專利名稱：作為β淀粉樣肽產(chǎn)生的抑制劑的新型α-(N-磺酰氨基)乙酰胺化合物的制作方法
作為β淀粉樣肽產(chǎn)生的抑制劑的新型α-(N-磺酰氨基)
乙酰胺化合物相關(guān)申請(qǐng)的參考本申請(qǐng)要求保護(hù)2007年10月31日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/984，118的權(quán)益。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有藥物和生物影響特性的(2R)-2_[[(4-氯苯基)磺酰基] [[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺、其藥物組合 物、其工藝和使用方法。所述新型化合物具有獨(dú)特的A β肽生產(chǎn)抑制作用，因此可用于預(yù)防 Αβ肽和/或淀粉樣蛋白沉積物在腦中的累積，并可用于治療或延遲阿爾茨海默病(AD)、唐 氏綜合癥、輕度認(rèn)知障礙和其它與β-淀粉樣肽相關(guān)的病癥的發(fā)生。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退化性疾病，其以記憶喪失開始，發(fā)展至包 括嚴(yán)重認(rèn)知障礙、行為改變和運(yùn)動(dòng)機(jī)能降低(Grundman，Μ.等人，Arch Neurol. (2004)61 59-66 ；Walsh, D. Μ.等人，Neuron (2004) 44 181-193)。阿爾茨海默病是最常見的癡呆形式， 并成為繼心血管病和癌癥之后的第三大死因。AD耗費(fèi)巨大，給患者本人和家庭帶來巨大損 失，使患者喪失勞動(dòng)力并需要他人護(hù)理。目前還沒有能有效預(yù)防AD或逆轉(zhuǎn)臨床癥狀和基礎(chǔ) 性病理生理學(xué)的治療。對(duì)癡呆患者的明確AD診斷需要尸檢時(shí)對(duì)神經(jīng)炎斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的數(shù)量和 位置進(jìn) 組織病理學(xué)i平價(jià)(Consensus recommendationsfor the postmortem diagnosis of Alzheimer's disease (對(duì)阿爾茨海默病的死后診斷的一致推薦)。Neurobiol Aging(1997) 18 :D1_2)。在患有21三體癥(唐氏綜合癥)的患者中觀察到相似的改變。斑塊 主要由β-淀粉樣(Α β)肽組成，所述β-淀粉樣(Αβ)肽由β-位點(diǎn)APP-切割酶(BACE) (以產(chǎn)生N-末端)和Y-分泌酶(以產(chǎn)生C-末端)分步蛋白水解淀粉樣前體蛋白(APP) 形成(Selkoe, D. J.，Physiol Rev. (2001)81 =741-766) 0 Y -分泌酶是一種跨膜蛋白復(fù)合 物，其包含Nicastrin、Aph-l、PEN-2以及衰老蛋白-I(PS-I)或衰老蛋白-2 (PS-2)中的一 種(Wolfe,M. S.等人，Science (2004) 305 :1119-1123)。PS-1 和 PS-2 被認(rèn)為包含 Y _ 分泌 酶的催化位點(diǎn)。Aβ 40是合成的最豐富的Aβ形式(80-90% )，而Αβ 42與AD發(fā)病機(jī)理最緊密關(guān) 聯(lián)。具體地說，導(dǎo)致罕見的AD家族形式的APP、PS-1和PS-2基因突變暗示A β 42聚集體為 主要的毒性物質(zhì)(Delkoe，D. J.，Physiol Rev.，(2001)81 =741-766) 目前，有證據(jù)顯示，寡 聚型、原纖維型和胞內(nèi)Αβ 42在疾病過程中起顯著作用(Cleary，J.P.等人，NatNeurosci. (2005) 8 79-84)。針對(duì)形成A β 42的酶(如γ -分泌酶)的抑制劑，代表了治療AD的潛在 疾病調(diào)修治療劑。除APP之外，Y-分泌酶還切割多種I型跨膜蛋白(Pollack，S. J.等人，Curr Opin Investig Drugs (2005) 6 :35_47)。盡管大部分這些切割事件的生理意義是未知的，但遺傳 證據(jù)表明，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Notch的Y-分泌酶切割(Artavanis-Tsakonas，S.等人，Science (1999) 284 (5415) 770-6 ；Kadesch, T. ；Exp Cell Res. (2000)260(1) :1_8)。在以 Y-分泌酶抑制劑給藥的嚙齒動(dòng)物中，已鑒別出胃腸(GI)道、胸腺和脾臟中的藥物相關(guān)毒 性(Dearfoss，G. H. Jordan等人，J BiolChem. (2003)278 46107-46116 ；Wong, G. Τ.等人，J Biol Chem. (2004)279 12876-12882 ；Milano, J.等人，Toxicol Sci. (2004)82:341-358)。 這些毒性可能與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制相關(guān)聯(lián)(Jensen, J.等人，Nat Genet. (2000)24 36-44)。機(jī)理性毒性的鑒定提出了是否可以用Y-分泌酶抑制劑實(shí)現(xiàn)可接受的治療指數(shù) 的問題。在Notch加工、藥代動(dòng)力學(xué)、藥物處置和/或組織特異性藥效學(xué)當(dāng)中選擇性抑制 Aβ形成可能影響治療范圍(therapeutic margin)。證據(jù)表明，通過抑制γ-分泌酶降低腦Αβ水平可以防止AD的發(fā)生和發(fā) 展(Selkoe, D. Physiol. Rev. (2001)81 741-766 ；Wolfe, Μ.，J. Med. Chem. (2001)44 2039-2060)。有新的證據(jù)表明Αβ在其它疾病中也起作用，所述疾病包括輕度認(rèn)知障礙 (MCI)、唐氏綜合癥、淀粉樣腦血管病(CAA)、Lewy小體癡呆(DLB)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥 (ALS-D)、包涵體肌炎(IBM)和年齡相關(guān)性黃斑退化。有利的是，抑制Y-分泌酶并減少A β 產(chǎn)生的化合物可用于治療這些或其它Aβ依賴性疾病。Αβ的過量生產(chǎn)和/或減慢清除引起CAA(Thai，D.等人，J. Neuropath. Exp. Neuro. (2002)61 :282-293)。在這些患者中，血管淀粉體沉積引起血管壁退化和可能與10-15%的 老年患者出血性中風(fēng)有關(guān)的動(dòng)脈瘤。與AD—樣，編碼A β的基因突變導(dǎo)致早期發(fā)病形式的 CAA，稱為帶有Dutch型淀粉樣變性的腦出血，表達(dá)該突變蛋白的小鼠發(fā)展出類似于患者的 CAA。特異性靶向Y-分泌酶的化合物可以降低或預(yù)防CAA。DLB表現(xiàn)為視幻覺、錯(cuò)覺和帕金森病。令人感興趣的是，引起A β沉積的家族AD突 變也可以引起Lewy 小體和DLB癥狀(Yokota，0.等人，Acta Neuropathol (Berl) (2002) 104 637-648)。此外，散發(fā)性DLB患者具有與AD類似的A β沉積物(Deramecourt, V.等人，J NeuropatholExp Neurol (2006)65 :278_288)?；谠摂?shù)據(jù)，Αβ 可能驅(qū)動(dòng) DLB 中的 Lewy 小 體病理學(xué)，因此Υ -分泌酶抑制劑可能減輕或預(yù)防DLB。約25 %的ALS患者具有顯著的癡呆或失語癥(Hamilton，R. L.等人，Acta Neuropathol (Berl) (2004) 107 :515_522)。這些患者大部分(約 60% )稱為 ALS-D,包含 主要由TDP-43蛋白組成的遍在蛋白陽性包涵體(Neumann, Μ.等人，Science (2006) 314 130-133)。約30 %的ALS-D患者具有淀粉體斑，它們與引起他們癡呆的A β —致 (Hamilton, R. L.等人，Acta Neuropathol (Berl) (2004) 107:515-522)。這些患者應(yīng)當(dāng)用淀 粉體成像劑鑒別，并有可能用Y “分泌酶抑制劑治療。IBM是一種罕見的年齡相關(guān)性骨骼肌變性疾病。A β沉積物在IBM肌肉中的出現(xiàn) 以及通過將APP過表達(dá)引導(dǎo)至轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉再現(xiàn)該疾病的幾方面，都表明Αβ在IBM 中的作用(綜述于Murphy，Μ. P.等人，Neurology (2006) 66 :S65_68)。特異性靶向γ-分 泌酶的化合物可以減輕或預(yù)防IBM。在年齡相關(guān)性黃斑變性中，Αβ被鑒定為玻璃疣的幾種組分之一，玻璃疣是視 網(wǎng)膜色素上皮(RPE)之下的胞外沉積物(Anderson，D. H.等人，Exp Eye Res (2004) 78 243-256)。近來的研究已表明了小鼠中Αβ和黃斑變性之間的潛在關(guān)聯(lián)(Yoshida，Τ.等 人，J Clin Invest (2005) 115 =2793-2800) 已在AD患者中發(fā)現(xiàn)了 Αβ沉積和核上性內(nèi)障(supranuclearcataracts)的增力口(Goldstein，L. E.等人，Lancet (2003) 361 1258-1265)。 特異性靶向Y“分泌酶的化合物可以減輕或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性?；贜otch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤生成中的作用，抑制Y-分泌酶的化合物也可以用作 治療癌癥的治療劑(Shih, I. -M.等人，Cancer Research (2007) 67 1879-1882)。Smith等人在2000年8月31日公布的國(guó)際申請(qǐng)W000/50391中公開了一系列磺酰 胺化合物，這些磺酰胺化合物可用于調(diào)節(jié)淀粉體β蛋白的產(chǎn)生，其作為治療多種疾病的手 段，尤其是阿爾茨海默病和其它與淀粉體沉積相關(guān)的疾病。于1999年12月14日公布的日本專利號(hào)11343279公開了一系列磺酰胺衍生物， 其為可用于治療自身免疫病的TNF-α抑制劑。Parker等人在于2003年7月3日公布的國(guó)際申請(qǐng)W003/053912中公開了一系列 為淀粉體抑制劑的α-(Ν_磺酰氨基)乙酰胺衍生物，其可用于治療阿爾茨海默病和與 β-淀粉樣肽相關(guān)的其它病癥。本發(fā)明新型化合物不屬于Parker等人在W003/053912中公開或描述的化學(xué)式定 義。令人驚奇的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺具有獨(dú)特的特性，使其可用于治療阿爾 茨海默病和其它與淀粉樣肽相關(guān)的病癥。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有下式I的(2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2_氟_4_ (1，2，4_噁 二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺、其藥物制劑及其在罹患或易患阿爾 茨海默病(AD)或其它與淀粉樣肽相關(guān)的疾病的患者中抑制A β產(chǎn)生的用途。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的 (2幻-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5， 5，5-三氟戊酰胺和藥學(xué)上可接受的佐劑、載體或稀釋劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療、緩解或延遲與淀粉樣肽相關(guān)的 病癥(尤其是阿爾茨海默病、淀粉樣腦血管病、輕度認(rèn)知障礙和唐氏綜合癥)發(fā)生的方法， 其包括與常規(guī)佐劑、載體或稀釋劑一起給予治療有效量的(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺或其溶劑化物 或水合物。另一方面，本發(fā)明提供一種制備(2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2_氟_4_ (1，2， 4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的方法，其包括在堿(優(yōu)選無機(jī) 堿，如碳酸銫)存在下使(R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺與在惰性有機(jī)溶劑中的3-(4-(溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4-噁二唑反應(yīng)的步驟。再一方面，本發(fā)明提供制備(2R) -2- [ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2_氟_4_ (1，2，4_噁 二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5_三氟戊酰胺的方法，其包括以下步驟(a)使(R) -2- (4_氯_N_ (4_氰基_2_氟芐基)苯基磺酰氨基)_5，5，5_三氟戊酰 胺與羥胺反應(yīng)，和(b)在酸性催化劑存在下，用在惰性有機(jī)溶劑中的原甲酸三乙酯處理所獲的 (R)-2-(4-氯-N-(2-氟-4-(N'-羥基甲脒基(carbamimidoyl))芐基)苯基磺酰氨基)_5， 5,5-三氟戊酰胺。由于本發(fā)明的化合物具有不對(duì)稱的碳原子，所以本發(fā)明包括外消旋物以及式I化 合物的各個(gè)對(duì)映異構(gòu)體形式，還包括如本文所述的手性和外消旋中間體。使用單個(gè)標(biāo)記如 (R)或(S)指包括主要的一種立體異構(gòu)體。可以按照已知方法，例如分級(jí)結(jié)晶、吸附層析或 其它合適的分離方法，將異構(gòu)體的混合物分離為單個(gè)異構(gòu)體?？梢栽谝牒线m的鹽形成基 團(tuán)之后，例如通過形成非對(duì)映異構(gòu)體鹽與光學(xué)活性的成鹽劑的混合物，將所述混合物分離 為非對(duì)映體鹽，并將分離的鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x化合物，以通常的方式將所獲外消旋物分離為相 反的物質(zhì)。對(duì)映異構(gòu)體形式還可以通過手性高壓液相層析柱通過分級(jí)來分離。在本發(fā)明的方法中，術(shù)語“治療有效量”是指方法中的每一活性組分足以顯示出有 意義的患者利益的總量，所述利益即與淀粉樣肽相關(guān)的病癥的康復(fù)。當(dāng)應(yīng)用于單獨(dú)給 予的單一活性成分時(shí)，該術(shù)語是指該單獨(dú)的成分。當(dāng)應(yīng)用于組合時(shí)，該術(shù)語是指產(chǎn)生療效的 活性成分的組合量，無論是組合給藥、連續(xù)給藥還是同時(shí)給藥。本文和權(quán)利要求書使用的術(shù) 語“治療、處理、療法”是指預(yù)防、延遲、抑制或改善與淀粉樣肽相關(guān)的疾病。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，式I的化合物可以與其它藥物組合使用，所述其 它藥物用于治療/預(yù)防/抑制或改善式I的化合物對(duì)其有效的疾病或病癥。這樣的其它藥 物可以通過某一途徑并以常用于該途徑的量與本發(fā)明的化合物同時(shí)或序貫給予。當(dāng)式I的 化合物與一種或多種其它藥物同時(shí)使用時(shí)，優(yōu)選含有這些藥物外加式I化合物的藥物組合 物。因此，除式I化合物以外，本發(fā)明的藥物組合物還包括那些含有一種或多種其它活性成 分的藥物組合物。可以單獨(dú)地或在同一藥物組合物中與(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺組合給予以 治療阿爾茨海默病的其它活性成分的實(shí)例，包括但不限于為膽堿酯酶抑制劑的藥物類型， 例如多奈哌齊(Aricept )、利斯的明(Exelon )、加蘭他敏(Reminy 1 ,現(xiàn)在為Razadyne )；為NMDA拮抗劑如美金胺(Namenda )和PDE4抑制劑如西洛司特(Ariflo )的其它藥物； NSAID類，例如R-氟比洛芬(Flurizan );降低膽固醇的他汀類藥物，例如普伐他汀、辛伐他 汀和阿托伐他??；抗淀粉體和抗-Aβ免疫治療；抑制Αβ聚集的化合物，例如鯊肌醇和氯 碘羥喹；抑制或修改Aβ生產(chǎn)或加工的其它化合物，例如γ-分泌酶抑制劑、β-分泌酶抑 制劑、Y-分泌酶調(diào)節(jié)劑、Aβ調(diào)節(jié)劑和GSK-3抑制劑；調(diào)節(jié)Aβ周轉(zhuǎn)的化合物，例如PAI-I 抑制劑；調(diào)節(jié)tau磷酸化的化合物，例如GSK-3和CDK-5抑制劑；PPAR γ激動(dòng)劑，例如羅格 列酮；調(diào)節(jié)tau或磷-tau周轉(zhuǎn)或者寡聚化的化合物，例如HSP90抑制劑、HDAC抑制劑和 抗-tau免疫療法；和穩(wěn)定或結(jié)合微管的化合物，例如紫杉烷衍生物和埃坡霉素衍生物；和 調(diào)節(jié)線粒體功能的化合物，例如Dimebon。
在癌癥治療中，本發(fā)明的化合物可以與已知的抗癌劑或治療一起使用。這樣的藥 物和治療包括細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、類視黃醇 受體調(diào)節(jié)劑、異戊二烯基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、血管生成抑制劑、干擾細(xì)胞周期關(guān)卡的藥物 和放療。另外，本發(fā)明的化合物可用于治療免疫病癥如狼瘡。以上的治療劑在與本發(fā)明的化合物組合使用時(shí)，在適用的情況下或者由本領(lǐng)域一 般技術(shù)人員確定時(shí)，例如可以以醫(yī)師臨床指引(Physician' s Desk Reference) (PDR)中指 示的量使用。然而，要理解的是，實(shí)際給予的化合物的量將由醫(yī)師根據(jù)相關(guān)的情況確定，包括要 治療的病癥、選擇給予的化合物、選定的給予途徑、個(gè)體患者的年齡、體重、反應(yīng)以及患者癥 狀的嚴(yán)重性。通用反應(yīng)流程本發(fā)明的化合物可以有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多不同方法制備。式I 的化合物可通過以下反應(yīng)流程1-5中描述的方法制備。所述程序的合理變化，以及本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)顯而易見的合成方法，屬于本發(fā)明的范圍。反應(yīng)流程1 在反應(yīng)流程1中所示的一種制備方法中，以基本上對(duì)映異構(gòu)體純形式使用的式II 的起始(α-氨基)乙酰胺可以通過眾所周知的文獻(xiàn)程序制備，例如使用在反應(yīng)流程3中描 述的不對(duì)稱Strecker合成法，將三氟丁醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭絀I的(α-氨基)乙酰胺，或者由(R) _5， 5，5-三氟正纈氨酸制備(參見I.0jima，J. Org. Chem. (1989)54 =4511-4522)；以及使用 反應(yīng)流程4中所述的方法，然后使用制備酰胺的通用程序R. C. Larock "Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, New York，1989，972—976 Μ。
ζ II 的(α 基)乙酰胺用適宜的堿處理，并用在適宜的非質(zhì)子溶劑如CH2Cl2中的對(duì)氯磺酰氯于約室溫 磺?；?，以獲得式III的磺酰氨基)乙酰胺。適宜的堿包括三乙胺、二異丙胺、吡啶等。在堿存在下，通過使式III的(α _磺酰氨基)乙酰胺與在適宜的非質(zhì)子化溶劑中 的式IV的噁二唑氟芐基烷基化劑在加熱或沒有加熱的情況下反應(yīng)，進(jìn)行式III的化合物向 式I的磺酰胺的轉(zhuǎn)變。式IV的氟芐基噁二唑可易于通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備，其中X 為離去基團(tuán)，和通過反應(yīng)流程6中所述的方法制備。用于該烷基化的適宜的堿包括無機(jī)堿， 例如碳酸鉀和碳酸銫。優(yōu)選的溶劑包括DMF和乙腈。反應(yīng)的溫度范圍通常為20°C-100°C。反應(yīng)流程2 在反應(yīng)流程2中所示的另一種制備方法中，在堿存在下在適宜的溶劑中通過用式 VI的2-氰基-4-氟芐基衍生物烷基化式III的化合物，制備式I的1，2，4-噁二唑化合物， 其中X為離去基團(tuán)，以產(chǎn)生式VII的腈。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法由式VII 的腈化合物制備式I的目標(biāo)化合物(參考Joule，J.A，等人，Heterocyclic Chemistry，第 3版，Chapman&Hall, London(1995)452-456和其中提及的參考文獻(xiàn))。例如，式VII的腈 與在醇溶劑如甲醇或乙醇中的羥胺于至回流的溫度反應(yīng)產(chǎn)生中間體酰胺肟，其隨后在酸源 (如三氟乙酸或三氟硼醚合物)存在下用在惰性有機(jī)溶劑如CH2Cl2、乙腈、四氫呋喃等中的 原甲酸酯(例如原甲酸三乙酯或原甲酸三甲酯)處理，以提供式I的1，2，4_噁二唑。反應(yīng)流程3 反應(yīng)流程3描述了式II的(α _氨基)乙酰胺的制備，以市售可得的三氟丁醛和 (R)-α -甲基芐胺開始，在Strecker條件下與在適宜的溶劑如甲醇中的乙酸和氰化物源 (例如氰化鈉、氰化鉀或三甲基氰硅烷)反應(yīng)，得到為非對(duì)映體混合物的式VIII的氨基腈。 起始的三氟丁醛還可以通過氧化三氟丁醇制備。用硫酸將式VIII的腈水解為相應(yīng)的式IX 的酰胺，并中和反應(yīng)物，之后酸化，并由適宜的溶劑如甲醇、異丙醇、乙酸乙酯、叔丁基甲酯 或其混合物重結(jié)晶，以得到> 99%非對(duì)映體過量的式X的酰胺。然后可以通過在適宜的催 化劑如氫氧化鈀或披鈀碳存在下氫化，除去芐基，以得到式II的氨基酰胺，其可以用對(duì)氯 磺酰氯磺酰化，以得到式III的磺酰胺。
反應(yīng)流程4 在另一種制備方法中，如反應(yīng)流程4所示，可以5，5，5-三氟-2-氧代戊酸開始，使 用酶促方法立體選擇性產(chǎn)生式II的(α-氨基)乙酰胺?？梢允褂檬惺劭傻玫?R)-氨基轉(zhuǎn) 移酶，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，由式XIII的化合物制備基本對(duì)映異構(gòu)體純形 式的式XIV的(R)_5，5，5-三氟正纈氨酸。在替代方法中，可以使用市售可得的(R)-氨基 酸脫氫酶實(shí)施酶促方法。使用下述方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法實(shí)施酶促方法。 可以使用本領(lǐng)域眾所周知的用于酰胺制備的通用程序?qū)嵤┦絏IV的(R)-5，5，5-三氟正纈 氨酸向式II化合物的轉(zhuǎn)變。反應(yīng)流程5 可如反應(yīng)流程5所示使用引發(fā)劑如AIBN，在適宜的溶劑如二氯甲烷、二氯乙烷或 四氯化碳中通過用N-溴琥珀酰亞胺溴化市售可得的2-氟-4-氰基甲苯，制備式VIa的芐 基溴。溴化以高收率進(jìn)行，如果需要，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，容易地將式 VIa的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槭絍I的化合物，其中X為離去基團(tuán)。反應(yīng)流程6 作為對(duì)以上反應(yīng)流程2所述式I的磺酰氨基噁
唑的線性順序中使用的式VI化 合物的替代，用于反應(yīng)流程1所示的匯集途徑的式IV化合物的制備示于反應(yīng)流程6。在醇 類溶劑中于室溫用羥胺處理市售可得的2-氟-4-氰基甲苯，得到式XI的粗酰胺肟，其可以 直接用于隨后的反應(yīng)。通過用醚合三氟化硼和原甲酸三乙酯處理環(huán)化式XI的酰胺肟，以兩步超過90%的收率得到式XII的噁二唑。作為使用三氟化硼的替代，還可以通過使用三氟 乙酸作為酸源徹底完成環(huán)化。在適宜的溶劑如二氯甲烷、二氯乙烷或四氯化碳中使用引發(fā) 劑如AIBN用N-溴代琥珀酰亞胺溴化，得到式IVa的一溴噁二唑化合物。如果需要避免可能 的一溴化物和二溴化物的混合物，則可以用N-溴代琥珀酰亞胺和AIBN有意地過度溴化式 XI化合物的甲苯甲?；倌軋F(tuán)，以得到相應(yīng)的二溴化物，然后其可以用亞磷酸二乙酯還原， 以超過90%的收率得到式VIa的一溴化物。二溴化和還原可以以超過90%的總收率一鍋 完成，不用分離二溴化物?；蛘撸€可以在適宜的兩相溶劑體系如乙酸乙酯/水、二氯甲烷 /水、乙酸丁酯/水、三氟甲苯/水等中用過量的溴酸鈉和亞硫酸氫鈉由式XII的化合物制 備式IVa的化合物，以提供一溴化物和二溴化物中間體的混合物，該混合物用磷酸二乙酯/ 二異丙胺原位還原，得到式IVa的一溴化物。如果需要，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的方法，容易地將式IVa的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槭絀V的化合物，其中X為離去基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括藥物組合物，其含有式I的化合物和藥物佐劑、 載體或稀釋劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及需要治療的哺乳動(dòng)物響應(yīng)于β-淀粉樣肽抑制 的疾病的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的式I化合物或其溶劑化物或水合 物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其需要的患者中治療、緩解或延遲阿爾茨海 默病、淀粉樣腦血管病、系統(tǒng)性淀粉樣變病、帶有Dutch型淀粉樣變性的遺傳性腦出血、多 發(fā)腦梗死性癡呆、輕度認(rèn)知障礙和唐氏綜合癥的發(fā)生的方法，其包括給予所述患者治療有 效量的式I化合物或其溶劑化物或水合物。對(duì)于治療用途，式I的藥物活性化合物通常作為藥物組合物使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和常規(guī) 技術(shù)給予，所述藥物組合物包含作為必需活性成分的至少一種這樣的化合物連同藥學(xué)上可 接受的固體或液體載體，以及任選的藥學(xué)上可接受的佐劑和賦形劑。所述藥物組合物包括適于口服、胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)和靜脈內(nèi))、透 皮、舌下、支氣管或鼻內(nèi)給藥的劑型。因此，如果使用固體載體，則制劑可制片，以粉末或丸 劑形式置于硬膠囊中，或者是錠劑或糖錠(troche or lozenge)形式。固體載體可以含有 常規(guī)的賦形劑，如粘合劑、填充劑、成片潤(rùn)滑劑、崩解劑、潤(rùn)濕劑等。如有需要，片劑可以通 過常規(guī)技術(shù)包衣?？诜苿┌ㄓ擅髂z制備的壓入配合(push-fit)膠囊，以及由明膠和包 衣如甘油或山梨糖醇制備的軟密封膠囊。壓入配合膠囊可包含與下列各項(xiàng)混合的活性成 分填充劑或粘合劑如乳糖或淀粉，潤(rùn)滑劑如滑石或硬脂酸鎂，和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊 中，所述活性化合物可被溶解或懸浮在合適的液體如脂肪油、液體或液體聚乙二醇中，有或 沒有穩(wěn)定劑。如果使用液體載體，則制劑可以為糖漿、乳液、軟明膠膠囊、無菌注射溶媒、水 性或非水性液體懸浮液形式，或者可以是干燥制品，使用前用水或其它合適的溶媒重構(gòu)。液 體制劑可以含有常規(guī)的添加劑，如懸浮劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、非水性溶媒(包括食用油)、防 腐劑以及調(diào)味劑和/或著色劑。對(duì)于胃腸外給藥，溶媒通常(至少大部分)包括無菌水，不 過可以使用鹽水溶液、葡萄糖溶液等。也可以使用注射懸浮液，在此情況下可以使用常規(guī)懸 浮劑。常規(guī)的防腐劑、緩沖劑等也可以加入到胃腸外劑型中。對(duì)于局部或鼻內(nèi)給藥，可在制 劑中使用適于穿透特定屏障的滲透劑或透過劑。這樣的滲透劑一般是本領(lǐng)域已知的。所述 藥物組合物通過對(duì)含有適量活性成分(即本發(fā)明的式I化合物)的所需制劑適合的常規(guī)技術(shù)制備。參見例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Pub 1 ishingCompany, Easton, PA，第 17 版，1985。達(dá)到療效的式I化合物的劑量不僅取決于諸如患者的年齡、體重和性別以及給藥 方式等因素，還取決于所需的Aβ抑制的程度和式I化合物對(duì)所涉及的具體病癥或疾病的 效力。還設(shè)想式I化合物的治療和劑量可以以單位劑量形式給藥，因此單位劑量形式應(yīng)由 本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)整，以反映相對(duì)活性水平。決定所用的具體劑量(和每天的給藥次數(shù)) 屬于醫(yī)師決定的范圍，并且可以根據(jù)本發(fā)明的具體情況通過劑量滴定改變，以產(chǎn)生所需的 療效。對(duì)于罹患或可能罹患如本文所述的與A β肽產(chǎn)生有關(guān)的任何疾病的哺乳動(dòng)物(包 括人)，式I化合物或其藥物組合物的適宜劑量，在胃腸外給藥時(shí)，日劑量一般為約0. Olmg/ kg至約10mg/kg，優(yōu)選為約0. lmg/kg至2mg/kg。對(duì)于口服給藥，劑量范圍可為約0. Olmg/ kg至約20mg/kg，優(yōu)選0. l-10mg/kg體重?；钚猿煞謨?yōu)選以相同劑量給藥，每天1_4次。但 是通常以小劑量給藥，劑量逐漸增加，直到確定對(duì)所治療的宿主最佳的劑量。根據(jù)良好的臨 床實(shí)踐，優(yōu)選以產(chǎn)生有效抗淀粉體效果而不引起任何有害的或不希望的副反應(yīng)的濃度水平 給予本發(fā)明的化合物。但是，應(yīng)該理解，實(shí)際給予的化合物的量由醫(yī)師根據(jù)相關(guān)情況決定， 包括所治療的疾病、所給予的化合物的選擇、選定的給藥途徑、個(gè)體患者的年齡、體重和反 應(yīng)以及患者病癥的嚴(yán)重程度。生物學(xué)數(shù)據(jù)PXR轉(zhuǎn)移活化孕烷X受體(PXR)是主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450(CYP)3A4的核激素受體，其 在代謝許多臨床處方藥物方面起重要作用。眾所周知誘導(dǎo)CYP3A4可以通過增加共給予 的CYP3A4底物的代謝清除引起藥物-藥物相互作用(Bertilsson，G.等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA(1998) 95 12208-12213 ；Lehmann, J. Μ.等人，J. Clin. Invest. (1998) 102 1016-1023)，或者可以引起歸因于自誘導(dǎo)的藥物暴露損失。表征發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的藥物候選物 的誘導(dǎo)潛力已變成整個(gè)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要藥物篩選方法。PXR轉(zhuǎn)移活化測(cè)定用于評(píng)價(jià)CYP3A4 的誘導(dǎo)潛力，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定用于監(jiān)測(cè)歸因于細(xì)胞毒性的測(cè)定干擾。使用的細(xì)胞培養(yǎng)基是DMEM。脂轉(zhuǎn)染胺2000、PBS、胰蛋白酶-EDTA(0. 25 和 青霉素-鏈霉素購(gòu)自GIBCO/Invitrogen(Carlsbad，CA)。熱失活的胎牛血清(FBS)購(gòu) 自Sigma (St. Louis, MO)。活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。！fepG2 細(xì)胞得自 ATCC(Manassas, VA)。人 PXR-pcDNA3 和包含 CYP3A4 啟動(dòng)子的螢 光素酶報(bào)告體CYP3A-Luc在Bristol-Myers Squibb產(chǎn)生。黑色標(biāo)準(zhǔn)384孔板購(gòu)自BD Biosciences (Lexington, KY)。螢光素酶底物(Steady-Glo)購(gòu)自 Promega (Madison, WI)。 對(duì)照化合物利福平購(gòu)自Sigma (St. Louis, MO)。HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)在T175瓶中使用含10% FBS的DMEM進(jìn)行。轉(zhuǎn)染混合物包含 1 μ g/mL PXR-pcDNA3 質(zhì)粒 DNA、20 μ g/mLCyp3A_Luc 質(zhì)粒 DNA、90 μ L/mL 脂轉(zhuǎn)染胺 2000 和無 血清培養(yǎng)基。在于室溫溫育20分鐘后，將轉(zhuǎn)染混合物(lml/瓶)加至新鮮培養(yǎng)基中的細(xì)胞 (20ml/瓶)，將瓶于370C (5% CO2)過夜溫育。將每個(gè)瓶中的細(xì)胞用PBS洗滌，加入4mL胰蛋白酶-EDTA(0. 25% )，并于室溫溫育 1分鐘。然后吸出胰蛋白酶，將瓶于室溫再溫育5分鐘。然后劇烈敲擊瓶，以散開細(xì)胞聚集物。在加入含5%活性炭/葡聚糖處理的FBS的IOmL DMEM之后，將整個(gè)混合物轉(zhuǎn)移至圓 錐管。再通過ImL細(xì)管尖吸打解聚懸浮液中的細(xì)胞團(tuán)。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞，并以培養(yǎng)基稀釋至 3. OX IO5個(gè)細(xì)胞/mL。將50 μ L細(xì)胞混合物加至含有溶解在100% DMSO中的0. 25 μ L測(cè)試化 合物的黑色標(biāo)準(zhǔn)384孔板的每個(gè)孔。將所述板于37°C (5% CO2)過夜溫育，然后將25 μ L螢 光素酶底物(Steady-Glo，Promega)加至每個(gè)孔。在15分鐘后，以Viewlux (Perkin-Elmer) 讀板器讀取板。利福平(10 μ Μ)是一種眾所周知的PXR激動(dòng)劑，納入每塊板中作為內(nèi)標(biāo)和陽性對(duì) 照。然后將數(shù)據(jù)表示為活化百分率(％Act)，其中總信號(hào)為得自ΙΟμΜ利福平的信號(hào)，空白 信號(hào)為得自DMSO溶媒的信號(hào)。
0/Act=化合物信號(hào)-空白信號(hào)/總信號(hào)-空白信號(hào)*100%以10 個(gè)濃度(50 μ M-2. 5nM，1 3 連續(xù)稀釋)測(cè)試化合物，XL-Fit (IDBS, Inc.) 用于曲線擬合。報(bào)告發(fā)生20%和60%活化(分別為EC20A和EC60A)的化合物濃度。人孕烷-X受體主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)CYP3A4以及CYP2B6、CYP2C8/9、2期酶如UGT，以 及幾種轉(zhuǎn)運(yùn)體，例如P-gp、MRP2和0ATP2。以上的測(cè)試表明，在hPXR轉(zhuǎn)移活化測(cè)定中， (2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨 基]-5，5，5-三氟戊酰胺具有6. 9μ M的EC2qa (20%的10 μ M利福平反應(yīng))和大于16. 7 μ M 的EC6cia(60%的10 μ M利福平反應(yīng))。這些結(jié)果提示，(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基] [[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺可以通過活化 hPXR具有為人CYP3A4誘導(dǎo)物的潛力。Fa2N-4細(xì)胞中細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)在體外使用Fa2N_4細(xì)胞系評(píng)價(jià)(2R) _2_[ [ (4_氯苯基)磺?；鵠[[2_氟_4_(1， 2，4_噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺誘導(dǎo)CYP3A4mRNA的能力。 Fa2N-4細(xì)胞是永生化的人肝細(xì)胞系，其使用猿猴病毒40 (SV40) T抗原作為永生化基因產(chǎn) 生，同時(shí)保留幾種CYP同種型(包括CYP3A4)的基礎(chǔ)表達(dá)和誘導(dǎo)力。Fa2N-4細(xì)胞和MFE支 持培養(yǎng)基 F 由 XenoTech，LLC(Lenexa, Kansas)提供。Fa2N-4細(xì)胞以0. 67X IO6個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度在12孔膠原蛋白包被的板上提 供。在接入細(xì)胞時(shí)，更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞過夜保持在濕潤(rùn)的、供應(yīng)CO2的培養(yǎng)箱中。在該適應(yīng) 期之后，在光學(xué)顯微鏡下檢查細(xì)胞，并確定細(xì)胞是否形態(tài)正常和適于使用。在處理期當(dāng)中， 每天目測(cè)檢查細(xì)胞；根據(jù)需要以文件記錄由于測(cè)試物產(chǎn)生的細(xì)胞形態(tài)、匯合和毒性跡象。用 4種濃度(最終溫育時(shí)0. 5μΜ、2μΜ、8μΜ和20μΜ)的(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺和溶劑溶媒 對(duì)照(0. 1% DMS0)平行三份處理細(xì)胞培養(yǎng)物。利福平(ΙΟμΜ)是一種原型的CYP3A4誘導(dǎo) 物，用作陽性對(duì)照。Fa2N-4細(xì)胞接觸測(cè)試物總共3天。用含有測(cè)試物的新鮮培養(yǎng)基每日更 換培養(yǎng)基。在總共約72小時(shí)的接觸后，吸出培養(yǎng)基，用熱磷酸緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞1次， 之后加入細(xì)胞裂解緩沖液(Qiagen，Valencia, CA)。以Fa2N_4永生化人肝細(xì)胞檢驗(yàn)(2R) _2_[ [ (4_氯苯基)磺?；鵠[[2_氟_4_ (1，2， 4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺誘導(dǎo)CYP3A4 mRNA表達(dá)的能力。用利福平(10 μ M)處理Fa2N-4肝細(xì)胞3天引起細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)顯著(12倍)增加， 表明細(xì)胞正確地發(fā)揮機(jī)能。用(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺誘導(dǎo)肝細(xì)胞3天導(dǎo)致CYP3A4 mRNA表達(dá) 濃度依賴性增加，于最高測(cè)試濃度(20 μ M)達(dá)到溶媒對(duì)照的2. 6倍。該誘導(dǎo)程度等于由利 福平引起的誘導(dǎo)響應(yīng)的22%，提示(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁 二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺于高于20μΜ的濃度時(shí)可以中度誘 導(dǎo)CYP3A4。于較低的(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基) 苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺濃度(彡8.0μΜ)時(shí)，觀察到相對(duì)較小的CYP3A4 誘導(dǎo)(彡2. 0倍)。在肝臟微粒體中的代謝穩(wěn)定性小鼠、大鼠、狗、人和獼猴肝臟微粒體得自BD Gentest (Woburn，MA)。批次為1 3(小鼠)、8(大鼠)、8(狗)、19和26(人)以及3(獼猴)。在三組條件下研究了肝臟微粒 體中(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨 基]-5，5，5-三氟戊酰胺的氧化代謝作用。人和狗的溫育混合物(總體積3 mL，有機(jī)溶劑含 量0.3%)包含(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基] 甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺(1 μ Μ)、微粒體蛋白(lmg/mL) ,NADPH(ImM) ,Tris氯化物 緩沖液(100mM，pH7.4)和氯化鎂(3. 3mM)。反應(yīng)以平行三份進(jìn)行，通過加入NADPH開始，之 后于37°C溫育50分鐘。于0、5、10、20、30、40和50分鐘取等份的樣品(0. 25mL)，通過加入 3體積乙腈猝滅反應(yīng)。獼猴和大鼠的溫育混合物(總體積3mL，有機(jī)溶劑含量0. 3% )包含 (2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5， 5，5-三氟戊酰胺(1 μ Μ)、微粒體蛋白(0. lmg/mL) ,NADPH(ImM)、Tris氯化物緩沖液(lOOmM， pH7. 4)和氯化鎂(3. 3mM)。反應(yīng)以平行三份進(jìn)行，通過加入NADPH開始，之后于37°C溫育50 分鐘。于0、5、10、20、30、40和50分鐘取等份的樣品(0. 25mL)，通過加入3體積乙腈猝滅反 應(yīng)。小鼠和獼猴的溫育混合物(總體積3 mL，有機(jī)溶劑含量0.3%)包含(2R)-2-[[(4-氯 苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰 胺(1 μ Μ)、微粒體蛋白(0. lmg/mL)、NADPH(ImM)、Tris 氯化物緩沖液(lOOmM，pH7. 4)和氯 化鎂(3.3 mM)。反應(yīng)以平行兩份進(jìn)行，通過加入NADPH開始，之后于37°C溫育40分鐘。于 0、5、1 OU 5、20、30和40分鐘取等份的樣品(0. 25mL)，通過加入3體積乙腈猝滅反應(yīng)。對(duì) 于所有的研究，都立即通過LC/MS方法分析樣品。由每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(2幻-2-[[(4-氯苯基) 磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的峰 面積比率計(jì)算母體消失速率。使用 Houston JB.，Biochem Pharmacol 1994 ；47 1469-1479 ；Iwatsubo 等人， Pharmacol Ther(1997) 73 147-171 ；和 Obach 等人，JPharmacolExp Ther (1997)283 46-58描述的方法，由肝臟微粒體數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)多個(gè)物種中的(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基] [[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的肝清除率 (CLh, int，mL/min/kg)。在多個(gè)物種的NADPH加強(qiáng)的肝臟微粒體存在下，測(cè)定(2R) _2_[ [ (4_氯苯基)磺酰 基][[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的體外代謝 速率。本發(fā)明的化合物(2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺(ΙμΜ)分別以690、630、40、495和32pmol/min/ mg小鼠、大鼠、狗、獼猴和人微粒體中存在的蛋白的速率代謝。當(dāng)(2幻-2-[[(4-氯苯基) 磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺消耗 速率放大至體內(nèi)清除時(shí)，預(yù)測(cè)的(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺體內(nèi)(血清)清除值在小鼠、大鼠、狗、 獼猴和人中分別為87、52、14、39*8mL/min/kg。這些數(shù)據(jù)提示，(2R)-2-[ [ (4-氯苯基)磺 酰基][[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺預(yù)期在 人中為低清除化合物。體外藥理學(xué)衰老蛋白結(jié)合測(cè)定使用以前描述的用于[3H] (2R，3S) _2_異丁基-Ni-(⑶_2_氧代(3_苯 氧基芐基)氮雜罩-3-基)-3_丙基琥珀酰亞胺(RE987，化合物A[SeifTert D等人， Presenilin-I and-2 are molecular targets for y-secretaseinhibitors. J. Biol. Chem. (2000)275(44) =34086-34091])的方法，采用[3H] (R)-4-((N-(1-氨基-4-甲 基-1-氧代戊烷-2-基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺進(jìn)行 放射性配體置換測(cè)定。進(jìn)行幾個(gè)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)[3H] (R)-4-((N-(1-氨基-4-甲基-1-氧代戊 烷-2-基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺結(jié)合Y-分泌酶。 首先，[3H](R)-4-((N-(l-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4_氯苯基磺酰氨基)甲 基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺與野生型和PS-1/PS-2敲除成纖維細(xì)胞的膜的特異性結(jié) 合表明，[3H] (R)-4-((N-(1-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲 基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺特異性結(jié)合野生型成纖維細(xì)胞的膜，但不結(jié)合敲除成纖 維細(xì)胞的膜，且特異性信號(hào)被結(jié)構(gòu)上不同的Y-分泌酶抑制劑競(jìng)爭(zhēng)。其次，用幾種Y-分泌 酶抑制劑研究[3H] (R)-4-((N-(l-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)_4_氯苯基磺酰氨 基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺結(jié)合的藥理學(xué)。這些結(jié)果表明，置換結(jié)合THP-I 膜的[3H] (R)-4-((N-(1-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4_氯苯基磺酰氨基)甲 基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺與使用先前的放射性配體結(jié)合測(cè)定檢測(cè)的Y-分泌酶效 力和培養(yǎng)細(xì)胞中的Aβ形成抑制均良好關(guān)聯(lián)。在含有L-谷氨酰胺(Life Technologies Inc.)和10 μ Μβ -巰基乙醇的 RPMI1640中，以旋動(dòng)培養(yǎng)將THP-I細(xì)胞培養(yǎng)至5 X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞密度。通過離心收獲 細(xì)胞，將含有2X IO8個(gè)細(xì)胞的沉淀在干冰/乙醇中快速冷凍，并在使用前儲(chǔ)存于-70°C。 在測(cè)定當(dāng)天，以2X108個(gè)細(xì)胞/IOmL勻漿緩沖液于4°C融化細(xì)胞，所述勻漿緩沖液由 50mMHEPESpH7. 0組成，含有104 μ M4- (2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽、80ηΜ抑肽酶、 2μ M亮抑酶肽、4 μ M貝他定、1. 5μ M抑肽素A和1.4μΜΕ-64(0. 蛋白酶抑制劑混合物 Ρ8340, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的蛋白酶抑制劑混合物。使用 Polytron (Brinkman， ffestbury, NY)以 18，OOOrpm 勻化細(xì)胞 1 5 秒，然后用 Sorval RC5B 離心機(jī)以 18，OOOrpm 于4°C離心15分鐘。將獲得的沉淀重懸浮在4°C緩沖液中，以產(chǎn)生5mg/mL的總蛋白濃度。 為用于結(jié)合測(cè)定，以測(cè)定緩沖液將細(xì)胞勻漿稀釋至300μ g/mL的濃度，所述測(cè)定緩沖液由 50mM HEPESpH7. 0、0. 1 % CHAPSO組成。通過加入200 μ L細(xì)胞勻漿物至含有0. 75ηΜ放射 性配體([3H] (R) -4- ((N- (1-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)~4~氯苯基磺酰氨基)甲
14基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺，llOCi/mmol)和多種濃度的未標(biāo)記化合物的50 μ L測(cè) 定緩沖液在聚丙烯96孔板(Costar，Cambridge, ΜΑ)中開始測(cè)定，并于37°C溫育1小時(shí)。 最終的DMSO濃度為1%。使用Irmotech細(xì)胞收集器經(jīng)由GFF玻璃纖維濾器(Irmotech BiosystemsInternational，Lansing, MI)過濾分離結(jié)合的放射性配體與游離的放射性 配體。濾器用0.3ml/孔的磷酸緩沖鹽水pH 7. O于4°C洗滌3次，并使用Wallac 1450 Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(PerkinElmer，Boston，MA)檢測(cè)放射性活性。競(jìng)爭(zhēng)化合物的Ki 值通過 Cheng-Prussoff 校正使用 XLfit (IDBS, Guildford, UK)計(jì)算的 IC5tl 值導(dǎo)出。以上的放射性配體結(jié)合測(cè)定用于檢測(cè)化合物對(duì)Y-分泌酶復(fù)合物的衰老蛋白靶 向位點(diǎn)的親合力。(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基) 苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺對(duì)[3H] (R)-4-((N-(l-氨基-4-甲基-1-氧代戊 烷-2-基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺結(jié)合THP-I膜中的衰 老蛋白產(chǎn)生劑量依賴性抑制。多個(gè)實(shí)驗(yàn)的分析產(chǎn)生Ki = 0. 48 nM士0. 24nM(平均值士SD， η = 8)。培養(yǎng)細(xì)胞的A β形成抑制使用在Bristol-MyersSquibb 開發(fā)的H4 APP751 SWE 克隆8. 20 (穩(wěn)定表達(dá)APP751 的Swedish突變體的H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)測(cè)定化合物在細(xì)胞中的A β 40抑制或A β 42抑 制。通過每周兩次的傳代以1 20的稀釋度將細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期。對(duì)于IC5tl測(cè)定，將在含 有0. 0125% BSA (Sigma A8412)的DMEM培養(yǎng)基中的30 μ L細(xì)胞(1. 5 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔)直 接鋪板于含有0. 1 μ L連續(xù)稀釋的化合物的DMSO溶液的384孔化合物板(Costar 3709)上。 在5% CO2中于37°C溫育19小時(shí)后，短暫離心板(lOOOrpm，5分鐘)。將每孔的10 μ L等份 試樣轉(zhuǎn)移至第二塊測(cè)定板(Costar 3709)，用于A β 40檢測(cè)。通過稀釋至含0. 2% BSA的40 mMTriS-HCKpH 7.4)新鮮制備抗體混合物，并加至測(cè)定板。對(duì)于A β 42檢測(cè)，混合對(duì)A β 42 新表位(565，在Bristol-Myers Squibb 開發(fā)；綴合至 Wallac 試劑(Perkin Elmer))特異性 的抗體和Αβ 肽(26D6，在SIBIA/Bristol-Myers Squibb 開發(fā)；綴合至APC(Perkin Elmer)) 的N-末端序列，將20 μ L混合物加至溫育細(xì)胞板的每個(gè)孔，產(chǎn)生0. Sng/孔565和75ng/孔 26D6的終濃度。對(duì)于A β 40檢測(cè)，混合如上所述對(duì)A β 40新表位(TSD，在Bristol-Myers Squibb開發(fā)；綴合至Wallac試劑(PerkinElmer))和26D6特異性的抗體，將20 μ L混合物 加至預(yù)先已由細(xì)胞板取出的10 μ L等份試樣，產(chǎn)生1. 6ng/孔TSD和1 7. 5ng/孔26D6的終 濃度。用鋁箔密封含有抗體的測(cè)定板，并于4°C過夜溫育。使用Viewlux計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)測(cè)定信號(hào)，并使用以CurveMaster (基于Excel Fit)擬合的曲線測(cè)定IC5tl值。(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基] 氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺有效抑制H4-8Sw細(xì)胞中的A β 40和A β 42形成。多個(gè)實(shí)驗(yàn)的分 析產(chǎn)生的Αβ 40抑制的IC5tl = 0. 30士0. 15ηΜ(平均值士SD，n = 50)，產(chǎn)生的Aβ 42抑制的 IC50 = 0. 27士0. 12ηΜ(平均值 士SD，η = 45)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制通過跨膜受體的Notch家族進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Y-分泌酶活性。因?yàn)橐种芅otch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起不需要的機(jī)理性副作用，所以使用針對(duì)Notchl-ΔΕ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞測(cè)定反 篩選Y-分泌酶抑制劑。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通過PCR產(chǎn)生小鼠Notchl表達(dá)構(gòu)建體，并通過測(cè)序確認(rèn)。該構(gòu)建體在ρ⑶NA3. Ι+Hyg載體(Invitrogen)中產(chǎn)生，所述載體被修飾為包含N-末端 20個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和C-末端7Xmyc標(biāo)記。信號(hào)序列來源于小鼠Notchl ；7Xmyc-標(biāo)記 通過使用重疊引物產(chǎn)生，并亞克隆入P⑶NA3. Ι+Hyg載體的Hindlll/Xhol位點(diǎn)中。小鼠Notchl-Δ E構(gòu)建體包含小鼠Notchl信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域中的M1727V突 變，以抑制內(nèi)部翻譯起始。由氨基酸1704至2193的小鼠Notchl-ΔE編碼序列分離自小鼠 脾臟Quick Clone cDNA文庫(kù)(Clontech)，并以Xbal/Hindll片段亞克隆入含有7X myc-標(biāo) 記和信號(hào)序列的修飾載體中。Hela細(xì)胞保持在含有10% FBS (GibcoBRL)、青霉素/鏈霉素(GibcoBRL)和2 mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)的 DMEM(GibcoBRL)中。使用 TransIT-HelaMONSTER(Mirus)按照 生產(chǎn)商的指引瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前16小時(shí)將Hela細(xì)胞(ATCC)以4X IO6個(gè)細(xì)胞/T175 瓶的密度鋪板在Hela生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM(高葡萄糖，含HEPES)，含谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素 和10%胎牛血清)中。使用HelaMonster轉(zhuǎn)染試劑(Mirus)用以下各項(xiàng)轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)培養(yǎng)基中 的細(xì)胞:6μ g 小鼠 Notchl-Δ E 質(zhì)粒、15. 6 μ g 載體質(zhì)粒(pCDNA3. 1+hyg) ,14. 4 μ gCBFl 質(zhì)粒 (螢光素酶報(bào)告體)。CBFl-螢光素酶報(bào)告構(gòu)建體由SV40啟動(dòng)子(pGL3-啟動(dòng)子，Promega) 上游的4X拷貝的CBFl結(jié)合元件組成。使用重疊引物產(chǎn)生CBFl-螢光素酶報(bào)告體，以產(chǎn)生 4XCBF1結(jié)合區(qū)。將該片段亞克隆入pGL3-啟動(dòng)子構(gòu)建體的Nhel/Bglll位點(diǎn)。該構(gòu)建體的 完整性通過測(cè)序證實(shí)。以TE緩沖液(IOmM Tris,lmM EDTA，pH8. 0)稀釋DNA母液用于轉(zhuǎn) 染。在DNA加入后5-6小時(shí)，由含胰蛋白酶-EDTA的瓶中取出細(xì)胞，并以5X IO4個(gè)細(xì)胞/ mL的濃度重懸浮在限定培養(yǎng)基(DMEM(高葡萄糖，含HEPES)，含谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、 0.0125%牛血清白蛋白和非必需氨基酸)中。以200yL/孔(IXlO4個(gè)細(xì)胞)的體積將細(xì) 胞鋪板入96孔黑色Clearview板(Packard)中，并于37°C溫育1. 5小時(shí)，以允許細(xì)胞粘附至 所述板。初始以100% DMSO將測(cè)試化合物稀釋入96孔聚丙烯板中。然后通過轉(zhuǎn)移入含限 定培養(yǎng)基的板中將DMSO化合物母液稀釋47. 6倍，得到2. 1 % DMSO濃度。將稀釋的化合物 溶液(IOyL)加至細(xì)胞板，產(chǎn)生最終0. DMSO濃度。含有化合物的細(xì)胞板于37°C過夜溫 育。在此過夜溫育后，輕緩去除培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔加入25μ L磷酸緩沖鹽水(含鈣和鎂)。 以等比例混合Luc-Screen (Applied Biosystems)試劑A和B，并將50 μ L混合物加至每個(gè) 孔。將所述板于室溫溫育10分鐘，之后將黑色背襯貼附至板的底部，以TopCoimt (Packard) 讀取信號(hào)。然后使用非線性回歸擬合濃度響應(yīng)曲線，以確定IC5tl值。通過跨膜受體的Notch家族進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Y-分泌酶活性。因?yàn)镹otch信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制會(huì)引起不需要的機(jī)理性副作用，所以使用上述針對(duì)Notchl-ΔΕ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞測(cè)定反篩選Y-分泌酶抑制劑。多個(gè)實(shí)驗(yàn)分析(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺對(duì)Notchl-Δ E 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制產(chǎn)生的IC5tl = 58士23 ηΜ(平均值士SD，η = 58)?；谝种艫 β 40(0. 3ηΜ)和Notch(58nM)的細(xì)胞效力，針對(duì)(2R) _2_[ [ (4_氯苯基) 磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的 Notch/APP 選擇性為 193X(95% CI = 163-232)。體內(nèi)藥理學(xué)A^ELISA使用夾心ELISA測(cè)定檢測(cè)動(dòng)物的A β種類。本文包括這些測(cè)定的簡(jiǎn)短論述，因?yàn)楦鞣N抗體的表位細(xì)節(jié)決定了要檢測(cè)的Αβ種類。小鼠和大鼠Αβ共有相同的Αβ序列，該 序列與人Αβ不同。由于這些序列差異，識(shí)別人Αβ的N-末端區(qū)的抗體如26D6弱結(jié)合嚙 齒動(dòng)物Αβ。同樣，緊密結(jié)合嚙齒動(dòng)物Αβ的抗體如252弱結(jié)合人Αβ。開發(fā)兩種測(cè)定來檢 測(cè)嚙齒動(dòng)物A β 40 :252-TSD和4G8-TSD。TSD-4G8測(cè)定不僅可以檢測(cè)A β 40，而且可以檢測(cè) 其它BACE- γ -分泌酶切割產(chǎn)物(Α β 11-40)和α -分泌酶-γ -分泌酶切割產(chǎn)物(Ρ3)。表 1概述了在本申請(qǐng)中提出的測(cè)定及其用途。
表1 用于體內(nèi)樣品測(cè)定的抗體對(duì)的概述 a “X”的確切位置是未知的。盡管252識(shí)別Αβ的N-末端區(qū)，但不知道Aβ的氨 基末端截短是否影響252結(jié)合。這種不確定性在大鼠中不可能是問題，因?yàn)镹-末端截短是 罕見的。這些測(cè)定的每一種都使用幾種方法驗(yàn)證。首先，將不同量的合成A β改變加入到 生物基質(zhì)，并將信號(hào)增加與用合成Αβ在緩沖溶液中獲得的信號(hào)增加相比較。其次，用抗 Αβ抗體耗盡生物樣品中的Αβ。第三，測(cè)定用高劑量γ-分泌酶抑制劑治療的動(dòng)物的樣品。 已驗(yàn)證的測(cè)定有效檢測(cè)到外源加入的A β (回收率>80%)，在Αβ免疫耗竭后信號(hào)極大降 低(相比于非特異性對(duì)照降低>80%)，且信號(hào)降低至與使用高劑量Y-分泌酶抑制劑治 療的動(dòng)物的樣品的測(cè)定基底(assay floor)接近或重疊的值。最佳的和經(jīng)驗(yàn)證的Αβ測(cè)定 仍含有少量信號(hào)(5-20%的溶媒對(duì)照)，其不能被抗A β抗體或用Y-分泌酶抑制劑治療耗 竭。該信號(hào)不可能為Αβ，因此被稱為測(cè)定基底。測(cè)定基底不用于校正任何Αβ測(cè)量值，因 此報(bào)告的值可能低估了 Αβ抑制的實(shí)際量。Αβ 40在體內(nèi)用作Αβ 42的替代品。生物樣品中的Aβ 40豐度約為Aβ 42的10 倍?；谂囵B(yǎng)細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)，A β 40是A β 42的良好替代品，其中A β 40和A β 42類似地受 (2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5， 5，5-三氟戊酰胺和其它Y-分泌酶抑制劑抑制。大鼠研究在活體中每日早晨以4mL/kg經(jīng)口管飼將99% PEG-400U% Tween-80的給藥溶媒給予雌性 Harlan Sprague-Dawley大鼠(約200_250g)。給藥溶液在研究開始時(shí)一次制備。于56°C 加熱和超聲用于溶解給藥溶液中的化合物。所有的程序都按照ACUC指引進(jìn)行。終端血樣 在CO2安樂死之后通過心臟穿刺獲得，并收集在EDTA管中。在離心后獲得血漿。解剖腦組 織，稱重，并在干冰上冷卻，直至分析。離心CSF樣品，以除去細(xì)胞或碎片，然后用4% BSA以 1 2稀釋，并冷凍，用于隨后的分析。在處理前將組織病理學(xué)樣品置于中性緩沖福爾馬林 中。將收集用于占據(jù)的樣品在包埋基質(zhì)中包被，并于_25°C至-30°C在2-甲基丁烷浴中冷 凍，之后在干冰中冷凍。使用眼球后取血獲得活體血漿樣品。
腦Αβ40 測(cè)定使用polytron 以 4mL/g在PBS，pH7. 8、2%CHAPS、完全蛋白酶抑制劑(Roche)中勻 化大鼠腦(半球的一半)。通過以20，SOOxg離心30分鐘去除大碎片，用PBS、2. 5% BSA以
I 2稀釋獲得的上清液。將含50yg/mL TSD9S3. 2抗體的PBS溶液的White Microlite
IIELISA板(Thermo Electron)于37°C溫育1小時(shí)。在板振蕩器上用200μ L5%牛血清白 蛋白(BSA ；重量/體積，以PBS制備)于室溫封閉板2小時(shí)，然后用500yL/^LPBS、0.05% Tween-20洗滌板5次。將澄清的腦勻漿物以50 μ L/孔的6份復(fù)制品加樣，并于室溫溫育1 小時(shí)。如前洗滌板，然后與用PBS、0. 05% Tween.0. BSA以1 2000稀釋的辣根過氧化 物酶(HRP)-綴合的252抗體(Biosource)溫育1小時(shí)。3份復(fù)制品僅含有252-HRP抗體，而 3份復(fù)制品含有252-HRP抗體和特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體的1 μ g/mL大鼠Aβ 1-14(Anaspec)； 將該背景信號(hào)由總信號(hào)中扣除，以產(chǎn)生特異性信號(hào)。使用Pierce Supersignal Pico化學(xué) 發(fā)光底物檢測(cè)結(jié)合的252-HRP抗體10分鐘，并以Packard TopCount定量。將樣品對(duì)置于 每塊板上的腦勻漿參比標(biāo)準(zhǔn)化?；讦ˇ?0標(biāo)準(zhǔn)曲線，LLQ為10pg/mL組織，LLD為20pg/g 組織。血漿A β 40測(cè)定用TSD抗體包被板，并如對(duì)腦A β 40測(cè)定一樣洗滌。用PBS緩沖液，ρΗ7.8、0. 25% 諾乃洗滌劑Ρ40、2. 5% BSA以1 3稀釋血漿樣品。將樣品以50 μ L/孔的6份復(fù)制品加樣， 并于室溫溫育1-2小時(shí)。使用以PBS、0. 05%Tween、0. 1%BSA1 8000稀釋的4G8-生物素 (Signet)檢測(cè)樣品1小時(shí)。3份復(fù)制品僅具有4G8-生物素抗體，3份復(fù)制品具有4G8-生物素 抗體和競(jìng)爭(zhēng)特異性信號(hào)的1 μ g/mL Αβ 17-24，由此建立每個(gè)樣品的背景值。在如上洗滌后， 將板與以PBS、0.05%Tween、0. 1%BSA 1 50，000稀釋的鏈酶抗生物素蛋白-HRP (Zymed) 溫育10分鐘。如對(duì)腦Aβ 40測(cè)定一樣檢測(cè)和定量。將樣品對(duì)置于每塊板上的血漿參比標(biāo) 準(zhǔn)化?；贏 β 40標(biāo)準(zhǔn)曲線，LLQ為7. 5pg/mL血漿，LLD為23pg/mL血漿。CSF A β 40 測(cè)定用TSD抗體包被板，并如腦A β 40測(cè)定一樣洗滌。用PBS，pH 7.8,0. 1% Tween-20 以1 10稀釋CSF樣品。在收集時(shí)，預(yù)先用4% BSA的水溶液以1 2稀釋CSF。將樣品 以50 μ L/孔的3份復(fù)制品加樣，并于室溫溫育1-2小時(shí)。使用PBS、0.05% Tween.O. 1% BSA 1 8000稀釋的4G8-生物素(Signet)檢測(cè)樣品1小時(shí)。因?yàn)楸尘暗停圆恍枰?對(duì)該測(cè)定運(yùn)行復(fù)制樣品和競(jìng)爭(zhēng)肽。檢測(cè)結(jié)合的4G8-HRP，并如血漿Αβ40測(cè)定一樣定量。將 樣品對(duì)置于每塊板上的CSF參比標(biāo)準(zhǔn)化?；贏 β 40標(biāo)準(zhǔn)曲線，LLQ為20pg/mLCSF，LLD為 400pg/mLCSF。Y-分泌酶位點(diǎn)占據(jù)用低溫恒溫器以20 μ m厚度切冠狀腦切片，并融化封裝在Superfrost Plus載玻 片上。將切片保存在吻側(cè)海馬(rostral hippocampus)平面處，每個(gè)載玻片的3個(gè)切片，間 隔約120 μ m,并于_20°C冷凍備用。對(duì)于占據(jù)研究，將腦切片溫至室溫，干燥，在50mMHEPES 緩沖液，ΡΗ7· 4中溫育10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有1. 5ηΜ[3Η] ΙΝ973 (Goldstein, Μ. Ε.等人， J. Pharmacol. Exp. Ther (2007) 323 102-108)或[3H] (R) -4- ((N- (1-氨基 _4_ 甲基-1-氧 代戊烷-2_基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺的相同緩沖液 中，并于室溫溫育10分鐘。為確定非特異性結(jié)合，將鄰接的切片在含有[3H]IN973或[3H](R) -4- ((N- (1-氨基-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4-氯苯基磺酰氨基)甲基)-N- (2-甲 氧基乙基)苯甲酰胺但含有0.5-未標(biāo)記的Y-分泌酶抑制劑的緩沖液中溫育。在溫育后， 用冰冷的PBS，pH7. 2將載玻片洗滌3次，每次2分鐘，將載玻片浸入冰冷的蒸餾水中，并用 鼓風(fēng)的冷空氣干燥。將載玻片置于氚-敏感性儲(chǔ)磷屏(Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL)下，并在黑暗中曝光7天。使用Cyclone磷掃描儀(Packard,Meriden,CT)以 及OptiQuant獲取和分析軟件(Packard)由儲(chǔ)磷屏獲取圖像。檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的光密度 (表示為數(shù)字光度單位/平方毫米)，并表示為溶媒對(duì)照的百分率。組織病理學(xué)方法在通過CO2窒息安樂死后，由腹部取出近十二指腸的約3cm長(zhǎng)段，用冰冷的磷酸緩 沖鹽水淋洗，并置于10%緩沖福爾馬林中，之后制作切片。將十二指腸的組織切片包埋在液 體石蠟中，封裝成塊，并切為3份徑向(橫過管腔)環(huán)狀切片，使用高碘酸席夫堿法染色，之 后進(jìn)行顯微鏡評(píng)價(jià)。所有的動(dòng)物直至進(jìn)行預(yù)定尸檢時(shí)仍存活。急性大鼠研究30mg/kg 的單劑(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2_ 氟 _4-(1，2，4_ 噁 二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺分別將血漿Αβ 40和腦Αβ 40顯著降 低至溶媒對(duì)照的2%和16%的水平。為進(jìn)一步研究大鼠中(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的作用，以Img/ kg、10mg/kg 和 100mg/kg 給予單劑(2R) _2_[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁 二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺，在2、5、8、12和24小時(shí)后收集組織， 用于血漿Αβ40、腦Αβ40和Y-分泌酶位點(diǎn)占據(jù)檢測(cè)。這些檢測(cè)表明，給藥后2-24小時(shí)， 10mg/kg和100mg/kg降低的血漿A β 40和腦A β 40低于基線A β 40值的25%。相比之下， lmg/kg沒有引起腦A β 40統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的變化，但引起血漿A β 40短暫升高。具體地說，血漿 A β 40至8小時(shí)時(shí)增加至起始值的250%，之后至24小時(shí)時(shí)回到基線值。Y -分泌酶位點(diǎn) 占據(jù)表明，在100mg/kg劑量之后的整個(gè)給藥間隔中，腦中大于94%的Y-分泌酶抑制劑結(jié) 合位點(diǎn)被占據(jù)，在10mg/kg劑量之后在除24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)之外的所有時(shí)間點(diǎn)被占據(jù)(88% )。 相比之下，在lmg/kg劑量之后2小時(shí)僅75%的腦γ -分泌酶結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，至24小時(shí)時(shí) 位點(diǎn)占據(jù)逐漸回到基線水平。急性大鼠研究的結(jié)果表明，(2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4- (1，2，4-噁 二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺降低血漿Αβ40、腦Αβ40和CSF A β 40，ED50 在 lmg/kg 至 10mg/kg 之間。亞慢性大鼠研究基于先前章節(jié)中描述的(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺對(duì)大鼠腦Αβ40的作用，每日給予大鼠 3、10、30或100mg/kg/天的劑量。在第3劑之后12小時(shí)或24小時(shí)或者第4劑之后5小時(shí) 使動(dòng)物安樂死。在給藥后5、12或24小時(shí)通過線性外推由表2所示的相同劑量組中的動(dòng)物 獲得的值評(píng)估腦Αβ40 AUC的降低?；谠摲治?，于3mg/kg/天時(shí)，Αβ40 AUC降低平均為 53%，于10mg/kg/天或更高的劑量時(shí)，增加至超過85%。檢測(cè)化合物在數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平， 以評(píng)價(jià)化合物在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的AUC (0-24小時(shí))值。這些值表明，3劑后的化合物暴 露不超過初始劑量后暴露的2倍。這些大鼠的十二指腸組織的組織學(xué)評(píng)價(jià)表明，以IOOmg/kg/天給藥的大鼠中1/3具有輕微病變。
表2 :4天大鼠研究結(jié)果的概述 a值代表相對(duì)于溶媒對(duì)照組的平均值表示的η = 3只動(dòng)物的平均腦A β 40水平b通過線性外推相同劑量組中于給藥后5、12或24小時(shí)由動(dòng)物獲得的值估計(jì)腦 A β 40 AUC 降低。。值代表η= 3只動(dòng)物的平均AUC (uM-h或ng -h/mL)。由第1劑后5、12和24小 時(shí)取得的樣品(研究1)或第1劑后5、12、1 7和24小時(shí)取得的樣品(研究2)評(píng)估AUC。d值代表η = 3只動(dòng)物的平均AUC(uM · h或ng · h/mL)。由第3劑后12和24小 時(shí)以及第4劑后5小時(shí)取得的樣品(研究1)或者第3劑后12、17、24小時(shí)和第4劑后5小 時(shí)取得的樣品(研究2)評(píng)估AUC。e在3只動(dòng)物中的1只中觀察到杯狀細(xì)胞化生NAD=未檢測(cè)到異常亞慢性大鼠研究的結(jié)果表明，(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟_4-(1，2， 4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺降低了腦Αβ40，無GI毒性。具 體地說，相比于誘發(fā)GI毒性需要的100mg/kg/天的劑量，3mg/kg/天的劑量引起約50%的 腦Αβ40 AUC降低。對(duì)高劑量組的一只動(dòng)物(以該劑量水平評(píng)價(jià)的3只動(dòng)物中的1只)，每天1次給予 100mg/kg/天(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯 基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺，共給予4天，對(duì)其近十二指腸的顯微鏡評(píng)價(jià)顯示，在 該動(dòng)物中具有輕微的杯狀細(xì)胞化生。在以彡30mg/kg給予(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠 [[2-氟-4- (1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺的大鼠中沒有 觀察到與藥物相關(guān)的十二指腸改變。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每天一次以30mg/kg/天或300mg/kg/天對(duì)大鼠給藥4天或7天 (表3)。終點(diǎn)(給藥后5小時(shí))的腦Αβ 40水平為溶媒對(duì)照的13%，因此類似于先前采 用(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨 基]-5，5，5-三氟戊酰胺的大鼠研究。第一次和第四次給藥后5小時(shí)的化合物血漿水平相 似。300mg/kg/天劑量組中的某些大鼠(5只中的4只)在給藥4天后出現(xiàn)了 GI毒性，但其 它治療組沒有大鼠具有可檢測(cè)的GI毒性，包括給藥7天的動(dòng)物。表3 大鼠研究3的結(jié)果概述 aN =測(cè)試5只動(dòng)物/劑量組/終點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)(第4天或第7天)b5只動(dòng)物中的4只觀察到杯狀細(xì)胞化生NAD=未檢測(cè)到異常以上結(jié)果證實(shí)，(2R)-2_[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺是有效的選擇性Y-分泌酶抑制劑。這 些結(jié)果支持將(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基] 甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺作為阿爾茨海默病和其它與淀粉樣肽相關(guān)的疾病的 治療性治療藥物的用途。給出以下的實(shí)施例是為了闡述，不能被視為以任何方式限制本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明 的變化在本發(fā)明合理的精神范圍內(nèi)。本申請(qǐng)的化合物可以以有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的眾多方法制備。本申請(qǐng) 的化合物可以使用下述方法以及合成有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域已知的合成方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員知 曉的其變體方法合成。優(yōu)選的方法包括但不限于下述的那些方法。本文提及的所有參考文 獻(xiàn)都通過引用整體結(jié)合到本文中?？梢允褂帽菊鹿?jié)中描述的反應(yīng)和技術(shù)制備所述化合物。所述反應(yīng)在適于所用試劑 和材料的溶劑中進(jìn)行，并適于要實(shí)施的轉(zhuǎn)化。另外，在下述的合成方法的描述中，要理解的
21是，所有提出的反應(yīng)條件，包括溶劑的選擇、反應(yīng)氣氛、反應(yīng)溫度、實(shí)驗(yàn)過程和后處理程序， 都選擇該反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)條件，其應(yīng)當(dāng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉的。有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人 員理解，分子的不同部分上存在的官能團(tuán)必須與所提出的試劑和反應(yīng)相適。與所述反應(yīng)條 件相適的取代基的這類限制對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，因而必須使用替代方法。具體實(shí)施方案的描述在以下的實(shí)施例中，所有的溫度都以攝氏度給出。熔點(diǎn)以ThomasScientific Unimelt毛細(xì)管熔點(diǎn)裝置記錄，且未修正。核磁共振(1H NMR)光譜以Bruker Avance 300、 Bruker Avance 400或Bruker Avance 500光譜儀記錄。所有的光譜都在所示溶劑中確定， 并以在內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷(TMS)之前的δ單位報(bào)告化學(xué)位移，質(zhì)子間耦合常數(shù)以赫茲(Hz) 報(bào)告。多重譜如下指示s，單峰；d，雙峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬峰；dd，雙 組雙重峰；brd，寬雙重峰；dt，雙組三重峰；brs，寬單峰；dq，雙組四重峰。使用溴化鉀(KBr) 或氯化鈉膜的紅外(IR)光譜以Jasco FT/IR-410或Perkin Elmer 2000 FT-IR光譜儀由 4000cm-1至400CHT1測(cè)定，對(duì)聚苯乙烯膜ieOlcnT1的吸光度校準(zhǔn)，并以厘米倒數(shù)報(bào)告(cnT1)。 旋光度[a ]D WRudolph Scientific Autopol IV旋光計(jì)在所示溶劑中測(cè)定；濃度以mg/mL 給出。低分辨率質(zhì)譜(MS)和表觀分子量(MH+)或(M-H)+以Firmegan SSQ7000測(cè)定。高 分辨率質(zhì)譜以Finnegan MAT900測(cè)定。液相色譜(LC) /質(zhì)譜以偶聯(lián)WaterMicromass ZQ的 Shimadzu LC 進(jìn)行。使用以下的縮寫DMF(二甲基甲酰胺)；THF(四氫呋喃)；DMSO(二甲基亞砜)； Leu(亮氨酸)；TFA(三氟乙酸)；MTBE(甲基叔丁醚)；DAST[( 二乙基氨基)三氟化硫]； HPLC (高效液相層析)；rt (室溫)；aq.(水性)；AP (面積百分率)。制備A(R)-2-氨基-5，5，5-三氟戊酰胺鹽酸鹽步驟A. 4，4，4-三氟丁醛 將二氯甲烷(4. 2L)加至配有機(jī)械攪拌和冷水浴的20 L四頸圓底燒瓶中。開始 攪拌，將反應(yīng)混合物冷卻至0°C至-2°c。加入4，4，4-三氟丁醇(750. Og)，將反應(yīng)混合物進(jìn) 一步冷卻至_5°C至_8°C。加入TEMPO (2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基，游離基)(9. 15 g)， 同時(shí)將溫度保持在_5°C至_8°C。將溴化鉀水溶液(60g，在1. 17L水中)加至以上溶液， 將溫度保持于_5°C至_8°C。將NaOCl水溶液(8. 8L，6_7%重量，使用碳酸氫鈉緩沖至pH =8. 5)加至反應(yīng)混合物(小心放熱反應(yīng))，同時(shí)將反應(yīng)混合物的溫度保持在_5°C。類似 地，高碘酸鈉(NalO4)可以替代NaOCl作為氧化劑。在完全加入后，分離二氯甲烷層，用二 氯甲烷(lX750mL)洗滌水層。組合二氯甲烷層，并使用無水硫酸鈉干燥。過濾干燥劑，通 過NMR測(cè)定4，4，4-三氟丁醛溶液的濃度。含有標(biāo)題化合物的溶液直接用于下一步，無需額 外加工。1HNMr(CDCI3) (400MHz) δ 2. 30-2. 50 (m, 2H, CH2-CF3)，2. 70-2. 80 (m, 2H, CH2-CHO)， 9. 8 (s，1H, CH0)。步驟B. 5，5，5-三氟-2-(l-苯乙基氨基)戊腈(非對(duì)映體的混合物) 將R-Ci-甲基芐胺(528.5g)加至配備機(jī)械攪拌、冷水浴的合適容器中，并保持在 氮?dú)鈱又隆＜尤?，4，4-三氟丁醛溶液(來自步驟A，550g)，接著加入甲醇(3.3L)。然后 將反應(yīng)混合物冷卻至約0°C至_3°C。滴加乙酸(冰的，260mL)，將溫度保持在約0°C，之后 在15分鐘內(nèi)加入三甲基氰硅烷(581mL)。類似地，氰化鈉(NaCN)或氰化鉀可用作氰化物 源。將反應(yīng)混合物溫至25°C-27°C，并過夜攪拌。通過TLC測(cè)定反應(yīng)的完成情況。將冷水 (10. OL)加至反應(yīng)混合物中，用二氯甲烷(IX 10. 0L)萃取反應(yīng)混合物。用水(2X10. 0L) 洗滌二氯甲烷層，接著用鹽水(1X5. 0L)洗滌。二氯甲烷層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并減壓濃 縮，產(chǎn)生為粘性液體的標(biāo)題氨基腈(非對(duì)映體的混合物)，平均收率90%。1HNMR(⑶Cl3) (400MHz) δ 1. 42 (d&m, 5H)，2. 15&2. 35 (兩個(gè) m，各 1H)，3. 10-3. 20 (m, 1H)，4. 10-4. 15 (m, 1H) ,7. 10-7. 35 (m, 6H)。步驟C.5，5，5_三氟-2-(l-苯乙基氨基)戊酰胺(非對(duì)映體的混合物) 將5，5，5_三氟-2-(l-苯乙基氨基)戊腈(來自步驟B的非對(duì)映體的粗混合物， 1. IOkg)溶解在適宜容器中的二氯甲烷(5.5L)中，所述容器配備機(jī)械攪拌、用于冷卻的冰 浴，并保持在氮?dú)鈱酉隆ｉ_始攪拌，將反應(yīng)混合物冷卻至0°c至-5°c。在1小時(shí)內(nèi)將濃硫酸 (1.75L)滴加入以上混合物中，將溫度保持在0°C以下；在完成加入后獲得澄清溶液。將反 應(yīng)混合物的溫度升至25°C至27°C，并過夜攪拌(12-14小時(shí))。通過HPLC測(cè)定反應(yīng)的完成 情況。將反應(yīng)混合物緩慢傾至碎冰(約15.0kg)上，并用氨水(約25%，體積)中和。分 離水層，用二氯甲烷(2X3. 0L)萃取。用水(1X12. 0L)洗滌混合的二氯甲烷，接著用鹽水 (1X3. 0L)洗滌。富含產(chǎn)物的有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，并減壓濃縮，產(chǎn)生0. 85kg(72.0%)粗標(biāo) 題化合物。1HNMr(CDCI3) (400MHz)(非對(duì)映體的混合物)δ 1. 36 (d&m, 4Η, CH3 (J = 8. OHz&lH, CH2)，1. 90 (m, 1H, CH2)，2. 15&2. 35 (兩個(gè) m，1H，每個(gè) CH2-CF3)，2. 80-2. 90 (m, 1H, CH-Ph)， 3. 60-3. 70 (m, 1H, -(CONH2) CH(NH) ,5. 90&6. 45(1H，每個(gè) CONH2,具有其它非對(duì)映體的小峰)， 7. 20-7. 40 (m, 6H, Ar+NH)。步驟D. (R)-5，5，5-三氟-2-((R)-I-苯乙基氨基)戊酰胺鹽酸鹽 將5，5，5_三氟-2-(l-苯乙基氨基)戊酰胺(非對(duì)映體的混合物)(850g)加至配 有機(jī)械攪拌和冷水浴的合適容器中。加入甲醇(2. 55 L)、乙酸乙酯(1. 7L)和水(1. 06L)，將 反應(yīng)混合物冷卻至0°C至5°C。在30-45分鐘內(nèi)滴加二噁烷的HCl溶液(4. 5M，1. 72L)。類 似地，異丙醇和叔丁基甲酯的混合物可以用作溶劑，HCl水溶液或濃HCl可以用作HCl源。 然后將反應(yīng)混合物的溫度升至25°C至27°C，并攪拌2小時(shí)。通過TLC確定反應(yīng)的完成情 況。過濾沉淀的固體，用適宜的溶劑如乙酸乙酯(1.8L)洗滌濾餅，接著用石油醚(2. 5L)或 異丙醇和叔丁基甲酯的混合物洗滌。使固體于室溫在敞口碟中干燥，得到標(biāo)題R-氨基酰胺 (480g，50%收率，非對(duì)映體過量=99. 9% )。1HNMr(CDCI3) (400ΜΗζ) δ 1. 73 (d, 3Η, CH3, J = 8. 0Hz)，2. 08-2. 09 (m, CH2 的 2H)，2. 20-2. 40 (m, 2H, CH2-CF3)， 3. 50-3. 55 (m, 1H, CH-Ph)， 4. 40-4. 41 (m, 1H, - (CONH2) CH (NH)，7. 48-7. 53 (brs, 5H, Ar)。步驟E. (R) -2-氨基-5，5，5-三氟戊酰胺鹽酸鹽 向適合的壓力容器中加入(R) -5，5，5-三氟_2_ ((R) 苯乙基氨基)-戊酰胺鹽 酸鹽(1.50kg)連同甲醇(15.0L)。這之后加入水(701. OmL)，之后加入20%披氫氧化鈀的 碳(225 g)。類似地，披鈀碳(Pd/C)可以用作氫化催化劑。用氮?dú)鉀_洗容器3次，然后于 60°C將氫氣壓入容器(3-4kg/cm2)中。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)的完成情況。在完成時(shí)，使反 應(yīng)混合物冷卻至30-35°C，通過寅式鹽墊過濾，然后用甲醇洗滌。然后減壓濃縮濾過物。在 完成濃縮后，用二氯甲烷(2. 5L/洗滌)處理余下的反應(yīng)混合物，過濾，并于45°C干燥12小 時(shí)，產(chǎn)生標(biāo)題化合物(915g，91. 0%;純度=97% )。1HnMR(DMSO-CI6) (400ΜΗζ) δ 2. 00 (m, 2H, CH2)，2. 30-2. 40 (m, 2H, CH2-CF3)，3. 85-3. 88 (m，1H，- (CONH2) CH (NH)，7. 64&8. 11 (brs，1H，每 個(gè) CONH2)，8. 44 (brs,3H, NH3+)。13CWR(DMS0_d6) (100. 0 MHz) δ 169. 57，13 1. 20，128. 45， 125. 71，122. 97,50. 91,29. 46,29. 18,28. 89,28. 61,23. 56,23. 53。制備B(R)-5，5，5-三氟正纈氨酸方法A. R-轉(zhuǎn)氨酶(Biocatalytics 和 BMS 轉(zhuǎn)氨酶)將含有5，5，5-三氟-2-氧代戊酸(lOOmg，0. 588_ο1)、R，S-丙氨酸(200mg， 2. 244mmol)和0. 02mM吡哆醛磷酸鹽的0. IM磷酸鉀緩沖液pH7. 5的溶液與得自 Biocatalytics的R-轉(zhuǎn)氨酶AT_103(5mg，44單位)或得自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) SC16569的克隆的R-轉(zhuǎn)氨酶(0. 5mL, 10單位，BMS轉(zhuǎn)氨酶)以總體積5mL 在15mL管中于30°C溫育44小時(shí)。用AT-103和BMS轉(zhuǎn)氨酶獲得的(R) _5，5，5-三氟-2-氨 基戊酸的反應(yīng)收率分別為49%和48%。對(duì)映體過量在兩種情況下均為100%。
通過加入輔助酶增加收率，以將丙酮酸鹽還原為乳酸鹽。乳酸鹽脫氫酶需要NADH 作為輔因子。使用甲酸脫氫酶再生NADH。將含有5，5，5_三氟-2-氧代戊酸(lOOmg， 0. 588mmol)、D，L-丙氨酸(200mg，2. 244mmol)、0· 02mM 吡哆酸磷酸鹽、甲酸鈉(68mg， lmmol)、NAD(3. 31mg，5 μ mol)、由兔肌肉克隆的 L-乳酸脫氫酶(BiocatalyticsLDH-103， 0. 107mg, 15單位)和甲酸脫氫酶(0. 5mL, 15單位，由巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris) 克隆，并在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá))的0. IM磷酸鉀緩沖液，pH7. 5的溶 液，與得自Biocatalytics的R-轉(zhuǎn)氨酶AT-103 (5mg，44單位)或得自蘇云金芽孢桿菌 (Bacillusthuringiensis) SC16569 的克隆的 R-轉(zhuǎn)氨酶(0. 5mL, 10 單位)以總體積 5mL 在 15mL管中于30°C溫育。用AT-103和BMS轉(zhuǎn)氨酶獲得的(R) _5，5，5-三氟-2-氨基戊酸的 反應(yīng)收率分別為94%和91%。對(duì)映體過量在兩種情況下均為100%。方法B. (R)-氨基酸脫氫酶(Biocatalytics 和 BMS)程序1 將 5，5，5-三氟-2-氧代戊酸(60. 00g, 0. 353mol) ,NH4Cl (64. 19g，1. 2mol)、 葡萄糖(86. 4g,0. 479mol)和水(975mL)加至2_L夾套反應(yīng)器。加入Na0H(36mL，ΙΟΝ)，于 30°C用磁鐵攪拌混合物，以溶解固體。pH約為7。加入Na2CO3 (12. 72g，0. 12mol)，其使pH達(dá) 到約8. 5。然后將NADP(458mg,0. 60mmol)、葡萄糖脫氫酶(33. 7mg，5277單位，得自Amano Enzyme Company)和 R-氨基酸脫氫酶(600mgD-AADH_102，得自 Biocatalytics)以該順序 加入。通過滴加IONNaOH使反應(yīng)混合物達(dá)到pH9。于30°C攪拌反應(yīng)混合物，并通過由恒pH 滴定(pHstat)加入5NNa0H保持在pH9. 00。在21小時(shí)后，(R) _5，5，5-三氟-2-氨基戊酸 的溶液收率為51. lg，84. 7%收率，100%對(duì)映體過量。程序2 將 5，5，5-三氟-2-氧代戊酸(60. 00g, 0. 353mol)、NH4C1 (64. 19g，1. 2mol)、 葡萄糖(86. 4g，0. 479mol)和水(975mL)加入2_L夾套反應(yīng)器。加入Na0H(36mL，ΙΟΝ)，用磁 鐵于30°C攪拌混合物，以溶解固體。pH約為7。加入Na2CO3 (12. 72g，0. 12mol)，其使pH達(dá) 到約8. 5。然后將NADP (458mg，0.60mmol)、葡萄糖脫氫酶(33. 7mg，5277單位，得自Amano Enzyme Company)和D-氨基酸脫氫酶(50mL提取物，含1500單位，BMS酶)以該順序加入。 通過滴加IONNaOH使反應(yīng)混合物達(dá)到pH9。于30°C攪拌反應(yīng)混合物，并通過由恒pH滴定 (pHstat)加入5NNa0H保持在pH9. 00。在15小時(shí)后，(R) _5，5，5-三氟-2-氨基戊酸的溶 液收率為51. 04g，84. 6%收率，99. 對(duì)映體過量。制備C4-(溴甲基)-3-氟苯甲腈方法A. NBS/AIBN 溴化將1，2_ 二氯乙烷(151kg)連同4-氰基-2-氟代甲苯(24kg) ^P AIBN(2kg)加至合 適的容器中。將混合物加熱至70 74°C。一旦料溫達(dá)到70°C，則以12kg/小時(shí)的速率分 份加入N-溴代琥珀酰亞胺(47. 4kg)，將溫度保持于70 74V (重要的是控制加入速率， 以避免放熱反應(yīng))。在加入24kgN-溴代琥珀酰亞胺之后經(jīng)GC檢測(cè)取樣混合物，將反應(yīng)物加
熱至70-74°C，直至觀察到完全反應(yīng)。將混合物冷卻至0-5°C，并使其再靜置2小時(shí)。過濾 混合物，用MTBE(24kg)洗滌濾餅。濾過物用水(3X65kg)洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉(10. 3kg) 干燥6小時(shí)，過濾，用MTBE(24kg)洗滌濾餅。減壓蒸發(fā)溶液，加入乙醇(12kg)，將混合物 加熱至40-45°C，然后在攪拌的同時(shí)緩慢冷卻至0-5°C，以結(jié)晶。過濾混合物，并用冷乙醇 (5kg)洗滌濾餅。由石油醚重結(jié)晶粗固體，過濾，并用石油醚(IOkg)洗滌，得到為乳白色固 體的標(biāo)題化合物4-(溴甲基)-3-氟苯甲腈(21kg，55%收率)。1HNMR(SOOMHhCDCl3) δ ppm 4. 46-4. 50 (m, 2H) 7. 36(dd, J = 8. 85，1. 32Hz, 1H) 7. 44(dd, J = 7. 91，1. 32Hz, 1H) 7. 52(dd, J =7. 91，7. 16Hz, 1H)。13CNMR (75MHz，CDCl3) δ ppm23. 65 (d, J = 4. 60Hz, 1C) 113. 76 (d, J = 9. 77Hz, 1C) 117. 09 (d, J = 2. 87Hz, 1C) 119. 44 (d, J = 24. 71Hz, 1C) 128. 44 (d, J = 4. 02Hz, 1C) 130. 66-130. 81 (s, 1C) 130. 81-131. 06 (s, 1C) 132. 18 (d, J = 3. 45Hz, 1C) 159. 86 (d, J = 254. 03Hz,1C)。IR (KBr)3088，3077，3040，2982，2250，1571，1508，1439，1248cm—1。C8H5BrFN 的理論分析值理論值 C，44. 89 ；H, 2. 35 ；N, 6. 54 ；F, 8. 88 ；實(shí)測(cè)值=C, 44. 94 ；H，2. 73 ；N，6. 56 ；F，8. 73。方法B.溴酸鈉溴化向適合的反應(yīng)器中加入二氯甲烷(40L)和3-氟-4-甲基苯甲腈(4kg，18. 7mol)， 之后加入溴酸鈉的水溶液(13. 45kg，89. lmol，溶解在53. 6L水中)。將反應(yīng)混合物冷卻至 0-5°C。在2-3小時(shí)內(nèi)加入亞硫酸氫鈉(9. 25kg，溶解在42L水中)溶液，同時(shí)保持10_20°C 的料溫(反應(yīng)是放熱的)。在結(jié)束加入后，200W燈照射反應(yīng)器，將料溫增加至25-30°C。保 持光照射和溫度，直至依據(jù)HPLC產(chǎn)物為70-75%。去除照射，終止攪拌，使反應(yīng)物沉降15分 鐘。除去有機(jī)層，剩下的水層用二氯甲烷萃取兩次。合并有機(jī)層，用10%硫代硫酸鈉溶液洗 滌4次。然后用鹽水(IOL)洗滌有機(jī)層，并用硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)層，然后加入石油醚， 并兩次蒸餾至干燥，以除去所有的二氯甲烷。加入石油醚(3L)，冷卻淤漿至5-10°C達(dá)1小 時(shí)。過濾淤漿，并用冷石油醚洗滌。在真空烘箱內(nèi)于40-45°C干燥產(chǎn)物，得到為乳白色固體 的標(biāo)題化合物(3. 2kg，50. 4%收率)。由母液回收標(biāo)題化合物的代表性程序由濃縮母液(300g)得到粗物質(zhì)(約36% 4_(溴甲基)-3_氟苯甲腈和約59%偕二溴化物)，并將2當(dāng)量的二異丙基乙胺(基于偕二 溴化物)溶解在乙腈(3L)和水(50mL)中。將反應(yīng)物冷卻至0_5°C，并在30分鐘內(nèi)加入亞 磷酸二乙酯(169g，1.22mol)(加入是放熱的)。于0_5°C攪拌反應(yīng)物60-90分鐘，并通過 TLC監(jiān)測(cè)。當(dāng)依據(jù)TLC不再存在二溴化物時(shí)，加入水(3. 3L)，并過濾所獲的淤漿。濾餅用水 洗滌，并在真空烘箱中干燥(直至水分含量< 1%)，以產(chǎn)生202g (依據(jù)HPLC為98AP)額外 的標(biāo)題化合物。制備D3-氟-N'-羥基-4-甲基苯甲脒(benzimidamide)的制備在N2氣氛下向配有機(jī)械攪拌的合適容器中加入202. 0g3-氟_4_甲基苯甲腈，接著 加入1.0L乙醇。在20分鐘內(nèi)經(jīng)加液漏斗加入羥胺(144mL的50%水溶液)。于環(huán)境溫度攪 拌混合物，直至HPLC分析表明反應(yīng)完成(沒有剩下起始物質(zhì))。在1小時(shí)內(nèi)向淺黃色溶液 滴加水(3. 0L)，以產(chǎn)生稠淤漿。在冰水浴中將淤漿冷卻至2°C達(dá)1.5小時(shí)，過濾，并于35°C 真空干燥22小時(shí)，產(chǎn)生為白色固體的標(biāo)題化合物(230. 3g,91.6%)0 1H-NMRKDCI3, 500MHz) δ 7. 30(m，2H)，7. 19 (m, 1H)，4. 87(s，2H)，2. 28(s，3H) ； 13C-NMR (CDCl3, 500MHz) δ 162. 15，160. 19，151. 58，131. 82，131. 76，131. 66，131. 62，127. 01,126. 87，121. 06,112. 69,112. 5 1，14. 48 ；19F-WR (CDCl3, 500MHz) δ -116. 35，-116. 37，-116. 39。LC-MSM+H169. 19。制備E3-(3-氟-4-甲基苯基)_1，2，4-噁二唑的制備方法Α.三氟化硼將粗酰胺肟3-氟-N'-羥基-4-甲基苯甲脒(118. 6g)和原甲酸三乙酯(292mL， 260g, 1. 76mol)在二氯甲烷(800mL)中淤化，并于室溫加入三氟化硼乙醚(14. 8mL, 16. 6g, 0. 12mol)。將獲得的黃色溶液加熱至45°C達(dá)1小時(shí)，并于室溫保持16小時(shí)，依據(jù)HPLC其提 供了 60%轉(zhuǎn)變。將該溶液加熱至45°C達(dá)2. 5小時(shí)，使殘留的起始物質(zhì)變?yōu)榧s1%。在冷卻 至室溫后，將INHCl (600mL)加入混合物。分離各相，水層用二氯甲烷(200mL)萃取。合并 的有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，并于25°C減壓濃縮，以得到白色固體。在高真空下干燥16小時(shí)，得 到標(biāo)題化合物(102. 3g，經(jīng)兩步為98%收率)。方法B.三氟乙酸在N2氣氛下將3-氟-N'-羥基-4-甲基苯甲脒(302. 52g，1.79mol)、原甲酸三 乙酯(382. 5mL,341. Ig, 2. 3mol)和乙腈(1512mL)加入配有機(jī)械攪拌的合適容器。將反 應(yīng)混合物加熱至45°C，并于該溫度加入三氟乙酸(6. 72mL, 10. 08g,87. 6mmol)。將反應(yīng)混 合物于60°C再加熱90分鐘，然后冷卻至室溫。在60分鐘內(nèi)滴加水(3L)。將淤漿冷卻至 40C，并于該溫度攪拌30分鐘。過濾固體，并于50°C真空干燥12小時(shí)，以產(chǎn)生為白色固體 的3-(3-氟-4-甲基苯基)-1，2，4-噁二唑(306g，95.6% )。HPLC表明99. 8%的化學(xué)純 度。1H-Wr(CdcI3JOOMHz) δ 8. 67 (s, 1H), 7. 71 (m, 2H), 7. 23 (t, J = 8HZ, 1H), 2. 28 (s, 3H)； 13C-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 166. 9447，164. 7258，162. 5473，160. 1066，132. 0480，132. 0077， 128. 5987，122. 9910，122. 9507，114. 2568，114. 0147，14. 6902。19F-NMR (CDCl3, 400MHz) δ -115. 94，-115. 96。C9H7N2O 的理論計(jì)算值C，60. 67 ；H, 3. 96 ；N, 15. 72。實(shí)測(cè)值=C, 60. 54 ；H, 3. 78 ；N, 15. 69。制備F3-(4-(溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4_噁二唑的制備方法A.分步溴化向 3-(3-氟-4-甲基苯基)-1，2，4-噁 二 唑(5. 34g，30mmol)、CCl4(50mL)和 NBS (11. 7g,66mmol)的攪拌混合物加入AIBN(246mg，1. 5mmol)。在氮?dú)庀聦⒎磻?yīng)混合物加 熱至80°C達(dá)3小時(shí)，冷卻至室溫，并加入50mL飽和碳酸氫鈉溶液。分離有機(jī)層，并用二氯 甲烷(50mL)萃取水層。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾，用rotovap濃縮，得到為白色固體的 3- (4- (二溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4-噁二唑(9. 34g，93 % )，其用于下一步，無需進(jìn)一步 純化。將 3-(4-( 二溴甲基)-3_ 氟苯基)-1，2，4_ 噁二唑(8.37 g,25mmol)和 THF(60mL) 加入200mL圓底燒瓶。將混合物冷卻至0°C，并在15分鐘內(nèi)滴加二異丙基乙胺(3. 48g， 27mmol)，接著滴加亞磷酸二乙酯(3. Ig, 26. 8mmol)。于室溫?cái)嚢杌旌衔?0分鐘，并用40mL 水猝滅。水層用乙醚(2X80mL)萃取。合并的有機(jī)層用20mL飽和NH4Cl水溶液和20mL飽 和氯化鈉溶液洗滌。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾，并用rotovap濃縮，得到粗固體，其通過 短硅膠柱(pad)純化，得到3-(4-(溴甲基)-3_氟苯基)-l，2，4-噁二唑(6. 03g,94% )0
27熔點(diǎn) 87. 3 °C。1H-Nmr(Cdci3JOOmHz) δ 8. 80 (s, ιη) , 7. 94 (dd, ιη) , 7. 87 (dd, 1Η), 7. 58 (t, 1Η) ,4. 57(s，2H) ；13C-NMR (CDCl3, 400ΜΗζ) δ 166. 97，166. 95，165. 45，162. 29，159. 73， 132. 34，132. 30，128. 99，128. 90，128. 81，124. 04，124. 01，115. 56，115. 32,25. 22,25. 18 ； 19F-WR(CDCl3,400ΜΗζ) δ -115. 81,-115. 84,-115. 86。C9H6BrFN2O 的理論計(jì)算值C，42. 05 ； H, 2. 35 ；N, 10. 90。實(shí)測(cè)值C，42. 17 ；H, 2. 17 ；N, 10. 63。方法B.替代的一鍋溴化將3-(3-氟-4-甲基苯基)-1，2，4-噁二唑(101.8g,0. 57mol)和N-溴代琥珀酰 亞胺(206g, 1. 16mol)溶解在乙腈(約1L)中，并于室溫加入偶氮二異丁腈(4. 2g,26mmol)。 將混合物加熱至70°C達(dá)2小時(shí)，在該時(shí)間點(diǎn)HPLC顯示起始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)變?yōu)橐讳寤锖投?化物的混合物。將混合物冷卻至0°C，并加入二異丙基乙胺(73mL，54. 2g，0. 42mol)，同時(shí)保 持反應(yīng)溫度在5 C以下。緩慢加入亞磷酸二乙酯(54.711^，58.68，0.4211101)，將反應(yīng)混合物 溫至室溫。在2小時(shí)后，HPLC表明二溴化物完全轉(zhuǎn)變?yōu)橐讳寤铩＜尤胨?1.2L)，過濾所 獲的沉淀。用水(2X200mL)洗滌，并干燥，得到3-(4-(溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4-噁二 唑(135g，92%收率)。方法C 溴酸鈉溴化(直接分離)將溴酸鈉(2. 54g)溶解在水(8. 4mL)中。于室溫向該溶液加入3_(3_氟_4_甲 基苯基)-1，2，4_ 噁二唑(l.Og)的 Et0Ac(12mL)溶液。滴加 NaHSO3(1. 75g)的水(17mL) 溶液(注意放熱)。于室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)，然后保持在冷室中過夜。分離有機(jī)層，用 10% Na2S2O3和水洗滌，然后濃縮。將所獲固體溶解在EtOAc (約6mL)中。緩慢加入庚烷 (約30mL)。于室溫?cái)嚢栌贊{3小時(shí)，然后過濾。用庚烷(15mL)洗滌固體，然后干燥，得到 0. 74g(51% )標(biāo)題化合物HPLC 99. 42AP。第二遍回收將濾過液濃縮至約30mL體積，過 濾所獲淤漿，得到為白色固體的標(biāo)題化合物0. 23 (16% ), HPLC為97. 09AP。方法D 溴酸鈉溴化(使用二溴化物還原的兩步程序)于室溫將3-(3-氟-4-甲基苯基)-1，2，4-噁二唑(20. Og, 112. 2mmol)的二氯甲 烷(200mL)溶液加入NaBr03(50.8g，336.7mmol)的水(200mL)溶液。將所獲兩相混合物 冷卻至O0C0滴加NaHSO3 (35. 7g，336. 7mmol)的水(160mL)溶液，以將料溫保持在20°C以 下(約1小時(shí))。于室溫?cái)嚢杷@的紅色溶液，直至依據(jù)HPLC3-(3-氟-4-甲基苯基)-1， 2，4_噁二唑低于1.0AP(約2小時(shí))。分離有機(jī)層(底層)，并用二氯甲烷(200mL)萃取水 層。用10% Na2S2O3水溶液(200mL)、水(200mL)和15%鹽水(200mL)洗滌合并的二氯甲 烷溶液。在真空濃縮后獲得白色固體(一溴化物和二溴化物的混合物)。將該固體溶解在 濕MeCN(200mL，KF:1. 5-4% )中，并將溶液冷卻至_5°C至0°C。加入N，N-二異丙基乙胺 (6. Og, 8. lmL，46. 4mmol)，接著在 15 分鐘內(nèi)滴加亞磷酸二乙酯(6. Og, 46. Immol)。于 _5°C 至0°C攪拌混合物，直至3- (4- (二溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4-噁二唑< 0. 5AP (1. 5-2小 時(shí))。在30分鐘內(nèi)加入水(500mL)，產(chǎn)生白色淤漿。于室溫?cái)嚢柙撚贊{1_3小時(shí)，然后過濾。 濾餅用水(2X200mL)洗滌，然后于45°C真空干燥20小時(shí)。C9H6BrFN2O 的理論計(jì)算值理論值，C，42. 05 ；H, 2. 35 ；N, 10. 89 ；Br, 31. 08 ；F, 7. 39。 實(shí)測(cè)值:C, 42. 10 ；H, 2. 24 ；N, 10. 90 ；Br, 31. 18 ；F, 7. 00。實(shí)施例1(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺步驟A. 5，5，5-三氟-2-(1-苯乙基氨基)戊腈向(R)-苯乙胺(9. 60g,79. 4mmol)和乙酸(5. 08g,79. 6mmol)的 Me0H(150mL)溶 液加入NaCN(3. 88g，79. 6mmol)。將反應(yīng)物冷卻至0°C，并加入4，4，4-三氟丁醛(10. Og, 79. 6mmol)的Me0H(50mL)溶液。將反應(yīng)物溫至室溫，并攪拌20小時(shí)。用水(400mL)稀釋反 應(yīng)物，并用CH2Cl2(3X300mL)萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)Na2SO4干燥，并真空濃縮，以得到為淺黃 色油狀物的氨基腈標(biāo)題化合物(18. lg，89%，為非對(duì)映體的4 1混合物)=1HNMR(300MHz， CD3OD) δ 7. 3 8-7. 27 (m，5Η)，4· 15-4. 02 (m，1Η)，3. 69 (t，J = 7. 5Hz，0. 22Η)，3. 18(t，J = 7.5 Ηζ,Ο. 78Η)，2· 48-2. 26 (m, 1Η)，2· 25-2. 03 (m, 1Η)，2· 01-1. 86 (m, 2Η)，1. 39 (d, J = 6. 5Ηζ, 2. 34Η)，1. 36 (d, J = 6. 5 Ηζ,Ο. 66Η) ；ESIMSm/z 257[C13H15F3N2+H]。步驟B. (R)-5，5，5-三氟-2-((R)-I-苯乙基氨基)戊酰胺鹽酸鹽向5，5，5-三氟-2-(1-苯乙基氨基)戊腈(18.(^，70.31讓01，非對(duì)映體的4: 1 混合物)的CH2Cl2 (IOOmL)溶液加入H2SO4 (IOOmL)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?2小時(shí)，傾至碎冰 上，并用NH4OH中和?；旌衔镉肊t0Ac(3X500mL)萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)Na2SO4干燥，并真 空濃縮，以得到為橙色油狀物的非對(duì)映體混合物(18.94g，98%)的標(biāo)題化合物的游離堿 1HNMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 40-7. 18(m，5H)，6· 78(brs,0. 23Η)，6· 50(brs,0. 77Η)，6· 00(brs,
0.77Η) ,5. 81 (brs,0. 23H)，3. 82 (q, J = 6. 5Hz，0· 23H)，3. 70 (q, J = 6. 5Hz,0. 77H)，3. 14 (t, J = 6. ΟΗζ,Ο. 23H) ,2. 86 (t, J = 7. 0Hz，0. 77H)，2. 35-1. 86 (m，2H)，1. 84-1. 64 (m，2H)，
1.39 (d, J = 6. 5Ηζ，0· 69H)，1. 35 (d, J = 6. 5Ηζ，2· 31Η) ；ESIMSm/z275 [C13H17F3N2CHH]。鹽酸鹽向?yàn)榉菍?duì)映體混合物(11. 9g，43. 4mmol)的標(biāo)題化合物的游離堿的Et2O/ MeOH(7 l,40mL)溶液加入IN HCl的Et20(70mL)溶液。通過加熱混合物并加入MeOH(至 4 IEt2CVMeOH的最終比率)再溶解形成的白色沉淀。使溶液冷卻至室溫，并使其過夜 靜置。分離標(biāo)題化合物的氨基酰胺鹽酸鹽，其為白色固體的單一非對(duì)映體(3. llg，23%) 1HNMR(300MHz, CD3OD) δ 7. 93(brs, 1H)，7· 69(brs, 1Η)，7· 54-7. 44(m，5H)，4· 39 (q, J = 7. 0Hz, 1H) ,3. 50 (t, J = 6. 5Hz，1H)，2. 29-2. 20 (m，2H)，2. 10-2. 01 (m，2H)，2. 07 (d，J = 7. 0Hz,3H) ；ESI MSm/z275[C13H17F3N2CHH]。步驟C. (R) -2- (4-氯苯基磺酰氨基)_5，5，5-三氟戊酰胺向(R)-5，5，5-三氟-2-((R)-I-苯乙基氨基)戊酰胺鹽酸鹽(3. IOg, 10. Ommol)的 EtOH(IOOmL)溶液加入Pd (OH) 2 (350mg)和水(IOmL)。于50°C氫化(40psi)反應(yīng)混合物4小 時(shí)。通過寅氏鹽過濾反應(yīng)物，真空濃縮濾過液，得到為白色固體的中間體胺鹽酸鹽。向所述 胺的CH2Cl2(IOOmL)懸浮液加入N，N- 二異丙基乙胺(5. 25mL,30. Ommo 1)和4-氯苯磺酰氯 (2. 53g，12. Ommo 1)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?18 小時(shí)，并用 EtOAc (200mL)稀釋，用 NaHCO3 (250mL) 和鹽水(250mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并真空濃縮。通過用CH2Cl2/己烷(2 1)研磨殘余 物獲得為白色固體的標(biāo)題化合物(2. 91g,84%) =1HNMR(300MHz，CD3OD) δ 7. 84(dt，J = 8. 5，
2.0Hz，2H)，7· 55(dt, J = 8. 5,2. 0Hz，2H)，3· 85(dd, J = 8. 5,5. OHz, 1H)，2. 34-2. 05 (m, 2H)， 1. 97-1. 68 (m, 2H) ；ESI MSm/z345 [CnH12ClF3N203S+H]。步驟D. (R)-2-(4-氯-N-(2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)芐基)苯基磺酰氨 基)-5，5，5_三氟戊酰胺
向磺酰氨基(R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺(130mg，0. 37mmol) 的 DMF(2mL)溶液加入 Cs2CO3 (241mg，0. 74mmol)和 3-(4-溴甲基-3-氟-芐基)-1，2， 4-噁二唑(257mg，0. 48mmol)。將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，用水(50mL)稀釋，并用 Et0Ac(2X50mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物用水(2X50mL)和鹽水(50mL)洗滌，并真空濃 縮。殘余物通過柱色譜純化(硅膠，0-55% EtOAc/己烷)，以得到為白色固體的標(biāo)題噁二 唑化合物(92mg,45% )熔點(diǎn) 66-680C ；1HNMR(500MHz, CDCl3) δ 8. 77 (s, 1H)，7· 90 (dd, J = 8. 0，1. 5Hz，1H)，7. 77—7. 71 (m，3H)，7. 64 (dd, J = 7. 5,7. 5Hz，1H)，7. 51 (d，J = 8. 5Hz，2H)， 6. 34 (s, 1H), 5. 28 (s, 1H), 4. 66 (d, J = 15. 6Hz，1H)，4. 51 (d，J = 15. 6Hz，1H)，4. 39 (dd，J =8. 9,6. 3Hz, 1H), 2. 25-1. 82 (m, 3H)，1. 54-1. 47 (m, 1H) ；ESIMSm/z521 [C20H17C1F4N404S+H]+ ； HPLC98. 9% (AUC)，tE = 19. 4 分鐘。實(shí)施例2(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基] 氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺步驟A. 4-(溴甲基)-3-氟苯甲腈向3-氟-4-甲基苯甲腈(5. Og, 0. 23mol)的IOOmL四氯化碳溶液加入N-溴代琥 珀酰亞胺(4. 97g，0. 28mol)和AIBN(100mg,0. 61mmol)，使混合物回流6小時(shí)。冷卻反應(yīng) 物，并過濾。濾過物用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾，真空去除溶劑，得到為乳白色固體的 5. 44g標(biāo)題化合物。1HNMR表明存在20%起始物質(zhì)。標(biāo)題化合物的1HNMRGOOMHz,⑶Cl3) δ 7. 54-7. 30 (m, 3H)，4. 83 (s, 2H)。步驟B. (R)-2-(4-氯-N-(4-氰基-2-氟芐基)苯基磺酰氨基)_5，5，5_三氟戊酰 胺向(R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺(6. 88g,20. Ommol)和4_(溴 甲基)-3-氟苯甲腈(6. 43g,30mmol)的 DMF(35mL)溶液加入無水 Cs2CO3 (19. 56g，60mmol)。 所獲混合物于室溫?cái)嚢?5分鐘，然后用EtOAc (200mL)稀釋，用水(100mLX4)洗滌，并經(jīng) Na2SO4干燥。產(chǎn)物通過Biotage (40+M柱，3%-80% EtOAc的己烷溶液，651mL)純化。獲得 為白色固體的標(biāo)題化合物(6. 50g，68. 收率)。1HNMR(DMS0-d6，400MHz) δ 7. 80-7. 88 (m, 3H)，7. 70-7. 75 (m, 2H)，7. 67 (d, 2H, J = 8)，7. 60 (s，1H)，7. 26 (s, 1H)，4. 99 (d, 1H, J = 16)，4. 68 (d, 1H, J= 16)，4. 14 (t, 1H, J = 8)，1. 99-2. 17 (m, 2H)，1. 80-1. 94 (m, 1H)， 1. 40-1. 56 (m, 1H). LC/MSM+H478. 14，94%。步驟C. (2R)-2_[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2_ 氟 _4_(1，2，4_ 噁二唑 _3_ 基)苯 基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺向(R)-2-(4-氯-N-(4-氰基-2-氟芐基)苯基磺酰氨基)_5，5，5_三氟戊酰 胺(6. 5g, 13. 6mmol)的 EtOH (70mL)溶液加入 NH2OH (50 % 的 H2O 溶液，2. 6mL40. 8mmol)。 所獲混合物在氮?dú)庀掠?0°C攪拌1小時(shí)，然后冷卻至室溫。減壓蒸發(fā)溶劑。將殘 余物溶解在EtOAc中，并用水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生白色固體，其由 EtOAc和己烷重結(jié)晶，得到為白色固體的中間體酰胺肟(6.938，定量收率)。向中間體 (R)-2-(4-氯-N-(2-氟-4-(N' _羥基甲脒基)芐基)苯基磺酰氨基)_5，5，5-三氟戊酰 胺(6. 93g，13. 6mmol)和原甲酸三乙酯(6. 77mL，40. 8mmol)在二氯乙烷(30mL)中的混合物 加入BF3 · OEt2 (0. 17mL, 1. 36mmol)。所獲混合物于70°C攪拌1小時(shí)，然后冷卻至室溫。色譜(硅膠，biotage，40+m柱，3% -80% etoac的己烷溶液，651ml)得到為白色固體的標(biāo)題 化合物(4.9g，69. 3%收率)。 將以上的4. 9g產(chǎn)物與第二批9. 8g (2r) _2_ [ [ (4_氯苯基)磺酰基][[2_氟_4_ (1， 2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺(通過實(shí)施例1所述的程序 制備)混合。向混合批(14.7g)加入異丙醇(75ml)。回流混合物，直至幾乎全部分散，然 后過濾。于室溫?cái)嚢铻V過液16小時(shí)，并過濾。在干燥至恒定質(zhì)量后獲得白色精細(xì)晶體白色 固體，得到(2r)-2-[[(4-氯苯基)磺酰基][[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲 基]氨基 1-5,5, 5-三氟戊酰胺(13. 7g)。1hnmr(cdcl3, 500μηζ) δ 8. 77 (s，1h)，7. 90 (dd，j = 8. 0，1. 5hz，1h)，7. 77—7. 71 (m，3h)，7. 64 (dd, j = 7. 5,7. 5hz，1h)，7. 51 (d，j = 8. 5hz，2h)， 6. 34 (s，1h)，5. 28 (s, 1h)，4. 66 (d, j = 15. 6hz, 1h)，4. 51 (d，j = 15. 6hz, 1h)，4. 39 (dd, j = 8. 9,6. 3hz, 1h), 2. 25-1. 82 (m, 3h)，1. 54-1. 47 (m, 1h) ；esimsm/z521 [c2(ih17c1f4n404s+h]+。實(shí)施例3(2r)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基] 氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺步驟a. (r)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺 于室溫向適合的干燥容器加入(r)_2-氨基-5，5，5_三氟戊酰胺鹽酸鹽 (199. 52g0.966mol，1.0 當(dāng)量)，接著加入 4-氯苯磺酰氯(215. 22g0. 989mol，1. 02 當(dāng)量， 97%重量/重量％)和1.6lthf。在20分鐘內(nèi)加入三乙胺(206. 5g，2. 04mol，2. 1當(dāng)量)，將 罐溫保持于15-25°c，所獲白色淤漿于15-25°c攪拌30分鐘。于20-25°c將水(1.4l，7體積) 加入反應(yīng)混合物，然后通過真空蒸餾除去thf (1. 4l，7體積)(在蒸餾過程中在250-400mmhg 下將罐溫保持在40-60°c )。在蒸餾過程結(jié)束時(shí)，在30分鐘內(nèi)加入1. 4l(7體積)水，同時(shí) 保持罐溫于50-60°c，所獲淤漿于50-60°c攪拌30分鐘，然后冷卻至10°c。攪拌淤漿至少 1小時(shí)，過濾產(chǎn)物。用水(每次洗滌600ml)洗滌濾餅，直至檢測(cè)的濾餅洗滌液5。于 不超過70°c (夾套溫度)真空干燥濾餅，直至干燥失重< 0. 5重量/重量％，得到為白色 固體的標(biāo)題化合物(300g，91% 收率)。1hnmr(dmso-ci6) (400μηζ) δ 160-1. 90 (兩個(gè) m，1h， 每個(gè) ch2)，2. 10-2. 35 (m, 2hch2_cf3)，3. 85-3. 88 (m, 1h, - (conh2) ch(nh)，7. 13&7. 37 (brs, 1h,每個(gè) conh2)，7. 61 (m, 2h, ar-ha)，7. 64 (m, 2h, ar-hb)，8. 18 (d, 1h, j = 8. ohz，nh-so2)。 13cnmr (dmso-Cl6) (100. ομηζ) δ 171. 75，140. 27，137. 77，131. 71,129. 56，128. 95，126. 22， 55. 12，30. 1，29. 82，29. 53，29. 25，25. 82，25. 79。步驟b. (2r)-2_[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2_ 氟 _4_(1，2，4_ 噁二唑 _3_ 基)苯 基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺 步驟B，程序1將3-(4-(溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4-噁二唑(492. 14g，1. 10 當(dāng)量，1. 914mol)、 (R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5_三氟戊酰胺(600g，1.00當(dāng)量；1. 74mol)、碳酸銫 (312. 22g，0. 55 當(dāng)量；0. 98mol)、四正丁基碘化銨(64. 29g，0. 10 當(dāng)量；0. 17mmol)和乙腈 (9mL/g ；5. 4L)加入合適的容器。將夾套加熱至40°C (內(nèi)部38°C )。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng) 物，直至(R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺<5AP。將容器冷卻至內(nèi)部溫度 為20°C，并加入水(5.4L)。分離各相，富含產(chǎn)物的層在頂部。廢棄底層。在18分鐘內(nèi)加入 水(3. 7L)，將反應(yīng)物在20°C保持20小時(shí)，然后過濾。將水(6L)加入容器，并攪拌，以便將 粘附至攪拌槳和容器壁的固體轉(zhuǎn)移。以用于沖洗反應(yīng)器的水洗滌粗濾餅1次。粗濾餅于 50°C在真空下于盤子中干燥。干燥的粗濾餅稱重為699g。將濾餅轉(zhuǎn)移至IOL反應(yīng)器，并加入 THF (2. 025L)，之后加入羥胺溶液(50%的水溶液)(42. 97mL，0. 40當(dāng)量，0. 696mol)。將反應(yīng) 器夾套加熱至40°C。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，直至(R)-2-(4-氯-N-(4-氰基-2-氟芐基)苯 基磺酰氨基)-5，5，5_三氟戊酰胺<0.4AP。將反應(yīng)物冷卻至20°C，加入水(2L)，將反應(yīng)物 于20°C攪拌30分鐘。分離各相，在攪拌的同時(shí)用庚烷(8L)處理有機(jī)相，反應(yīng)物變成油狀，然 后沉淀。使淤漿于20°C靜置2小時(shí)，過濾反應(yīng)物，用庚烷(2L)洗滌濾餅。粗濾餅在真空下 于40-501托盤干燥，在干燥至<1%干燥失重后稱重為6138。將粗產(chǎn)物連同臨0!1(3. 678L) 和MeCN(1.226L) —起轉(zhuǎn)移回容器。將夾套加熱至60°C (內(nèi)部52°C )，以實(shí)現(xiàn)完全溶解，于 該溫度緩慢加入水(2. 023L)，保持內(nèi)部溫度> 50°C。當(dāng)水加入完成時(shí)，在4小時(shí)內(nèi)將溶液冷 卻至15°C的內(nèi)部溫度，同時(shí)發(fā)生結(jié)晶。將另外的水加入反應(yīng)器(400mL)，過濾反應(yīng)物，將母 液返回容器。攪拌母液2分鐘，以游離容器中的任何粘附產(chǎn)物。用母液洗滌粗濾餅，接著用 庚烷(1. 500L)洗滌。產(chǎn)物在真空下于40-50°C托盤干燥，直至干燥失重< 0. 5%，以得到為 發(fā)亮的乳白色固體的(2R) -2-[ [ (4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4- (1，2,4-噁二唑-3-基) 苯基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺(577.68，63.76%收率)。步驟B，程序2將(R)-2-(4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺(2. 68kg, 7. 77mol,l當(dāng)量)、 3-(4-(溴甲基)-3-氟苯基)-1，2，4_ 噁二唑(2. OOkg, 7. 78mol, 1 當(dāng)量)、碳酸銫(1. 65kg， 5. 06mol，0. 65 當(dāng)量)、四丁基碘化銨(0. 29kg, 0. 78mol，0. 1 當(dāng)量)和乙腈(12. 0L4. 5L/kg) 加入合適的容器。將反應(yīng)物加熱至35°C，直至通過HPLC監(jiān)測(cè)完成(依據(jù)HPLC，3-(4-(溴 甲基)-3_氟苯基)-1，2，4_噁二唑< 0.5相對(duì)AP)。將反應(yīng)物冷卻至15°C，并在攪拌下加 入水(10. 72L，4L/kg)，之后加入冰乙酸(0. 22kg)，以使反應(yīng)物的pH < 6. 5。終止攪拌，分離各相(頂層包含產(chǎn)物)。向富含產(chǎn)物的層加入甲苯(26.8kg，31L，10kg/kg)，之后加入鹽 水溶液(20%重量/重量，6.391^，2171^)，分離各層(頂層包含產(chǎn)物)。將混合物在真空 (200mbar)下于約50°C蒸餾，直至除去乙腈。如有需要在蒸餾后再用甲苯調(diào)整濃度，以確保 反應(yīng)器中的總體積為約10L/kg。加入異丙醇(0. 48kg, 0. 2L/kg)，將批料冷卻至15°C，以開 始結(jié)晶。過濾所獲淤漿，并用冷甲苯(18. 65kg，21.56L，8L/kg)洗滌。粗濾餅于50°C在真空 下托盤干燥，直至干燥失重< 1.0%。將干濾餅連同異丙醇(27.34kg，34.8L，13L/kg)和羥 胺(50%水溶液，0. 05kg, 1. 51mol,0. 2當(dāng)量)一起加入100L反應(yīng)器。將混合物加熱至65°C， 并通過HPLC監(jiān)測(cè)，直至(R) -2- (4-氯-N- (4-氰基-2-氟芐基)苯基磺酰氨基)_5，5，5-三 氟戊酰胺<0. 4AP。然后蒸餾反應(yīng)物(罐溫約50°C，真空300mbar)，直至反應(yīng)體積為原來的 約60%。加入乙腈(5.361^，2171^)，將反應(yīng)溫度增加至701，以達(dá)到完全溶解。緩慢加入 水(11. 26L，4. 2L/kg)，同時(shí)保持反應(yīng)溫度> 65°C。在2小時(shí)內(nèi)將反應(yīng)物冷卻至15°C，并發(fā) 生結(jié)晶。過濾淤漿，用冷異丙醇水溶液(2 IIPA 水，體積)洗滌。在真空烘箱中干燥濾 餅，直至干燥失重< 1%。然后通過溶解在乙腈(2L/kg，基于輸入的干濾餅的重量)和甲醇 (6L/kg)中重結(jié)晶產(chǎn)物，然后加熱至50°C。緩慢加入水(4L/kg)，保持反應(yīng)溫度>50°C。在 2小時(shí)內(nèi)將反應(yīng)物冷卻至15°C。過濾所獲淤漿，并用甲醇乙腈水(6 2 4，5L/kg) 溶液洗滌，以產(chǎn)生為白色固體的(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二 唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺(2. 02kg，50%收率)。實(shí)施例4(2R)-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[[2-氟-4-(1，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基] 氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺步驟A. (2幻-2-[[(4-氯苯基)磺?；鵠[(4_氰基_2_氟苯基)甲基]氨基]_5， 5,5-三氟戊酰胺 將(R) -2- (4-氯苯基磺酰氨基)-5，5，5-三氟戊酰胺(3. 444kg)、碳酸鉀 (2. 774kg)、四丁基溴化銨(0.484kg)和4-(溴甲基)-3-氟苯甲腈(2.092kg)加入反應(yīng) 器。然后加入乙酸乙酯(17. 2L)和水(3.44L)，將批料加熱至50°C，直至依據(jù)HPLC完成 (< 1，相對(duì)AP起始物質(zhì))。反應(yīng)通常在約15小時(shí)內(nèi)完成。將批料冷卻至15-20°C，并加 入水(6.88L)，分離底層水相。加入磷酸二氫鈉溶液(0.2M水溶液，20.66L)，分離底層水 相，測(cè)試pH，以確保其< 6. 5。(注意如果pH > 6. 5，則可以再加入20. 66L的0. 2M磷酸 二氫鈉溶液，并重復(fù)萃取和PH檢測(cè))。然后通過恒體積真空蒸餾更換溶劑。將反應(yīng)器置于 真空(270mmHg)下，將夾套加熱至75_80°C。一旦開始乙酸乙酯的蒸餾，則以相同的蒸餾收 集速率加入異丙醇(41. 34L)，并以恒定水平維持總批料體積。一旦加入所有的異丙醇，則 釋放真空，并加入水(13. 76L)。在水加入過程中將料溫保持于約50°C。然后將批料冷卻至15-20°C，并過濾。用50% (體積/體積)異丙醇水溶液(4X21. 6kg)洗滌濕濾餅，然后 于50°C真空干燥，得到為乳白色固體的標(biāo)題化合物(3. 648kg，78%收率)。1HNMR(300MHz， DMS0-d6) δ ppm 1. 42-1. 55 (m，1H) 1. 80-1. 93 (m，1H) 2. 00-2· 15 (m，2H) 4. 44 (dd，J = 7. 91, 1. 13Hz, 1H)4. 68 (d, J = 17. 71Hz，1H) 4. 99 (d，J = 17. 71Hz，1H) 7. 26 (s，1H) 7. 50 (s， 1H) 7. 63-7. 73 (m, 4H) 7. 78-7. 87 (m, 3H)。13CNMR (75MHz，DMS0_d6) ppm 22. 58-22. 97 (m, 1C)29. 96 (d, J = 29. 09Hz, 1C)41. 46 (d, J = 5. 49Hz, 1C) ,57. 86,110. 97, 111. 45 (d, J =10. 43Hz,1C),117. 58,119. 11(d, J = 25. 80Hz，1C)，124. 89，128. 53，128. 56，129. 21， 131. 17，131. 98，137. 44，138. 32，158. 99 (d，J = 247. 54Hz，2C)，170. 25。19FNMR, (CDCl3, 282MHz) δ :-116.5, -65.9。 IR(KBr) :3443，3342，3210，2955，2245，1699，1577，1476， 1163cm 1OC19H16ClF4N3O3S 的理論計(jì)算值理論值 C，47. 75 ；H, 3. 37 ；N, 8. 79 ；S, 6. 71 ；F, 15. 90 ；Cl, 7. 41。實(shí)測(cè)值:C,47. 95 ；H, 3. 31 ；N, 8. 67 ；S, 6. 72 ；F, 15. 59 ；Cl, 7. 49。步驟B. (R) -2- (4-氯_N_ (2_氟_4_ (N ‘-羥基甲脒基)芐基)苯基磺酰氨基)_5， 5,5-三氟戊酰胺 將(2R)-2_[[(4-氯苯基)磺?；鵠[(4_氰基_2_氟苯基)甲基]氨基]_5，5， 5-三氟戊酰胺(399g)和甲醇(1.6L)加入反應(yīng)器，接著加入羥胺(50%的水溶液，93mL， 1. 8當(dāng)量)。將混合物加熱至45-50°C，直至依據(jù)HPLC完成反應(yīng)(< 0. 15，相對(duì)AP起始物 質(zhì))。緩慢加入水(0.5L)，將料溫保持于30-5(TC。使料液靜置，直至開始結(jié)晶，然后加入 水(2.7L)。將料液冷卻至15-20°C，并過濾。用2 IMeOH 水(2L)洗滌濾餅，然后于 50°C真空干燥，得到為白色固體的標(biāo)題化合物(415g，96%收率)。1H匪R(300MHz，DMS0-d6) δ ppm 1.43-1.64(m，lH)l. 77-1. 93 (m，lH) 1.93-2. 17 (m，2H) 4.41 (dd，J = 8. 48，6.03Hz， 1H)4. 60 (d, J = 17. 14Hz, 1H)4. 94 (d, J = 16. 77Hz, 1H) 5. 81-5. 98 (m, 2H) 7. 19-7. 27 (m, 1H)7. 37-7. 47(m，2H)7. 52(d，J = 4. 14Hz，2H) 7. 64 (d，J = 8. 67，Hz，2H) 7. 85 (d，J = 8. 85Hz，2H)9. 71-9. 83(m,1H)。IR(KBr) :3491，3379，1680，1651，1592，1433，1343。C19H19ClF4N4O4S 的理論計(jì)算值理論值，C，44. 66 ；H, 3. 74 ；N, 10. 96 ；S, 6. 27 ；F, 14. 87 ；Cl, 6. 94。實(shí)測(cè)值:C，44. 90 ；H, 3. 91 ；N, 10. 91 ；S, 6. 41 ；F, 15. 21 ；Cl, 6. 95。步驟C. (2R)-2_[[(4-氯苯基)磺酰基][[2_ 氟 _4_ (1，2，4_ 噁二唑 _3_ 基)苯 基]甲基]氨基]_5，5，5-三氟戊酰胺
5，5-三氟戊酰胺(246g)加入反應(yīng)器，之后加入無水乙腈(509mL)、原甲酸三乙酯(120mL) 和三氟乙酸(7mL)。將溶液加熱至40-50°C，直至依據(jù)HPLC完成反應(yīng)(< 0. 15，相對(duì)AP起 始物質(zhì))。一次加入甲醇(1.48L)，接著加入水(1.034L)，將批料保持于45-5CTC。然后將 批料冷卻至15-20°C，并過濾。用2 6 5MeCN MeOH 水洗滌濾餅，于50_60°C在真 空下托盤干燥，得到為白色固體的標(biāo)題化合物(228g，90%收率)。1HNMR,(⑶Cl3，300MHz) δ :1. 40-1. 58 (m, 1H) 1. 75-1. 90 (m, 1H) 1. 92-2. 07 (m, 1H) 2. 10-2. 26 (m, 1H) 4. 37 (dd, J = 8. 67,6. 22Ηζ, 1Η)4· 48 (d, J = 15. 64Hz, 1Η)4· 64 (d, J = 15. 82Hz, 1H) 5. 54 (s，1H)6. 33 (s, 1H)7. 44-7. 54 (m, 2H) 7. 62(t, J = 7. 72Hz, 1H)7. 68-7. 76 (m，3H) 7. 85(dd, J = 7. 91，1. 51Hz, 1H)8. 76(s，1H)。13CNMR, (DMS0_d6，75MHz) δ : 170. 34，167. 75，165. 80，159. 64 (d，J = 244. 5Hz, 1C)，138. 19，137. 64，131. 25 (d, J = 3. 75Hz, 1C)，129. 31，129. 23，129. 05 (d, J = 14. 25Hz, 1C), 126. 74 (q, J = 274. 5Hz，1C)，126. 91，126. 80，123. 12 (d，J = 3.75Hz，lC)， 113. 7 (d，J = 24. OHz, 1C)，57. 92，41. 38 (d, J = 4. 5Hz, 1C)，30. 04 (d, J = 30. OHz, 1C)， 22. 90. 19FNMR, (CDCl3, 282MHz) δ :-116. 3，-66. 5。IR(KBr) :3454，334，3286，2952，1705， 1432，1325，1260，1167，1084,828cm_10 C20H17ClF4N4O4S 的理論計(jì)算值理論值，C, 46. 11 ；H, 3. 29 ；N，10. 71 ；S,6. 15 ；F, 14. 58 ；Cl, 6. 80。實(shí)測(cè)值:C，46. 06 ；H, 3. 24 ；N, 10. 71 ；S, 6. 25 ；F, 14. 60 ；Cl, 6. 88。
權(quán)利要求
一種化合物，所述化合物為(2R) 2 [[(4 氯苯基)磺?；鵠[[2 氟 4 (1，2，4 噁二唑 3 基)苯基]甲基]氨基] 5，5，5 三氟戊酰胺。
2.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的(2幻-2-[[(4-氯苯基)磺酰 基][[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺以及藥學(xué) 上可接受的佐劑、載體或稀釋劑。
3.一種用于治療或延遲阿爾茨海默病、淀粉樣腦血管病、輕度認(rèn)知障礙和/或唐氏綜 合癥發(fā)生的方法，所述方法包括給予其需要哺乳動(dòng)物治療有效量的(2R) -2-[ [ (4-氯苯基) 磺?；鵠[[2-氟-4-(l，2，4-噁二唑-3-基)苯基]甲基]氨基]-5，5，5-三氟戊酰胺。
4.權(quán)利要求3的方法，所述方法用于治療阿爾茨海默病。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型α-(N-磺酰氨基)乙酰胺化合物、其藥物組合物、其工藝以及治療阿爾茨海默病和其它與β-淀粉樣肽相關(guān)的病癥的方法。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101910141SQ200880124010
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者J·E·小斯塔雷特, K·W·吉爾曼, R·E·奧爾森 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司