專利名稱：：木酚素化合物用于抗皺治療的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請要求以2007年6月20日提交的韓國專利申請第10-2007-0060178號作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，其公開內(nèi)容通過引用的方式納入本文。本發(fā)明涉及從肉豆蔻(nutmeg)或肉豆蔻假種皮(arilofnutmeg)分離和純化的木酚素化合物用于減少皺紋的新用途，更詳細地說，本發(fā)明涉及一種新的抗皺組合物，包含作為有效成分的由通式1表示的法拉格林A(fragrinΑ)、由通式2表示的奧斯托百木酚素7(austobaiIignan7)、由通式3表示的利卡靈E(licarinE)以及通由式4表示的肉豆蔻衣木酚素(macelignan)，所述提取物或化合物用于減少皮膚皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分解的用途，以及通過使用上述提取物或化合物來抑制皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分離的方法。
背景技術(shù)：
：一般來說，皺紋是自然老化的一部分，它是由肌肉的長期反復(fù)收縮所造成的。皮膚老化在廣義上可分為內(nèi)因性老化即自然老化以及外因性老化。自然老化是由遺傳因素決定，很難調(diào)節(jié)，而外因性老化主要受環(huán)境因素影響，很容易進行人為調(diào)節(jié)。因此，一直進行著對外因性老化的預(yù)防研究，特別受到矚目的是防止外因性光老化導(dǎo)致的皺紋形成的研究，所述外因性光老化過程是由于長期UV輻射導(dǎo)致的(GilchrestB.A.,J.Am.Acad.Dermatol.，198921:610_613)。光老化即外因性皮膚老化的臨床特征是皮膚變得粗糙并且失去彈性、產(chǎn)生不規(guī)則的色素沉積并且深層皺紋增加。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)作為美容重要部位的臉面和頭部的皺紋形成，其受光老化的影響非常大，因此，作為抗皺化妝品開發(fā)的基礎(chǔ)研究，正在積極地進行對人皮膚或動物模型中的光老化和皺紋形成的研究。對于光老化和皺紋形成，目前報道了對諸如膠原(collagen)的合成和分解等的基礎(chǔ)生理代謝變化的研究結(jié)果(LavkerR.M.，BlackwellscienceInc.,1995123-135)。對皮膚老化產(chǎn)生影響的外部因子中包括風(fēng)、溫度、濕度、煙霧、環(huán)境污染和紫外線輻射，特別是把紫外線輻射引起的老化叫做“光老化”。當皮膚暴露于大量紫外線輻射時，皮膚中就會產(chǎn)生高濃度活性氧簇(reactiveoxygenspecies)，從而破壞皮膚的酶和非酶抗氧化防御體系。因此皮膚組織的主要蛋白成分——膠原會明顯減少而對膠原的減少產(chǎn)生重大影響的是基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)?；|(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)為一種參與細胞外基質(zhì)和基底膜分解的酶，并且已經(jīng)報道當紫外線照射時皮膚內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性增強以大量分解膠原，因此基質(zhì)金屬蛋白酶-1對膠原降解有重要作用，并且在皺紋形成中起非常重要的作用(SimG.S.,KimJ.Hetal.,Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,200520(1)40-45)。目前開發(fā)的一些抗皺活性成分存在的問題在于其不能用作化妝品原料，所述活性成分非常不穩(wěn)定性并且不容易到達皮膚，使得需要一種特別的穩(wěn)定系統(tǒng)和遞送系統(tǒng)，并且其減少皮膚皺紋的效果并不可觀。因此最近含類維生素A(retinoid)的護膚劑正逐漸受到關(guān)注。目前，類維生素A被用作解決光老化現(xiàn)象的一種手段，所述光老化現(xiàn)象例如日光產(chǎn)生的皺紋、皮膚增厚、皮膚下垂以及皮膚彈力減少。但是類維生素A的問題在于其是非常不穩(wěn)定的化合物，對紫外線、水分、熱和氧非常敏感使得其容易產(chǎn)生化學(xué)變化。為了解決這一問題，已經(jīng)集中進行了開發(fā)源于天然物的有效成分的研究。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，本發(fā)明的各位發(fā)明人已經(jīng)進行了長期的研究以找到一種天然化合物，其可有效用于減少皺紋，并且已經(jīng)找到了一種肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物，以及從所述肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物分離和純化得到的木酚素化合物——法拉格林A(fragrinA)、奧斯托百木酚素7(austobailignan7)、利卡靈E(licarinE)和肉豆蔻衣木酚素(macelignan)，上述物質(zhì)對減少皺紋有明顯效果，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物以及木酚素化合物——法拉格林A、奧斯托百木酚素7、利卡靈E以及肉豆蔻衣木酚素的一種全新用途，所述木酚素化合物分離自肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物。技術(shù)方案為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種抗皺用組合物，其含有一種作為有效成分的木酚素化合物，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。此外，本發(fā)明提供上述木酚素化合物用于制備減少皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分解的試劑的用途。此外，本發(fā)明提供一種減少皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分解的方法，包括將有效量的所述木酚素化合物給予或者涂抹于有需要的受試者。此外，本發(fā)明提供一種抗皺組合物，包含作為有效成分的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物。此外，本發(fā)明提供了肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物用于制備減少皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分解的試劑的用途。此外，本發(fā)明提供一種減少皺紋、誘導(dǎo)膠原合成和抑制膠原分解的方法，包括將有效量的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物給予或者涂抹于有需要的受試者。下面詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的特征在于提供了肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物以及木酚素化合物——由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素的全新用途，所述木酚素化合物分離和純化自肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物。[通式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>[通式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>肉豆蔻是熱帶地域種植的多年生植物肉豆蔻樹(Myristicafragrans)的果實，其在很久以前即開始作為香料使用。此外，肉豆蔻的假種皮為所述肉豆蔻樹的皮區(qū)域，并且被報道具有抑制幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)成長(InVivo.,17；541-4，2003)、激活肝的解毒作用(FoodChem.Toxicol.，31;517-211993)、皮膚疣的化學(xué)預(yù)防作用(CancerLett.,56；59-63，1991)、消炎活性(Jpn.J.Pharmacol.,49；155-63，1999)的作用。但是到現(xiàn)在為止對肉豆蔻或肉豆蔻假種皮的抗皺效果還沒有報告。本發(fā)明的木酚素化合物可利用常規(guī)提取和色譜方法從肉豆蔻或肉豆蔻假種皮分離和純化得到。從肉豆蔻或肉豆蔻假種皮進行的提取可以單獨或混合使用如下物質(zhì)來完成，例如水、有機溶劑如C1-C6有機溶劑(乙醇、甲醇、丙醇、異丙醇和丁醇)、丙酮、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、環(huán)己烷、石油醚、二乙醚、苯等。優(yōu)選使用水或C1-C6有機溶劑進行提取。提取時肉豆蔻或肉豆蔻假種皮與溶劑的比例雖然沒有特別規(guī)定，但可以向肉豆蔻或肉豆蔻假種皮粉末添加量為所述粉末重量1-20倍的溶劑。優(yōu)選地，為了提高提取效率，向所述粉末中添加量為該粉末重量2-5倍的溶劑。提取過程優(yōu)選地在常壓室溫條件下進行為宜，并且提取時間為6-96小時，優(yōu)選36到72小時，但是提取時間會根據(jù)提取溫度而變化。另外在提取過程中，可使用攪拌機(shaker)來進一步提高提取效率。在用于所述提取過程中之前，可將肉豆蔻或肉豆蔻假種皮在收獲后洗滌或洗滌后干燥。所述干燥過程可以采用曬干、陰干、熱風(fēng)烘干以及自然干燥中的任何一種來進行。為了增加提取效率，肉豆蔻或肉豆蔻的假種皮可以在用粉碎機粉碎后再使用。肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物的制備是通過例如如下方式進行的，即將干燥的肉豆蔻或肉豆蔻假種皮倒入提取裝置中，提取溶劑的重量為其重量的4-10倍，將其置于提取裝置中1-5天，用濃縮機濃縮以及干燥，最終可以得到提取物。利用硅膠柱色譜(silicagelcolumnchromatography)對上文得到的提取物進行處理以獲取有極性的級分，并且對特定的分離級分進行反相柱色譜(reversephasecolumnchromatography)以及高效液相色譜(HPLC)處理，從而從所述級分中分離出法拉格林Α、奧斯托百木酚素7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素。所述法拉格林A、奧斯托百木酚素7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素全部分離和純化自肉豆蔻或肉豆蔻假種皮。但是，用于活性成分的提取以及分離的方法不受限于上述方法。上述本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百木酚素7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素濃度依賴地抑制紫外線照射導(dǎo)致的人體皮膚成纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的生成，并且增加I型前膠原(type-Iprocollagen)的合成。另外，當用本發(fā)明的組合物處理經(jīng)UV輻射的無毛小鼠時，所述小鼠中膠原的合成同樣增加。因此，本發(fā)明提供一種抗皺組合物，包含作為有效成分的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及分離和純化自肉豆蔻和肉豆蔻假種皮的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素。所述組合物可以為化妝品組合物或食品組合物。所述化妝品組合物可通過本領(lǐng)域中公知的方法制備，它不僅包含肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及分離和純化自肉豆蔻和肉豆蔻假種皮的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素，還包含一種或多種常規(guī)賦形劑和添加劑。更詳細地說，本發(fā)明的化妝品組合物含有作為有效成分的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及分離和純化自肉豆蔻和肉豆蔻假種皮的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素，并且可與皮膚學(xué)上可使用的賦形劑一起制備成基礎(chǔ)化妝品(化妝水、化妝膏精華液、潔面乳如泡沫潔面乳和潔面水、面膜、按摩油、按摩膏)、調(diào)色化妝品(粉底、口紅、睫毛膏、隔離霜)、護發(fā)產(chǎn)品(洗發(fā)水、潤絲、護發(fā)素、發(fā)膠)以及香皂等形式。所述賦形劑可包括但不限于皮膚柔軟劑、皮膚浸透增強劑、著色劑、芳香劑、乳化劑、稠化劑或溶齊U。此外，還可以添加香料、色素、殺菌劑、防氧化劑、防腐劑以及保濕劑等，可以添加用于提高物理性質(zhì)的增稠劑、無機鹽類或合成聚合物。比如，在制備含有肉豆蔻提取物肉、豆蔻假種皮提取物以及從上述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素的潔面乳和香皂時，它們可以通過向普通潔面乳或香皂基質(zhì)中添加本發(fā)明提取物或木酚素化合物很容易地來制備。在制備化妝膏時，它可以通過向常規(guī)水包油化妝膏基質(zhì)中添加本發(fā)明提取物的提取物或木酚素化合物來制備。此外，可添加香料、螯合劑、色素、防氧化劑、防腐劑等，并且可以添加用于提高物理性質(zhì)的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)或合成聚合物。本發(fā)明的的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可被適宜地包含在化妝品組合物形式中，其含量范圍是總制劑重量的0.005重量％到10重量％，優(yōu)選是0.01到5重量％。如果所加入的組合物的量在0.005重量％以下，則它的抗皺作用很低，如果其加入量為10重量％以上，則其在抗皺作用方面沒有顯著差異，而僅僅是增加了它們的添加量。另外，本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可以以食品組合物形式提供。本發(fā)明的食品組合物包括功能性食品(functionalfood)、營養(yǎng)補品(nutritionalsupplement)、保健食品(healthfood)以及食品添加劑(foodadditives)等所有形式。前述類型的食品組合物可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備成多種形式。比如，作為保健食品，可以把本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林Α、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素制備成供飲用的茶、果汁和飲料，或者將其制備成用于攝取的顆粒、膠囊或粉末。此外，本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可以與已知有減少和預(yù)防皺紋效果的常規(guī)活性成分混合在一起以制備組合物。此外，為制備功能性食品，可以將本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素添加到飲料(包括酒精飲料)、水果以及其加工食品(例如罐裝水果、瓶裝水果、果醬、千搗醬等)、魚類、肉類以及其加工食品(例如火腿、香腸、咸牛肉等)、面包類以及面條類(例如日本面條、小麥面條、中國面條、意大利實心面條、意大利通心面等)、果汁、各種飲料、小甜餅、麥芽糖、乳制品(例如黃油、干酪等)、植物油、人造黃油、植物蛋白、蒸煮食品、冷凍食品、各種調(diào)味料(例如豆醬、醬油、芥末醬等)等以制備組合物。另外，本發(fā)明的提取物或木酚素化合物以食品添加劑形式使用時可以被制備為粉末或濃縮液形式。本發(fā)明的食品組合物中含有的本發(fā)明提取物或木酚素化合物的濃度優(yōu)選地占整個食品重量的0.0001-50重量％。另外，本發(fā)明提供了肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素用于制備減少皺紋的試劑的用途。此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素用于制備誘導(dǎo)膠原合成或抑制膠原分解的試劑的用途。此外，本發(fā)明還提供一種減少皺紋的方法，所述方法包括將有效量的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素給予或涂抹于有需要的受試者。本發(fā)明還提供一種用于誘導(dǎo)膠原合成或抑制膠原分解的方法，所述方法包括將有效量的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素給予或涂抹于有需要的受試者。這里，肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素在上文中已被充分地描述，而本文所用的“有效量”是指肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可以在所述受試者中產(chǎn)生減少皺紋、誘導(dǎo)膠原合成或抑制膠原分解的效果的給藥量，并且所述“受試者”是指包括哺乳動物特別是人類在內(nèi)的動物。所述受試者可以是需要抗皺治療的患者。本發(fā)明肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可以一直給藥，直到獲得上面所記載效果中的所需效果為止，而且可以通過本領(lǐng)域中公知的經(jīng)口或腸胃外給藥。有益效果如上文所述，本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素抑制皺紋形成中的重要因素一膠原分解酶-1(MMP-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-1)，以此遏制膠原的分解和激活新原膠原(I型原膠原)的生成，并且具有提高的抑制由光老化導(dǎo)致的皺紋的效果。從而本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從肉豆蔻和肉豆蔻假種皮分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可以用于治療或預(yù)防光老化引發(fā)的皺紋。圖1示出了從肉豆蔻假種皮分離法拉格林A以及奧斯特百木酚素7的工藝圖。圖2是示出了肉豆蔻假種皮的75%甲醇提取物抑制膠原分解酶-1活性的圖。圖3是示出了法拉格林A抑制膠原分解酶-1活性的圖。圖4是示出了奧斯托百木酚素7抑制膠原分解酶-1活性的圖。圖5示出了從肉豆蔻假種皮分離利卡靈E的工藝圖。圖6示出了從肉豆蔻分離肉豆蔻衣木酚素的工藝圖。圖7是確證了把本發(fā)明提取物以及木酚素化合物涂抹在皮膚時的抗皺效果的照片。圖8是確證了把本發(fā)明提取物以及木酚素化合物經(jīng)口給藥時的抗皺效果的照片。具體實施例方式下面參照實施例對本發(fā)明進行詳細說明。但應(yīng)理解，下面的實施例只是處于舉例說明的目的，而不應(yīng)被理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例1從肉豆蔻假種皮分離和純化法拉格林A以及奧斯托百木酚素7并且確定其結(jié)構(gòu)<!-!>法拉格林A以及奧斯托百木酚素7的分離和純化將IOOg干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻假種皮加入到400ml75%甲醇中，并且在室溫狀態(tài)下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻假種皮的75%甲醇提取物13.26g。把上述提取溶液用乙酸乙酯、丁醇和水進行分級分離。將乙酸乙酯級分(10.29g)利用硅膠柱色譜以氯仿與乙酸乙酯(9Kvv))的混合溶液洗脫以得到級分V(0.52g)和級分VI(0.19g)。對級分V以氯仿、乙酸乙酯和丙酮(240.31(ν/ν/ν))的混合溶劑進行柱色譜得到了級分V-C(0.05g)。之后利用循環(huán)高效液相色譜以100%甲醇對級分V-C進行洗脫得到了單一物質(zhì)級分V-C-2法拉格林A(0.03g)。對級分VI以氯仿、乙酸乙酯和丙酮的(3012(ν/ν/ν))混合溶劑進行柱色譜得到了級分VI-B(0.52g)。之后利用循環(huán)高效液相色譜以100%甲醇對級分VI-B進行洗脫得到了單一物質(zhì)級分VI-B-5奧斯特百木酚素7(0.Ollg)。圖1中圖示了上述分離工藝。<1-2>單一物質(zhì)V-C-2的結(jié)構(gòu)分析為了分析上述分離的單一物質(zhì)V-C-2的結(jié)構(gòu)，分別在600MHz和150MHz對該物質(zhì)的1H-NMR光譜和13C-NMR光譜(溶劑CDC13)進行測量。1H-NMR和13C-NMR的綜合分析結(jié)果總結(jié)在下表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>為了以13C-NMR光譜和1H-NMR光譜的結(jié)果為基礎(chǔ)測定1H-1H的相關(guān)關(guān)系(correlation)和1H-13C的相關(guān)關(guān)系，測定了1H-1HCOSY光譜和1H-13CHMBC光譜。在FAB/MS中在m/z358觀測到單一物質(zhì)的[M]+，表明了分子量為358且分子式為C21H2605。根據(jù)上面的1H-WRj3C-WRjH-1HCOSY^1H-13CHMBC以及FAB/MS的結(jié)果和之前出版的參考文獻(Chem.Pharm.Bull.，35，2，668，1987)，可以確認分離的單一物質(zhì)是用通式1表示的法拉格林A:2-(4_烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基)-1-(4_羥基-3-甲氧基苯基)-丙(2-(4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxy)_1_(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propane))。[通式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><1-3>單一物質(zhì)VI-B-5的結(jié)構(gòu)分析為了確定上述分離的單一物質(zhì)VI-B-5的結(jié)構(gòu)，分別在600MHz和150MHz對所述單一物質(zhì)的1H-WR光譜和13C-WR光譜(溶劑⑶Cl3)進行測量。1H-WR和13C-WR的綜合分析結(jié)果總結(jié)在下表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>為了以13C-NMR光譜和1H-NMR光譜的結(jié)果為基礎(chǔ)測定1H-1H的相關(guān)關(guān)系和1H-13C的相關(guān)關(guān)系，測定了1H-1HCOSY光譜和1H-13CHMBC光譜。在FAB/MS中在m/z342上觀測所分離的單一物質(zhì)的[M]+，表明了分子量為342且分子式為C2。H2205。根據(jù)上面的1H-WRa13C-WR^H-1H,COSY1H-13C,HMBC以及FAB/MS的結(jié)果和之前出版的參考文獻(Aust.J.Chem.，28，81，1975)，可以確認分離的單一物質(zhì)是用通式2表示的奧斯托百木酚素7[通式2]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>實施例2細胞增殖效果為了檢查細胞增殖效果，從而證明減少皮膚皺紋效果，使用成纖維細胞進行了MTT測定[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物還原法]。首先把人體正常成纖維細胞(humannormalfibroblasts)鋪在96孔板上，濃度為2XIO5個細胞/孔，并且在含有10%FBS(牛胎血清)的DMEM培養(yǎng)基中以37°C、5%CO2的條件原代培養(yǎng)24小時。經(jīng)原代培養(yǎng)后，將所述細胞用各種濃度的本發(fā)明樣品處理。然后用沒有血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，并且將所述細胞傳代培養(yǎng)48小時。傳代培養(yǎng)步驟后，向培養(yǎng)基添加MTT溶液ΙΟΟμΙ。然后將所得溶液放置4個小時，之后去除培養(yǎng)基。向每個孔分別添加二甲亞砜溶液100μ1并且攪拌20分鐘，之后利用微板讀數(shù)器在540nm測定了每孔的吸光度。Hii式t施徹丨ι格林Α及奧其斤特百木酚素7mmmmMm按上述實施例2的方法，測定了肉豆蔻假種皮的75%甲醇提取物和從其分離和純化得到的法拉格林A和奧斯特百木酚素7的細胞增殖效果。在上述MTT測定中，使用未經(jīng)所述樣品處理的培養(yǎng)基作為對照組并且測量其吸光度，分析結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表3所示，本發(fā)明肉豆蔻假種皮提取物、法拉格林A以及奧斯特百木酚素7與對照組相比具有優(yōu)秀的細胞增殖效果。實施例3測丨定紫外光照射的成纖維細胞,中的某質(zhì)金屬蛋白IS-I(MMP-I)把成纖維細胞以2XIO5細胞/ml的濃度在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直到達到約85%匯合為止。在照射紫外線(UV)之前，去除培養(yǎng)基，并且用PBS清洗細胞以除去血清成分，然后以20J/cm2劑量的紫外線照射。在將成纖維細胞用紫外線照射后，將所述細胞用每種所述樣品進行處理并且用沒有添加血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。為了測定基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的表達水平，利用了蛋白質(zhì)印跡，并且使用布拉德福(bradford)法定量其中含有所培養(yǎng)的成纖維細胞的培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)總量。把提取的蛋白質(zhì)在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，之后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將所述膜用5%脫脂奶粉在常溫下封閉1小時以防止其被其他未知蛋白所污染。把基質(zhì)金屬蛋白酶-1的一抗體以11000的比例稀釋到封閉溶液中，并且使之在常溫下與膜反應(yīng)2小時。與一抗體反應(yīng)后，將所述膜用Tris緩沖鹽水Tween20(TBST)振蕩洗滌三次，每次10分鐘。將識別基質(zhì)金屬蛋白酶-1的一抗的二抗以11000比例稀釋到5%脫脂奶粉中，并且使之在常溫下與所述膜反應(yīng)1小時。然后，將所述膜用Tris緩沖鹽水Tween20振蕩洗滌三次，每次10分鐘，方式與一抗反應(yīng)的方式相同，之后利用化學(xué)發(fā)光法進行顯像。泖Ii式種仿丨丨2:#_百胃髓緒魏處麵議Φ·冊S酶-I(MMP-I)的表汰水平的測量為了檢測肉豆蔻假種皮的75%甲醇提取物對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的活性抑制效果，利用上述實施例3的蛋白質(zhì)印跡測定法分析了基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的表達水平。這里相比的對象為用不同濃度(3，5及10yg/ml)的肉豆蔻假種皮提取物處理的實驗組、經(jīng)0.01%二甲亞砜處理的陰性對照組以及經(jīng)0.01%二甲亞砜和20J/cm2紫外線處理的陽性對照組。其結(jié)果如圖2所示，肉豆蔻假種皮的提取物以劑量依賴方式抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且與20J/cm2紫外線處理的陽性對照組相比，每個處理濃度下均顯示出了顯著差異(**，ρ<0.01;*，ρ<0.05)。比如當分別以lOyg/ml處理時，作為比較化合物的維生素C對基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達抑制與陰性對照組相比高出20%，而對于本發(fā)明的肉豆蔻假種皮提取物而言，抑制活性則高出60%。因此，本發(fā)明人確認了本發(fā)明的肉豆蔻假種皮提取物表現(xiàn)出了與公知抗老化化合物——維生素C相似的活性，從而可有效地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且本發(fā)明的肉豆蔻假種皮提取物也顯示出了對抗衰老標記基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的抑制作用。測試實施例3用法拉格林A處理時細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量為了測定法拉格林A對基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-I)抑制活性，這里相比的對象為用不同濃度(3，5及10μM)法拉格林A處理的實驗組、經(jīng)0.01%二甲亞砜處理的陰性對照組以及經(jīng)0.01%二甲亞砜和20J/cm2紫外線處理的陽性對照組。其結(jié)果如圖3所示，法拉格林A以劑量依賴方式抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且與20J/cm2紫外線處理的陽性對照組相比，每個處理濃度下均顯示出了顯著差異(**，ρ<0.01;*，ρ<0.05)。比如當分別以10μM處理時，作為比較化合物的維生素C對基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達抑制與陰性對照組相比高出20%，而對于本發(fā)明的肉豆蔻假種皮提取物而言，抑制活性則高出65%。因此，本發(fā)明人確認了本發(fā)明的法拉格林A表現(xiàn)出了與公知抗老化化合物——維生素C相似的活性，從而可有效地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且本發(fā)明的法拉格林A也顯示出了對抗衰老標記基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的抑制作用。_0]Illi式實施例4用奧Iffffi百木酚素7處理時細胞,中某質(zhì)金屬蛋白_-1(MMP-I)表汰水平的測量為了測定奧斯托百木酚素7對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)抑制活性，這里相比的對象為用不同濃度(3，5及10μM)奧斯托百木酚素7處理的實驗組、經(jīng)0.01%二甲亞砜處理的陰性對照組以及經(jīng)0.01%二甲亞砜和20J/cm2紫外線處理的陽性對照組。其結(jié)果如圖4所示，奧斯托百木酚素7以劑量依賴方式抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且與20J/cm2的紫外線處理的陽性對照組相比，每個處理濃度下均顯示出了顯著差異(**，p<0.01;*，p<0.05)。比如當分別以處理10μM處理時，作為比較化合物的維生素C對基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達抑制與陰性對照組相比高出20%，而對于本發(fā)明的奧斯托百木酚素7而言，抑制活性則高出約65%。因此，本發(fā)明人確認了本發(fā)明的奧斯托百木酚素7表現(xiàn)出了與公知抗老化化合物質(zhì)——維生素C相似的活性，從而可有效地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達，并且本發(fā)明的奧斯托百木酚素7也顯示出了對抗衰老標記基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的抑制作用。實施例4用肉豆蔻假種皮乙醇提取物處理時細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表汰水平的測量將IOOg干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻假種皮添加至400ml乙醇中，并且在室溫下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻假種皮乙醇提取物(13.98g)。對上述乙醇提取物，以與上述實施例3相同的方式進行對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量，結(jié)果是與用20J/cm2紫外線處理的陽性對照組相比，以10μg/Ml乙醇提取物進行處理的組的基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達水平減少了65%。實施例5用肉豆蔻假種皮己烷提取物處理時細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量將IOOg干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻假種皮添加至400ml己烷中，并且在室溫下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻假種皮己烷提取物(16.73g)。對上述己烷提取物，以與上述實施例3相同的方式進行對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量，結(jié)果是與用20J/cm2紫外線處理的陽性對照組相比，以10μg/Ml己烷提取物進行處理的組的基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達減少了55%。^MM6到丨9m^^'Mmmm^itPiJkmmm^mmmik利用上述實施例4的肉豆蔻假種皮乙醇提取物制備了具有實施例6-9組成成分的化妝水。以10.0重量％、1.0重量％、0.1重量％和0.01重量％的濃度將所述提取物溶解于乙醇中，用乙醇調(diào)節(jié)重量。然后均勻地攪拌所述溶液(見表4)。表4成分實施例6實施例7實施例8實施例9^ι.乙醇提取物(%)IoToΓοOοΓο2.丙三醇(％)27ο27ο27ο27ο<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>t施徹丨10到13制各含有肉百蔻假種皮提取物的化妝膏利用上述實施例4的肉豆蔻假種皮乙醇提取物制備了具有實施例10-13組成成分的化妝膏。首先把物質(zhì)(2)_(6)在75-80°C下溶解，再把物質(zhì)(7)-(10)以相同溫度條件溶解。把物質(zhì)(7)_(10)乳化到物質(zhì)(2)-(6)中，然后將所述粗提取物以10.0wt%、1.0wt%、0.1襯％和0.01wt%的濃度分別加入，并且攪拌所述化妝膏。最后放入香料并且加入純凈水補足余量(見表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例14到17制備含有法拉格林A的化妝水利用本發(fā)明的法拉格林A制備了具有實施例14-17組成成分的化妝水。把法拉格林A以5.0wt%、0.lwt%,0.00lwt%4種濃度溶解到水中，再與磷酸溶液混合。將所述溶液與乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加的香料和防腐劑混合，然后用水調(diào)節(jié)重量。然后均勻地攪拌所述溶液(見表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例18到21制備含有法拉格林A的化妝膏利用本發(fā)明的法拉格林A制備了具有實施例18-21組成成分的化妝膏。首先在75-80°C下，溶解物質(zhì)(2)-(6)并且在相同溫度下溶解物質(zhì)(7)-(10)。把物質(zhì)(7)-(10)乳化到物質(zhì)(2)-(6)中，然后把法拉格林A以5.0wt%、0.lwt%、0.01%和0.001%的濃度分別加入，并攪拌所述乳液。最后，添加香料并且用純水補足余量(見表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>^WM22至II25制各含有奧其/fffi百木酚素7的仆,妝水利用本發(fā)明的奧斯托百木酚素7制備了具有實施例22-25組成成分的化妝水。把奧斯托百木酚素7以5.0wt%,0.lwt%、0.01wt%禾口0.001wt%4種濃度分別溶解到水中，再與磷酸溶液混合。將所述溶液與乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加香料和防腐劑混合，然后用水調(diào)節(jié)重量。然后均勻地攪拌所述溶液(見表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>20<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例26到29制各含有奧斯ffi百木酚素7的化妝膏利用本發(fā)明的奧斯托百木酚素7制備了具有實施例26-29組成成分的化妝膏。首先在75-80°C下溶解物質(zhì)(2)-(6)并且在相同溫度下溶解物質(zhì)(7)-(10)。把物質(zhì)(7)-(10)乳化到物質(zhì)(2)-(6)，然后把奧斯托百木酚素7以5.0wt%,0.lwt%,0.01%和0.001%的濃度分別加入并且攪拌所述乳液。最后添加香料并且用純凈水補足余量(見表9)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>測試實施例4含有肉豆蔻假種皮提取物的組合物的膠原合成體內(nèi)測定對無毛小鼠(hairlessmouse)每天1次照射20J/cm2紫外線，持續(xù)4周，然后把100ml實施例6-13的含肉豆蔻假種皮提取物的組合物涂抹在小鼠背部。然后對小鼠進行活組織切片檢查，從組織學(xué)上測定了所述活組織檢查組織中的膠原形成。在本申請中，對新生成的膠原量的測定是通過先將所述組織免疫染色，然后對經(jīng)免疫染色的組織進行影像分析來進行。測定結(jié)果見表10。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表10所示，肉豆蔻假種皮乙醇提取物含量的增加導(dǎo)致膠原合成量的增加，與化妝水相比化妝膏中提取物活性更高。人們相信這是因為化妝膏在皮膚中的保留高于化妝水。式t施徹丨5體內(nèi)測丨定含有法#格林A的會目合物的膠原合成量對無毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外線，持續(xù)4周，然后把100ml實施例14_21的含法拉格林A的各組合物涂抹在小鼠背部。然后對小鼠進行活組織切片檢查，從組織學(xué)上測定了所述活組織檢查組織中的膠原形成。在本申請中，對新生成的膠原量的測定是通過先將所述組織免疫染色，然后對經(jīng)免疫染色的組織進行影像分析來進行。結(jié)果見表11。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表11所示，法拉格林A的含量增加導(dǎo)致膠原合成量的增加，并且與化妝水相比化妝膏中所述提取物的活性更高。人們相信這是因為化妝膏在皮膚中的保留高于化妝水。式t施仿1丨6體內(nèi)測丨定含有奧其/fffi百木酚素7的會目合物的膠原合成量(invivo)對無毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外線，持續(xù)4周，然后把100ml實施例22_29的含奧斯托百木酚素7的組合物涂抹在小鼠背部。然后對小鼠進行活組織切片檢查，從組織學(xué)上測定了所述活組織檢查組織中的膠原形成。在本申請中，對新生成的膠原量的測量通過先將所述組織免疫染色，然后對經(jīng)免疫染色的組織進行影像分析的方式來進行。測定結(jié)果見表12。表12如表12所示，奧斯托百木酚素7的含量增加導(dǎo)致膠原合成量的增加，并且與化妝水相比化妝膏中所述提取物的活性更高。人們相信這是因為化妝膏在皮膚中的保留高于化妝水。<30~1>利卡靈E的分離和純化將100g(干重)干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻假種皮加入至400ml95v/v%乙醇中，并且在室溫下放置兩天。用沃特曼(Whatman)2號濾紙將所提取的溶液過濾2次。然后，將所述乙醇過濾液真空濃縮并且凍干，從而制備了肉豆蔻假種皮乙醇粗提取物(26.61g)。用乙酸乙酯、丁醇和水依次將所述提取物分級分離。得到了乙酸乙酯級分(18.44g)。利用硅膠柱色譜(MerckKieselgel66；70-230mesh)以氯仿與乙酸乙酯(91(v/v))的混合溶液對乙酸乙酯級分進行洗脫得到了級分II(3.04g)。用真空旋轉(zhuǎn)濃縮機徹底去除溶劑，從而制備了肉豆蔻假種皮粗提取物。之后利用硅膠柱色譜以氯仿、己烷、乙酸乙酯和丙酮(15100.10.l(v/v/v/v))的混合溶劑對級分II進行處理，得到了級分II-B。利用制備型高效液相色譜以100%甲醇洗脫級分II-B得到了單一物質(zhì)級分II-B-2(0.016g)。圖5圖示了上述分離工藝。<30~2>結(jié)構(gòu)分析為了確定所述分離的單一物質(zhì)III-B-2的結(jié)構(gòu)，分別在600MHz和150MHz測量了所述物質(zhì)的t-WR光譜和13C-WR光譜(溶劑DMS0)，并測定了DEPT光譜。對和13C-NMR的綜合分析結(jié)果總結(jié)在表13中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><30-3>質(zhì)量分析為了分析所述單一物質(zhì)的質(zhì)量，測定了FAB/MS，并在FAB/MS中在m/z324上觀測到所述單一物質(zhì)的[M]+，表明了分子量為324且分子式為C2。H2。04。根據(jù)上面的1H-NMR13.C-NMR、DEPT以及FAB/MS的結(jié)果和之前發(fā)表的參考文獻(HarveyD.J.，J.Chromatogr.，110=91-102,1975)，可以確認所分離的單一物質(zhì)是用通式3表示的利卡靈E:[通式3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>Illi式實施例7用利卡靈E處理時細胞,中某質(zhì)金屬蛋白_-I(MMP-I)的表汰7k平的測定為了測定利卡靈E對基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-I)的活性抑制效果，利用上述實施例3的蛋白質(zhì)印跡法比較了分別以不同濃度(3、5和ΙΟμΜ)的利卡靈E處理的測試組，結(jié)果是與UV20J/cm2處理的陽性對照組相比，它們分別顯示了35%、47%以及73%的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的活性抑制效果。這表明本發(fā)明的利卡靈E表現(xiàn)出對抗衰老標記基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的抑制作用。實施例31到34制備含有利卡靈E的化妝水利用本發(fā)明的利卡靈E制備了具有實施例31-34組成成分的化妝水。把利卡靈E以5.Owt%,0.Iwt%,0.01wt%^P0.00Iwt%4種濃度溶解到水中，再與磷酸溶液混合。將所述溶液與乙醇、丙三醇、丙二醇所添加的香料和防腐劑混合，然后用水調(diào)節(jié)重量。然后均勻地攪拌所述溶液(見表14)。表14_____<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例35到38制備含有利卡靈E的化妝膏利用本發(fā)明的利卡靈E制備了具有實施例35-38組成成分的化妝膏。首先在75-80°C下溶解物質(zhì)(2)-(6)并且在相同溫度下溶解物質(zhì)(7)-(10)。把物質(zhì)(7)-(10)乳化到物質(zhì)(2)_(6)中，然后把利卡靈E以5.Owt%,0.lwt%、0.01%和0.001%的濃度分別放入并且攪拌所述乳液。最后添加香料并且用純凈水補足余量(見表15)表15<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>Hli式實施例8體內(nèi)測丨定含利卡靈E的鉬合物的膠原合成量對無毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外線，持續(xù)4周，然后把100ml實施例31_38的含利卡靈E的組合物涂抹在小鼠背部。然后對小鼠進行活組織切片檢查，從組織學(xué)上測定了所述活組織檢查組織中的膠原形成。在本申請中，對新生成的膠原量的測量通過先將所述組織免疫染色，然后對經(jīng)免疫染色的組織進行影像分析來進行。測定結(jié)果見表16。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表16所示，利卡靈E的含量增加導(dǎo)致膠原合成量的增加，并且與化妝水相比化妝膏中所述提取物的活性更高。人們相信這是因為化妝膏在皮膚中的保留高于化妝水。實施例39從肉豆蔻分離和純化肉豆蔻衣木酚素<39-1>肉豆蔻衣木酚素的分離和純化將IOOg(干重)干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻加入至400ml75%甲醇中，并且在室溫下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻甲醇提取物(7g)。把所述提取物用乙酸乙酯、丁醇和水進行分級分離。得到了乙酸乙酯級分(4.2g)。利用硅膠柱色譜(MerckKieselgel66；70-230mesh)以己烷與乙酸乙酯(101(ν/ν))的混合溶液對乙酸乙酯級分進行洗脫，得到了級分III(Ig)。通過柱色譜以己烷與乙酸乙酯(201(ν/ν))的混合溶劑對所述級分III進行處理，得到了級分III-B(0.52g)。之后利用制備型Rp-18柱色譜(MerckLiChropr印；25-40μm)通過80%甲醇對級分III-B進行洗脫，得到了單一物質(zhì)級分III-B-2(0.5g)。圖6中圖示了上述分離工藝。<39~2>結(jié)構(gòu)分析為了確定所述分離的單一物質(zhì)III-B-2的結(jié)構(gòu)，分別在600MHz和150MHz測量了所述物質(zhì)的13C-NMR光譜和1H-NMR光譜(溶劑DMS0)。為了以13C-WR光譜和1H-WR光譜的結(jié)果為基礎(chǔ)測定1H-1H的相關(guān)關(guān)系和1H-13C的相關(guān)關(guān)系，測定了1H-1HCOSY光譜和1H-13CHMBC光譜。1H-匪RJ3C-WRJH-1HCOSY和1H-13CHMBC的綜合分析結(jié)果表示在表17中。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>觀測到所述單一物質(zhì)的[M]+，表明了分子量為328且分子式為C2(lH2404。<39~4>比旋光度測定把20mg所述單一物質(zhì)III-B-2溶解在2ml氯仿(CHCl3)中，并且用比旋光度測定儀(Polarimeter；AutomaticPolarimeter,APIII—589，Rodulph,NJ,USA)檢IlJ比旋光度([a]D)0結(jié)果是，比旋光度為[a]D=+4.O(CHCl3,c=1.0)。通過上面的1H-WRj3C-WRjH-1HCOSY、1H-13CHMBC^ΕΙ/MS和[a]D的結(jié)果和已發(fā)表的參考文獻(Woo,W.S.etal.，Phytochemistry,261542-1543，1987)，發(fā)現(xiàn)所述單一物質(zhì)是用通式4所表示的肉豆蔻衣木酚素[通式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>泖瞧麵9融百絲減麵謝IS-I(MMP-I)_汰水平的測定為了測定肉豆蔻衣木酚素的基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)抑制活性效果，利用上述實施例3的蛋白質(zhì)印跡法比較了分別以不同濃度(3、5和ΙΟμΜ)的肉豆蔻衣木酚素處理的測試組，結(jié)果是與UV20J/cm2處理的陽性對照組相比，它們分別顯示了31%、42%以及63%的對基質(zhì)金屬蛋白酶-1的抑制活性效果。這表明本發(fā)明的肉豆蔻衣木酚素示出了對抗衰老標記基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的抑制作用。實施例40測丨定當用肉百蔻乙醇提取物處理時細朐中某質(zhì)金屬蛋白IS-I(MMP-I)的表汰水平將IOOg干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻加入至400M1乙醇中，并且在室溫下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻乙醇提取物(12.7g)。對該乙醇提取物，以與實施例3相同的方法進行對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量，結(jié)果是與用20J/cm2照射紫外線處理的陽性對照組相比，以5μg/Ml和10μg/Ml乙醇提取物處理的組的基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的表達水平分別降低了38%和75%。實施例41測定當用肉豆蔻已烷提取物處理時對細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)的表汰水平將IOOg干燥且經(jīng)粉碎的肉豆蔻IOOg加入至400M1己烷，并且在室溫下放置兩天。過濾所提取的溶液后進行真空濃縮，從而制備了肉豆蔻己烷提取物(26.6g)。對上述己烷提取物，以與實施例3相同的方法進行對基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達水平的測量，結(jié)果是與用20J/cm2紫外線處理的陽性對照組相比，以5μg/Ml和10μg/Ml己烷提取物處理的組的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達水平分別降低了32%和68%。測試實施例10體內(nèi)驗證肉豆蔻提取物以及肉豆蔻衣木酚素的抗皺效果在實驗前使6周齡的無毛小鼠(Skh:HR_l)適應(yīng)一個星期，并且注意維持溫度為23士3°C，相對濕度為50士5%以及12小時的明暗周期(07:00-19:00/照明時間)。使用了小鼠專用飼料和自來水喂養(yǎng)它們。每周三次紫外線(UV)照射相同時間，UV照射量為第1周50mJ/cm2，第2周100mJ/cm2，第3周200mJ/cm2，第4周以及第4周后為250mJ/cm2。分為4組。分別是對照組、UV對照組、UV/肉豆蔻組和UV/肉豆蔻衣木酚素組。在本實驗中，涂抹各50μ1的6%肉豆蔻提取物和20mM肉豆蔻衣木酚素溶液。對于本實驗，肉豆蔻提取物與肉豆蔻衣木酚素均溶解在乙醇聚乙二醇中(73(v/v))。實驗之后，為了確定抗皺效果，利用硅膠聚合物(SILFLOimpressionmaterial)從無毛小鼠的背部印模(r印lica)取樣，結(jié)果如圖7所示，確認了在照射UV后涂抹肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素的組與紫外線陽性組相比，皺紋得到抑制。在圖7中，A是正常組，B是UV照射組，C是肉豆蔻提取物涂抹組，而D是肉豆蔻衣木酚素涂抹組。'M^mmuM^mMMMMmMAmMMMhMMMM^MMmm效能在實驗前使6周齡的無毛小鼠(Skh:HR_l)適應(yīng)一個星期，并且注意維持溫度為23士3°C，相對濕度為50士5%以及12小時的明暗周期(07:00-19:00/照明時間)。使用了小鼠專用飼料和自來水喂養(yǎng)它們。每周三次紫外線(UV)照射相同時間，UV照射量為第1周50mJ/cm2，第2周100mJ/cm2，第3周200mJ/cm2，第4周以及第4周后為250mJ/cm2。分為4組。分別是對照組、UV對照組、UV/肉豆蔻組和UV/肉豆蔻衣木酚素組。分別經(jīng)口給予200mg/kg肉豆蔻和20mg/kg肉豆蔻衣木酚素。對于本實驗，將肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素溶解在0.25%CMC(羧甲基纖維素)溶液中。實驗之后，為了確定抗皺效果，利用硅膠聚合物(SILFLOimpressionmaterial)在無毛小鼠的背部印模(r印lica)取樣，結(jié)果如圖8所示，確認了在照射UV后經(jīng)口給予肉豆蔻提取物和肉豆蔻衣木酚素的組與紫外線陽性組相比，皺紋得到抑制。在圖8，中A是正常組，B是UV照射組，C是肉豆蔻提取物給藥組，而D是肉豆蔻衣木酚素給藥組。實施例42到45制備含有肉豆蔻衣木酚素的化妝水利用本發(fā)明的肉豆蔻衣木酚素制備了具有實施例42-45組成成分的化妝水。把肉豆蔻衣木酚素以5.Owt%,0.lwt%、0.01襯％和0.001wt%4種濃度溶解到水中，再與磷酸水溶液混合。將所述溶液與乙醇、丙三醇、丙二醇、所添加的香料和防腐劑混合，然后用水調(diào)節(jié)重量。然后均勻地攪拌所述溶液(見表18)。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施仿ι丨46至I丨49泡丨各含有肉百蔻衣木酚素的化妝膏利用本發(fā)明的肉豆蔻衣木酚素制備了具有實施例46-49組成成分的化妝膏。首先在75-80°C下溶解物質(zhì)(2)-(6)并且在相同溫度下溶解物質(zhì)(7)-(IO)0把物質(zhì)(7)-(10)乳化到物質(zhì)(2)_(6)中，然后把肉豆蔻衣木酚素以5.0wt%、0.lwt%、0.01%和0.001%的濃度分別放入其中并且攪拌所述乳液。最后添加香料并且用純水補足余量(見表19)。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>測試實施例11體內(nèi)測量含有肉豆蔻衣木酚素的組合物的膠原合成量對無毛小鼠每天1次照射20J/cm2紫外線，持續(xù)4周，然后把IOOml實施例40_47的含肉豆蔻衣木酚素的組合物涂抹在小鼠背部。然后對小鼠進行活組織切片檢查，從組織學(xué)上測定了所述活組織檢查組織中的膠原形成。在本申請中，對新生成的膠原量測量通過先將所述組織免疫染色，然后對經(jīng)免疫染色的組織進行影像分析來進行。測定結(jié)果見表20。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>如表20所示，肉豆蔻衣木酚素的含量增加導(dǎo)致膠原合成量的增加，并且與化妝水相比化妝膏中所述提取物的活性更高。人們相信這是因為化妝膏在皮膚中的保留高于化妝水。實施例50到53制各含有本發(fā)明的肉百蔻衣木酚素的飲料按照一般的飲料制備方法，混合表21所示的成分(總體積1000ml)并且在85°C下攪拌1小時，然后通過對上述溶液進行殺菌而制備成含有本發(fā)明的肉豆蔻衣木酚素的飲料。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>產(chǎn)業(yè)上的可利用性從上文中可以看出，本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百木酚素7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素具有抑制膠原分解酶-1(MMP-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-1)和誘導(dǎo)新膠原(I型原膠原)生成的活性，從而具有抗皺作用。因此，本發(fā)明的肉豆蔻提取物、肉豆蔻假種皮提取物以及從所述提取物分離和純化得到的法拉格林A、奧斯托百木酚素7、利卡靈E和肉豆蔻衣木酚素可用于預(yù)防或治療由光老化引起的皺紋。權(quán)利要求一種抗皺組合物，其特征在于包含作為有效成分的木酚素化合物，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素[通式1][通式2][通式3][通式4]FPA00001027113700011.tif,FPA00001027113700012.tif,FPA00001027113700021.tif,FPA00001027113700022.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗皺組合物，其特征在于所述木酚素化合物提取自肉豆蔻或肉豆蔻假種皮。3.—種木酚素化合物用于制備減少皺紋的試劑的用途，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及由通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。4.一種木酚素化合物用于制備誘導(dǎo)膠原合成的試劑的用途，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。5.一種木酚素化合物用于制備抑制膠原分解的試劑的用途，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。6.一種減少皺紋的方法，其特征在于將有效量的一種木酚素化合物給予或涂抹于有需要的受試者，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。7.一種誘導(dǎo)膠原合成的方法，其特征在于將有效量的一種木酚素化合物給予或涂抹于有需要的受試者，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。8.一種抑制膠原分解的方法，其特征在于將有效量的一種木酚素化合物給予或涂抹于有需要的受試者，所述木酚素化合物選自由通式1表示的法拉格林A、由通式2表示的奧斯托百木酚素7、由通式3表示的利卡靈E以及通式4表示的肉豆蔻衣木酚素。9.一種抗皺組合物，其特征在于含有肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物。10.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物用于制備減少皺紋的試劑的用途。11.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物用于制備誘導(dǎo)膠原合成的試劑的用途。12.肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物用于制備抑制膠原分解的試劑的用途。13.一種減少皺紋的方法，其特征在于將有效量的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物給予或涂抹于有需要的受試者。14.一種誘導(dǎo)膠原合成的方法，其特征在于將有效量的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物給予或涂抹于有需要的受試者。15.一種抑制膠原分解的方法，其特征在于將有效量的肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物給予或涂抹于有需要的受試者。全文摘要本發(fā)明涉及從肉豆蔻(nutmeg)或肉豆蔻假種皮(arilofnutmeg)分離和純化得到的木酚素化合物用于抗皺的新用途，更詳細地說，本發(fā)明涉及肉豆蔻提取物或肉豆蔻假種皮提取物、法拉格林A(fragrinA)、奧斯托百木酚素7(austobailignan7)、利卡靈E(licarinE)以及肉豆蔻衣木酚素(macelignan)用于抗皺的新用途。本發(fā)明的提取物以及木酚素化合物具有抑制膠原分解酶-1(MMP-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-1)以及生成新膠原(I型原膠原)的活性，從而具有抑制由光老化引起的皺紋的效果。因此本發(fā)明的提取物以及木酚素化合物可用于預(yù)防或治療由光老化引起的皺紋。文檔編號A61K8/34GK101815498SQ200880103077公開日2010年8月25日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2007年6月20日發(fā)明者H·J·李,J·H·金,J·Y·李,J-K·黃,J-S·申,鄭熹徹,鄭裁潤,金道彥申請人:生物關(guān)懷有限公司;新樹有限公司