專利名稱：：診斷方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及對發(fā)展嚴重敗血癥的易感性診斷和預防。
背景技術：
：敗血癥是對感染的全身炎癥反應，在嚴重情況下造成器官衰竭和死亡。它是發(fā)病和死亡的日益常見的原因，特別是在老年、無免疫應答和病危個體中。已報道敗血癥在非冠脈重病監(jiān)護病房中是最常見的死亡原因(BoneRC等人；Chest.1992年6月;101(6):1644-55)。它以所有住院治療的1%-2%發(fā)生并且死亡率范圍從敗血癥的20%至嚴重敗血癥的40%至敗血癥性《木克(嚴重敗血癥的一個亞類)的〉60%(Leibovici;AnnInternMed1991;U4(8):703，Martin等人;NEnglJMed.2003年4月17日；348(16):1546-54)。敗血癥的臨床定義為出現(xiàn)兩種或更多種以下的狀況，同時具有確認的或懷疑的感染(1)發(fā)燒(溫度:^8。C)或體溫過低(溫度〈6。C);(2)心率〉90次每分鐘；(3)呼吸率〉20次呼吸每分鐘或PaC02<32mmHg;和(4)白細胞計數(shù)〉12(x109細胞/L)或<4(x109細胞/L)。已知狀況(1)至(4)為SIRS(嚴重炎癥反應綜合征)標準(BoneRC等人；Chest.1992Jun;101(6):1644-55)并且被承認是診斷嚴重炎癥的國際標準。表現(xiàn)出SIRS標準的兩種或更多種而沒有證實的或懷疑的感染的個體^f皮歸類為具有非感染相關的SIRS。嚴重敗血癥的臨床定義為如上定義的敗血癥，伴有敗血癥誘導的低血壓、器官功能障礙或灌注異常。敗血癥誘導的低血壓定義為收縮壓〈90mmHg或從不存在其他低血壓原因下的基線處降低<40mmHg。灌注異常可包括，但不限于灌注不足、乳酸性酸中毒、少尿或精神狀況的急性改變。嚴重敗血癥包括作為亞類的敗血癥性休克狀況。該狀況由敗血癥誘導的低血壓的存在而特別定義，盡管足夠的體液復蘇(Fluidresuscitation)連同存在灌注異常。接受收縮性藥或血管加壓藥的個體可能在測量灌注異常時不是低血壓。為了治療嚴重敗血癥，在更嚴重的癥狀(低血壓、器官功能異?；蚬嘧⒉蛔?發(fā)作前診斷以建立充分的治療對成功的結果是極其重要的(RiversE等人.NEnglJMed2001;345(19):1368-77)。例如，Kumar等人表明死亡與在進行第一次治療前、敗血癥誘導的低血壓發(fā)作后所經(jīng)過的小時數(shù)相關(Kumar等人.CritCareMed2006;34(6):1589-96)。需要可靠的生物學或臨床標志物以盡早確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險而最小化在治療建立前的延遲。發(fā)明概述肝素結合蛋白(HBP,CAP37,Azurocidin)是糖基化的、單鏈、帶負電的37kDa無活性的絲氨酸蛋白酶同源物，顯示與人中性粒細胞彈性蛋白酶44%的序列同一性。已發(fā)表了HBP的三維結構(Iversen等人NatStructBiol.1997年4月；4(4):265-8)。它包含在人中性粒細胞的嗜天青顆粒(azurofilicgranulae)中(Lindmark等人，JLeukocBiol1999;66(4):634-43)。它是多功能蛋白，已顯示通過改變血管細胞骨架的Ca"+平衡而誘導血管滲漏(Gautam等人，NatureMedicine2001;7(10):1123-7)。與纖維蛋白原復合的A族鏈球菌(GAS)的M蛋白已顯示通過刺激嗜中性粒細胞的B2-整聯(lián)蛋白受體而誘導HBP的釋放(Herwald等人，Cell2004;116(3):367畫79)。LPS還可通過未知的機理誘導HBP釋i史(Rasmussen等人，F(xiàn)EBSLett1996;390(1):10912)。HBP的序列是公開可用的(例如作為NCBI登錄號NP—001691區(qū)域27..248)并在下面再現(xiàn)為序列識別號1。序列識別號15lgpcgrgpdfftrva:lfrdw工dgvlnnpgp先前還未對表現(xiàn)出一種或多種SIRS標準的個體中的HBP水平進行研究。本發(fā)明人首次表明，HBP水平在隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體中增加。HBP水平在記錄敗血癥誘導的低血壓之前達12小時升高，但如果建立治療則迅速降低。本發(fā)明人還首次表明，HBP/白細胞計數(shù)(WBC)比在隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體中升高。因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種鑒定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的方法，該方法包括測量個體中的HBP并由此確定該個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。本發(fā)明方法還可包括測量個體中的WBC或嗜中性粒細胞計數(shù)(NC)、分別計算HBP/WBC比或HBP/NC比并由此確定該個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。因此，本發(fā)明方法可包括測量個體中的HBP并計算個體中的HBP/WBC水平或HBP/NC比，并由此確定該個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。本發(fā)明還提供-用于檢測HBP的試劑，用來確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中；-用于確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的方法的測試試劑盒，所述測試試劑盒包括用于^r測個體中的HBP的試劑；-降低個體發(fā)展嚴重敗血癥的危險的方法，其包括(i)使用本發(fā)明方法確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中；和(ii)將治療有效量的適于治療感染的藥劑和/或靜脈注射液施用于在(i)中被鑒定為處于危險中的個體。圖1顯示在嚴重敗血癥組(n二51)、敗血癥組(『95)、感染而沒有SIRS組(n=44)和SIRS而沒有感染組(n=12)中的HBP濃度(圖la)、HBP/WBC比(圖lb)、CRP水平(圖lc)、IL-6水平(圖Id)和乳酸鹽水平(圖le)。在方框內(nèi)的線中值；方框邊緣四分位數(shù)(Q1、Q3);觸須線數(shù)值范圍；x和o:由患者數(shù)確定的超偏值。圖la和圖lb的直線分別表示HBP水平為20ng/ml的截斷值和HBP/WBC比為2的截斷值。圖2顯示HBP水平和/或HBP/WBC比、HBP水平、HBP/WBC比、乳酸鹽、白細胞計數(shù)、CRP和IL-6的ROC曲線。從0,0至1,1的直線是參考線。連接產(chǎn)生對角線部分。圖3顯示在嚴重敗血癥組的每個個體(n-51)的HBP/WBC比(圖3a)或HBP濃度(圖3b),依據(jù)相對于最低測量的血壓的時間(由在0小時處的箭頭表示)從收集第一個血漿樣品的時間作圖。在圖3a中的空心圓表示落在HBP/WBC比截斷水平以下但得分在HBP濃度截斷水平以上的患者。在圖3b中的空心圓表示落在HBP濃度截斷水平以下但得分在HBP/WBC比截斷水平以上的患者。圖4顯示在取自16個患有嚴重敗血癥的患者的連續(xù)的血漿樣品中經(jīng)96小時的HBP/WBC比變化(圖4a)和在耳又自7個患有敗血癥、感染而沒有SIRS或沒有感染的患者的連續(xù)血漿樣品中經(jīng)72小時的HBP/WBC比變化(圖4b)。每條線表示單獨的患者。發(fā)明詳述夢錄本發(fā)明涉及鑒定受治療者是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的方法。因此本發(fā)明涉及個體對于嚴重敗血癥的易感性診斷。在測試下的個體通常被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。所述個體通常是哺乳動物。所述哺乳動物通常是人類或諸如馬、母牛、羊、狗或貓的家養(yǎng)哺乳動物。所述個體優(yōu)選人類。個體因為其具有證實的或懷疑的感染和/或顯示出SIRS標準的一種或多種或者兩種或更多種而可能被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。所述SIRS標準是(1)發(fā)燒(溫度〉381:)或體溫過低(溫度<36匸)；(2)心率>90次每分鐘；(3)呼吸率>20次呼吸每分鐘或PaC02<32mmHg;和(4)白細胞計數(shù)>12(x109細胞/L)或<4(x109細胞/L)。證實的或懷疑的感染通常是細菌感染、寄生蟲感染或真菌感染的一種或多種。細菌感染可由一種或多種革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的細菌引起。所述一種或多種革蘭氏陰性的細菌可以選自大腸桿菌(&c/zen'c/^co//)、克雷伯氏菌屬(AT/eZmW/a^;.)(通常為克雷伯氏肺炎菌(AT./"ew附ow/ae)或產(chǎn)商臾克雷4白菌(《.ox少toct/))、腸一干菌屬(￡>tera6acferW/)(通常為陰溝腸桿菌(￡.c/oacae)或產(chǎn)氣腸桿菌())、包特氏菌屬(So^fete//")(通常為支氣管敗血性包特氏菌(5.6rawc/n'^p"c")、百日咳包特氏菌(5.pe^^&)或副百日咳包特氏菌(5.parapeWMM/s))、衣原體屬(C/z/awj^z'a)(通常為砂目艮衣原體(C.frac/zomato))、軍團菌屬(丄eg/o"e〃a)(通常為嗜肺軍團菌(Z.;wewwop/w7/"))、假單胞菌屬()(通常為綠膿假單胞菌(Paerag/"osa))、支原體屬(綺co//osma5p/.)(通常為月申炎支原體(Afp"gw附o"/ae))、；克感口耆血牙干菌(Z/ae附op/n7ws/"/7we"za)、津占質(zhì)妙、雷氏菌)、奇異變形菌(戶ra&ws脂'ra&fc)、鮑氏不動桿菌(J"'"eto6flCer6fifw顧,7)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(5ye"o的//2蘭o"os1ma/to//n7/a)和月鹵膜炎奈瑟氏球菌(7Ve/Men'amem>2g///<ies)(通常為血清組A、B、C、H、I、K、L、X、Y、Z、29E或W135)。所述一種或多種革蘭氏陽性的細菌可以選自葡萄球菌屬()(通常為金黃色葡萄球菌(S.aw船)或凝固酶陰性的葡萄球菌(5"to//^/ococc/))、鏈球菌屬(5^^p/ococcwsw/.)(通常為月巿炎4連J求菌(51,/wewmow'ae)或酉良膿鏈球菌(S，oge腦))和腸球菌屬(五她腦oc面卿.)(通常為屎腸球菌或糞腸球菌(E/aeca/^))。真菌感染可能由一種或多種選自以下的真菌引起白色念珠菌(C朋AV/aa/6/cara)、熱帶念珠菌(O"ofefefraj9/ca//s)、近平滑念珠菌(Ca"d油戶ra戸7冊i)、克柔念珠菌(Ca"c/油Arw化/)、光滑念珠菌(Ga"(i油g/a6rato)和煙曲霉(^4/er/g/〃MS/訓/gof加)。證實的或懷疑的感染可影響身體的任何部位。典型實例包括影響以下部位的感染肺；呼吸道；肝；腎；泌尿道；皮膚(表皮和皮下的)；心臟；胃；腸；血液；骨；關節(jié)或其任意組合。證實的或懷疑的感染可以是腦膜炎。感染可以通過本領域中公知的診斷實踐而證實，例如取自個體的樣品的微生物培養(yǎng)、取自個體的尿或其他體液樣品的抗原測試(特別是對肺炎鏈球菌感染和軍團菌屬感染)或PCR分析(特別是對由諸如支原體、軍團菌屬、衣原體和百日咳包特氏菌的細菌感染引起的非典型肺炎)。新近開發(fā)了多重PCR技術，所述多重PCR技術能夠同時測試多種細菌感染和真菌感染。感染可能因為存在一種或多種以下的一般癥狀而被懷疑高于38。C的發(fā)燒；寒戰(zhàn)；疼痛；持續(xù)痛(ache)或觸痛(tenderness);全身的疲勞感；盜汗；和伴有發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹或疼痛或流出白色、淡黃色或淡綠色體液的傷口或切口。本發(fā)明可用于確定具有發(fā)展嚴重敗血癥的一種或多種另外的危險因子和/或一種或多種傾向的個體的易感性。增加發(fā)展嚴重敗血癥的易感性的危險因子通常包括增加感染易感性的任何因子。這些因子可包括削弱的免疫系統(tǒng)(即個體是無免疫應答的)、或住院治療的患者中存在靜脈內(nèi)導管、手術傷口、外科引流或被稱為褥瘡潰瘍或褥瘡的皮膚受損部位。糖尿病個體更易于發(fā)展嚴重敗血癥。本發(fā)明的診斷方法可以與另一檢測或遺傳測試聯(lián)合進行以改進風險預測。通常，個體不具有慢性炎性相關的疾病和/或不顯示與這樣的疾病特別相關的癥狀。這樣的疾病的實例包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、哮喘、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎和諸如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征和炎性腸病的腸的炎性疾病。如果個體確實具有慢性炎性相關的疾病，他們另外具有如上定義的證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的9一種或多種或兩種或更多種。通常，個體不具有嚴重敗血癥或不顯示將導致嚴重敗血癥的診斷的癥狀。通常這樣的癥狀包括敗血癥誘導的低血壓、器官功能障礙或灌注異常。敗血癥誘導的低血壓被定義為收縮壓<90mmHg或從不存在其他低血壓原因下的基線處降低〈40mmHg。灌注異常可包括，但不限于灌注不足、乳酸性酸中毒、少尿或精神狀況的急性改變。嚴重敗血癥包括作為亞類的敗血癥性休克狀況。該狀況由敗血癥誘導的低血壓的存在而特別定義，盡管足夠的體液復蘇連同存在灌注異常。接受收縮性藥或血管加壓藥的個體可能在測量灌注異常時不是低血壓。本發(fā)明涉及測量HBP在個體中的水平。通常通過確定HBP在取自個體的體液樣品中的濃度而測量HBP水平。根據(jù)本發(fā)明，與基線水平或濃度相比增加的HBP水平指示個體對發(fā)展嚴重敗血癥是易感性的或個體處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。基線水平通常為HBP在被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中但沒有隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體中的水平。例如，本發(fā)明人已表明，當HBP水平是通過確定HBP在取自個體血漿樣品中的濃度而測量時，發(fā)展非嚴重敗血癥的個體具有約8.5ng/ml的中值HBP濃度，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約6.5ng/ml的中值HBP濃度，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約9ng/ml的中值HBP濃度。對于所有被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中但沒有隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體類型的中值HBP濃度為約8ng/ml。在本發(fā)明中，在取自個體的體液樣品中伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥易感性或危險性的增加的HBP濃度通常為大于約15ng/ml或大于約16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml或24ng/ml。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的增加的HBP濃度優(yōu)選大于約20ng/ml。根據(jù)本發(fā)明，伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥增加的易感性或危險性的HBP水平或濃度的增加相對于基線水平或濃度為至少2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的HBP水平或濃度的增加相對于基線水平或濃度優(yōu)選至少2.5倍，因此，重敗血癥的危險。根據(jù)本發(fā)明，相對于基線比增加的HBP/WBC比表明個體對發(fā)展嚴重敗血癥是易感性的或個體處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中?；€比通常為在被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中但沒有隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體中的HBP/WBC比。當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量并且在血樣中的WBC是以細胞數(shù)xlO"l測量時，本發(fā)明人已表明，例如，發(fā)展非嚴重敗血癥的個體具有約0.7:1的中值HBP/WBC比，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約0.85:1的中值HBP/WBC比，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約0.9:1的中值HBP/WBC比。對于所有被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中但沒有隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體類型的中值HBP/WBC比為約0.75:1。在本發(fā)明中，當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量并且在血樣中的WBC計數(shù)是以細胞數(shù)xl09/1測量時，伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的增加的HBP/WBC比通常大于約1.4:1，或大于約1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1或2.4:1。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的增加的HBP/WBC比優(yōu)選大于約2.0:1。根據(jù)本發(fā)明，伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的HBP/WBC比的增加相對于基線比至少為1.5倍、2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的HBP/WBC比的增加相對于基線比優(yōu)選為至少2.5倍。本發(fā)明人已確定，在被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的個體中的平均嗜中性粒細胞計數(shù)(NC)為白細胞計數(shù)(WBC)的約80%。本發(fā)明還可評估HBP/NC比以確定發(fā)展嚴重敗血癥的危險。根據(jù)本發(fā)明，相對于基線比增加的HBP/NC比表明個體對發(fā)展嚴重敗ii血癥是易感性的或個體處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中?；€比通常為在不具有感染和/或不顯示任何SIRS標準的個體中的HBP/NC比。當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量并且在血樣中的NC計數(shù)以細胞數(shù)x109/1測量時，本發(fā)明人已表明，例如，發(fā)展非嚴重敗血癥的個體具有約0.55:1的中值HBP/NC比，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約0.65:1的中值HBP/NC比，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約0.7:1的中值HBP/NC比。對于所有被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中但沒有隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體類型的中值HBP/NC比為約0.6:1。在本發(fā)明中，當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量并且在血樣中的NC計數(shù)是以細胞數(shù)x109/1測量時，伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的增加的HBP/NC比通常大于約l.l:l,或大于約1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1或1.9:1。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的增加的HBP/NC比優(yōu)選大于約1.6:1。根據(jù)本發(fā)明，伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的HBP/NC比的增加相對于基線比至少為1.5倍、2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發(fā)展嚴重敗血癥的易感性或危險性的HBP/NC比的增加相對于基線比優(yōu)選為至少2.5倍。本發(fā)明通常在從個體獲得的樣品上體外進行。樣品通常包含個體的體液。樣品優(yōu)選血液、血漿、血清、尿、腦脊液或關節(jié)液樣品。樣品最優(yōu)選血液樣品。通常在檢測前例如通過離心而處理所述樣品。樣品通常還可在才企測前儲存，優(yōu)選地在-70。C以下儲存。本領域中公知的標準方法可用于檢測HBP水平。這些方法通常包括使用用于檢測HBP的試劑。所述試劑通常與HBP特異性結合。所述試劑可以是對于HBP具有特異性的抗體。特異性應當理解為試劑或抗體與HBP結合而對任何其他的分子(特別是任何其他的蛋白)沒有顯著的交叉反應性。例如，對于HBP具有特異性的試劑或抗體將不顯示與人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶顯著的交叉反應性。可通過任何合適的方法評估交叉反應性。用于本發(fā)明方法中的抗體可以是能夠結合至HBP的全抗體或其片段?？贵w可以是單克隆的。這樣的全抗體通常是通過本領域公知的任何合適的方法制成的抗體。例如，通過用HBP在合適的條件下免疫通常為兔或小鼠的哺乳動物并從例如所述哺乳動物的血清中分離抗體分子，可以獲得多克隆的抗體。單克隆抗體可通過雜交瘤或重組體方法獲得。雜交瘤方法涉及用HBP在合適的條件下免疫通常為兔或小鼠的哺乳動物、然后收獲所述哺乳動物的脾細胞并將其與骨髓瘤細胞融合。然后，將融合的細胞的混合物稀釋并且克隆從單個母細胞中生長。隨后測試由不同克隆分泌的抗體與HBP結合的能力，并然后將最多產(chǎn)且穩(wěn)定的克隆在培養(yǎng)基中生長為高容積。收集并純化分泌的抗體。重組方法涉及將不同免疫球蛋白基因區(qū)段克隆入噬菌體或酵母以產(chǎn)生具有稍微不同的氨基酸序列的抗體庫?？梢赃x擇產(chǎn)生結合至HBP的抗體的序列并且該序列被克隆至，例如，細菌細胞系用于生產(chǎn)。通常，抗體是哺乳動物抗體，諸如靈長類抗體、人類抗體、嚙齒動物抗體(例如小鼠或大鼠)、兔抗體、綿羊抗體、豬抗體、馬抗體或駱駝抗體?？贵w可以是駱駝科動物抗體或鯊魚抗體。抗體可以是納米抗體(nanobody)?？贵w可以是抗體的任何類或同種型，例如IgM，但優(yōu)選IgG。可用于本方法的全抗體的片段包括抗原結合部位，例如Fab或F(ab)2片段。全抗體或片段可以與其他部分結合，所述其他部分例如可用于將2個或更多個片段或抗體連接在一起的連接體。這樣的連接體可以是化學連接體或者可以與片段或全抗體的融合蛋白的形式存在。因此，連接體可用于將具有相同或不同結合特異性的全抗體或片段連接在一起，例如將能夠結合相同或不同多態(tài)性的全抗體或片段連接在一起。抗體可以是能夠結合至兩種不同抗原的雙特異性抗體，所述兩種不同抗原通常為本文提及的任意兩種多態(tài)性?？贵w可以是通過將兩種可變結構域背靠背連接而形成的部位的任何形式存在的情況下，則這些不同特異性通常為在不同位置或在不同蛋白上的多態(tài)性。在一個實施方案中，抗體是包括來自諸如人源化抗體的不同天然抗體的序列的嵌合抗體。評估HBP水平的方法通常包括用能夠與HBP特異性結合的試劑或抗體^^妄觸樣品。這樣的方法可包括浸漬片測定(dipstickassay)和酶if關免疫吸附測定(ELISA)。通常，浸漬片包括與HBP特異性結合的一種或多種抗體或蛋白。如果存在多于一種抗體，抗體優(yōu)選地具有不同的非重疊的決定子以便它們可以同時結合至HBP。ELISA是需要分離試劑的非均勻的、固相測定。ELISA通常使用夾心技術或竟爭技術而進行。夾心技術需要兩種抗體。第一種特異性結合HBP并結合至固體支持體。第二種抗體結合至標志物，通常是酶偶聯(lián)物。使用酶的底物量化HBP-抗體復合物并由此量化在樣品中的HBP的量。抗原竟爭性抑制測定通常也需要結合至支持體的HBP-特異性抗體。將HBP-酶偶聯(lián)物加入待測定的樣品(包含HBP)。HBP-酶偶聯(lián)物與未標記的HBP之間的竟爭抑制允許定量樣品中的HBP的量。用于ELISA反應的固體支持體優(yōu)選包含孔。本發(fā)明還使用不包含抗體的測量HBP的方法。高效液相色譜(HPLC)分離和熒光檢測優(yōu)選用作確定HBP水平的方法?？墒褂孟惹懊枋龅腍PLC設備和方法(TsikasD等人.JChromatogrBBiomedSciAppl1998;705:174-6)。通?；诔叽缁螂姾蛇M行HPLC期間的分離。在HPLC之前，通常將內(nèi)源氨基酸和內(nèi)標L-高精氨酸加入測定樣品并且這些在CBA柱(Varian,HarborCity,CA)上被相提取。樣品中的氨基酸優(yōu)選用鄰-苯二醛(OPA)衍生化。對于所有氨基酸，測定的準確度和精密度優(yōu)選在質(zhì)量控制樣品內(nèi)測定?？墒褂帽绢I域中公知的標準方法測量個體中的白細胞計數(shù)或嗜中性粒細胞計數(shù)。這樣的方法包括自動計數(shù)或手動計數(shù)。本發(fā)明還提供了診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括用于測量個體中的HBP水平并從而確定該個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的裝置。試劑盒通常包括特異性結合HBP的一種或多種抗體。例如，試劑盒可包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體或人源化抗體?？贵w可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段如Fab片段、F(ab，)2片段或Fv片段。如果存在多于一種抗體，抗體優(yōu)選具有不同的非重疊的決定子以-使它們可同時結合至HBP。所述試劑盒可另外包括用于測量個體中WBC計數(shù)的裝置。所述試劑盒可另外包括使上述方法的任一實施方案能夠?qū)嵤┑囊环N或多種其他試劑或裝置。這樣的試劑或裝置包括以下的一種或多種合適的緩沖液(水溶液)、從樣品中分離HBP的裝置、從個體中獲得樣品的裝置(例如包括針的導管或裝置)或可在其上進行定量反應的包括孔的支持體。試劑盒可以任選地包括使試劑盒能夠用于本發(fā)明方法的說明書或關于本方法可對哪些個體實施的詳細說明。甜中的個體的治療。因此，用于降低發(fā)展嚴重敗血癥的危險的物質(zhì)可用于制備用于治療通過本發(fā)明方法鑒定為處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的個體的藥物。因此，通過本發(fā)明方法鑒定為處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的個體的狀況可通過施用這樣的物質(zhì)而被改善。從而，嚴重敗血癥可被預防?？捎糜诮档桶l(fā)展嚴重敗血癥的危險的治療有效量的物質(zhì)可給予通過本發(fā)明方法鑒定為需要其的個體。適于降低發(fā)展嚴重敗血癥的危險的物質(zhì)通常包括一種或多種抗生素和/或一種或多種靜脈注射液。所述一種或多種抗生素通常為廣譜抗生素。廣譜抗生素通常選自一種或多種氨基糖苷類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、磺胺類藥或四環(huán)素類。例如，合適的抗生素包括，但不限于，慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、托普霉素、頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、阿莫西林、氨千西林、氨千西林-舒巴坦、氯唑西林、雙氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、芐星青霉素G、青霉素G鉀、普魯卡因青霉素G、青霉素V鉀、艱拉西林、替卡西林、替卡西林-克拉維酸鉀、乙胺嘧啶-石黃胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺曱噁唑、曱氧千啶-磺胺甲噁唑、金霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素。根據(jù)本發(fā)明可用于降低發(fā)展嚴重敗血癥的危險的物質(zhì)通常與藥學上可接受的載體或稀釋劑配制用于本發(fā)明中的施用。藥物載體或稀釋劑可以15是，例如，等滲溶液。例如，固體口服形式可包括連同活性物質(zhì)的稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；潤滑劑，如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇；結合劑，例如淀粉、阿拉伯樹膠、明膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素或聚乙烯基吡咯烷酮；崩解劑，如淀粉、海藻酸、藻酸鹽或羥基乙酸淀粉鈉；沸騰復合劑；染料；增甜劑；濕潤劑，如卯磷脂、聚山梨醇酯、硫酸月桂酯；和通常用于藥物制劑的非毒性的且藥理學上非活性的物質(zhì)。這樣的藥物制劑可以已知的方式制備，例如通過混合過程、?；^程、制片過程、包糖衣過程或薄膜包衣過程。用于口服施用的液態(tài)分散體可以是糖漿、乳液或懸浮液。糖漿可包含例如蔗糖或蔗糖與甘油和/或甘露醇和/或山梨醇作為載體。懸浮液和乳液可包含例如天然樹膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素或聚乙烯醇作為載體。用于肌肉內(nèi)注射的懸浮液或溶液可包含連同活性物質(zhì)的藥學上可接受的載體，例如無菌水、橄欖油、油酸乙酯、諸如丙二醇的二醇，以及如果需要，合適量的利多卡因鹽酸鹽。用于靜脈內(nèi)施用或輸注的溶液可包含例如無菌水作為載體，或者優(yōu)選地，它們可以無菌的、含水的、等滲的鹽溶液的形式。將用于預防嚴重敗血癥的治療有效量的物質(zhì)施用于根據(jù)本發(fā)明被鑒定的患者。例如抗生素的劑量可根據(jù)多種參數(shù)確定，特別是根據(jù)使用的物質(zhì)；待治療患者的年齡、體重和狀況；施用途徑；以及所需的治療方案。此外，醫(yī)師將能夠?qū)θ魏翁囟ɑ颊叽_定所需施用途徑和劑量。根據(jù)特定抗生素的活性、待治療的受治療者的年齡、體重和狀況以及施用的頻率與途徑，典型的日劑量為每kg體重乂人約0.1mg至50mg。優(yōu)選地，日劑量水平為從5mg至2g。劑量可以單劑量提供或者可以多劑量提供，例如以諸如每日施用2劑、3劑或4劑的有規(guī)律的間隔服用。以下實施例舉例說明了本發(fā)明實施例1.方法研究參與者2006年3月至2007年4月，具有臨床上懷疑感染的202個成年患者被選入在瑞典隆德大學醫(yī)院(LundUniversityHospital)的傳染病醫(yī)療中心(InfectiousDiseaseClinic)的前瞻性研究。入選的標準為發(fā)燒〉38。C并且抗生素治療少于24小時。在許可進入時記錄抗生素治療的持續(xù)時間、人口統(tǒng)計學、SIRS標準和收縮壓(SBP)。分析C反應蛋白(CRP)、乳酸鹽和WBC計數(shù)，并且用于后來分析HBP、IL-6水平的血漿樣品在從許可進入的12小時內(nèi)獲得。在20個患者中，與記錄SIRS標準和SBP平行獲得達96小時的連續(xù)血漿樣品。在出院后，記錄最終的診斷和28天死亡率并且根據(jù)SIRS標準對患者分類(Bone等人，Chest1992;101(6):1644-55)。嚴重敗血癥(第一組)被定義為存在敗血癥并且SBP<90mmHg或在血樣收集的24h內(nèi)從基線處>40mmHg的SBP降低；敗血癥(第二組)被定義為顯示出兩種或更多種SIRS標準以及感染；非敗血癥(第三組)被定義為顯示一種SIRS標準以及感染；和非感染(第四組)被定義為顯示兩種或更多種SIRS標準以及非感染的最終診斷。最終感染診斷為肺炎(n=61)、上呼吸道感染(n=35)、泌尿道感染(n=38)、表皮和皮下感染(n=29)、心內(nèi)膜炎(n=4)、腸胃炎(n=12)或包括局部感染的其他感染(n=ll)。在35個患者(17%)中診斷出菌血癥(17個革蘭氏陰性和18個革蘭氏陽性的細菌)。顯示兩種或更多種SIRS標準的非感染的診斷是肺栓子和系統(tǒng)性血管炎。將血樣收集在4mL塑料的血漿檸檬酸鹽管中、立即以3000rpm離心10min、等分并在-70。C下儲存直到分析時。HBP、IL-6、CRP、乳酸鹽、WBC和HBP/WBC比的分析通過夾心ELISA測定HBP的濃度(ng/ml),如在(Tapper等人；Blood2002;99(5):1785-93)中所述。血漿樣品在PBS中稀釋1/40并且以雙份運行。如在(Rasmussen等人;FEBSLett1996;390(1):109-12)中所述生產(chǎn)并純化重組體人HBP。如在(Lindmark等人；J.Leukoc.Biol1999;1766(4):634-43)中所述制備并純化針對重組體HBP的小鼠單克隆抗體(2F23A)和兔抗血清(409A)并分別以1/3000和1/7000使用。來自Bio-RadLaboratories(Richmond,CA)的過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG以1/3000使用。通過用WBC(xl09細胞/L)除HBP濃度(ng/ml)計算HBP/WBC比。用市售的人IL-6試劑盒(Quantikine,R&DSystems,UK)測試IL-6,檢測限3pg/mL。血漿樣品被稀釋1/40。在RocheHitachiModular-P上根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用來自RocheDiagnostics(Mannheim,Germany)的試劑進行CRP和乳酸鹽分析，除了用于乳酸鹽分析的樣品取自血漿檸檬酸鹽管而不是草酸鹽-氟化物管。才艮據(jù)生產(chǎn)商的說明(Sysmex)在SysmexXE2100中測量白細胞計數(shù)(WBC)。統(tǒng)計分析以中值、四分位數(shù)范圍提供數(shù)據(jù)。使用曼-懷氏等級和檢驗(Mann-Whitneyranksumtest)進行顯著性才企驗。雙尾p值<0.05被視為統(tǒng)計學上顯著的。確定HBP、HBP/WBC比、CRP、WBC和IL-6的接受者工4乍對爭^f正(Receiver-operatingcharacteristic)(ROC)曲纟戔(DeLong等人；Biometrics1988;44(3):837-45)和曲線下面積(AUC)。以95%置信區(qū)間(95%CI)報道AUC值。從交叉表計算敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。陽性似然比和陰性似然比也在表1中才艮道。2.結果研究的參與者的特征滿足入選標準的202個患者包括在內(nèi)。將患者分為以下4組51個患有嚴重敗血癥的患者(第一組)；95個患有敗血癥的患者(第二組)；44個非敗血癥的患者(第三組)和12個非感染的患者(第四組)。這4組的中值年齡和男性/女性比分別為62歲，31/20;57歲,42/53;44歲,15/29;和73歲，11/1。在第一組、第二組和第三組中分別有22個、11個和2個患者被發(fā)現(xiàn)菌血癥。研究參與者中HBP水平和HBP/WBC比的分析許可進入時，與在第二組、第三組和第四組中分別為1/95、0/44和0/12患者相比，嚴重敗血癥組(p〈0.0001)(圖la)的HBP水平顯著較高，42/51患者超過20ng/ml的截斷水平。此外，與其他組相比，嚴重敗血癥組的患者顯示顯著(pO.OOOl)較高的HBP/WBC比(圖lb)。在嚴重敗血癥組的44/51患者中、在敗血癥組的2/95患者中、在非敗血癥組的0/44患者中和在非感染組的0/12患者中發(fā)現(xiàn)高于2.0的HBP/WBC比。此外，與在敗血癥組中的2/95患者和在另外2個組中的0個患者相比較，在嚴重敗血癥組中的47/51患者的血漿HBP水平>20ng/ml或HBP/WBC比>2.0(表1)。類似地，在嚴重敗血癥組中的CRP、IR-6和乳酸鹽水平也顯著較高(p=0.003，pO.OOOl,p〈0細l),盡管在組之間存在大量重疊(圖lc至圖le)。HBP水平和HBP/WBC比的預測值分析如在本研究中布i定25%的嚴重敗血癥患病率，與計算的CRP和IL-6的所有不同截斷水平相比，以下變量顯示在it斷嚴重敗血癥中更好的特異性、^t感性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、陽性似然比(PLR)和陰性似然比(NLR):-HBP水平>20ng/ml表明個體將發(fā)展嚴重敗血癥；或-HBP/WBC比>2.0表明個體將發(fā)展嚴重敗血癥；或-HBP水平〉20ng/ml或HBP/WBC比>2.0表明個體將發(fā)展嚴重敗血癥。這些發(fā)現(xiàn)在表la、表lb和表lc中概述并且由ROC曲線(圖2)所支持。在表2中顯示ROC曲線的統(tǒng)計學分析。HBP水平和HBP/WBC比在臨床癥狀發(fā)作前預測嚴重敗血癥在嚴重敗血癥組的51個患者的20個患者中，在達到最j氐SBP之前，HBP值被提高，達12h(圖3a和圖3b)。在24h內(nèi)，在11個患者中的HBP水平快速降低，所述患者用足夠的抗生素和靜脈注射液治療并痊愈而沒有并發(fā)癥。然而，在患者持續(xù)循環(huán)系統(tǒng)不穩(wěn)定的5個病例中，HBP水平保持升高，這些患者中的1個在入選日的28天內(nèi)死亡(圖4a)。在全部5個患者中，全部死于嚴重敗血癥組并且全部是在最后一次收集的升高的HBP樣品之后1-4日內(nèi)死亡。在患有敗血癥的6個患者中和具有非敗血癥的1個患者中，HBP水平保持低于20ng/ml，以上患者隨后連續(xù)取樣(圖4b)。在嚴重敗血癥組中的20個患者在許可進入時具有增加的HBP水平或HBP/WBC比但是正常的SBP，表明這些指標能夠在標準臨床診斷成為可能之前預測嚴重敗血癥。這通過呈現(xiàn)3天發(fā)燒、腹瀉和嘔吐病史的70歲女性來示例說明。身體檢查是不顯著的，除了發(fā)燒38°C、脈搏率100但130mm/Hg的正常SBP,并且她住院時臨時診斷為腸胃炎。她被給予1000ml靜脈內(nèi)晶體液。6小時后，她發(fā)展為SBP為70mm/Hg的嚴重低血壓、呼吸窘迫，并^^皮立即轉(zhuǎn)移至ICU，后來在ICU:^斷出由于大腸桿菌敗血癥的具有彌漫性血管內(nèi)凝血的ARDS(成人呼吸窘迫綜合征)。在許可進入時，她的HBP水平為80ng/ml并且HBP/WBC比為4.2。表la:在診斷嚴重細菌性敗血癥中所測試的變量的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比變量截斷敏感性特異性PPVNPVPLRNLR<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表lb:在診斷嚴重細菌性敗血癥中HBP的不同截斷水平的敏感性和特異性^HBP截斷特異性敏感性(ng/ml)>1595.188.2>1698,088.2>1798.684.3>1998.684.3>2099.382.4>2199.380.4>2299.378.4>2399.376.5>2499.374.5表lc:在診斷嚴重細菌性敗血癥中HBP/WBC比的不同截斷水平的壽文感性和特#￥HBP/WBC特異性敏感性比截斷1.487.192,21.595.088.21.795.586.31.896.386.31.998.086.32.098.6挑.32.98.684.32.298.681.42.398,678.42.49S.674.53.699.354.9表2:在診斷嚴重細菌性敗血癥中對所測試的變量的ROC曲線的分析測試結果曲線下^f示準漸近面積偏差顯著性(a)(b)漸近95%置信區(qū)間下限上限HBP(ng/ml)HBP/WBC比HBP/WBC比或HBP水平(ng/ml).949細.017.022.019.000.000.000.920.905.988.993,923.997CRP(mg/ml),719.040.000,641.797IL6(pg/ml).789.038.000.714.863乳酸鹽(mmo1/1).769.050.000697.841WBC計數(shù).511.050.820.413.6082權利要求1.一種鑒定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的方法，所述方法包括測量所述個體的HBP并由此確定所述個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。2.如權利要求1所述的方法，其中所述HBP是在取自所述個體的體液樣品中測量的。3.如權利要求1或2所述的方法，其還包括測量所述個體的白細胞計數(shù)(WBC)或嗜中性粒細胞計數(shù)(NC)，分別計算HBP/WBC比或HBP/NC比，并由此確定所述個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。4.如權利要求3所述的方法，其中所述WBC或NC是在取自所述個體的血樣中測量的。5.如權利要求2所述的方法，其中確定所述個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中包括確定所述體液樣品中的HBP濃度是否大于20ng/ml。6.如權利要求2所述的方法，其中所述體液樣品中的HBP水平或濃度相對于HBP的基線水平或濃度增加至少2.5倍。7.如權利要求4所述的方法，其中，當所述體液樣品中的HBP濃度是以ng/ml測量并且所述血樣中的WBC是以細胞數(shù)xl09/1測量時，確定所述個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中包括確定HBP/WBC比是否大于2。8.如權利要求4所述的方法，其中所述血樣中的HBP/WBC比或HBP/NC比分別相對于基線HBP/WBC比或HBP/NC比增加至少2.5倍。9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述個體被懷疑處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。10.如權利要求9所述的方法，其中所述個體具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的一種或多種。11.如權利要求9所述的方法，其中所述個體具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的兩種或多種。12.如權利要求10或11所述的方法，其中所述證實的或懷疑的感染影響肺；呼吸道；肝；腎；泌尿道；皮膚(表皮的和皮下的)；心臟；胃；腸；血液；骨；關節(jié)或其任意組合。13.如權利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述個體是無免疫應答的患者；糖尿病患者；具有靜脈內(nèi)導管、手術傷口、外科引流或褥癡的住院治療的患者；或其任意組合。14.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述個體是哺乳動物。15.如權利要求14所述的方法，其中所述哺乳動物是人。16.—種用于檢測HBP以用于確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的試劑。17.如權利要求16所述的試劑，其中所述試劑包括HBP特異性抗體。18.—種降低個體發(fā)展嚴重敗血癥的危險的方法，其包括(i)使用根據(jù)權利要求1至15中任一項的方法確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中；和(ii)將治療有效量的適于治療感染的藥劑和/或靜脈注射液施用于在(i)中被鑒定為處于危險中的個體。19.如權利要求18所述的方法，其中所述適于治療感染的藥劑為抗生素。20.如權利要求19所述的方法，其中所述抗生素是廣譜抗生素。21.如權利要求19所述的方法，其中所述抗生素是克林霉素。22.—種在用于確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中的方法中使用的測試試劑盒，所述測試試劑盒包括用于檢測個體的HBP的試劑。23.如權利要求21所述的試劑盒，其另外包括用于測量個體的WBC的裝置。全文摘要已證明HBP水平在隨后發(fā)展嚴重敗血癥的個體中增加。因此，在個體中的HBP水平、HBP/WBC比或HBP/NC比可用于確定個體是否處于發(fā)展嚴重敗血癥的危險中。文檔編號A61K39/00GK101687023SQ200880019915公開日2010年3月31日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權日2007年6月12日發(fā)明者L·博喬克,亞當·林德,波爾·艾克森,海科·赫沃爾德,貝蒂爾·克里斯汀森申請人:漢莎醫(yī)藥有限公司