專利名稱：代謝綜合癥的治療或預防劑、檢查方法、檢查藥、以及代謝綜合癥的治療藥的候選化合物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種代謝綜合癥的治療或預防劑、檢查方法、檢查藥、以及代謝綜合癥 的治療藥的候選化合物的篩選方法。
背景技術(shù)：
近年來，代謝綜合癥的患者以發(fā)達國家為中心急速增加。所謂的代謝綜合癥，是指 內(nèi)臟脂肪型肥胖(內(nèi)臟肥胖、腹部肥胖)與高血糖、高血壓以及高血脂中的兩種以上并發(fā)的 復合生活習慣病。由于相關(guān)的復合癥狀，代謝綜合癥是促進心臟病、腦卒中等的進程以及老 年人的健康壽命和Q0L顯著惡化的最大原因。在這樣的背景下，為了維持全社會的活力以 及減少醫(yī)療成本，代謝綜合癥的征服和抑制成為大的社會需求。作為聯(lián)系代謝綜合癥與動脈硬化、血管并發(fā)病、器官功能障礙發(fā)病之間的重要的 分子基礎(chǔ)，脂肪因子(adipokine)等具有多樣的生理活性的體液因子引起了人們的關(guān)注。 體液因子也在脂肪組織以外的各種外周器官中產(chǎn)生，一方面，這些外周器官通過體液因子 密切配合以維持生物體內(nèi)的動態(tài)平衡，另一方面，體液因子的平衡的破壞也是動脈硬化和 器官功能障礙發(fā)病的原因之一。作為體液因子家族之一，本發(fā)明人關(guān)注了腎上腺髓質(zhì)素 (AM)及其受體活性調(diào)節(jié)蛋白(RAMP)系統(tǒng)。腎上腺髓質(zhì)素(AM)是在以血管為代表的全身組織產(chǎn)生的肽。已經(jīng)明確了除了血 管擴張作用以外，AM還具有體液量調(diào)節(jié)作用、激素分泌調(diào)節(jié)作用、抗氧化作用、抗炎作用等 多樣的生理活性。至此，本發(fā)明人報道確認了 AM敲除小鼠的雜合子血壓上升，對心血管系 統(tǒng)施加損傷時的心肥大、纖維化、腎功能低下、動脈硬化惡化，與此相對，確認了 AM過量表 達的小鼠血壓反而降低，顯示出了對器官損傷和動脈硬化的抵抗力，因此，AM具有器官保護 作用、抗動脈硬化作用。(參照非專利文獻1-3)。另外，AM敲除小鼠的純合子由于血管發(fā)育不充分，在胎生中期因為彌漫性出血和 浮腫而死亡，據(jù)此，本發(fā)明人首次明確了 AM是血管成熟、血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化所必需的物質(zhì) (參照非專利文獻4)。而且，最近報道了血中AM濃度伴隨著肥胖而上升，與身體質(zhì)量指數(shù) 相關(guān)，以及AM也在脂肪組織中表達，該表達在肥胖狀態(tài)下亢進(參照非專利文獻5、6)。另 一方面，觀察到AM敲除小鼠隨著年齡的增長，伴隨著肥胖、耐糖量異常、以及生物體內(nèi)氧化 應(yīng)激亢進，器官損害也進展，暗示了 AM與代謝綜合癥之間的關(guān)聯(lián)性。非專利文獻1 :Shindo T et al. Circulation. 2000非專利文獻2:Imai Y. Shindo T et al. ATVB. 2002非專利文獻3 :Niu P, Shindo T et al. Circulation. 2004非專利文獻4 :Shindo T et al. Circulation. 2001非專利文獻 5:Kato J et al. Hypertens Res. 2002非專利文獻 6:Numbu T et al. Regul Pept. 2005。

發(fā)明內(nèi)容
但是，AM由于血中半衰期短，因此用作慢性疾病代謝綜合癥的治療藥存在很多制 約。鑒于以上事實，本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高在物體內(nèi)的穩(wěn)定性的代謝綜合 癥的治療或預防劑。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種代謝綜合癥的檢查方法和檢查藥、 以及代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法。本發(fā)明人在深入研究的過程中，關(guān)注了 AM的受體系統(tǒng)。AM受體本體是屬于G蛋白 偶聯(lián)型受體B族的稱作CRLR(降鈣素受體樣受體)的七次跨膜型受體。CRLR與一次跨膜型 蛋白RAMP(受體活性修飾蛋白)1、2、3亞型異構(gòu)體(寸〗y(tǒng) 7 ★ — A )中的任意一者 結(jié)合，形成異二聚體。本發(fā)明人通過適當改變結(jié)合在CRLR上的RAMP的亞型異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)可以控制AM受 體和配體的親和性，從而完成本發(fā)明。具體地本發(fā)明提供了以下內(nèi)容。(1)、一種代謝綜合癥的治療或預防劑，其中，該代謝綜合癥的治療或預防劑含有 作為有效成分的編碼受體活性修飾蛋白(RAMP)2的以下(a)到(d)中任意一個所述的DNA、 或者該DNA編碼的多肽，(a)具有序列號1所述的堿基序列的DNA ；(b)具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA ；(c)具有編碼在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/ 或插入后的氨基酸序列的堿基序列的DNA ；(d)由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA。(2)、一種代謝綜合癥的檢查方法，其中，該方法包括從受試者的細胞中提取DNA的提取步驟；擴增步驟，以提取的所述DNA為模板，使用能夠特異性擴增由序列號3所述的堿基 序列構(gòu)成的DNA或其表達控制區(qū)域的DNA的一部分或全部的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)；對擴增的DNA的堿基序列進行測序的測序步驟；比較測序后的堿基序列和序列號3所述的堿基序列的比較步驟。(3)、一種代謝綜合癥的檢查藥，其中，所述檢查藥的有效成分是能夠特異性擴增 由序列號3所述的堿基序列構(gòu)成的DNA或其表達控制區(qū)域的一部分或全部的引物、或者與 由序列號2所述的氨基酸序列構(gòu)成的多肽特異性結(jié)合的抗體或抗體片段。(4)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括使序列號2所述的氨基酸序列、或者具有在序列號2所述的氨基酸序列中將一個 或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽與被檢測物接觸的步驟；檢測所述多肽和所述被檢測物的結(jié)合的步驟。(5)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括對內(nèi)源性RAMP2基因變異或敲除的動物給與被檢測物的步驟；檢測代謝綜合癥的癥狀改善的步驟。(6)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所 述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；檢測所述DNA的表達量的變化的步驟。(7)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所 述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的 相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；檢測從所述DNA合成的蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)局部存在的變化的步驟。(8)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括使序列號6所述的氨基酸序列、或者具有在序列號6所述的氨基酸序列中將一個 或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽、可分解該多肽的酶、以及被檢 測物共存的步驟；測量在規(guī)定時間后的所述多肽的殘留量的步驟；比較殘留量的測量值與在不存在所述被檢測物下測量的殘留量的步驟。(9)、一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所 述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的 相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA、并且表達具有序列號4所述的堿基序列的DNA、具有能夠在 嚴緊條件下與序列號4所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號4所述的堿 基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；檢測由具有序列號5所述的堿基序列的DNA編碼的配體的刺激引起的細胞內(nèi)信號 傳導的誘導、或者由所述配體的刺激引起的G蛋白的活化的步驟。根據(jù)本發(fā)明，由于在體內(nèi)給與RAMP2或其功能等同物，因此可以有效地治療或預 防代謝綜合癥。而且，RAMP2或其功能等同物為膜蛋白，因此具有較長的血中半衰期，可以 提高在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。


圖1是從RAMP2+/-、由ob/ob小鼠提取的肝臟的HE染色照片(a)、以及油紅0染 色照片(b)；圖2是RAMP2+/-小鼠的大腿動脈及其周圍的切片照片(a)、以及大動脈局部放大 圖(b)；圖3是RAMP2+/-小鼠的大腿動脈切片照片；圖4是示出RAMP2+/-小鼠的大腿動脈中的各基因的表達量的圖表；圖5是RAMP2+/-小鼠的其它大腿部切片照片；圖6是示出RAMP2+/-小鼠的大腿動脈的血栓量的圖表；圖7是示出RAMP2+/-小鼠的大腿動脈的血管狹窄量的圖表；圖8是RAMP2+/-小鼠的其它大腿部切片照片；圖9是用于特異性敲除內(nèi)皮細胞的RAMP2基因的載體的簡圖；圖10是示出來自血管內(nèi)皮細胞特異性RAMP2敲除小鼠的細胞中的RAMP2基因的 表達量的圖表；
圖11是從血管內(nèi)皮細胞特異性RAMP2敲除小鼠提取的肺的染色照片(a)、以及其 局部放大圖(b)；圖12是從血管內(nèi)皮細胞特異性RAMP2敲除小鼠提取的腎臟的外觀照片(a)、截面 照片(b)、以及切片的染色照片(c)；圖13是圖12(c)的局部放大圖；圖14是用于特異性敲除心肌細胞的RAMP2的其它載體的簡圖；圖15是從心肌細胞特異性RAMP2敲除小鼠提取的心臟的外觀照片(a)、以及切片 的染色照片(b)；圖16是圖15 (b)的局部放大圖；圖17是示出圖15的心臟的心肌細胞的橫徑的圖表。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的一個實施方式進行說明?！粗委熕?、預防藥〉本發(fā)明的代謝綜合癥的治療或預防藥含有作為有效成分的編碼受體活性修飾蛋 白(RAMP) 2的以下(a)到(d)中任意一個所述的DNA、或者該DNA編碼的多肽，(a)具有序列號1所述的堿基序列的DNA ；(b)具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA ；(c)具有編碼在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/ 或插入后的氨基酸序列的堿基序列的DNA ；(d)由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA。另外，本說明書中的“代謝綜合癥”是指內(nèi)臟脂肪型肥胖(內(nèi)臟肥胖、腹部肥胖)與 高血糖、高血壓以及高血脂中的兩種以上并發(fā)的狀態(tài)，包括動脈硬化、缺血性疾病(心肌梗 塞、心絞痛、腦梗塞、動脈硬化閉塞癥)、血管功能不全、器官功能不全等的并發(fā)癥，或者設(shè)想 為這些并發(fā)癥的原因之一。本發(fā)明中的“DNA”可以為正義鏈或反義鏈(例如，可以作為探針使用)，其形狀可 以是單鏈或雙鏈。另外，可以是基因組DNA，也可以是cDNA或合成DNA。本發(fā)明的DNA的最優(yōu)選的形式是具有序列號1所述的堿基序列的DNA，但是本發(fā)明 的DNA還括具有代謝綜合癥的治療或預防效果的各種變異體或同源體。在此，“代謝綜合癥 的治療或預防效果”是指改善內(nèi)臟脂肪型肥胖(內(nèi)臟肥胖、腹部肥胖)、高血糖、高血壓、高 血脂中的至少一種癥狀或者抑制癥狀惡化的效果，是指統(tǒng)計學上有意義的改善或抑制的效^ o序列號1為編碼人RAMP2的細胞外區(qū)域的堿基序列。具有該序列號1所述的堿基 序列的DNA的變異體或同源體包括例如具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的堿基序列 雜交的堿基序列的DNA。在此，作為“嚴緊條件”，例如可列舉出這樣的條件，即，在通常的雜 交緩沖液中在40 70°C (優(yōu)選為60 65°C )下進行反應(yīng)，在鹽濃度為15 300mM(優(yōu)選 為15 60mM)的洗滌液中進行洗滌。另夕卜，已知序列號2構(gòu)成了人RAMP2蛋白的細胞外區(qū)域(Trends in Biochemical Science, Vol. 31，No. 11，pp. 631-638)。還包括具有編碼在該序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的堿基序列的DNA。在此，“一個 或多個”通常為50個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選為30個氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選為10個氨基酸以內(nèi)(例 如，5個氨基酸以內(nèi)、3個氨基酸以內(nèi)、1個氨基酸)。在維持活化肌特異性酪氨酸激酶的能 力的情況下，變異的氨基酸殘基優(yōu)選變異為保留氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的其它的氨基酸。例如， 按照氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，可以列舉出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸 (R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羥基的側(cè) 鏈的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和氨基的側(cè)鏈的氨 基酸(D、N、E、Q)、具有含堿性基團的側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族基團的側(cè)鏈的氨 基酸(H、F、Y、W)(括號內(nèi)均表示氨基酸的一字母標記)。對于具有通過相對于某氨基酸序列將一個或多個氨基酸殘基缺失、插入和/或被 其它氨基酸取代而修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，已知其生物學活性被保持(Mark，D.F. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81，5662-5666、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic AcidsResearch(1982) 10，6487—6500、 Wang, A. et al. ， Science 224, 1431 — 1433、 Dalbadie-McFarland, G. et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79,6409-6413)。而且，具有序列號1的堿基序列的DNA的變異體或同源體中還包括由與序列號1 所述的堿基序列具有較高相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA。這樣的DNA優(yōu)選與序列號1所述 的堿基序列具有90%以上、更優(yōu)選具有95%以上(96%以上、97%以上、98%以上、99%以 上)的相同性。氨基酸序列或堿基序列的相同性可以由Karl in-Altschul算法BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877，1993)確定?；谠撍惴?，開發(fā)了稱作 BLASTN或BLASTX 的程序(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 403-410,1990)。在基于BLAST根據(jù)BLASTN來解 析堿基序列時，參數(shù)例如為score = 100、wordlength = 12。另外，在基于BLAST根據(jù)BLASTX 來解析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score = 50、wordlength = 3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數(shù)。這些解析方法的具體方法是公知的(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov.) 0本發(fā)明獲取DNA的方法沒有特別的限定，可以列舉出通過從mRNA逆轉(zhuǎn)錄來得到 cDNA的方法(例如RT-PCR法)、從基因組DNA調(diào)整的方法、通過化學合成進行合成的方法、 從基因組DNA文庫或cDNA文庫分離的方法等公知的方法(例如參照日本特開平11-29599 號公報)?！炊嚯摹当景l(fā)明的治療或預防劑中使用的多肽由所述DNA編碼，例如具有序列號2所述的 氨基酸序列、或者具有在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/ 或插入后的氨基酸序列。上述多肽由于不具有人RAMP2蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域的全部，因此期待 具有高的可溶性，能夠用以下方法等容易地精制。另外，RAMP2的細胞外區(qū)域是用于與CRLR 結(jié)合形成復合體所必需的(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，上述多肽與給與了該多肽的細胞膜上的 CRLR形成復合體，發(fā)揮代謝綜合癥的治療或預防效果。本發(fā)明的DNA所編碼的多肽例如可以通過使用導入有含有所述DNA的表達載體的 轉(zhuǎn)化子來制備。即，首先在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，以合成該DNA編碼的蛋白質(zhì)(多 肽)。然后，通過從轉(zhuǎn)化子或培養(yǎng)液回收合成的蛋白質(zhì)，可以得到本發(fā)明的多肽。
對于轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)，為了大量且容易地獲得多肽，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化子的種類等從 公知的培養(yǎng)基適當選擇，并適當調(diào)整培養(yǎng)基的PH、培養(yǎng)時間等(例如參照日本特開平 11-29599 號公報)。作為多肽的分離方法和精制方法，沒有特別的限定，可以列舉出利用溶解度的 方法、利用分子量的差的方法、利用電荷的方法等公知的方法(例如參照日本特開平 11-29599號公報)。以下說明能在本發(fā)明中使用的載體和轉(zhuǎn)化子。(載體)可以通過在適當?shù)妮d體中插入上述DNA來制備表達載體。所謂的“適當?shù)妮d體”， 只要是在原核生物和/或真核生物的各種宿主中能夠保持復制或能夠自我增殖的載體即 可，可以根據(jù)使用的目的進行適當選擇。例如，想要大量獲得DNA時，可以選擇高復制載體， 想要獲得多肽時，可以選擇表達載體。作為具體例，沒有特別的限定，例如可以列舉出日本 特開平11-29599號公報中所述的公知的載體。(轉(zhuǎn)化子)可以通過在宿主中導入含有所述DNA的載體來制作轉(zhuǎn)化子。這樣的宿主只要是 適于被本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主即可，作為其具體例子沒有特別的限制，可以列舉出細 菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞等的公知的天然細胞或人工建立的細胞(參照日本特開平 11-29599 號公報)。載體的導入方法可以根據(jù)載體或宿主的種類等適當選擇。作為其具體例子沒有特 別的限制，可以列舉出原生質(zhì)法、感受態(tài)(competent)法等公知的方法(例如參照日本特開 平11-29599號公報)。本說明書中的“有效成分”是指用于得到代謝綜合癥所希望的治療或預防效果而 以必要的量所含有的成分，在不滿足所希望的水平之前只要不損害效果還可以含有其它成 分。另外，藥物組合物的給藥途徑可以是口服或非口服，可以適當設(shè)定?？诜o藥時，藥物組合物可以含有一般使用的添加劑，如粘合劑、包含劑、賦形劑、 潤滑劑、崩解劑、潤濕劑，并制劑化為片劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、膠囊劑等各種形狀。另外， 藥物組合物可以是內(nèi)服水劑、懸濁劑、乳劑、糖漿劑等液體狀態(tài)，也可以是使用時再溶解的 干燥狀態(tài)。非口服給藥時，藥物組合物可以含有穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑、等滲劑等的添加劑， 通常以被收容于在單位給藥量安瓿或多給藥量容器或軟管內(nèi)的狀態(tài)流通。另外，藥物組合 物還可以制劑成可在使用時用適當?shù)慕橘|(zhì)(無菌水等)再溶解的粉體?！礄z查方法、檢查藥〉所述DNA可以在針對代謝綜合癥的罹患的有無的檢查中利用。本發(fā)明所涉及的代 謝綜合癥的檢查方法包括提取步驟、擴增步驟、測序步驟、以及比較步驟。在提取步驟中，從受試者的細胞提取DNA。提取的方法使用常規(guī)的方法即可。在擴增步驟中，以提取的DNA為模板，使用能夠特異性擴增由序列號3所述的堿基 序列構(gòu)成的DNA或其表達控制區(qū)域的DNA的一部分或全部的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)。由 此，特異性擴增具有序列號3的一部分或全部的DNA。另外，序列號3為人RAMP2基因的全 堿基序列。在測序步驟中，測序被擴增的DNA的堿基序列，在比較步驟中，比較被測序的堿基
9序列和序列號3所述的堿基序列。堿基序列的測序和比較可根據(jù)常規(guī)方法進行。當比較的 結(jié)果顯示取得的DNA的堿基序列與序列號3不同時，可以判斷疑似者已經(jīng)或者容易罹患代 謝綜合癥。并且，本發(fā)明的檢查方法還可以包括判斷步驟，用于例如將在擴增步驟中被擴增 的DNA導入RAMP2變異或敲除的細胞、組織、器官或者個體中，并進一步判斷屬于代謝綜合 癥的癥狀是否被改善，或者惡化是否被抑制。由此，由于可以排除被擴增的DNA的堿基序列 和序列號1所述的堿基序列的差異為單一的多態(tài)性的情況等，因此可以提高檢查精度。(敲除體)通過變異或敲除所述DNA，可以制作非人轉(zhuǎn)化細胞、組織、器官以及個體。作為非人 動物沒有特別的限制，可以列舉出小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔子、山羊、豬、狗、貓等。非人轉(zhuǎn)化動物的制作方法例如如下所述。首先，將本發(fā)明的DNA、DNA的變異、或者 與DNA相同重組的DNA導入非人哺乳動物的受精卵中。然后，將該受精卵移植到雌性個體 子宮中發(fā)育，從而制作轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的DNA的非人轉(zhuǎn)化動物。更具體地，例如可以如下地制作非人轉(zhuǎn)化動物。首先，使通過給與激素而過量排卵 后的雌性個體與雄性個體交配。然后，由交配后第一天的雌性個體的輸卵管取出受精卵，用 顯微注射等方法將含有變異的DNA、或者可與DNA相同重組的DNA的載體導入受精卵中。然 后，用適當?shù)姆椒ㄅ囵B(yǎng)導入后的受精卵后，將生存的受精卵移植到假妊娠的雌性個體(假 親)的子宮中，生出新生仔。可以通過對由該新生仔的細胞提取的DNA進行DNA印跡解析 來確認該新生仔中DNA是否被轉(zhuǎn)化。除此之外，還可以在胚胎干細胞(ES細胞)株中進行基因?qū)牒瓦x擇后，制作對在 生殖系統(tǒng)有用的嵌合體動物，通過交配，制作非人轉(zhuǎn)化動物。其它檢查方法包括檢測具有來自于受試者的細胞中的序列號1所述的堿基序列 的DNA的表達量的檢測步驟、以及比較檢測的DNA的表達量與健康者的序列號1所述的DNA 的表達量的比較步驟。在此，"DNA的表達”包括轉(zhuǎn)錄水平(mRNA的表達)和翻譯水平(蛋白質(zhì)的表達)。 因此，表達量可以通過使用能夠特異性擴增具有序列號1所述的堿基序列的一部分或全部 的DNA的引物，通過進行定量RT-PCR而進行檢查，也可以通過使用特異性地結(jié)合由序列號 2所述的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的抗體或抗體片段，通過蛋白印跡解析等而進行檢測。根據(jù)該檢查方法，當比較的結(jié)果顯示受試者的DNA的表達量與健康者的DNA的表 達量有意義地不同時，可以判斷疑似者已經(jīng)或者容易罹患代謝綜合癥。本發(fā)明中的代謝綜合癥檢查藥含有作為有效成分的能夠特異性地擴增具有編號1 所述的堿基序列的一部分或全部序列的DNA的引物、或者上述抗體或抗體片段。〈篩選方法〉本發(fā)明涉及的代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法包括對內(nèi)源性RAMP2 基因敲除的動物給與被檢測物的步驟、以及檢測代謝綜合癥的癥狀改善的步驟。根據(jù)該篩選方法，由于被檢測出癥狀改善的被檢測物可以補充或代替RAMP2的功 能，因此可以指定為代謝綜合癥的治療藥的候選化合物。其它的篩選方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴 緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；以及檢 測所述DNA的表達量的變化的步驟?？梢酝茰y檢測出序列號1等的DNA的表達量的變化的被檢測物能夠強化或減弱 RAMP2的功能。具體地，由于DNA表達量增加的物質(zhì)能夠強化RAMP2的功能，因此推測被給 藥時能夠治療代謝綜合癥。另一方面，降低DNA表達量的物質(zhì)由于能夠減弱RAMP2的功能， 因此推測可以通過給與拮抗該物質(zhì)的物質(zhì)來治療代謝綜合癥。另外，在該方法和以下的方法中使用的細胞可以表達也可以不表達內(nèi)源性RAMP2。 但是，在可以將內(nèi)源性RAMP2造成的不明確的影響排除在外這一點上，優(yōu)選不表達內(nèi)源性 RAMP2的細胞(例如C0S7)。其它的篩選方法包括使具有序列號2所述的氨基酸序列、或者在序列號2所述的 氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽與被檢測 物接觸的步驟；以及檢測所述多肽和所述被檢測物的結(jié)合的步驟。根據(jù)該篩選方法，可以得到結(jié)合在序列號2等的多肽上的被檢測物。推測該被檢 測物可能與序列號2等的多肽參與的代謝綜合癥的治療路徑相關(guān)，可以治療代謝綜合癥。其它的篩選方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴 緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與堿序列號1所述的堿 基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；以及 檢測由所述DNA合成的蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)局部存在的變化的步驟。根據(jù)該篩選方法，可以得到使由序列號1等合成的蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)局部存在變化 的被檢測物。在此，在AM和受體結(jié)合后，RAMP2才與受體一起通過內(nèi)吞作用而攝入細胞內(nèi)， 如果沒有由外部向AM的刺激，只要產(chǎn)生存活，就可以持續(xù)在細胞膜上穩(wěn)定存在。另外，可以 推測即使通過內(nèi)吞作用被暫時攝入細胞內(nèi)，但其一部分再次返回到細胞膜再利用。因此得 到的被檢測物具有能夠提高RAMP2參與的代謝綜合癥的治療效果的可能性，可以期待作為 代謝綜合癥的治療藥。其它的篩選方法包括使序列號6所述的氨基酸序列、或者具有在序列號6所述 的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽、可分 解該多肽的酶、以及被檢測物共存的步驟；測量在規(guī)定時間后的所述多肽的殘留量的步驟； 以及比較殘留量的測量值與在不存在所述被檢測物下測量的殘留量的步驟。序列號6是人腎上腺髓質(zhì)素(AM)的全氨基酸序列。根據(jù)該篩選方法，可以得到能 夠期待改變具有序列號6所述的氨基酸序列等的多肽(AM等)的體內(nèi)穩(wěn)定性的物質(zhì)。該物 質(zhì)具有能夠提高RAMP2參與的代謝綜合癥的治療效果的可能性，可以期待作為代謝綜合癥 的治療藥。另外，該方法中使用的酶在上述多肽中可以為特異性或非特異性，例如可以是肽 鏈內(nèi)切酶。其它的篩選方法包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴 緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基 序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA、以及表達具有序列號4的DNA、具有能 夠在嚴緊條件下與序列號4所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號4所述 的堿基序列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟； 以及檢測基于具有序列號5所述的堿基序列的DNA所編碼的配體的刺激的細胞內(nèi)信號傳導的誘導、或者基于所述配體的刺激的G蛋白質(zhì)的活化的步驟。序列號4是構(gòu)成屬于G蛋白偶聯(lián)型受體class B的被稱作CRLR(降鈣素受體樣受 體)的七次跨膜型受體的氨基酸序列。并且，序列號5為人RAMP2基因的全堿基序列。并 且，序列號5是人腎上腺髓質(zhì)素(AM)基因的全堿基序列。根據(jù)該篩選方法，可以得到在RAMP2和CRLR被一起表達的細胞中誘導基于AM刺 激的細胞內(nèi)信號傳導、或者基于AM刺激活化G蛋白質(zhì)的物質(zhì)。該物質(zhì)通過細胞內(nèi)信號傳導 的誘導或G蛋白質(zhì)的活化，具有能夠提高基于RAMP2的代謝綜合癥治療效果的可能性，可以 期待作為代謝綜合癥的治療藥。另外，以細胞內(nèi)的cAMP、Ca、N0水平、PKA的活性水平、Akt、ERK、P38MAPK、P13K的 磷酸化水平等的變化(尤其是上升)為指標，可以檢測出細胞內(nèi)信號傳導的誘導。其它的篩選方法包括指定復合體所形成的結(jié)合口袋的立體結(jié)構(gòu)的步驟、以及基 于所述立體結(jié)構(gòu)通過所述復合體和所述結(jié)合口袋由已知的結(jié)構(gòu)文庫在計算機上選擇被預 測為可結(jié)合的物質(zhì)的步驟，其中所述復合體為具有在序列號2所述的氨基酸序列中將一個 或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽與具有在序列號5所述的氨基 酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽的復合體。根據(jù)該篩選方法，能夠?qū)⒛芙Y(jié)合在RAMP2和CRLR的復合體上的候選化合物由大量 的物質(zhì)大幅度減少。通過使用上述任意的篩選方法對減少后的候選化合物進一步進行限 制，具有能夠更加提高基于RAMP2的代謝綜合癥治療效果的可能性，能夠更進一步期待作 為代謝綜合癥的治療藥。另外，該虛擬(in silico)篩選方法的步驟本身根據(jù)常規(guī)方法進 行即可。實施例[試驗例1]RAMP2基因敲除小鼠的制作用以下步驟制作目標載體。S卩，在含有RMAP2的基因組DNA序列中，作為5’側(cè)的 相同序列，利用PCR合成含從RAMP2的外顯子1的上游直到內(nèi)含子1的途中的約3kb的序 列(5’同源臂)；作為中間的相同序列，利用PCR合成從內(nèi)含子1的途中直到外顯子4的下 游(loxP臂)；以及作為3’側(cè)的相同序列，利用PCR合成外顯子4的下游約3kb的序列(3， 同源臂)。然后，在pBluescript中，通過從5’側(cè)到3’側(cè)的方向以5’同源臂、loxP、loxP臂、 新霉素抗性基因的序列(pGk-neo)、loXP、3，同源臂的順序進行亞克隆，制作目標載體。艮口， 設(shè)計為兩個loxP位點夾著RMAP2的外顯子2 4。通過限制性內(nèi)切酶處理使得到的目標載體成為線狀后，用電穿孔導入到小鼠胚胎 干細胞中。將新霉素抗性作為指標，對發(fā)生了重組的胚胎干細胞克隆進行濃縮，再通過DNA 印跡雜交(Southernblotting)選擇相同重組胚胎干細胞。通過將選擇的胚胎干細胞顯微注射到小鼠囊胚中來制作嵌合小鼠。將該嵌合小鼠 與野生型小鼠交配，制作在基因組序列的一個RAMP2基因的內(nèi)含子1以及外顯子4的下游 插入有l(wèi)oxP位點的小鼠(雜flox小鼠)。通過將制作的雜flox小鼠與在CAG啟動子下將導入有表達Cre重組酶基因的基 因的小鼠(CAG Cre小鼠)交配，得到由loxP夾著的區(qū)域被除去的RAMP2雜敲除小鼠。這 些RAMP2雜敲除小鼠之間交配，得到RAMP2純敲除小鼠。
[試驗例2]與遺傳性肥胖小鼠的交配將在試驗例1中得到的RAMP2雜敲除小鼠(RAMP2+/-)與作為遺傳性肥胖的小鼠 的瘦素缺乏(ob/ob)小鼠交配，通過使子代小鼠(RAMP2+/-、wt/ob)返回與ob/ob小鼠交配 而制作孫代小鼠(RAMP2+/-、ob/ob)。ob/ob小鼠呈現(xiàn)肥胖癥狀，RAMP2+/-、ob/ob小鼠呈現(xiàn)更重度的肥胖癥狀。其結(jié)果 暗示了 PAMP2的表達減少是肥胖癥狀惡化的原因。[試驗例3]脂肪肝從ob/ob小鼠和RAMP2+/-、ob/ob小鼠提取肝臟，對其切片進行染色。由蘇木 素-伊紅(HE)進行染色的照片如圖1(a)所示，由油紅0進行染色的照片如圖1(b)所示。如圖1(a)所示，與ob/ob小鼠相比，在RAMP2+/-、ob/ob小鼠中在更廣的范圍內(nèi) 觀察到可被看作脂肪滴的白色斑點。該結(jié)果也與圖1(b)的結(jié)果一致，即，在圖1(b)中，在 RAMP2+/">ob/ob小鼠中可以得到基于脂肪滴的染色的紅色度比ob/ob小鼠強得多的圖像。 從這些結(jié)果可以顯示出PAMP2的表達減少是脂肪肝癥狀惡化的原因。[試驗例3]動脈硬化(形態(tài)學)通過在通過試驗例1得到的RAMP2雜敲除小鼠(RAMP2+/-)和野生型小鼠 (RAMP2+/+)的大腿動脈周圍留置聚乙烯管的滌綸套(cuff)四周時間來誘導由血管損傷帶 來的動脈硬化。用彈性vangieson染色對留置后的小鼠的大腿部滌綸套留置部的標本切片 進行染色后的低倍率照片如圖2(a)所示，大腿動脈部分的放大照片如圖2(b)所示。如圖2(a)所示，RAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比，平滑肌的增殖、炎癥細胞的浸 潤、細胞外基質(zhì)的增生亢進。另外，如圖2(b)所示，RAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比較，血 管內(nèi)腔側(cè)觀察到顯著的新生內(nèi)膜的形成。根據(jù)以上結(jié)果，RAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比， 從形態(tài)學的觀點考慮，可以判斷動脈硬化癥嚴重地惡化。(免疫學)為了在免疫學的觀點上也確認圖2的結(jié)果，研究了試驗例3中的留置后的小鼠的 大腿動脈中的ICAM1、VCAM1、MCP1以及PCNA蛋白質(zhì)的表達量。具體地，使用結(jié)合在各蛋白 質(zhì)上的單克隆抗體，通過常規(guī)方法對大腿動脈進行免疫染色，其結(jié)果如圖3(a) (d)所示。如圖3 (a) (d)所示，ICAM1、VCAM1、MCP1以及PCNA在RAMP2+/-小鼠中均比野 生型小鼠具有顯著多的表達量。由于ICAM1和VCAM1是伴隨著組織炎癥而表達亢進的粘附因子，因此，暗示了在 RAMP2+/-小鼠中產(chǎn)生比野生型小鼠更強的炎癥。該暗示可以由作為趨化因子的MCP1的表 達在RAMP2+/-小鼠中比在野生型小鼠中亢進得到證明。另外，由于PCNA為增殖細胞的標志，因此可以確認平滑肌的增殖在RAMP2+/-小鼠 中比在野生型小鼠中亢進。圖3(f)是留置后的小鼠的大腿動脈切片的二氫乙啶(DHE)染色圖，圖3(e)是由 p67phox抗體進行的大腿動脈切片的免疫染色圖。如圖3(f)所示，在RAMP2+/-小鼠中比在野生型小鼠中能夠范圍廣得多且強得 多地觀察到表示超氧化物的存在的紅色的染色。由此可以確認在病變部的氧化應(yīng)激在 RAMP2+/-小鼠中比在野生型小鼠中亢進。
13
另一方面，如圖3(e)所示，p67phoX在RAMP2+/-小鼠中比野生型小鼠具有顯著多 的表達量。根據(jù)p67phoX是與產(chǎn)生活性氧相關(guān)的NADPH氧化酶的亞基，暗示了 NADPH氧化 酶活性的亢進成為在病變部的氧化應(yīng)激的亢進的原因。根據(jù)以上結(jié)果，RAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比，從免疫學的觀點考慮，可以判斷 動脈硬化癥嚴重地惡化。(分子遺傳學)對所述留置前后的小鼠了考察了 RAMP2、RAMP3、CRLR以及AM的表達量。即，從留 置前后的小鼠提取大腿動脈附近的組織，以由該組織提取的全RNA為模板，使用各基因特 異的序列的引物進行定量實時PCR。具體的步驟依據(jù)常規(guī)方法。其結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，PAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比，留置前后的PAMP2的表達量有意 義地降低，另外，PAMP3和CRLR的表達量在統(tǒng)計上等同。由此，試驗例3中表示的結(jié)果顯示 了在PAMP2+/-小鼠中的動脈硬化癥與野生型小鼠相比惡化，這暗示了 PAMP2的表達量低。另外，在損傷前的狀態(tài)，AM的表達在PAMP2+/-小鼠中亢進。這暗示了即使在成體 中，如果RAMP2表達量降低，則作為配體的AM的表達也會隨著正反饋而上升。換言之，不僅 胎生期血管，即使在成體的血管中，RAMP2也顯示出傳導AM信號的中心作用。損傷后AM的表達量在野生型和RAMP2+/-小鼠之間無有意義的差，這可以認為因 為是即使是野生型在損傷后也引起AM的表達亢進。而且，在RAMP2+/-小鼠中，盡管在本底 信號中的AM的表達量亢進(或者盡管在損傷后與野生型小鼠的AM表達量之間無有意義的 差)，但是動脈硬化在RAMP2+/-小鼠中仍為重度，這可以認為是因為即使AM表達亢進，但是 由于RAMP2表達量低，所以由AM帶來的抗動脈硬化作用不能充分發(fā)揮。從以上的機制可以 推測僅AM表達量亢進不能發(fā)揮抗動脈硬化作用，只有使RAMP2表達量亢進才能夠發(fā)揮抗動 脈硬化作用。[試驗例4]血管閉塞(形態(tài)學)在通過試驗例1而得到的RAMP2雜敲除小鼠(RAMP2+/-)和野生型小鼠 (RAMP2+/+)的大腿動脈周圍涂布10%氯化鐵溶液，涂布24小時后提取各小鼠的大腿部。其 切片的HE染色照片如圖5所示。另外，利用提取的大腿動脈的橫切片(n = 5)來對血栓的 橫截面積進行定量。而且基于血栓的橫截面積和血管內(nèi)腔的全面積的比來計算血管的狹窄 率。血栓大小如圖6所示，血管的狹窄率如圖7所示。如圖5所示，RAMP2+/-小鼠與野生型小鼠相比，觀察到大的血栓的存在。該結(jié)果 與RAMP2+/-小鼠的血栓量(圖6)和血管的狹窄率(圖7)有意義地高于野生型小鼠一致。 這些結(jié)果暗示了從形態(tài)學的觀點考慮，RAMP2表達的降低使血栓癥惡化，促進了血管閉塞。(免疫學)考察了試驗例4中的大腿動脈的MCP-1和Mac-1蛋白質(zhì)的表達量。具體地，使用 結(jié)合在各蛋白質(zhì)上的抗體根據(jù)常規(guī)方法對大腿動脈進行免疫染色，其結(jié)果如圖8所示。如圖8所示，MCP-1和Mac-1蛋白質(zhì)在RAMP2+/-小鼠中均比野生型小鼠具有更大 范圍的表達量。由于MCP-1和Mac-1蛋白質(zhì)是伴隨著組織炎癥而表達亢進的趨化因子和粘 附因子，因此暗示了 RAMP2+/-小鼠在閉塞部位產(chǎn)生比野生型小鼠更強的炎癥。[試驗例5]條件性打靶
為了解釋AM-RAMP2系統(tǒng)的病理生理學意義，需要RAMP2敲除小鼠的純合子，但是 純合子(RAMP2-/-)是胎生致死。因此，使用Cre-loxP系統(tǒng)進行RAMP2基因的條件性打靶， 使RAMP2各細胞系列特異性地缺失。(血管內(nèi)皮細胞)具體地根據(jù)常規(guī)方法建立用Flox序列夾著RAMP2基因座的loxP小鼠。另一方面， 建立導入有血管內(nèi)皮細胞特異性表達的血管內(nèi)皮鈣粘附素(Cdh5)的啟動子序列位于Cre 序列的 5，側(cè)的載體(參照圖 9，Circulation Research. 2006 ；98 :897_904)的 Cre 小鼠。 通過使loxP小鼠和Cre小鼠交配，得到RAMP2被血管內(nèi)皮細胞特異性地敲除的小鼠。將建立的8 10周齡的成體小鼠麻醉后開腹，用含膠原酶的培養(yǎng)液對肝臟內(nèi)進行 灌流，原代培養(yǎng)分離培養(yǎng)后的竇狀(類洞)內(nèi)皮細胞。將由該細胞提取的全RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，使用具有特異性序列的引物對RAMP2進行定量實時PCR。其結(jié)果，如圖10所示，確認 了血管特異性RAMP2敲除小鼠與野生型小鼠相比只表達了遠遠少量(約20% )的RAMP2。另外，從血管特異性RAMP2敲除小鼠和野生型小鼠中提取肺，該肺的切片的HE染 色照片如圖11所示。如圖11(a)所示，在敲除小鼠中觀察到了較大的炎癥(圖11(a)中、 被圓包圍的部分)，如作為圖11(a)的局部放大圖的圖11(b)所示，也可以確認敲除小鼠與 野生型小鼠相比炎癥為重度。然后，從血管特異性RAMP2敲除小鼠和野生型小鼠中提取腎臟，該腎臟的外觀照 片如圖12(a)所示，截面照片如圖12(b)所示，切片的HE染色照片如圖12(c)所示，圖12(c) 的局部放大圖如圖13所示。敲除小鼠與野生型小鼠相比，全體膨脹(參照圖12(a))，確認 了腎小球硬化癥、大皰(bullae)的形成、腎積水癥等腎功能障礙(參照圖12(b)、(c)、圖 13)。根據(jù)圖10 13的結(jié)果，暗示了 RAMP2表達量的降低在各個器官中促進了損傷。(心肌細胞)建立導入有心肌細胞特異性表達的a -MHC的啟動子序列位于Cre序列的5’側(cè)、 且結(jié)合他莫昔芬的變異型雌激素受體(Mer)序列位于Cre的兩側(cè)的載體(參照圖14、Circ Res. 2001 ；89 ；20-25.)的Cre小鼠。除了使用該Cre小鼠這點不同外，按照與上述同樣的 步驟，得到RAMP2被心肌細胞特異性敲除的小鼠。向建立的小鼠腹腔內(nèi)給與他莫昔芬30mg/kg/日，開始給藥一周后提取心臟。該心 臟的外觀照片如圖15(a)所示，切片的Masson三色染色照片如圖15(b)所示。另外，利用心 臟的橫截組織切片測量心肌細胞的橫徑的結(jié)果如圖17所示。如圖15(a)、(b)所示，確認了 RAMP2心肌細胞特異性敲除小鼠與野生型小鼠相比，心臟肥大，該心臟肥大伴隨著心肌細胞 的肥大(圖17)。推測這些癥狀起因于RAMP2表達量的降低。圖16示出了圖15(b)的局部放大圖。如圖16所示，在RAMP2心肌細胞特異敲除 小鼠中觀察到纖維化硬化的病變部較多，另外，野生型小鼠未觀察到病變部位。推測這樣的 心臟的纖維化起因于RAMP2表達量的降低。工業(yè)上利用的可能性以上結(jié)果顯示了 AM的多樣的生理作用由RAMP2來規(guī)定，換言之，通過將RAMP2作 為靶標，可以人為地操作AM的生理作用，可以總括地治療或預防代謝綜合征。由于RAMP2 是低分子一次跨膜型蛋白質(zhì)，所以不僅血中半衰期長，在體內(nèi)的穩(wěn)定性良好，而且其結(jié)構(gòu)解析、可以人為控制該系統(tǒng)的低分子化合物激動劑的探索等也比較容易。因此RAMP2極其有 望作為治療靶標分子。
權(quán)利要求
一種代謝綜合癥的治療或預防劑，其中，該代謝綜合癥的治療或預防劑含有作為有效成分的編碼受體活性修飾蛋白(RAMP)2的以下(a)到(d)中任一個所述的DNA、或者該DNA編碼的多肽，(a)具有序列號1所述的堿基序列的DNA；(b)具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA；(c)具有編碼在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的堿基序列的DNA；(d)由與序列號1所述的堿基序列具有90％以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA。
2.一種代謝綜合癥的檢查方法，包括 從受試者的細胞中提取DNA的提取步驟；擴增步驟，以提取的所述DNA為模板，使用能夠特異性擴增由序列號3所述的堿基序列 構(gòu)成的DNA或其表達控制區(qū)域的DNA的一部分或全部的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)； 對擴增的DNA的堿基序列進行測序的測序步驟； 比較經(jīng)測序的堿基序列和序列號3所述的堿基序列的比較步驟。
3.一種代謝綜合癥的檢查藥，所述檢查藥的有效成分是能夠特異性擴增由序列號3所 述的堿基序列構(gòu)成的DNA或其表達控制區(qū)域的一部分或全部的引物、或者與由序列號2所 述的氨基酸序列構(gòu)成的多肽特異性結(jié)合的抗體或抗體片段。
4.一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，包括使序列號2所述的氨基酸序列、或者具有在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多 個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽與被檢測物接觸的步驟； 檢測所述多肽和所述被檢測物的結(jié)合的步驟。
5.一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，包括 對內(nèi)源性RAMP2基因變異或敲除的動物給與被檢測物的步驟； 檢測代謝綜合癥的癥狀改善的步驟。
6.一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的 堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同 性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟； 檢測所述DNA的表達量的變化的步驟。
7.一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，包括使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的 堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同 性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；檢測從所述DNA合成的蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)局部存在的變化的步驟。
8.一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，包括使序列號6所述的氨基酸序列、或者具有在序列號6所述的氨基酸序列中將一個或多 個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的多肽、可分解該多肽的酶、以及被檢測物 共存的步驟；測量在規(guī)定時間后的所述多肽的殘留量的步驟；比較殘留量的測量值與在不存在所述被檢測物下測量的殘留量的步驟。
9. 一種代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法，其中，該方法包括 使表達具有序列號1所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的 堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號1所述的堿基序列具有90%以上的相同 性的堿基序列構(gòu)成的DNA、并且表達具有序列號4所述的堿基序列的DNA、具有能夠在嚴緊 條件下與序列號4所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA、或者由與序列號4所述的 堿基序 列具有90%以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA的細胞與被檢測物接觸的步驟；檢測基于由具有序列號5所述的堿基序列的DNA編碼的配體的刺激的細胞內(nèi)信號傳導 的誘導、或者基于所述配體的刺激的G蛋白的活化的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可提高在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性的代謝綜合癥的治療或預防劑、檢查方法、檢查藥、以及代謝綜合癥的治療藥的候選化合物的篩選方法。該代謝綜合癥的治療或預防劑含有作為有效成分的編碼受體活性修飾蛋白(RAMP)2的以下(a)到(d)中任意一個所述的DNA、或者該DNA編碼的多肽(a)具有序列號1所述的堿基序列的DNA；(b)具有能夠在嚴緊條件下與序列號1所述的堿基序列雜交的堿基序列的DNA；(c)具有編碼在序列號2所述的氨基酸序列中將一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入后的氨基酸序列的堿基序列的DNA；(d)由與序列號1所述的堿基序列具有90％以上的相同性的堿基序列構(gòu)成的DNA。
文檔編號A61P1/00GK101873866SQ20088011747
公開日2010年10月27日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者新藤隆行 申請人:獨立行政法人科學技術(shù)振興機構(gòu)