專利名稱：包含鋰離子的骨組織植入物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于植入到骨組織中的植入物及其制備方法。
本發(fā)明還涉及噴砂粉末(blasting powder)和局部增加骨形成的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在， 一 期法(one-stage procedure)通常被用于把整形外科 (orth叩aedic)或牙科植入物，通常是金屬植入物，植入到骨組織中。
在所述一期法中，將第一植入物部分，例如牙科固定物(dental fixture),以外科手術(shù)的方式置于骨組織中，然后在外科手術(shù)之后，將愈
合帽(healing cap)或第二植入物部分，例如橋基(abutment),直接連接到 所述第一植入物部分。之后，使軟組織在所述愈合帽或第二植入物部分 周圍愈合。當使用愈合帽時，在幾周或幾個月之后不需要采用任何外 科過程去除所述帽，以及將第二植入物部分，例如橋基和臨時冠，連接 到所述第一植入物部分。該一期法例如在L Cooper等"A multicenter 12-month evaluation of single-tooth implants restored 3 weeks after 1-stage surgery", The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, Vol 16,No 2 (2001)中有描述。
二期法，其是另一種已知的植入方法，涉及在第一階段中以外科手 術(shù)的方式將第一植入物部分，例如牙科固定物，置于骨組織中，然后 在這里使其空載靜置和固定3個月或更長的愈合期，以便使骨組織生長 到植入物表面上從而使植入物良好地連接到骨組織，使覆蓋植入物位 置的軟組織中的切口在植入物之上愈合，和在第二階段中，打開覆蓋沖直 入物的軟組織并且將第二植入物部分，例如牙科橋基和/或修復(fù)牙齒 (restoration tooth)，連接到第一植入物部分，例如所述固定物，形成最 終才直入4勿纟吉才勾。it方';去4列長口在Br&nemark等"Osseointegrated Implants in the Treatment of the Edentulous Jaw, Experience from a 10-year period", Almquist & Wiksell International, Stockholm, Sweden中有描述。
然而，在愈合期間植入物不應(yīng)該凈皮加載的事實意p未著在3個月或更 長的愈合期間，第二植入物部分不可以連接到第 一植入物部分和/或不可
5以使用?？紤]到與此相關(guān)的不舒適性，期望將上述第一階段所需的時間周期最小化或甚至在一次手術(shù)中完成整個植入方法，也就是說，束用所述一期法。
對于一期法和二期法，對于一些病人，可能認為在功能性加載植入物之前等待至少3個月是更好的。然而，采用一期法的一個可選方案是在植入之后直接(立即加載)或在植入之后幾周(早期加載)就使植入物發(fā)
揮功能。這些方法，例如，在D M Esposito, pp 836-837, Titanium inMedicine, Material Science, Surface Science, Engineering, BiologicalResponses and Medical Application, Springer隱Verlag (2001)中有描述。
必不可少的是所述植入物在植入物與骨組織之間建立充分的穩(wěn)定性和結(jié)合，以使得可以實現(xiàn)以上披露的植入物立即或早期加載。也應(yīng)該注意的是，植入物的立即或早期加載可能對骨形成有益。
用于骨植入物的一些金屬或合金，例如鈦、鋯、鉿、鉭、鈮，或它們的合金，能夠與骨組織形成相對強的結(jié)合，這種結(jié)合可以與骨組織本身一樣強，有時甚至更強。這種金屬植入物材料最著名的例子是鈦和鈦的合金，在這方面它們的性能從大約1950年起就已經(jīng)是已知的了 。金屬與骨組織之間的這種結(jié)合被叫做"骨結(jié)合(osseointegmtion)"(Albrektsson T， Br&nemark P I, Hansson H A, Lindstr6m J,"Osseointegrated titanium implants. Requirements for ensuring along-lasting, direct bone anchorage in man", Acta Orthop Scand,52:155-170 (1981))。
可以提及的是， 一旦與氧接觸，鈦、鋯、鉿、鉭、鈮和它們的合金立刻被薄氧化物層覆蓋。鈦植入物上的這種天然氧化物層主要由二氧化鈦(IV)(Ti02)與少量的Ti203, TiO和丁1304構(gòu)成。
盡管(氧化的)金屬，例如鈦，與骨組織之間的結(jié)合可能是相對強的，但仍然期望增強這種結(jié)合。 "
到目前為止，有幾種處理金屬植入物以便獲得更好的植入物附著并由此獲得改善的骨結(jié)合的方法。這些方法中的一些涉及改變植入物的表面形貌(morphology),例如通過在植入物表面上生成不規(guī)則性以便與未處理的表面相比增加表面粗糙度。據(jù)信增加的表面粗糙度，其在植入物與骨組織之間產(chǎn)生更大的接觸和附著面積，在植入物與骨之間提供了更好的^4成保持性(mechanical retention)和強度。本領(lǐng)域中公知的是，表面粗糙度可以通過例如等離子噴涂，噴砂或酸蝕刻來提供。
用于獲得植入物對骨組織的更好附著的其它方法涉及改變植入物表面的化學(xué)性能。
幾種方法涉及將陶瓷材料例如羥磷灰石的層施加到植入物表面，尤其是為了改善植入物對骨的結(jié)合，因為羥磷灰石與骨是化學(xué)相關(guān)的。然而，包含羥磷灰石的涂層的一個缺點是它們可能是易碎的并且可能會從植入物表面剝落或破裂，這進而可能導(dǎo)致植入物的最終失敗。
改變植入物化學(xué)性能的其它方法涉及在植入物表面上施加氟和/或
氟化物(WO 94/13334， WO 95/17217, WO 04/008983和 WO04/008984)。
WO 2006/004297公開了骨誘導(dǎo)性金屬植入物，例如鈦或其合金，包含金屬氧化物層和形成于其上的生物活性材料層，該生物活性材料層由Li、 Na、 K、 Rb、 Cs、 Fr、 Mg、 Ca、 Sr、 Ba、 Ra、 Sc、 Y、 Lu、Ti、 Zr、 Hf、 Nb、 Ta、 Cr、 Mo、 W、 Mn、 Re、 Fe、 Ru、 Os、 Co、Rh、 Ir、 Ni、 Pd、 Pt、 Cu、 Ag、 Au、 Zn、 Ga、 In、 Ti、 Sn和Bi中的任一種或多種構(gòu)成。然而，工作實施例僅描述了包含釣作為生物活性層的鈦植入物。
也可以提及WO 2002/096475,涉及在鈦氧化物層中包含鈣、磷或碌L的鈥植入物，和WO 2005/084577,涉及在鈥氧化物層中包含4美的鈥植入物。
盡管存在提供植入物表面與骨之間相對強的結(jié)合的植入物，但是本領(lǐng)域仍然需要增強這種結(jié)合，也就是說，改善植入物在骨組織中的"骨結(jié)合"過程。
因此，本領(lǐng)域需要提供這樣的植入物，其具有期望的附著速率并且其具有 一 旦將其植入到骨組織中就在骨與植入物之間形成機械強結(jié)合
的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是滿足上述需要。因此，將提供用于植入到骨組織中的生物相容的植入物。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在骨組織中局部給予的鋰離子對骨組織中的骨形成和骨質(zhì)(bone mass)具有局部作用。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含含有和/或釋放鋰離子的表面氧化物層的植入物誘導(dǎo)成骨細胞中的堿性磷酸酶的增加的生成，其對于進一步的分化
(differentiation)和礦化是至關(guān)重要的。因此，可以實現(xiàn)改善的骨形成速率和改善的骨組織與植入物之間的附著速率，進一步改善植入物立即或早期加載的可能性。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與包含含有例如鉀或鎂離子的表面氧化物層的金屬植入物相比，包含含有和/或釋放鋰離子的表面氧化物層的植入物提供增加的成骨細胞增殖和增加的骨保護素生成。由此提供改善的骨質(zhì)，這意味著植入物與骨組織之間的更強的機械結(jié)合。
因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，局部給予鋰離子改善植入物在骨組織中的骨結(jié)合過程。
根據(jù)本發(fā)明的第 一方面，通過供植入到骨組織中的植入物實現(xiàn)了以上目的，所述植入物具有被氧化物層覆蓋的表面，其中所述氧化物層包含鋰離子。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于制備具有上述特征的骨組織植入物的方法。所述方法包含以下步驟 .、
a) 提供具有植入物表面的植入物；
b) 形成覆蓋所述植入物表面的氧化物層；
c) 在所述氧化物層上形成帶負電的離子；和
d) 使所述氧化物層與鋰離子接觸。
本發(fā)明的方法成本低廉并且易于實施，因此使得能夠大規(guī)模生產(chǎn)。此外，其易于消毒和儲存。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了包含金屬氧化物的噴砂粉末(blasting powder),所述金屬氧化物包含鋰離子。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了局部增加骨形成的方法。所述方法包含向有需要的人給予包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
本發(fā)明的第五方面涉及鋰離子或其鹽用于制備用于局部增加骨，成的藥物組合物的用途。
本發(fā)明的第六方面涉及用于將植入物植入到骨組織中的套件(kit),所述套件包含植入物和組合物，所述組合物包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
8通過本發(fā)明的以下描述，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將會變得顯而易見。


圖1是說明經(jīng)消毒的鈦樣品在LiN03中還原(reduction)之后，鋰的存在和分布的TOF-SIMS圖像。(鋰顯示為白點。)
圖2說明與草酸處理過的經(jīng)消毒的鈦樣品參照樣品(圖2b)相比，在經(jīng)消毒的鈦樣品上鋰的存在(編號7的峰)(圖2a)(得自TOF-SIMS測量)。
圖3是說明經(jīng)消毒的鈦樣品在LiOH中陽極化之后，鋰的存在和分布的TOF-SIMS圖像。
圖4說明在具有以及不具有不同濃度的鋰時，在細胞處理過的聚苯乙烯上培養(yǎng)3、 7和14天之后，MG-63細;9包的增殖程度。
圖5說明在具有以及不具有不同濃度的鋰時，在細胞處理過的聚苯乙烯上培養(yǎng)3、 7和14天之后，在細胞培養(yǎng)基中堿性磷酸酶的生成。
圖6顯示在具有以及不具有不同濃度的鋰時培養(yǎng)7天之后，MG-63細胞在參比表面1和2上的增殖程度。
圖7顯示與不包含鋰的未被刺激的表面相比，堿性磷酸酶在包含lmM濃度的鋰的參比表面1上的生成。
圖8是說明在參比表面1上培養(yǎng)36h之后，MG-63細胞的表面形貌的掃描電鏡圖像。
圖9是說明在參比表面2上培養(yǎng)36h之后，MG-63細胞的表面形貌的掃描電鏡圖像。
圖IO是說明在包含鋰的參比表面1上培養(yǎng)36 h之后，MG-63細胞的表面形貌的掃描電鏡圖像。
圖ll說明參比表面1、參比表面2，和分別包含鋰、鈣和鎂的參比表面1之間的MG-63細胞增殖的區(qū)別。
圖12顯示了在分別包含鋰、鈣和鎂的參比表面l上培養(yǎng)細胞7和14天之后，測得的骨保護素的量。
圖13說明與具有市售可得的OsseospeedTM表面的植入物相比，根據(jù)本發(fā)明的包含鋰的植入物在植入兔脛骨中6周之后的去除扭矩測試(removal torque test , RTQ)值。
具體實施例方式
本發(fā)明所用的術(shù)語"植入物"在其范圍內(nèi)包括供植入到脊推動物，
特別是哺乳動物，例如人的身體中的任何裝置(device)。植入物可以用 來替換anatomy和/或恢復(fù)身體的任何功能。
通常，植入物由一個或幾個植入物部分構(gòu)成。例如，牙科植入物 通常包含與第二植入物部分例如橋基和/或修復(fù)牙齒相連的牙科固定 物。然而，供植入用的任何裝置，例如牙科固定物，可以單獨被稱作 植入物，即使其它部分將要連接到其上。 '
本發(fā)明所用的術(shù)語"(供)植入到骨組織中的植入物"指的是供至少部 分植入到骨組織中的植入物，例如牙科植入物，如整體植入物 (one-piece implants)和整形外科植入物等等。供植入到骨組織中的植入 物也可以稱作骨組織才直入物。
本發(fā)明所用的術(shù)語"植入物表面"指的是植入物的至少 一個被限定 的表面區(qū)域。因此，該;故限定的表面區(qū)域可以包括植入物的整個表面 面積或者其某些部分。
供植入到骨組織中的植入物表面的 一 個例子是供植入到患者頜骨 中并將與骨組織接觸的牙科固定物的表面。
供植入到骨組織中的植入物表面的另 一 個例子是供植入到患者股 骨中的髖關(guān)節(jié)植入物的表面。
本發(fā)明涉及一種用于植入到骨組織中的植入物，所述植入物具有表 面；所述表面被氧化物層覆蓋，其中，所述氧化物層包含鋰離子。
根據(jù)本發(fā)明的植入物是生物相容的，并且在骨組織中對骨形成和骨 質(zhì)具有局部作用。此外，本發(fā)明的植入物引起增加的成骨細胞增殖，
和骨組織中增加的堿性磷酸酶和骨保護素生成。堿性磷酸酶是成骨細 胞生成的酶，其在骨礦化中起主要作用，和骨保護素是已知增加骨組織 中的骨礦物密度和骨體積的細胞因子。堿性磷酸酶和骨保護素的生成 清楚地表明根據(jù)本發(fā)明的植入物對骨重建具有積極作用。
如通過去除扭矩(RTQ)測試測量的那樣(圖13)，根據(jù)本發(fā)明的植入 物提供改善的植入物穩(wěn)定性和骨組織響應(yīng)。
覆蓋植入物表面的所述氧化物層包含分散在所述氧化物層的至少 一部分中的鋰離子。
鋰是小的、帶正電的、無毒、輕質(zhì)的離子，其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)容易分散
10盡管已知鋰鹽對躁郁癥(manic-depressive disorder)的治療作用，但 是研究已經(jīng)表明，鋰治療也影響骨礦物質(zhì)代謝(例如，Baran等，"Lithium Inhibition of Bone Mineralization and Osteoid Formation", J Clin Invest, pp 1691-1696 (1978); Nordenstr加等，"Biochemical Hyperparathyroidism and Bone Mineral Status in Patients Treated Long-Term with Lithium", Metabolism, vol 43, No 12， pp 1563-1567 (1994);和Mak等，"Effects of Lithium Therapy on Bone Mineral Metabolism: A Two-Year Prospective Longitudinal Study", J Clin Endocrin and Metabol, vol 83, No 11, pp 3857-3859 (1998》。 4
最近，已經(jīng)建議口服給藥氯化鋰用于治療低骨質(zhì)病癥，例如骨質(zhì) 疏松，這是因為已經(jīng)得出結(jié)論通過活化經(jīng)典Wnt通路，導(dǎo)致例如刺 激前成骨細胞復(fù)制，誘導(dǎo)破骨細胞生成和抑制成骨細胞和骨細胞凋亡， 鋰增強骨形成和改善骨質(zhì)(C16ment-Lacroix等，"Lrp5-independent Activation of Wnt Signalling by Lithium Chloride Increases Bone Formation and Bone Mass in Mice", PNAS， vol 102, No 48, pp 17406-17411 (2005),和Krishnan等，"Regulation of Bone Mass by Wnt Signaling", J Clin Invest, vol 116, No 5， pp 1202-1209 (2006)。
Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于治療骨質(zhì)疏松，并且一般來說對于骨合成代 謝藥物發(fā)現(xiàn)是非常吸引人的目標(Rawadi G等，"Wnt signalling pathway: a new target for the treatment of osteoporosis", Expert. Opin. Ther. Targets, Vol 9, pp 1OW-i077 (2005)))。鋰活化Wnt通路的事實使本發(fā)明非常適 合用于植入到骨組織中。
此外，鋰之前已經(jīng)被用于治療躁郁癥的事實暗示，全身給藥時的毒 理情況和副作用是公知的。
此外，鋰具有相對簡單的化學(xué)性能，并且通常是不滅的和不受例如 消毒的影響。
將鋰離子結(jié)合到所述氧化物層中可以破壞氧化物結(jié)構(gòu)，從而使氧 化物更有反應(yīng)性。當所述氧化物層中結(jié)合有帶正電的鋰離子時，在氧 化物表面(植入物表面)上提供了增加的正表面電荷密度。因此，骨組織 中的富電子蛋白質(zhì)可以以電的方式被吸引到所述表面。結(jié)合的離子也 可以影響所述氧化物的傳導(dǎo)性(conductivity),這可以對骨結(jié)合和血液相容性產(chǎn)生積極影響。
至少部分所述氧化物層應(yīng)該包含鋰離子，并且可以通過所述離子 在所述氧化物層中的存在，實現(xiàn)鋰在本發(fā)明植入物中的期望的骨誘導(dǎo)
(osseoinductive)效果。然而，這也可以通過/人所述氧化物層把鋰離子釋
放到植入物周圍的生理流體中來實現(xiàn)。
優(yōu)選，鋰離子均勻分散在氧化物層中。這種均勻分布示于圖l中。 根據(jù)本發(fā)明的植入物合適地是金屬植入物，例如由鈦或鈦合金制
成的才直入物。
然而，在實施方案中，所述植入物可以是非-金屬植入物，包括例如 陶瓷、塑料或復(fù)合材料。在這類實施方案中，植入物表面是施加在所述 非-金屬植入物上的金屬植入物層，從而提供了部分是金屬的植入物表 面。所述金屬植入物層優(yōu)選包含鈦或鈦合金。
然而，所述金屬植入物和所述金屬植入物層不限于特定金屬，而 是可以由任何生物相容的金屬材料制成，例如鋯或其合金、鉿或其合 金、鈮或其合金、鉭或其合金、鉻-釩合金、或這些材料的任何組合。
所述覆蓋所述植入物表面的氧化物層的厚度在2 - 100 nm的范圍內(nèi)。
一旦與氧接觸，鈦、鋯、鉿、，鉭、鈮和它們的合金立刻被薄氧化物 層覆蓋。鈦植入物上的這種天然氧化物層主要由二氧化鈦(IV)(Ti02)和 少量的Ti203、 TiO和丁1304構(gòu)成。
在優(yōu)選的實施方案中，所述氧化物層是自發(fā)形成的氧化物層，例 如與空氣接觸。這種自發(fā)形成的氧化物層的厚度在2 - 18 nm的范圍 內(nèi)，例如在2 - 6 nm的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的所述氧化物層隨時間不顯著長厚，并且保護下面的金 屬表面，使其不與任何周圍的試劑反應(yīng)。
被氧化物層覆蓋的金屬植入物表面是本領(lǐng)域已知的。然而，數(shù)篇 現(xiàn)有技術(shù)文獻強調(diào)在植入物表面上提供厚氧化物層，優(yōu)選高于600 nm 的重要性(Sul等,"Resonance frequency and removal torque analysis of implants with turned and anodized surface oxides", Clin. Oral. Impl. Res., Vol 13, pp 252-259 (2002); Sul等，"Qualitative and quantitative observations of bone tissue reactions to anodised implants", Biomaterials, Vol 23, No 8, pp 1809-1817 (2002))。這種植入物需要附加的氧化步驟，
12這是因為上述厚度的氧化物層不能自發(fā)得到。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)厚度小于100 nm的氧化物層，優(yōu)選具有小于18 nm 的天然氧化物層(也就是說，自發(fā)形成的氧化物層)厚度的氧化物層更適 合用于植入到骨組織中，因為厚氧化物層可能是非常易碎的。此外，在 植入物在骨組織中的較長時間植入期間，厚氧化物層可能導(dǎo)致碎裂和剝落。
該發(fā)現(xiàn)與Xiropaidis等相反，Xiropaidis等認為具有天然氧化物層的 4太才直入物#^人為骨傳導(dǎo)性專交差(less osteoconductive)。 (Xiropaidis等， "Bone-implant contact at calcium phosphate-coated and porous titanium oxide (TiUniteTM)-modified oral implants", Clin. Oral. Impl. Res, No 16, pp 532-539 (2005))。
根據(jù)本發(fā)明的氧化物層不影響或者改變植入物表面的形貌 (topogmphy)。此外，包含厚度小于100 nm,例如小于18 nm,例如在 2-6nm之間的氧化物層的植入物是生物相容的，這使其適于結(jié)合到人 體中。
因此，根據(jù)本發(fā)明的包含鋰離子的氧化物層適于任何幾何形狀或 任何基底。
根據(jù)本發(fā)明的植入物的植入物表面優(yōu)選是金屬植入物表面，所述金 屬植入物表面在其表面上包含金屬氧化物層。
特別地，根據(jù)本發(fā)明的所述植入物，特別是植入物的表面包含鈦 或其合金。因此，這種植入物表面被鈦氧化物層覆蓋。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的植入物中，覆蓋植入物表面的氧化物層是在 植入物的金屬表面上形成的金屬氧化物層。
在實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植入物可以進一步在所述氧化物層 之上提供有沉積物。這種沉積物可以包含骨刺激劑，例如鋰、鍶、鈣、 鎂或具有骨刺激作用的任何其它離子。典型地，所述沉積物包含鋰離子。
本發(fā)明所用的術(shù)語"沉積物"涉及在所述氧化物層上面提供的連續(xù) 或不連續(xù)的膜。這種沉積物可以具有任何厚度并且不結(jié)合到所述氧化 物層中，而是提供在所述氧化物層上。
典型地，所述沉積物是包含選自鋰、鍶、鎂和鈣離子中的任一種或 它們的組合的鹽沉淀物(salt precipitation)。通常，所述沉積物是鋰鹽沉淀物，也就是說，沉淀在植入物表面 的氧化物層上面的鋰鹽。
合適的鋰鹽的例子是氬氧化鋰、氟化鋰、氯化鋰、^琉酸鋰、硝酸 鋰、碳酸鋰。然而，可以使用能夠至少部分地溶解在植入物周圍的生 理流體中的任何鋰鹽。這樣的鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
一旦植入，包含鹽沉淀物的沉積物就容易和快速地溶解在周圍的 流體中，從而從所述植入物釋放出骨刺激離子。在植入物需要更加快速 地整合的情況中，例如在骨質(zhì)和骨量都很差的骨中，在其表面上具有這 種沉積物的植入物可以是特別有益的。
骨刺i離子例如鋰離子被容易和有效地釋放到植入物周圍的生理流體 中。因此，更高劑量的骨刺激離子，例如鋰離子可以被釋放到周圍的 流體中。 t
相應(yīng)地，可以從存在于植入物表面上的氧化物層中的氧化物中的 離子和從其釋放的離子這兩者，獲得鋰的期望效果。
根據(jù)本發(fā)明的植入物合適地缺乏包含磷酸鈣化合物的涂層。如背 景技術(shù)中概述的，這樣的植入物更易于從植入物表面剝落或破裂，這 可能導(dǎo)致植入物的最終失敗。
在本發(fā)明的實施方案中，在至少一部分所述植入物表面上，所述植
入物表面還可以包含均方^4M造度(root-mean-square roughness, Rq和/ 或Sq) S 250 nm的微粗糙度(micro-roughness)(也就是說，包含孔徑S 1 pm和孔深度S 500 nm的孔的微粗糙度)。本發(fā)明所用的術(shù)語"納或微 粗糙度"指的是包含尺寸小于1 |um的表面不規(guī)則(surface irregularities)
的表面粗糙度。
這種表面粗糙度有可能帶來植入物與骨組織之間的更大接觸和附 著面積，以及提供植入物與骨之間的更好的機械保持性和強度。在可4 的實施方案中，在至少 一部分所述植入物表面上所述植入物表面包含 氟和/或氟化物，例如0.2-20 at%，以及任選地還包含均方根粗糙度(Rq 和/或Sq) S 250 nm的微粗糙度。
(macro-roughness)。本發(fā)明所用的術(shù)語"巨粗糙度"指的是包含尺寸大于 1 |um的表面不規(guī)則的表面粗糙度。還應(yīng)該提及的是，所述植入物表面可以是帶螺紋的(threaded)或不帶 螺紋的(unthreaded),或其可以具有其它依用途而定的形貌特征。
此外，本發(fā)明涉及制備具有上面給出的特征的骨組織植入物的方 法，所述方法包含以下步驟
a) 提供具有植入物表面的植入物；
b) 形成覆蓋所述植入物表面的氧化物層；
c) 在所述氧化物層上形成帶負電的離子；和
d) 使所述氧化物層與鋰離子接觸。
如前面所提及的，所述植入物可以是金屬植入物，或者其可以是 提供有金屬表面的非-金屬植入物。當在本發(fā)明中采用非-金屬植入物 時，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)提供金屬植入物 表面。例如，可以使用任何合適的電化學(xué)處理。
覆蓋所述植入物表面的氧化物層優(yōu)選自發(fā)地形成，例如與空氣接 觸。這種層是鈍態(tài)和惰性的，也就是說，它是穩(wěn)定的并且阻止下面的 金屬表面發(fā)生進一步的反應(yīng)。 々
然而，在上述方法中可以采用任何常規(guī)的氧化技術(shù)。因此，所述方 法不限于自發(fā)形成氧化物層。例如，可以通過植入物在電解液中，例如 有機酸的水溶液中的陽極氧化，在金屬植入物表面上形成氧化物層。通 過在空氣中例如在150-1300°C加熱，也可以在金屬植入物表面上形成氧 化物層。此外，通過從合適的溶液在植入物表面上沉淀氧化物，可以在 金屬植入物表面上形成氧化物層。
如早已提及的那樣，覆蓋所述植入物表面的氧化物層優(yōu)選自發(fā)形 成，這是有利的，因為實際上不需要附加的氧化步驟。
關(guān)于上面給出的方法中的步驟c),通過將植入物表面置于堿性環(huán) 境，可以在所述氧化物層上形成帶負電的離子。
與水溶液接觸，所述金屬氧化物，例如鈦氧化物表面將分裂與其緊 鄰的水分子結(jié)構(gòu)，并且根據(jù)pH的不同，變成帶正電或帶負電的。當， 述表面不帶電并且沒有離子吸附在所述表面上時，該pH稱為零電荷點 pHpZC。鈦氧化物的pHpzc在5-7之間。
因此，當所述鈦氧化物表面被含水的堿性環(huán)境，例如pH超過7的 堿性溶液包圍時，由于形成表面結(jié)合的帶負電的羥基基團(hydroxide group)，表面變得略微帶負電。可以存在于周圍溶液中的帶正電的鋰離子，可以因此被以電的方式(electrically)吸引到所述氧化物表面(植入物 表面)并由此變得結(jié)合到所述氧化物層的至少一部分中，典型地是在氧 化物層的上面部分中。優(yōu)選，鋰離子均勻分布在所迷氧化物層中。
可以在所述氧化物的表面上局部實現(xiàn)堿性環(huán)境；也就是說，通過 施加電負性超過-0.5 V(more negative than -0.5V),典型地在-0.5至-3.5 V 的范圍內(nèi)的電勢，可以在所述氧化物層上形成帶負電的離子。施加這種 電勢將增加水分子的分裂，導(dǎo)致氬氣和在所述植入物表面上表面結(jié)合 的帶負電的羥基基團的形成。
可選地，通過將植入物表面置于堿性溶液中實現(xiàn)堿性環(huán)境，例如 通過將植入物表面浸泡在石咸性溶液中。這種石咸性溶液的pH應(yīng)該高于 7,例如高于10;典型地高于11。浸泡時間可以小于30分鐘，例如小 于20分鐘，典型地在10-15分鐘之間。
然后，使所述植入物表面與帶正電的鋰離子接觸；例如通過將植入 物表面置于包含鋰離子的溶液中。使所述氧化物層與鋰離子接觸的步 驟可以與在所述氧化物層上形成帶負電的離子的步驟同時進行，或在其 之后進行。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟c)和d)同時進行。
例如，通過在包含鋰的溶液中施加-0.5 V至-3.5 V范圍內(nèi)的電勢， 將形成帶負電的羥基基團，引起表面結(jié)合的羥基基團與溶液中存在的 鋰離子之間的靜電相互作用。該靜電相互作用導(dǎo)致鋰離子摻入到所述 氧化物層中。這在實施例1中有進一步的描述。
包含鋰離子的溶液可以是包含濃度為5.3 M或更小的氫氧化鋰的溶 液。氫氧化鋰的濃度應(yīng)該不超過5.3 M,其代表氫氧化鋰的溶度積。當 LiOH的濃度超過5.3 M時,將形成鹽晶 體并沉淀在氧化物表面上。在 根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟c)中，期望所述離子變得摻入到所述氧化物 中，因此LiOH的濃度應(yīng)該不超過所述溶度積。
氫氧化鋰的優(yōu)選濃度在0.05-2 M的范圍內(nèi)。
在所述氧化物表面上形成帶負電的離子和使所述氧化物層與鋰離 子接觸，從而將鋰離子結(jié)合到覆蓋植入物表面的氧化物層中的步驟不 限于特定方法，而是可以通過任何合適的方法或者方法的任何組合實 現(xiàn)。例如，所述植入物表面可以在包含鋰離子的堿性溶液中陽極化。 實施例1說明了通過在氬氧化鋰中陽極化而摻入鋰離子。
通過使所述植入物表面經(jīng)受陽極化(anodization)步驟，所述氧化物
16層的厚度將會受到影響。然而，由于所述陽極化優(yōu)選采用相對低的掃
描速率進行，例如低于6mV/s直至達到8V,因此所述氧化物的厚度將 不會生長到厚于100 nm。
因此，通過在植入物表面上形成的帶負電的羥基基團與周圍的溶 液中存在的帶正電的鋰離子之間的靜電相互作用，鋰離子被摻入到所述 氧化物層中。
任選地，根據(jù)本發(fā)明的方法可以在步驟d)之后包含漂洗和/或清余 所述植入物表面的步驟。此外，在所述漂洗步驟之后，可以將植入物表 面干燥和消毒。
在實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法進一步包含在所述氧化層上形 成包含骨刺激劑例如鋰、鍶、鈣、鎂的沉積物的步驟，例如通過在所述 植入物的所述表面上沉淀包含以上提及的離子的鹽；也就是說，在覆 蓋所述表面的氧化物層上。
所述鹽可以是以上離子的任何合適的鹽，其至少部分地可溶于植入 物周圍的生理流體中。鹽在植入物表面上的沉淀將在表面上形成連續(xù) 或不連續(xù)的膜。所述沉積物的厚度將取決于沉淀的鹽的量。
與植入物周圍的生理流體接觸時，這種鹽沉積物容易和快速地溶 解，從而通過從植入物表面釋放骨刺激離子，實現(xiàn)期望的骨刺激效果。
當所述沉積物是鋰鹽沉淀物時，通過改變在氧化物層的表面上形 成帶負電的離子的上述方法，可以實現(xiàn)形成這種沉積物的步驟。例如， 可以施加電負性超過-3.5 V的電勢。這種負電勢引起顯著增強的氬氣生 成和增加的水分子分裂。因此，在氧化物表面形成過量的帶負電的表 面結(jié)合的羥基基團，導(dǎo)致在氧化物層上的沉積物，也就是說，氫氧化鋰 沉淀物。進一步的描述參見實施例2。
此外，通過將植入物表面置于包含濃度高于5.3 M的溶度積的氫氧 化鋰的溶液中，將在氧化物表面(植入物表面)上形成鋰鹽沉積物。這也 由于周圍過量的羥基基團引起的。
然而，形成例如鋰鹽沉積物的步驟不限于任何特定方法，而是可 以使用任何方法。其也不限于特定的鋰鹽，而是可以使用至少部分可 溶于植入物周圍的生理流體中的任何鹽。
此外，可以使用用于形成包含選自鋰、鍶、鎂和鈣的離子中的任f 種或它們的組合的鹽沉淀物的任何方法，例如包含鋰的溶液也可以包含以上提及的離子中的任一種或它們的組合。在這種情況下，少量的 這些離子也可以變得被摻入到氧化物層中。
形成沉積物的步驟也可以通過上述方法的組合進行。
然而，應(yīng)該提及的是，在本發(fā)明中也可以采用用于在植入物表面上
摻入離子和形成沉積物的已知方法。這些方法包括例如
-等離子體沉積，例如采用等離子體源離子注入或金屬等離子體浸 :;殳離子注入，
陽任何電化學(xué)處理，例如在包含鋰離子的電解液中的伏安法， ' -用包含鋰離子的水溶液和/或非水溶液處理植入物，例如通過將 所述植入物浸漬在所述溶液中，
-用溶膠-凝膠技術(shù)處理植入物，
■束離子注入，
-真空電弧，
-過濾的真空電弧，
-金屬蒸汽真空電弧(metal vapour vacuum arc),
-離子鍍，
-化學(xué)氣相沉積，
-等離子體輔助的化學(xué)氣相沉積，
-賊射，
-激光燒蝕， ''
-在植入物表面上提供涂層，例如含磷酸釣的涂層或硅烷涂層，可 以將鋰離子摻雜到其中或結(jié)合到其上，
這些方法的任何組合等等。根據(jù)本發(fā)明的方法可以進一 步包含在 植入物表面上生成微粗糙度的步驟。
在植入物表面上提供鋰離子或其鹽之前、與之同時和/或之后，可以 采用以下方法任選地在植入物表面上提供納和/或微粗糙度，所述方法 例如是輕蝕刻(mild etching)、微加工、陽極化、火焰噴涂(flame spmying)、 電化學(xué)處理、激光、電火花侵蝕(spark erosion),或表面修飾 的任何其它合適的方法?？梢詤⒄誛O 04/008983和WO 04/008984, 其中披露了獲得這種植入物表面的合適的方法。然而，優(yōu)選的是，在根 據(jù)本發(fā)明的方法中在步驟a)之后提供所述納和/或微粗糙度。
本發(fā)明的方法也可以包含將氟施加到植入物表面的步驟?？梢詤?br> 18照WO 04/008983,其中披露了獲得這種植入物表面的合適方法。
根據(jù)WO 04/008983,在至少一部分植入物表面上提供氟和/或氟化 物和均方根粗糙度(Rq和/或Sq) S 250 nm的微粗糙度的一種合適方法是 在室溫下通過用濃度小于0.5 M,例如O.l M的氬氟酸水溶液處理植入 物，蝕刻時間不超過180秒，例如60秒(更多信息參見WO 04/008983)。
此外，在植入物表面上提供鋰離子或其鹽之前，和在任選地提供 所述微粗糙度之前，可以任選地在植入物表面上提供巨粗糙度。巨粗糙 度可以例如通過噴妙、例如用二氧化鈥顆粒噴砂、、蝕刻、微加工、陽極 化、火焰噴涂、任何電化學(xué)處理、激光、電火花侵蝕、機械加工、滾 花(knurling),或表面修飾的任何其它合適的方法提供。 "
也應(yīng)該提及的是，所述植入物表面可以是帶螺紋的或不帶螺紋的， 或可以具有其它依用途而定的形貌特征。
用于制備根據(jù)本發(fā)明的骨組織植入物的方法不限于摻入鋰離子， 而是通常也可用于將帶正電的離子摻入植入物表面中。因此，這樣的 方法涉及以下步驟
a) 提供具有植入物表面的植入物；
b) 形成覆蓋所述植入物表面的氧化物層；
c) 在所述氧化物層上形成帶負電的離子；和
d) 使所述氧化物層與帶正電的離子接觸。
本發(fā)明還涉及噴砂粉末，其包含金屬氧化物，其中所述金屬氧化 物包含4里離子。
所述金屬氧化物可以是選自鈦氧化物、鋯氧化物、鉿氧化物、鉭氧 化物和鈮氧化物的金屬氧化物。優(yōu)選所述噴砂粉末包含其中摻有鋰離 子的鈦氧化物。
也可以簡單地將氧化鋰用作本發(fā)明的噴砂粉末。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以采用所述噴砂粉末來進一步增強鋰離 子摻入到覆蓋植入物表面的氧化物層中。然而，可以單獨使用噴砂粉 末來將鋰離子摻入到在任何植入物表面上提供的任何氧化物層中。
本發(fā)明還涉及局部增加骨形成的方法。這種方法包含向有需要的 人給予包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。優(yōu)選地， 當將植入物在植入位置處植入到骨組織中時，在將所述植入物置于所述 位置處的骨組織中的空穴(cavity)中之前、同時和/或之后在所述才直入位置處給予包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載體的所述組合物。
可以在骨組織中的所述空穴中和/或在所述空穴附近，給予包含鋰離
子或其鹽的所述組合物。
用于所述組合物中的藥學(xué)上可接受的合適載體的例子是生理鹽水
溶液；蛻變(disintegrated)自體骨；脫4丐骨基質(zhì)；脂質(zhì)體； 一種或多種 可生物降解聚合物，例如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)的納或微顆 粒；透明質(zhì)酸；膠原(collagen);硫酸軟骨素；水凝膠，例如藻酸鹽； 脫乙酰幾丁質(zhì)；以及聚酯和磷酸三鈣的架(scaffold of polyester and tricalcium phosphate); 等等。
合適的載體的一個具體例子是PepGen P-15 PUTTY ,其是用P-15 增強的羥磷灰石顆粒，P-15是模擬Type-I膠原的細胞結(jié)合區(qū)域的合成 肽，懸浮在透明質(zhì)酸鈉中。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是速釋、緩釋或控制釋放配制劑。
本發(fā)明還涉及鋰離子或其鹽用于制備用于局部增加骨形成的藥物 組合物(如上面所公開的)的用途。
當將植入物在植入位置植入到骨組織中，可以在所述植入位置處局 部給予所述組合物。
本發(fā)明人認為，直接將鋰離子或其鹽局部給予到骨組織中優(yōu)于全 身給予。外來藥劑常常對人體具有各種影響，這些影響中有的是已知 的，有的是未知的。在骨組織中局部給予鋰或其鹽是有益的，這是因為 將實現(xiàn)骨刺激作用同時避免副作用。
此外，本發(fā)明涉及用于將植入物植入到骨組織中的套件，所述套件 包含植入物和包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載體的組合物(如上 面所公開的)。
雖然已詳細并參照其具體實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù) 人員明白的是，可以在本發(fā)明中進行各種改變和改進而不背離本發(fā)明的 精神和范圍。
現(xiàn)在，將通過以下非限制性實施例來說明本發(fā)明。 實施例
實施例1: 將鋰離子摻入到鈦氧化物層中 在LiN03中還原
20在pH 5-6, 0.1M LiN03中，通過電勢階躍技術(shù)(potential step technique )將鈦樣品還原。向樣品施加-3V的電勢階躍(所有電勢都相對 于雙接點(double junction)Ag/AgCl/KCl參比電極，相對于SHE是197 mV)5分鐘，產(chǎn)生連續(xù)氫氣釋放。在該還原過程之后，在干燥和消毒之 前，在MQ水中在超聲浴中將樣品漂洗2分鐘。通過飛行時間二次離 子質(zhì)譜法(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry, TOF-SIMS) 鑒定鋰的存在和分布(圖1)。
在石咸性溶液中陽極化
在pH〉11， 0.1MLiOH中，通過從OC(開路)到7V(所有電勢都相 對于雙接點Ag/AgCl/KCl參比電極，相對于SHE是197 mV)的LSV (線 性掃描伏安法)，以2和/或5mV/s的掃描速率和900 rpm的轉(zhuǎn)速，將 鈦樣品陽極化。在該陽極化過程之后，在干燥和消毒之前，在MQ水中 在超聲浴中將樣品漂洗2分鐘。在圖2a中的質(zhì)譜(峰7)說明在經(jīng)消毒的 鈦樣品的表面上鋰的存在，并且與草酸處理過的經(jīng)消毒的鈦樣品參比 樣品進行對比(圖2b)。
通過TOF-SIMS鑒定鋰的存在和分布(圖3)。
實施例2: 從鈥植入物表面釋放鋰
在pH5-6， 0.1MLiN03中，通過電勢階3夭技術(shù)將鈦樣品還原。向樣 品施加電負性超過-4V的電勢階3夭(所有電勢都相對于雙接點 Ag/AgCl/KCl參比電極，相對于SHE是197 mV) 5分鐘，導(dǎo)致劇烈地氫 氣釋放。在該還原過程之后，將樣品在水中漂洗并且干燥。
通過ISE (離子選擇電極)和ICP (電感耦合等離子體)鑒定鋰的釋 放。將四個4姿以上所述制備的硬幣形狀的樣品置于盛有15 ml MQ水的 燒杯中。在分析之前，采用20mMHNO3將水酸化至pH4，然后放置90 分鐘同時溫和攪拌。采用ISE和ICP分析溶液，兩種分析都給出了 0.4嗎鋰(litmm)/ml樣品的同樣結(jié)果。
參比實施例1: 培養(yǎng)MG-63細胞
MG-63是本領(lǐng)域常規(guī)采用的進行成骨細胞體外研究的人細胞系 (ATCC No CRL-1427, U.S.)。 MG-63來源于人骨肉瘤并且表現(xiàn)出人成骨細胞的許多顯著特征(trait characteristics),例如堿性磷酸酶(ALP)和 骨保護素(OPG)。 v
在本研究中，從第二代冷凍細胞獲得MG-63細胞，并且在37°C, 在5%<302和100%濕度的氣氛中，在Dulbecco's modified Eagle's培養(yǎng) 基(DMEM)中進一步培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有FCS 5%, PEST 1% , Gibco, UK)。當細胞達到匯合(confluence)時，通過采用0.05% Trypsin-EDTA(Gibco， UK)將它們傳代培養(yǎng)，直至獲得所需量的細胞。
在所有實驗中細胞成活力都很高(>98%),并且通過采用臺盼藍進行 檢測，其中在光學(xué)顯樣i鏡(LM)中在Biirkerchamber中檢測死亡細胞對染 色劑的吸收。
參比實施例2: MG-63細胞的增殖和堿性磷酸酶(ALP)的生產(chǎn)
為了研究鋰對MG-63細胞的增殖和堿性磷酸酶(ALP)的生產(chǎn)的影 響，以10 000個細胞/cm2的接種密度，將參比實施例1中制備的MG-63 細胞傳代培養(yǎng)到24孔板中，總共為20 000個細胞/孔。分別以10mM、' 5mM、 3mM和lmM的最終濃度，將無菌的經(jīng)濾過的LiN03(pH 5.2)添 加到板的各孔中。使用未處理的細胞作為對照。于37。C的溫度，在5% C02和100%濕度的氣氛中，將細胞培養(yǎng)3、 7和14天。
采用NucleoCassette方、;去，通過NucleoCounter (ChemoMetec A/S Denmark),測定在各時期之后各孔中的細胞總數(shù)(x 105)。
通過在pH為1.25的"試劑A"中的細胞溶解以及隨后通過"試劑B" 穩(wěn)定化，來研究細胞的數(shù)目。在NucleoCassette中，加入指示釋放的 DNA的量的碘化丙啶。將盒置于NucleoCounter中，并且測得的熒光染 料的量對應(yīng)于DNA的量。按照生產(chǎn)商的說明進行操作(Chemometec A/S, Denmark)。
在收獲時，分析細胞培養(yǎng)基的ALP含量。根據(jù)生產(chǎn)商 (SenzoLyte / NPP Alkaline Phosphatase Assay Kit Colorimetric BioSite, Sweden)的說明，通過細胞溶解測量細胞內(nèi)ALP。通過自動酶標儀 (Vmax, Molecular Device, UK)將吸收設(shè)置在405 nm。通過將樣品的 光密度與隨套件提供的標準進行比較，可以測定ALP濃度。按照生產(chǎn)商 的說明進行操作(BioSite, Sweden)。
參照圖4，采用5、3和1 mM鋰，在所有三個時間點均實現(xiàn)MG-63細胞的增加的增殖。在7天之后觀測到所監(jiān)測到的最高細胞數(shù)。
與對照(未刺激的細胞)相比，對于所有鋰濃度，ALP的生產(chǎn)最初都 很緩慢。在7天之后，與對照相比，監(jiān)測到小的增加。然而，在14禾 之后，對于所有鋰濃度；1 mM、 3 mM、 5 mM和10 mM，均;險測到 增加的ALP程度。ALP的最高量是對于1 mM鋰，在14天之后觀測 到的。結(jié)果示于圖5中。
參比實施例3: 參比表面的制備
清潔具有硬幣形狀的鈦樣品，然后浸沒在1M的草酸水溶液中，并 且在80。C放置30分鐘，同時劇烈攪拌。30分鐘之后，從草酸溶液中 取出樣品，并在水中漂洗，然后在水中在超聲浴中漂洗2分鐘。將所得 表面稱作"參比表面i"。
對一些樣品進行第二氬氟酸處理。在漂洗之后大約10分鐘，在室 溫將樣品浸沒在0.1 M的HF水溶液中，并且攪拌直至活性溶解開始， 然后是40 s的附加活性處理時間。接著，從HF溶液中移出樣品，并且 在水中漂洗，然后在水中在超聲浴中漂洗2分鐘。在消毒之前，在室溫 在空氣中將樣品干燥約60分鐘。將所得表面稱作"參比表面2"。
參比實施例4: 參比表面上的MG-63增殖
將消過毒的(卩-輻照)分別具有參比表面1和2的Ti硬幣置于24 孔板中。以10 000個細胞/cm2的接種密度，把MG-63細胞傳代培養(yǎng)到 24孔板中的硬幣上，總共是20 000個細胞/孔。以5mM和lmM的最 終濃度，將消毒的經(jīng)過濾的LiN03 (pH 5.2)添加到各孔中。使用未處理 的細胞作為對照。于37。C的溫度，在5。/。C02和100%濕度的氣氛中， 將細胞培養(yǎng)7天。
在培養(yǎng)7天之后，以lmM的濃度包含鋰的參比表面1誘發(fā)增加的 MG-63細胞增殖。在培養(yǎng)細胞7天之后，與沒凈皮刺激的參比表面2相比， 以1 mM的濃度包含鋰的參比表面2誘發(fā)高的細胞增殖。5 mM的最纟冬 鋰濃度誘發(fā)不大的增加的增殖。結(jié)果示于圖6中。
參比實施例5: 在參比表面1上的ALP生產(chǎn)
將在包含濃度為lmM的鋰的參比表面l上的ALP生產(chǎn)與未被刺激
23的不包含鋰的參比表面1進行對比。
如圖7中所示，在培養(yǎng)細l包7天之后，對于lmM鋰ALP生產(chǎn)增加。
參比實施例6: 表面形貌
制備具有(i)參比表面1、 (ii)參比表面2和(iii)參比表面1 +鋰的 鈦樣品，用于掃描電鏡(SEM)檢測。根據(jù)標準技術(shù)，在+4。C用戊二醛 將樣品固定(Kanowsky's),然后采用四氧化鋨，進行脫水，并且最終進 行鍍金。
圖8、9和10示出了在36h之后各表面的表面形貌。與在不包含鋰 的參比表面1和2上的細胞相比，包含鋰的參比表面1具有更大量的 在增殖期的細胞(圖10)(圓的非伸展細胞)和大量的粘著細胞(adhesive cell)。在參比表面l(圖8)和參比表面2(圖9)上，細胞都更薄、更平坦和 更力口伸展。
參比表面1和2上的細胞之間的間隔可能是由于固定困難引起 的，當細胞非常薄并且伸展時經(jīng)常能看到。
在包含鋰的參比表面1上培養(yǎng)的細胞的表面形貌顯示出所述細胞 伸展良好，表明高活性，增殖，以及在表面上形成基質(zhì)和偽足 (pseudopodia)。 細胞附著、增殖和基質(zhì)形成，
對比例1:在分別包含鋰、鈣和鎂的參比表面上的MG-63增殖
消過毒的(P輻照)具有參比表面1和2的Ti硬幣與具有分別包 含鋰、4丐和鎂的參比表面1的Ti硬幣進行比較，并將這些硬幣置于24 孔板中。以10 000個細胞/cm2的接種密度，把MG-63細胞傳代培養(yǎng)到 24孔板中的硬幣上，總共是20 000個細胞/孔。于37。C的溫度，在5% C02和100%濕度的氣氛中，將細胞培養(yǎng)7天。
采用NucleoCassette方法，通過NucleoCounter (ChemoMetec A/S Denmark),測定在各時期之后各孔中的細胞總數(shù)(x105)。 、
通過在pH為1.25的"試劑A"中的細胞溶解以及隨后通過"試劑B" 穩(wěn)定化，來研究細胞的數(shù)目。在NucleoCassette中，加入指示釋放的 DNA的量的碘化丙啶。將盒置于NucleoCounter中，并且測得的熒光染料的量對應(yīng)于DNA的量。按照生產(chǎn)商的說明進行操作(Chemometec A/S， Denmark)。
參照圖11,在培養(yǎng)細胞7天之后，包含鋰的參比表面1的增殖顯示 最高MG-63細胞增殖。該細胞增殖顯著高于包含鈣和鎂的參比表面。
對比例2:在參比表面1上骨保護素的生成 、
在具有分別包含鋰、4丐和鎂的參比表面1的Ti硬幣之間對比骨保 護素(OPG)的生成。
由DuoSet ELISA human 0PG/TNFRSF1 IB (R&D Systems, UK)測定 OPG的量。將各孔中的的上清液離心至不含細胞(5分鐘，400g)并進 一步用于研究。通過將得到的量與生產(chǎn)商提供的標準曲線對照，測定樣 品OPG濃度。測試靈敏度(MDD,可檢測的最小劑量)為50 pg/ml。 按照生產(chǎn)商的說明進行操作(R&D Systems, UK)。
如圖12中所示，在培養(yǎng)細胞7天和14天之后，關(guān)于包含鋰的參 比表面1觀測到最高OPG生成。
對比例3: 體內(nèi)骨組織響應(yīng)
在兔模型中檢測根據(jù)本發(fā)明的植入物的整合。目標是與市售可得 的對照植入物相比，定性和定量研究根據(jù)本發(fā)明的植入物表面改性的體 內(nèi)骨組織響應(yīng)。
用于去除扭矩研究的植入物
將具有包含鋰的參比表面1的扭矩固定物(四方頭去除扭矩設(shè)計， 3.5x8.2 mm)與具有市售可得的OsseospeecTM表面的對照扭矩固定物 (3.5x8.2 mm)進行對比。
才直入物插入
12只成年雄性新西蘭白兔按計劃進行外科手術(shù)。在最初的麻醉階段 2只兔子死亡(糾，10)。
外科手術(shù)平安無事地進行。在連續(xù)NaCl冷卻 下，進行低速鉆孔(對于鉆孔為1500 rpg，對于植入物插入為20 rpm)。 第一鉆頭是小的圓鉆孔錐(burr),并由此用作下一步的更大螺旋鉆(總共 6個鉆頭，直徑在1.2-3.35 mm范圍)的標記。
25將三個植入物("四方頭去除扭矩設(shè)計"；3.5 x8.2 mm)插入各粗隆 脛骨(tuburositas tibia)中。為脛骨植入物設(shè)定去除扭矩測試時間。
去除扭矩結(jié)果
在六周之后結(jié)束研究，殺死白兔。檢查植入物和周圍的組織。脛骨 rtq植入物易于定位，并且它們都顯示出骨膜骨組織生長的跡象。通過去 除扭矩測試(RTQ)進行植入物-骨界面的生物力學(xué)測試。RTQ儀器是電 子設(shè)備(Detektor AB, G6teborg, Sweden),包含用于測試在骨層中的植 入物穩(wěn)定性(峰值松動扭矩，Ncm)的應(yīng)變儀傳感器，并因此可以看作是 粗略反應(yīng)骨組織與植入物之間的界面剪切強度的三維測試(Johansson C. B. , Albrektsson T. C/;力(9ra/ zm/7/"w& Am 1991; 2:24-9)。在才直入物的相同 軸上施加線性增加的扭矩直至發(fā)生整合失敗，并且記錄峰值。
如圖13中所示，與市售可得的OsseospeedTM表面相比，根據(jù)本發(fā)明 的包含鋰的植入物的去除扭矩值得到改善。
權(quán)利要求
1.用于植入到骨組織中的植入物，所述植入物具有表面；所述表面被氧化物層覆蓋，其特征在于，所述氧化物層包含鋰離子。
2. 如權(quán)利要求1所述的植入物，其中，所述植入物為金屬植入物。
3. 如權(quán)利要求2所述的植入物，其中，所述金屬植入物包含鈦或 鈦合金。
4. 如權(quán)利要求1所述的植入物，其中，所述植入物為非-金屬植入 物；所述表面為施加的金屬植入物層。
5. 如權(quán)利要求4所述的植入物，其中，所述金屬植入物層包含鈦 或鈦合金。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，其中，所述氧化物層 的厚度在2 - 100 nm的范圍。
7. 如權(quán)利要求6所述的植入物,，其中，所述氧化物層的厚度在2 -18 nm的范圍。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的植入物，其中，所述氧化物層的厚度在 2 - 6 nm的范圍。
9. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，其中，所述氧化物層 是從所述植入物的所述表面形成的金屬氧化物層。
10. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，還包含在所述氧化物 層上面的沉積物，其中，所述沉積物包含骨刺激劑。
11. 如權(quán)利要求10所述的植入物，其中，所述骨刺激劑選自鋰、 鍶、鎂和鈣或它們的組合。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的植入物，其中，所述沉積物是鹽沉 淀物，包含選自鋰、鍶、鎂和鈣的離子中的任一種或它們的組合。
13. 如權(quán)利要求12所述的植入物，其中，所述鹽沉淀物是鋰鹽沉 淀物。
14. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，其中，所述植入物沒 有包含磷酸鉤化合物的涂層。
15. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，其中，所述植入物的 所述表面包含微粗糙度。
16. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的植入物，其中，所述植入物的所述表面包含氟。
17. 制備骨組織植入物的方法，所述植入物具有被包含鋰離子的氧 化物層覆蓋的植入物表面，所述方法包含以下步驟a) 提供具有植入物表面的植入物；b) 形成覆蓋所述植入物表面的氧化物層；c) 在所述氧化物層上形成帶負電的離子；和d) 使所述氧化物層與鋰離子接觸。
18. 如權(quán)利要求所述的17方法，其中，所述氧化物層是自發(fā)形成的。
19. 如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，所述氧化物層上的所 述帶負電的離子是通過將所述植入物表面置于堿性環(huán)境中而形成的。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述堿性環(huán)境是通過將所 述植入物表面置于堿性溶液中而形成的。
21. 如權(quán)利要求17-19中任一項所述的方法，其中，所述氧化物層 上的所述帶負電的離子是通過施加-0.5 V至-3.5 V范圍的電勢而形成 的。
22. 如權(quán)利要求17-21中任一項所述的方法，其中，所述步驟c和 所迷步驟d是進行同時的。
23. 如權(quán)利要求17-22中任一項所述的方法，其中，通過將所述氧化 物層置于包含鋰離子的溶液中，使所述氧化物層與鋰離子接觸。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述溶液包含氫氧化鋰。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述溶液包含濃度為5.3 M 或更小的氫氧化鋰。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述溶液包含濃度在0.05-2M的范圍內(nèi)的氫氧化鋰。
27. 如權(quán)利要求17-26中任一項所述的方法，還包含在所述氧化層 上面形成包含骨刺激劑的沉積物的步驟。
28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述骨刺激劑選自鋰、鍶、 4丐和鎂或它們的組合。
29. 如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，所述沉積物是通過在 所述氧化物層上沉淀鹽而形成的，所述鹽包含選自鋰、鍶、鈣和鎂的離 子中的任 一 種或它們的組合。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述鹽為氫氧化鋰。
31. 如;K利要求29或30所述的方法，其中，所述沉積物是通過施 加電負性超過-3.5 V的電勢而形成的。
32. 如;K利要求29或30所述的方法，其中，所述沉積物是通過將 所述植入物表面置于》成性溶液中而形成的，所述石咸性溶液包含濃度大于 5.3 M的氬氧化鋰。
33. 如權(quán)利要求17-32中任一項所述的方法，還包含在步驟a)之 后，在所述植入物的所述表面上產(chǎn)生微粗糙度的步驟。
34. 如權(quán)利要求17-33中任一項所述的方法，還包含將氟施加到所 述植入物的所述表面的步驟。
35. 包含金屬氧化物的噴砂粉末，其中，所述金屬氧化物包含鋰離子。
36. 如權(quán)利要求35所述的噴砂粉末，其中，所述金屬氧化物為二 氧化鈦。
37. 如權(quán)利要求35所述的噴砂粉末，其中，所述金屬氧化物為氧 化鋰。
38. 通過向有需要的人給予包含鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載 體的組合物來局部增加骨形成的方法。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中，當將植入物在植入位置處 植入到骨組織中時，在將所述植入物在所述位置處置于骨組織中的空穴 中之前、同時和/或之后，在所述植入位置處給予所述組合物。
40. 鋰離子或其鹽用于制備局部增加骨形成的藥物組合物的用途。
41. 如權(quán)利要求40所述的用途，其中，當將植入物在植入位置處 植入到骨組織中時，在所述植入位置處局部給予所述組合物。
42. 用于將植入物植入到骨組織中的套件，所述套件包含植入物， 其特征在于，所述套件還包含含有鋰離子或其鹽和藥學(xué)上可接受的載 體的纟且合物。
全文摘要
本發(fā)明基于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當將骨組織植入物植入到所述骨組織中時，在骨組織中局部給予鋰離子可以改善骨形成和骨質(zhì)。特別地，本發(fā)明涉及骨組織植入物及其制備方法，所述骨組織植入物具有被包含鋰離子的氧化物層覆蓋的植入物表面。本發(fā)明還提供了包含鋰離子的噴砂粉末、局部增加骨形成的方法、和鋰離子或其鹽用于制備局部增加骨形成的藥物組合物的用途。
文檔編號A61L27/30GK101686861SQ200880023940
公開日2010年3月31日 申請日期2008年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日
發(fā)明者I·彼得森, S·漢松 申請人:艾斯特勒科技公司