-AE。8圖11:強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對(duì)人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用其中4一Control;—Ec-LDP-Hrlmg/kg;LDM0.05mg/kg;*一Ec-LDP-Hr-AE0.3mg/kg;Ec-LDP-Hr-AE0.4mg/kg;a—Ec-LDP-Hr-AE0.5mg/kg。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。<實(shí)施例1〉重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Ec-Z"/V/r的構(gòu)建.-PCR反應(yīng)引物PI:5'ggtggaggcggtteaggtggaggtteagcgcccgccttctecgtcagt3'(l-27bp為(G4S)2連接肽序列，28-48bp與力達(dá)霉素輔基蛋白l-21bp配對(duì))P2:5'tgaaccgcctecacctgaaccgcctecaccgccgaaggtcagagecacgtg3'(l-30bp為(G4S)2連接肽序列，31-51bp與力達(dá)霉素輔基蛋白639-660bp配對(duì))P3:5'aactgtgtggtgggctatattggcgaacgctgtcagtatcgcgatctgaaatggtgggaactgcgcggtggaggcggtteaggt3，(l-66bp為寡肽Ec片段序列，67-84bp%(G4S)2連接肽l-18bp配對(duì))P4:5'gcetcgagcacgcccagccattceggccatttcgcacagetgcgateggtacaatagcccacateatgtgaaccgcctecacctga3'(下劃線部分為A7wl酶切位點(diǎn)，9-60bp為寡肽Hr序列，61-86bp與(G4S)2連接肽1-18配對(duì))P5:5'gccatatgaaatacctgctgccgaccgetgetggtctgctgetcetcgetgcccagccggcgatggccatggccaactgtgtggtgggctatatt3'(下劃線部分為Mfel酶切位點(diǎn)，9-66bp為pelB信號(hào)肽序列，67-95bp與寡肽Ec的1-21bp配對(duì))P6:5'gc￡§L§tg_aaatacctgctgccgacc3'(下劃線部分為Mfel酶切位點(diǎn)，與pdB信號(hào)肽序列l(wèi)-18bp配對(duì))P7:5'gcetcgagcacgcccagccattcegg3，(下劃線部分為屈ol酶切位點(diǎn)，與寡肽Hr序列42-60bp配對(duì))Rl:5'gccgaaggtcagagecacgtg3，(與力達(dá)霉素輔基蛋白639-660bp配對(duì))R2:5'gcgcccgccttctecgtcagtc3'(與力達(dá)霉素輔基蛋白l-22bp配對(duì))R3:5'gcetcgaggccgaaggtcagagecacgtg3'(下劃線部分為oI酶切位點(diǎn)，與力達(dá)霉素輔基蛋白639-660bp配對(duì))(1)以質(zhì)粒pEFL(含有力達(dá)霉素輔基蛋白基因)為模板，弓l物1和引物Rl以及引物4和引物R2分別進(jìn)行第一輪常規(guī)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收360bp的片段，克隆至pMD18-T載體，分別命名為pMDl和pMD2，挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒作為下一輪PCR反應(yīng)的模板；(2)以質(zhì)粒pMDl和pMD2為模板，弓l物2和引物Rl以及引物5和引物R2進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收426bp以及420bp的片段，克隆至pMD18-T載體，分別命名為pMD3和pMD4，挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒作為下一輪PCR反應(yīng)的模板；(3)以質(zhì)粒pMD3為模板，弓1物3和引物R3進(jìn)行第三輪PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收500bp的片段，克隆至pMD18-T載體，命名為pMD5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒作為下一輪PCR反應(yīng)的模板；(4)以質(zhì)粒pMD5為模板，弓I物6與引物R1進(jìn)行第四輪PCR反應(yīng)；同時(shí)以質(zhì)粒pMD4為模板，引物5和引物R2進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收500bp以及420bp的片段；(5)以回收的兩個(gè)片段混合作為模板，引物6和引物7進(jìn)行第五輪重疊拼接PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收600bp的片段，克隆至pMD18-T載體，命名為pMD-五c-丄DP-i^。重組質(zhì)粒pMD-五c-丄i^-Z^的構(gòu)建見(jiàn)(圖1)，挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；(6)測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒用Mfel和^oI雙酶切，酶切得到的小片段與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的pET30a載體連接，得到重組表達(dá)載體pET-五c-丄D/5-/^(圖2)。經(jīng)過(guò)五輪PCR構(gòu)建的融合蛋白基因全長(zhǎng)612bp，編碼204個(gè)氨基酸，其中pe舊信號(hào)肽長(zhǎng)72bp,編碼24個(gè)氨基酸，融合蛋白分泌至周質(zhì)腔中時(shí)信號(hào)肽被周質(zhì)腔中的信號(hào)肽酶切除，只留下兩個(gè)氨基酸甲硫氨酸和丙氨酸；EGFC環(huán)長(zhǎng)66bp，編碼22個(gè)氨基酸，之后依次是(G4S)2連接肽(IO個(gè)氨基酸)、力達(dá)霉素輔基蛋白(110個(gè)氨基酸)、(G4S)2連接肽(IO個(gè)氨基酸)、抗HER2抗體重鏈CDR3區(qū)(20個(gè)氨基酸)、A7^I酶切位點(diǎn)(2個(gè)氨基酸)以及組氨酸標(biāo)簽(6個(gè)氨基酸)，因此，最后得到的融合蛋白含有182個(gè)氨基酸殘基，測(cè)序結(jié)果和預(yù)期一致，表明載體構(gòu)建成功。其基因序列和氨基酸序列見(jiàn)序列表。<實(shí)施例2>融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將表達(dá)載體pET-Ec-丄Z)尸-份轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21sto/M(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。從平板上挑取一個(gè)單克隆接種至10mlLB培養(yǎng)基(含有卡那霉素50/xg/ml)中，37'C搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日將10ml菌液轉(zhuǎn)接至lLLB培養(yǎng)基(含有卡那霉素50/xg/ml)中，37'C搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD60(^2。菌液在無(wú)菌條件下于4°C、5,000g離心10分鐘，菌體沉淀用1L新鮮的LB培養(yǎng)基(含有卡那霉素50Mg/ml)重懸，加入IPTG至終濃度為O.lmM，37'C搖床振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。按照pET系統(tǒng)操作手冊(cè)中的步驟，分別制備全細(xì)胞組分、培養(yǎng)液上清組分、周質(zhì)腔組分、細(xì)胞質(zhì)可溶性組分和包涵體組分，15%SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在周質(zhì)腔中經(jīng)誘導(dǎo)的菌體在18kD處有目的條帶表達(dá)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無(wú)此帶(圖3)。對(duì)影響表達(dá)產(chǎn)量的各個(gè)條件溫度、菌體起始密度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定表達(dá)條件為溫度37°C、菌體起始密度OD600=2、IPTG濃度為O.lmM、誘導(dǎo)時(shí)間8小時(shí)。<實(shí)施例3>融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化(1)將誘導(dǎo)好的菌液于4'C、10,000g離心10分鐘，收集菌體，融合蛋白主要定位于大腸桿菌的周質(zhì)腔，周質(zhì)腔蛋白的提取采用滲透壓震驚法；(2)將菌體重懸于100ml高滲溶液(30mMTris-Cl,lmMEDTA,20。/。蔗糖，pH8.0)中，用磁力攪拌器于室溫緩慢攪拌10分鐘；'(3)于4。C、10,000g離心IO分鐘，收集菌體，棄去上清液；(4)用90ml預(yù)冷的蒸餾水(低滲溶液)重懸菌體，用磁力攪拌器于4。C緩慢攪拌10分鐘；(5)于(C、10，000g離心IO分鐘，收集上清液；11(6)上清液中加入10mlIOX結(jié)合緩沖液(200mM磷酸緩沖液，5MNaCl,200mM詠唑)，使磷酸緩沖液、NaCl、咪啤的終濃度分別為20mM、0.5M和20mM;(7)由于融合蛋白帶有六聚組氨酸標(biāo)簽，因此其純化方法主要采用Ni2+親和層析技術(shù)，親和層析柱HisTrapHP購(gòu)于GE公司；(8)msTrap親和層析柱先用蒸餾水沖洗5個(gè)柱體積，再用1X結(jié)合緩沖液(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl,20mM咪唑)平衡5個(gè)柱體積；(9)將上述提取的周質(zhì)腔蛋白溶液上柱，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(10)洗滌緩沖液I(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCi,50mM咪唑)沖洗柱子5體積，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(11)洗滌緩沖液II(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl,70mM咪唑)沖洗柱子5體積，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(12)洗脫緩沖液(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl，500mM咪唑)洗脫蛋白，洗5-8個(gè)柱體積，流速控制為lml/min，分管收集流出液以備分析；(13)將各部分的流出液各取50u1進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖4)分析，收集含目的蛋白的洗脫液；(14)將含目的蛋白的洗脫液用IOK的超濾管(Millipore公司)濃縮至所需濃度，蛋白溶液于-8(TC保存?zhèn)溆谩＜兓娜诤系鞍桩a(chǎn)量為每升發(fā)酵液9mg活性蛋白，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為95.3。/。。(圖5)。<實(shí)施例4〉融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫活性分析1.ELISA法分析融合蛋白對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性(1)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3，人表皮癌細(xì)胞A431、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3以1X104個(gè)細(xì)胞/井的密度接種于96孔板(不同細(xì)胞的大小以及生長(zhǎng)速度有差異，本數(shù)量是以MCF-7細(xì)胞為例，其他的細(xì)胞以24小時(shí)長(zhǎng)滿96孔板為準(zhǔn))，37'C培養(yǎng)24小時(shí)后用PBS洗3次(3分鐘/次)，加入4'C預(yù)冷的0.05%戊二醛50U1/井，于4"C固定細(xì)胞15分鐘；(2)固定好的細(xì)胞用PBS洗3次后，用1%BSA/PBS溶液以200/xl/井于4'C封閉過(guò)夜；(3)用PBST緩沖液(PBS中含有0.05%的Tween-20)洗3次；(4)將融合蛋白倍比稀釋加入到96孔板中，50m1/井，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行井，37'C溫育2小時(shí)；(5)用pbst洗3次后，加入抗His-tag單抗(1:2000)稀釋，50m1/井，37°C溫育2小時(shí)；(6)用PBST洗板3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(]:2500)稀釋，50/^1/井，37'C溫—存2小時(shí)；(7)用PBST洗板5次，加入辣根過(guò)氧化物的底物反應(yīng)液(鄰苯二胺0.1M檸檬酸H202=4mg:10ml:15mU，100]Ul/井，室溫避光反應(yīng)10分鐘。以2M的硫酸100Ml/井終止反應(yīng)，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定492nm的吸光值。結(jié)果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)高表達(dá)EGFR和HER2的腫瘤細(xì)胞，如SK-0V-3、A431、SK-BR-3和MCF-7都有較強(qiáng)的免疫結(jié)合活性，而對(duì)不表達(dá)EGFR和HER2的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3則沒(méi)有免疫結(jié)合活性，且結(jié)合活性的強(qiáng)弱與EGFR和HER2的表達(dá)水平存在一定的相關(guān)性，如SK-OV-3細(xì)胞EGFR和HER2表達(dá)水平均較高，因此，融合蛋白與該細(xì)胞的親和活性最強(qiáng)(圖6)。2.細(xì)胞免疫熒光法分析融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞結(jié)合活性將SK-BR-3細(xì)胞(EGFR和HER2均表達(dá))以4X104的密度接種到放有蓋玻片的六孔板中，37'C培養(yǎng)24小時(shí)后用PBS洗3次，加入甲醇于室溫固定10分鐘，吸棄甲醇，再次加入甲醇置于-20'C固定IO分鐘，PBS洗3次；加入融合蛋白Ec-LDP-HR(50|Ug/ml)，于室溫孵育2小時(shí)或于4"過(guò)夜，然后PBS洗3次；加入1:500稀釋的抗His-tag抗體，室溫反應(yīng)2小時(shí)，PBS洗3次；加入l:IOO稀釋的FITC(中文？)標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫避光反應(yīng)1小時(shí)，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察并照相。結(jié)果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr可與SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合(圖7)。3.競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光試驗(yàn)，分析融合蛋白Ec-LDP-HR與EGFR和HER2結(jié)合的特異性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-BR-3細(xì)胞，用胰酶消化后計(jì)數(shù)，取5個(gè)離心管，每管中加入5x1()S個(gè)細(xì)胞，PBS洗3次后用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，13PBS洗3次；在5個(gè)離心管中分別加入PBS、Ec-LDP-Hr蛋白(100/xM)和抗EGFR抗體(5/xg)混合物、抗EGFR抗體(5/ag)、Ec-LDP-Hr(100/xM)蛋白和抗HER2抗體(5將)混合物、抗HER2抗體(5/ig)，反應(yīng)體積均為100/J，4。C反應(yīng)過(guò)夜；離心去上清，PBS洗3次后加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(l:100稀釋)，室溫反應(yīng)l小時(shí)；離心去上清，PBS洗3次后重懸于lmlPBS中，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，融合蛋白可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制抗EGFR抗體和抗HER2抗體與SK-BR-3細(xì)胞的結(jié)合(圖8a和8b)。<實(shí)施例5>強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備取高活性的力達(dá)霉素純品(專利號(hào)00121527.2)，經(jīng)C4柱分離活性發(fā)色團(tuán)，流動(dòng)相為水乙腈三氟乙酸(78%:22%:0.05%)，檢測(cè)350nm處的吸光值，收集發(fā)色團(tuán)。將融合蛋白與發(fā)色團(tuán)按照l(shuí):3的分子比混合，置于搖床上緩慢晃動(dòng)，室溫避光反應(yīng)12-16小時(shí)，將二者的混合液經(jīng)SephadexG-75柱除去未包裝上的發(fā)色團(tuán)。經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，融合蛋白與發(fā)色團(tuán)已成功組裝，得到了強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE(圖9)。<實(shí)施例6>MTT法檢測(cè)強(qiáng)化融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、SK-BR-3、SK-0V-3、A431、NIH3T3細(xì)胞，用胰酶消化后計(jì)數(shù)，以4000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中(本數(shù)量是以MCF-7細(xì)胞為例，不同細(xì)胞的生長(zhǎng)速度不同，接種量也不相同，以未加藥的細(xì)胞72小時(shí)長(zhǎng)滿96孔板為原則)，37'C培養(yǎng)24小時(shí)后吸棄培養(yǎng)液，加入以培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的力達(dá)霉素或強(qiáng)化融合蛋白200/Al/L，每個(gè)藥物濃度設(shè)三個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入以PBS溶解的MTT(5mg/ml)20/xl，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜，室溫?fù)u床振蕩10分鐘，酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm處的吸光值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔各3孔，按下面公式計(jì)算細(xì)胞的存活率及強(qiáng)化融合蛋白的IC5o值細(xì)胞存活率=(A加藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)X100%結(jié)果表明，強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對(duì)SK-OV-3、SK-BR-3、A431和MCF-7等腫瘤細(xì)胞均有強(qiáng)烈的殺傷作用(圖10a、10b、10c、10d、10e)，其14IC5o值低于LDM和單特異性的強(qiáng)化融合蛋白，而對(duì)不表達(dá)EGFR和HER2的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞，其ICso值則與LDM相當(dāng)(表1)。由此可以看出，強(qiáng)化融合蛋白與LDM和單特異性的強(qiáng)化融合蛋白相比，其對(duì)高表達(dá)EGFR和HER2的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性則略有下降，這表明強(qiáng)化融合蛋白的作用具有特異性。表1.LDM和強(qiáng)化融合蛋白對(duì)各種細(xì)胞的ICm)但<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><實(shí)施例7>強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對(duì)人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的治療作用'取體重為18-22g的雌性BALB/c裸鼠2只，將人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3接種于裸鼠腋窩皮下，每只接種1X1(^個(gè)細(xì)胞。待瘤塊長(zhǎng)至足夠大小時(shí)，將其在無(wú)菌生理鹽水中剪成2X2X2mm3的小塊，用套管針將腫瘤分別移植到36只體重為18-22g的雌性BALB/c裸鼠右腋窩皮下，用火膠棉將切口粘住。待瘤塊長(zhǎng)至100mr^大小時(shí)，將裸鼠按照瘤塊大小、體重分6組，使每組瘤塊大小平均值為100mm3，且各組體重平均值接近，每組6只裸鼠。瘤塊接種后第12天和第19天尾靜脈注射給藥。LDM劑量為0.05mg/kg，；融合蛋白Ec-LDP-Hr劑量為lmg/kg，強(qiáng)化融合蛋白3個(gè)劑量組，分別為0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，均為尾靜脈注射給藥。實(shí)驗(yàn)期間每3天測(cè)量一次腫瘤直徑和體重，根據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積(a:腫瘤長(zhǎng)徑，b:腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖11)，計(jì)算抑瘤率，觀察體重變化(表2)。實(shí)驗(yàn)第30天處死動(dòng)物，分離腫瘤并稱重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對(duì)人卵巢癌移植瘤有顯著療效，其中強(qiáng)化融合蛋白0.5mg/kg、0.4mg/kg和0.3mg/kg劑量組第30天的抑瘤率分別為80.3%、70.3%、65.8%,0.5mg/kg和0.4mg/kg劑量組明顯優(yōu)于LDM治療組(抑瘤率為65%)。表2.強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對(duì)人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所〈120〉一種雙特異性寡肽-力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE<160>2〈210〉丄<211〉612<212〉腿〈213>人工序列<220><221〉sig—peptide〈222〉(1)…(72)<223〉〈400〉1tgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcg60atggccatggcgaactgtgtggtgggctatattggcgaacgctgtcagtatcgcgatctg120aaatggtgggaactgcgcggtggaggtggttcaggtggaggcggttcagcgcccgccttcISOtccgtcagtcccgcctcgggtctgagtgacggacagagcgtgtcggtgtcggtcagcggt240gccgccgccgCt3C3tCgCCcagtgcgctccggtcggtggccaggacgcg300tgcaacccggcgaccgcgacgtccttraccacggacgcgtccggagcggcgtcgttcagc360ttcgtcgtgcgcaagtcgtacacgggctcc3CgCCCg33ggcacgccggtcggcagcgtc420gactgcgccacggccgcctgteacctcggcgccggcaactccgggctcgaCCtCggCC2lC480gtggctctgaccttcggcggtggaggcggttcaggtggaggc幽tcacatgatgtgggc540tattgtaccgatcgcagctgtgcgaaatggccggaatggc'tg能Cgtgctcgagcaccac600C3CCaCC3CC3C612<210>2<211>182<212>PRT〈213〉人工序列17<220>《223〉<400>2MetAlaAsnCysValValGlyTyrlieGlyGluArgCysGinTyr11015ArgGluLeuLysTrp20TrpGluLeuArgGly25GlyGlyGlySerGly30GlyGlyGlySerAla35ProAlaPheSerVal40SerProAlaSerGly45LeuSerAspGlyGin50SerValSerValSer55ValSerGlyAlaAla60AlaGlyGluThrTyr65TyrlieAlaGinCys70AlaProValGlyGly75GinAspAlaCysAsn80ProAlaThrAlaThr85SerPheThrThrAsp90AlaSerGlyAlaAla95SerPheSerPheVal100ValArgLysSerTyr105ThrGlySerThrPro110GluGlyThrProVal115GlySerValAspCys120AlaThrAlaAlaCys125AsnLeuGlyAlaGly130AsnSerGlyLeuAsp135LeuGlyHisValAla140LeuThrPheGlyGly145GlyGlyGlySerGly150GlyGlyGlySerHis155AspValGlyTyrCys160ThrAspArgSerCys165AlasTrpProGlu170TrpLeuGlyValLeu175GluHisHisHisHis180HisHis18218權(quán)利要求1.一種雙特異性寡肽-力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，其特征是所說(shuō)融合蛋白由靶向EGFR的寡肽、力達(dá)霉素輔基蛋白、靶向HER2的寡肽以及力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)四部分組成，其分子量為19.3kD，基因全長(zhǎng)612bp，編碼204個(gè)氨基酸。2.權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，其特征是靶向EGFR的寡肽Ec基因?yàn)?6bp，編碼EGFC環(huán)的22個(gè)氨基酸殘基；力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因330bp，編碼110個(gè)氨基酸；靶向HER2的寡肽Hr基因長(zhǎng)60bp，編碼抗HER2抗體C6.5重鏈CDR3區(qū)的20個(gè)氨基酸。3.制備權(quán)利要求1所述強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的方法，其特征是所說(shuō)方法包括以下歩驟(1)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-五c-丄"/5-/^的構(gòu)建；(2)融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌(菌種保藏號(hào)CGMCCNo.2846)中的誘導(dǎo)表達(dá)；(3)融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化；(4)融合蛋白Ec-LDP-Hr的生物學(xué)活性測(cè)定；(5)強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備。4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是運(yùn)用基因工程技術(shù)，分別克隆得到五c-丄D尸基因片段和丄AP-份基因片段，并在丄"戶基因的N水端引入pelB信號(hào)肽序列；將丄D尸基因與基因進(jìn)行重疊拼接PCR，得到￡0丄1)尸-/^基因，將此基因片段插入到pET30a表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體pET-￡c-i"尸-7/r。5.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是將表達(dá)載體pET-Ec-丄Z)/3-//r轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL21加"tm(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到融合蛋白Ec-LDP-Hr。6.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是釆用親和層析方法，從大腸桿菌周質(zhì)腔中純化融合蛋白Ec-LDP-Hr。7.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是采用ELISA法、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，分析融合蛋白Ec-LDP-Hr對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。8.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是將融合蛋白Ec-LDP-Hr與力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)AE在體外進(jìn)行分子組裝，得到強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE。9.權(quán)利要求1所述強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE在制備抗腫瘤導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種雙特異性寡肽-力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，該融合蛋白由靶向表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2的兩個(gè)寡肽、力達(dá)霉素輔基蛋白以及力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)四部分組成，研究證明，其在體外能與表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤療效顯著，顯示了靶向藥物的小型化與高效化的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61P35/00GK101497666SQ200910000090公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年1月7日優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日發(fā)明者悅商,甄永蘇,郭曉芳,金蓮舫申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所