專利名稱：合成tlr激動劑的綴合物及其應(yīng)用的制作方法
合成TLR激動劑的綴合物及其應(yīng)用 鵬申i青白勺航躬l本申請要求以2007年2月7日提交的序列號為60/888， 699的美國申請作為優(yōu)先
權(quán)基礎(chǔ)，該申請的內(nèi)容以引用的方式納入本說明書。 艦fe禾l闊 本文所述發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院頒布的授權(quán)號為AI056453的政府基金的 資助下完成的。美國政府對于本發(fā)明享有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
最近十年來已獲悉很多關(guān)于微生物病原體的先天識別的分子機理。普遍接受的 觀點是，許多體細胞能夠表達多種能檢測潛在病原體的模式識別受體，而與適應(yīng)性免疫系 統(tǒng)無關(guān)(見Janeway et al. , A匪.Rev. Immunol. ,20 :197(2002))。所述受體被認為與 被稱為病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的微生物組分相互作用。PAMP的實例包括肽聚糖、 革蘭氏陽性細胞壁中的脂磷壁酸、甘露糖(其通常存在于微生物的碳水化合物中，但在人 體內(nèi)罕有)、細菌的DNA、病毒的雙鏈RNA，以及真菌細胞壁中的葡聚糖。PAMP通常滿足某 些標準，所述標準包括(a)它們由微生物表達而不是由微生物的哺乳動物宿主表達，(b) 在多種不同的病原體中都具有保持的結(jié)構(gòu)，和(c)能夠剌激先天免疫。已發(fā)現(xiàn)類鐸受體 (Toll-like rec印tor， TLR)在PAMP檢測中和對微生物感染的早期應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵性作 用(見Underhill et al. , Curr. Ooin. Immunol. , 14 :103 (2002))。已經(jīng)識別了十種哺乳 動物TLR和許多這些TLR的激動劑。例如，TLR7和TLR9分別對咪喹莫特(imiquimod)和 免疫剌激性CpG寡核苷酸(ISS-ODN)進行識別和應(yīng)答。合成免疫調(diào)節(jié)劑R-848(瑞喹莫德 (resiquimod))能夠激活TLR7和TLR8。盡管TLR的激活能夠引發(fā)共有的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反 應(yīng)(包括銜接蛋白MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF- k B、以及促炎細胞因子和效應(yīng)細胞因子)，但某些 細胞類型仍傾向于產(chǎn)生特定的TLR。例如，TLR7和TLR9主要存在于樹突細胞(DC)與B淋 巴細胞中的內(nèi)體的內(nèi)表面上(在人體內(nèi)；小鼠的巨噬細胞表達TLR7和TLR9)。另一方面， TLR8存在于人的血液單核細胞中(見Hor皿ng et al. , .T. Immunol. , 168 :4531 (2002))。
干擾素(INF)類也參與免疫應(yīng)答的有效誘導(dǎo)，尤其在病毒感染之后(Brassard et al. , .T. Leukoc. Biol. , 71 :568 (2002))。但是，許多病毒能產(chǎn)生多種在各種水平上阻礙干擾 素的產(chǎn)生或作用的蛋白質(zhì)。干擾素的拮抗被認為是一種規(guī)避先天性免疫以及適應(yīng)性免疫的 一般策略(見Levy et al. 'Cytokine Growth Factor Rev. ,12 :143(2001))。盡管TLR激 動劑對一些治療方法來說可能具有足夠的活性，但是在一些情況下微生物干擾素拮抗劑能 夠減弱合成TLR激動劑的輔助效果。 對微生物感染的更具特異性的反應(yīng)是基于自動免疫接種和被動免疫接種。如果認 為通用免疫接種不具有成本效益(或藥物經(jīng)濟學上不可行)，那么對能得益于免疫預(yù)防的 高危群體的識別可能具有成本效益，盡管可能無法直接識別該群體。但是，對于特定的細菌 感染例如葡萄球菌感染，有一些定義明確的高危群體，包括透析患者、進行腦室腹膜分流術(shù) 的患者、感染性心內(nèi)膜炎高?；颊咭约隘燄B(yǎng)院的居住者，這些群體都遭受著慢性病癥的困擾，這些病癥使他們感染葡萄球菌的風險不斷增加。而且，這些患者中，許多患者感染與醫(yī) 療護理相關(guān)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(healthcare-associatedmethicillin-resista nt St即hylococcus aureus, HAMRSA)的風險也有增加。但是，與防止感染相比，阻止葡萄 球菌群集可能更易做到。 使用多克隆抗體(Capparelli et al. , Antimicrob. A咖tsChemo. ,49 : 4121(2005))或單克隆抗體(mAb) (www, biosynexus. com/productcandidates. html)的被 動免疫預(yù)防可即時(盡管是短期的)保護不能等待疫苗作用顯現(xiàn)或免疫系統(tǒng)受損過度而不 能對疫苗產(chǎn)生應(yīng)答的患者。被動免疫預(yù)防的一種可能的適應(yīng)癥是MRSA相關(guān)感染的醫(yī)院內(nèi) 的爆發(fā)。在該情形下，暴露于感染的個體可通過即時預(yù)防獲益，而居住在同一個病區(qū)或長期 療養(yǎng)機構(gòu)的個體可通過自動免疫接種獲益。此外，重癥監(jiān)護病房患者是被動免疫預(yù)防的潛 在受益者，因為他們都可能具有一種或多種葡萄球菌感染風險因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過穩(wěn)定的共價鍵與大分子相連的合成TLR激動劑的綴合物和包括 所述綴合物的組合物，以及應(yīng)用所述綴合物的方法。所述綴合物可包括與合成TLR激動劑 (例如TLR7或TLR9激動劑)直接相連的大分子、或通過一種接頭(例如氨基、羧基或丁二 酰胺基團)與TLR激動劑相連的大分子。例如本發(fā)明的綴合物包括一種與以下大分子共價 相連的合成TLR激動劑(藥效團)例如，肽；多肽，例如抗體或其抗原結(jié)合片段；脂質(zhì)；聚 合物，例如聚乙二醇；珠，例如聚苯乙烯珠；或樹突狀物(dendrimer)。本發(fā)明的綴合物為廣 譜、長效和無毒的合成免疫剌激劑，其適用于激活哺乳動物例如人類的免疫系統(tǒng)。具體而 言，本發(fā)明的綴合物可使免疫應(yīng)答最優(yōu)化，同時抑制與非綴合TLR激動劑有關(guān)的不良的全 身副作用。 合成TLR激動劑可有助于使該綴合物指向靶細胞內(nèi)體內(nèi)的TLR并促進大分子的送 遞。在一個實施方案中，合成TLR激動劑為特異性針對內(nèi)體TLR的激動劑。在一個實施方 案中，TLR激動劑可為TLR7、TLR8、TLR3或TLR9激動劑。此外，合成TLR激動劑可增強對大 分子的應(yīng)答(例如免疫應(yīng)答)。類似地，大分子可適用于激活免疫系統(tǒng)和/或可使綴合物指 向特定細胞。因此，大分子——例如具有與合成TLR激動劑相連的伯氨基的大分子——可 增強合成TLR激動劑的活性或具有另外的有益的活性。例如，大分子可通過幫助激動劑指 向靶細胞內(nèi)體內(nèi)的TLR、通過增強由TLR激動劑誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、或通過使受體交聯(lián)、或上 述方式的任何結(jié)合而強化TLR激動劑的活性。在一個實施方案中，大分子為一種自發(fā)納入 脂質(zhì)體中的脂質(zhì)。在一個實施方案中，大分子為一種表面具有胺基的納米粒。在與TLR激 動劑偶聯(lián)之后，可駐留(或存在)于內(nèi)體中的TLR激動劑-納米粒綴合物的尺寸可為例如 約100nm。 醫(yī)院獲得性金黃色葡萄球菌(SA)感染是造成發(fā)病和死亡的主要原因。然而，疫苗 不能用于急性環(huán)境，這是因為它們需要太長的時間才能發(fā)揮作用，并且它們對于免疫受損 患者無效。本發(fā)明提供了一種快速接種具有革蘭氏陽性細菌感染例如SA感染風險的患者 的方法，所述方法使用類鐸受體-7(TLR7)激動劑和一種或多種革蘭氏陽性細菌抗原(免疫 原)。使用本發(fā)明的疫苗可在約6天內(nèi)誘發(fā)免疫，由此可用于不適用標準接種方案(例如急 性醫(yī)療環(huán)境)的應(yīng)用中。
如本文所述，制備了一種包括革蘭氏陽性細菌、炭疽桿菌(Bacillus anthracis， BA)和一種合成TLR7激動劑的組合物。所述組合物誘發(fā)體外的IL12和IL6分泌(骨髓來 源的巨噬細胞(BMDM)激活的表現(xiàn))，并保護小鼠抵抗體內(nèi)隨后原本要發(fā)生的致命肺內(nèi)BA攻 擊。具體而言，含有一種TLR7激動劑綴合物和一種免疫原(UC-IV199-白蛋白/經(jīng)輻射的 BA芽孢)的組合物的施用在6天內(nèi)誘發(fā)對BA的保護性免疫。但是，僅使用BA芽孢或使用 BA加一種常規(guī)佐劑(例如霍亂毒素(CT))注射動物體則不能保護該動物體免于致命攻擊。 在未經(jīng)用藥的動物體內(nèi)保護性免疫應(yīng)答的快速程度是出乎意料的。 因此，本發(fā)明提供了免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合 物包括一種與革蘭氏陽性細菌細胞偶聯(lián)(例如，與滅活的金黃色葡萄球菌上的游離氨基 偶聯(lián))的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑，例如UC-IV199 ;—種與分離的革蘭氏陽性細 菌抗原的細菌提取物偶聯(lián)的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑；一種與分離的革蘭氏陽性 細菌蛋白(例如重組蛋白)偶聯(lián)的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑；或一種與分離的革 蘭氏陽性細菌碳水化合物偶聯(lián)的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑。例如可通過一些使金 黃色葡萄球菌多糖與蛋白載體(例如用于破傷風類毒素的蛋白載體)相連的方法使合成 TLR7激動劑與細菌碳水化合物偶聯(lián)。滅活的細菌制劑可通過Y輻射、加熱或化學處理制 備。在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包括一種與佐劑和一種含有滅活的革 蘭氏陽性細菌細胞的制劑偶聯(lián)的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑；一種與佐劑和一種含 有革蘭氏陽性細菌提取物的制劑偶聯(lián)的合成TLR激動劑，例如TLR7激動劑；或一種與佐劑 和一種含有分離的革蘭氏陽性細菌抗原(例如重組蛋白)的制劑偶聯(lián)的合成TLR激動劑， 例如TLR7激動劑。例如所述免疫原性組合物可包括與白蛋白和一種含有滅活的革蘭氏陽 性細菌(例如滅活的金黃色葡萄球菌)的制劑偶聯(lián)的UC-IV199。在一個實施方案中，本發(fā) 明的免疫原性組合物包括一種與佐劑和一種含有重組革蘭氏陽性細菌抗原或分離的革蘭 氏陽性細菌碳水化合物的制劑偶聯(lián)的合成TLR7激動劑，所述重組革蘭氏陽性細菌抗原例 如分離的革蘭氏陽性細菌蛋白或其肽。在一個實施方案中，單劑量的免疫原性組合物可在 短時間例如少于約10天內(nèi)表現(xiàn)出極強的活性，例如提供保護性免疫。 在一個實施方案中，在住院治療之前0至7天對受試者施用無菌疫苗。在一個實 施方案中，疫苗為肌內(nèi)給藥。在一個實施方案中，疫苗以10iig至10mg的劑量給藥。
當可用的多用途化學方法允許進行與任何抗原的綴合、并且可修飾的綴合物具有 確定的化學計量時，使用本發(fā)明的合成TLR激動劑(例如TLR7激動劑)的綴合物將非常有 利。所述綴合物的制備花費低且藥效強大，并由此提供快速的保護，故可在急性環(huán)境例如創(chuàng) 傷、燒傷、術(shù)前或生物恐怖侵襲(bio-terrorism)時使用。
因此，提供一種如下的式(I)化合物，或其可藥用鹽
<formula>formula see original document page 12</formula>
環(huán)烷基取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子
;焼基、輕基C卜6亞焼基、C卜6焼
芳基、C5—9 其中X1為-0-、 -S-、或-NIT-;
其中Y為S或NH;
其中Re為氫、(V1Q烷基或被C3
一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中取代基為羥基、Q 氧基、C卜6烷氧基(V6亞烷基或氰基； 其中R1為(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、C6—1Q芳基、或取代的C6 雜環(huán)基、取代的(V9雜環(huán)基； 其中R2各自獨立地為氫、_0H、 (CrC6)烷基、取代的(CrC6)烷基、(CrC6)烷 氧基、取代的(C「C6)烷氧基、-C(0)-(C「C6)烷基(烷酰基)、取代的-c(o)-(c「Ce)烷 基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0) 0 (CrC6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (CrC6)烷基、-NRaRb、-C (0) NRaRb (氨甲酰基)、 取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基； 其中Ra和Rb各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、(Q-C;)烷氧基、鹵代
(c「c6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷?；?、羥基(c「c6)烷基、芳基、芳基
(Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基；
其中X2為一個鍵或一個連接基團；
其中R3為一種大分子；
其中n為l、2、3或4; 其中m為1、2、3或更大；例如5、 10、 15或更大; 其中q為1、2、3，或最多達約1，000、約10， 000或更大，例如約105、約106或更多。 在一個實施方案中，q為l，且m為l至20或其間的任何整數(shù)。在另一個實施方案中，m為 1，且q為〉2。在一個實施方案中，m為1，且W可為一種病毒——例如一種非猿免疫缺陷 病毒(SIV)的慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、立桿病毒、鼻病毒、乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一種革蘭 氏陽性細菌或細菌芽孢或者一種納米?；蛞环N珠例如二氧化硅珠，并且q為102、103、104、 10s、10e或更大。因此所述綴合物可包括TLR激動劑的多聚體、大分子的多聚體或上述兩者。 所述多聚體可為線狀或分支狀。 在一個實施方案中，W可為一種包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陽性細菌的肽、革蘭 氏陽性細菌的蛋白質(zhì)、革蘭氏陽性細菌的碳水化合物或一種佐劑的大分子，所述佐劑例如 為異源蛋白或肽，即源自革蘭氏陽性細菌以外來源的蛋白質(zhì)或肽，例如宿主細胞蛋白或肽， 例如白蛋白或卵清蛋白；或異源脂質(zhì)、異源核酸、珠例如聚苯乙烯珠、納米?；驑渫粻钗?。
因此，在多個實施方案中，m可為1或2 ;且q可為1或2。在一些實施方案中，m為1，且W基團的表面與成百上千或更多q個基團相連。例如，二氧化硅顆粒的反應(yīng)活性位點可以用于將二氧化硅顆粒連接至本文上式的基團部分上。對于此構(gòu)型而言，f可為本文所述的其它任何大分子，例如納米粒、珠、樹突狀物、脂質(zhì)、芽孢或細菌細胞。在另一些實施方案中，上式與基團R3可形成一種具有3至約10個重復(fù)單元的交替重復(fù)鏈(例如式-R3-式-R3-式-R3等)。 本發(fā)明綴合物中的大分子與TLR激動劑形成一個穩(wěn)定的鍵，即所述綴合物不發(fā)揮
前藥的作用。所述大分子可包括由碳、氧、氫、氮、硫、磷或其任何結(jié)合組成的有機分子，只要
該大分子不危害身體組織即可(例如其無毒并且/或者不引發(fā)炎癥)。所述大分子可使得
靶向目標或增強免疫應(yīng)答，例如所述大分子可為一種抗原，例如黑色素瘤特異性肽。 在多個實施方案中，當本文所述的任何結(jié)構(gòu)式的分子中存在多于一個的R3時，R3
可各自相同，或W基團可彼此不同。因此，當存在多于一個的RS基團時，W各自獨立地為針
對各式所定義的基團。 此外，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含至少一種式(I)的化合物或其可藥用鹽，并結(jié)合有可藥用的稀釋劑或載體。 除TLR激動劑綴合物和其它分子之外，本發(fā)明還包括合成TLR激動劑與大分子的綴合物的應(yīng)用。所述綴合物可用于預(yù)防、抑制或治療包括但不限于以下的疾病過敏性哮喘；傳染病，例如病毒性呼吸道感染，如與流感病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)感染有關(guān)的病毒性呼吸道感染；狼瘡；和其它的自身免疫疾??；并且所述綴合物可用作疫苗，例如癌癥或傳染病的疫苗。在一個實施方案中，單劑量的綴合物對于剌激免疫應(yīng)答可表現(xiàn)出極強的活性。此外，由于綴合物的低毒性，在一些情況下可以以較高的劑量給藥，例如在全身性給藥的情況下；然而在另一些情況下可以以較低的劑量給藥，例如，由于綴合物的定域作用。在一個實施方案中，當以高劑量給藥時，合成TLR激動劑綴合物可誘發(fā)拮抗反應(yīng)，因此可適用于抑制或治療哮喘或自身免疫疾病。首次劑量可誘發(fā)高應(yīng)答，該高應(yīng)答轉(zhuǎn)而抑制免疫應(yīng)答，從而避免發(fā)生炎癥。因此較高劑量和再次給藥的應(yīng)用可導(dǎo)致對免疫應(yīng)答的抑制。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)防或抑制哺乳動物的革蘭氏陽性細菌感染的方法。所述方法包括對哺乳動物施用一種有效量的組合物，所述組合物包含一種革蘭氏陽性細菌的細菌抗原和一定量的式(IA)化合物或其可藥用鹽，所述鹽包括其水合物，
<formula>formula see original document page 13</formula> 其中X1為-0-、 -S-或-NRC-; 其中Re為氫、C卜1Q烷基或取代的C卜1Q烷基，或者Re和R1可與氮原子一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、d—6烷基、羥基C卜6亞烷基、(V6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、(V6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
R1為氫、(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜環(huán)基、取代的C5—9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜6烷基、羥基C卜6亞烷基、(V6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、(V6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
f各自獨立地為氫、-0H、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(C「Ce)烷氧基、取代的
(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷酰基)、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)
芳基(芳酰基)、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(0) 0(C「C6)烷基、-NRaRb、 -C(0)NRaRb(氨甲?；?、取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
Ra和Rb各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代
(c「c6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷?；⒘u基(c「c6)烷基、芳基、芳基
(Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基； f為一個鍵或一個連接基團；n為1、2、3或4 ;且W為一種大分子，包括異源肽、異源蛋白質(zhì)、異源脂質(zhì)、珠例如聚苯乙烯珠、異源核酸分子或樹突狀物。 在某些實施方案中，上述基團R1的定義可與本文所述的其他任何式的基團R1的定義交互使用。 因此，大分子或接頭的非限制性實例不僅包括氧原子、硫原子、氮原子或碳原子(如果需要，適當?shù)馗郊託湓右匝a充化合價)，還包括具有能增加溶解性的側(cè)鏈的大分子或接頭，例如含有嗎啉代環(huán)、哌啶子基環(huán)、吡咯烷環(huán)或哌嗪環(huán)等的基團；氨基酸類、氨基酸聚合物類(蛋白質(zhì)或肽)，例如二肽或三肽等；碳水化合物(多糖)；核苷酸，例如PNA、RNA和
DNA等；有機物質(zhì)聚合物，例如聚乙二醇、聚交酯等；單體脂質(zhì)和聚合脂質(zhì)；不溶性有機納米
粒；無毒的機體物質(zhì)，例如細胞類、脂質(zhì)類、抗原類，例如微生物，所述微生物例如病毒、細菌、真菌等?？乖惪砂ㄊЩ畹恼麄€生物體或其亞組分等。 此外，還提供一種預(yù)防或抑制哺乳動物的革蘭氏陽性細菌感染的方法。所述方法包括對哺乳動物施用一種有效量的式(IB)化合物或其可藥用鹽，所述可藥用鹽包括其水合物，
(R2)n(IB) 其中X1為-0-、 -S-、或-NRe-; 其中Re為氫、C卜1Q烷基或取代的C卜1Q烷基，或者Re和R1可與氮原子一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、d—6烷基、羥基C卜6亞烷基、(V6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、(V6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
R1為氫、(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜
14環(huán)基、取代的C5—9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜6烷基、羥基C卜6亞烷基、(V6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、(V6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；[OOM] f各自獨立地為氫、-0H、 (Q-Ce)烷基、取代的(Q-Ce)烷基、(C「Ce)烷氧基、取代的
(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)
芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(0) 0(C「C6)烷基、-NRaRb、 -C(0)NRaRb(氨甲酰基)、取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
If和W各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代
(c「c6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷酰基、羥基(c「c6)烷基、芳基、芳基
(Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基； f為一個鍵或一個連接基團；n為l、2、3或4 ;且W為所述革蘭氏陽性細菌、一種所述革蘭氏陽性細菌的分離的抗原性蛋白或肽，或一種所述革蘭氏陽性細菌的分離的多糖。在一個實施方案中，所述革蘭氏陽性細菌為一種葡萄球菌。在一個實施方案中，W為一種葡萄球菌的分離的抗原性蛋白質(zhì)或肽，并且該化合物與一種滅活的葡萄球菌的制劑一起給藥。 本發(fā)明提供了一種用于醫(yī)學療法的本發(fā)明化合物(例如，用于預(yù)防細菌性疾病，
例如用于疫苗中)。本發(fā)明化合物還適用于生物防御，例如抵抗炭疽桿菌。 此外，還提供了用于醫(yī)學療法的本發(fā)明的組合物和化合物，例如用于治療哮喘或
病毒感染、或預(yù)防病毒感染；以及將所述綴合物用于制備治療TLR相關(guān)病癥或癥狀或表現(xiàn)
出增強的免疫應(yīng)答或抑制的免疫應(yīng)答的病癥或癥狀的藥物的應(yīng)用。 此外，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的化合物或一種其可藥用鹽，并結(jié)合有可藥用的稀釋劑或載體；所述藥物組合物還任選地結(jié)合有一種選定的革蘭氏陽性細菌的制劑(例如滅活制劑或提取物)、選定革蘭氏陽性細菌的分離的蛋白質(zhì)、或選定革蘭氏陽性細菌的分離的碳水化合物(多糖)。 本發(fā)明包括TLR7激動劑與一種大分子的綴合物的應(yīng)用，所述大分子(例如具有伯氨基)能夠增強激動劑的活性，例如白蛋白；或具有一種獨立的所需活性，例如為革蘭氏陽性細菌的抗原。綴合物可包括直接與TLR7激動劑連接的大分子、或通過接頭與TLR7激動劑連接的大分子。綴合物可最優(yōu)化免疫應(yīng)答，同時限制TLR7激動劑的不良全身性副作用。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療哺乳動物例如人的革蘭氏陽性細菌感染的方法。所述方法包括對需要這類治療的哺乳動物施用一種有效量的本發(fā)明化合物或一種其可藥用鹽，所述化合物或其可藥用鹽與一種佐劑或與至少一種革蘭氏陽性細菌的抗原綴合。 此外，還提供了一種識別適用于預(yù)防、抑制或治療特定病癥或癥狀的綴合物的方法，例如通過識別體內(nèi)或體外通過綴合物誘導(dǎo)的細胞因子譜，或識別例如早期、中期或晚期的具有針對TLR激動劑的TLR的內(nèi)體。由于不同的細胞具有不同的內(nèi)體，故對細胞中內(nèi)體模式的識別可使綴合物靶向特定的細胞類型，或促進綴合物接近內(nèi)體。


圖1示出一種TLR激動劑/ a _半乳糖_神經(jīng)酰胺綴合物。
圖2示出一種G1 PAMAM與乙二胺母核的UC-1V150綴合物。
圖3A示出一種連接大分子和合成TLR激動劑的接頭(SANH)。
圖3B示出UC-1V150的合成。 圖3C示出UC-1V150與MSA的綴合。將200 ii 1 MSA(25mg/ml)與100 ii 1綴合緩沖 液(1M磷酸鹽，pH = 7. 2)和690 ii 1 PBS混合。將含844 ii g SANH的10 ii 1 DFM(40倍摩爾 過量于MSA)加入至蛋白溶液中(反應(yīng)混合物中NP的最終濃度為5mg/ml)。稍作混合后使 反應(yīng)在室溫下進行2h。為除去過量的SANH，將反應(yīng)混合物裝載至微旋過濾裝置(microcon spin filter device, YM_3， Millipore)，并濃縮至約70 ii L。將溶解于10iU DMF中的 460 ii g UC-1V150加入經(jīng)SANH修飾的MSA中，并將該反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)過夜。首先 將反應(yīng)混合物用微旋過濾裝置(Millipore :YM-3)濃縮至50 yl，然后裝載至G25微旋柱上 (GE Healthcare)，以除去過量的UC_1V150。 圖4為式I化合物(0VA/SANH/UC-1V150綴合物)的吸收曲線(于約350nm處) 的示圖。 圖5示出合成TLR7激動劑UC-1V150與小鼠血清白蛋白(MSA)的綴合反應(yīng)的吸光 度曲線。UC-1V150與鼠血清白蛋白(MSA)的比例約為5 : 1。
圖6示出TLR激動劑/磷脂綴合物。 圖7示出以不同劑量和時間給藥的UC-1V199/脂質(zhì)的作用。
圖8A-B示出UC-1V199/脂質(zhì)抑制TLR7和TLR2信號傳導(dǎo)。 圖9示出對超強(ultr即otent) TLR7激動劑(皮摩爾/納摩爾激動劑和小分子拮 抗劑)的雙相(biphasic)劑量反應(yīng)。 圖IOA和B示出UC-1V150/MSA綴合物能夠激活鼠類動物的骨髓來源巨噬細胞(圖 表A)和人外周血液單核細胞(圖表B)。細胞用多種濃度的綴合物培養(yǎng)，對于BMDM，濃度為 0. 5nM至10 ii M，或者，對于PBMC，濃度為0. 1_10 y M。 24h后收集培養(yǎng)上清液并用Luminex 分析細胞因子水平。 圖11A、 B和C示出TLR7激動劑綴合物的體內(nèi)藥效。每只C57BL/6小鼠用不同量 的UC-1V150 (醛基修飾的SM-360320)或UC-1V150/MSA注射(尾靜脈注射)。收集血清試 樣并用Luminex分析細胞因子水平。未綴合的合成TLR7激動劑SM-360320的作用僅持續(xù) 2小時，而UC-1V150/MSA能持續(xù)作用至少6小時。 圖12示出UC-1V150/MSA綴合物的體內(nèi)持續(xù)局部活性，其無全身性效應(yīng)。將 C57BL/6小鼠麻醉并對其施用3nmo1的UC-1V150/MSA(鞘內(nèi)注射)。在指定時間點時處死 小鼠并收集BALF和血清。將兩組獨立實驗的數(shù)據(jù)合并，每組至少6只小鼠。結(jié)果以平均值 士SEM示出。 圖13示出經(jīng)輻射的炭疽芽孢TLR7激動劑綴合物對BMDM中細胞因子的誘導(dǎo)。
圖14提供了用UC-1V150/MSA免疫接種小鼠并用芽孢攻擊后的小鼠存活率圖。A) 在炭疽桿菌感染前1天，年齡相當?shù)拇菩訟/J小鼠以0. 75nmo1/小鼠的量用單純的鹽水或 用含有MSA (與UC-1V150/MSA等量)、UC_1V150或UC-1V150/MSA的鹽水鼻內(nèi)(i. n.)給藥， 存活率最長評估13天。B)在流感病毒感染前1天，Balb/c小鼠以5nmo1/小鼠的量用鹽水或UC-1V150/MSA鼻內(nèi)(i.n.)給藥，評估21天的存活率。在每個模型中，使用Kaplan-Meier 存活曲線和時序檢驗確定顯著性。每組至少測試8只小鼠。 圖15提供單劑量使用含TLR7激動劑和綴合物的疫苗后存活百分數(shù)的圖表。
圖16示出抵抗炭疽芽孢暴露的保護取決于CD4+細胞。 圖17示出小鼠的局部細胞因子曲線。C57BL/6小鼠分別用UC-1V150/MSA綴合物 或未綴合的UC-1V136以每只3nmo1或500nmo1的量鞘內(nèi)(i. t.)給藥。在指定時間點收集 BALF和血清，并通過多重免疫分析確定細胞因子水平。示出了由每組至少3-5只小鼠得到 的平均值士SEM。 圖18示出SIV顆粒與UC-1V150直接綴合的吸光度譜線。 圖19示出由合成TLR7激動劑和病毒顆粒的綴合物引起的BMDC中的細胞因子誘導(dǎo)。
圖20A-B示出UC-1V150/失活SIV的綴合物(圖表A)或UC-1V150/0VA/0DN(圖 表B)對IL-12的產(chǎn)生的作用。骨髓BMDC如所示出的以0. 1 y g/mL在不同條件下培養(yǎng)24 小時。用ELISA測定該細胞培養(yǎng)上清液中的IL-12水平。 圖21為0VA/UC-1V150或0VA/0DN(0DN =寡聚脫氧核苷酸)對骨髓來源樹突細胞 (BMDC)的剌激作用的示圖。 圖22為雙綴合物(0VA/UC-1V150/0DN 1043)的UV光譜的示意圖。 圖23為用0VA/0DN/UC-1V150綴合物在BMDC中誘導(dǎo)IL-12的示意圖。0VA/1043
和OVA/1018為ODN綴合物。 圖24示出合成TLR激動劑與脂質(zhì)體中脂質(zhì)部分的綴合作用。經(jīng)由間隔接頭與C-15 脂質(zhì)偶聯(lián)的TLR綴合物的自組裝導(dǎo)致形成100nM的納米粒。TLR激動劑與該脂質(zhì)的NHS-酯 以等摩爾量在DMF和l個當量的三乙胺中反應(yīng)6小時。反應(yīng)混合物在50 : 50乙腈/水的 無梯度洗脫條件下通過制備型HPLC純化。 圖25示出TLR激動劑/脂質(zhì)體綴合物的示意圖。脂質(zhì)體用膽固醇DOPE :DSPC : mPEG2000-DSPE : TLR-DSPE : B0DIPY-D0PE30 : 30 : 30 : 5 : 5 : 1. 5形成；
DSPE =二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；DOPE =二油酰磷脂酰乙醇胺；BODIPY = 6-(((4_4_ 二 氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-噴丹烯-3-基)苯乙烯基氧基)乙?；? 氨基己酰氨基-DOPE。將膽固醇DOPE : DSPC : DSPE-TLR激動齊U : DSPE-mPEG(以
i : i : i : o. 16 : o. ie的摩爾比)的氯仿溶液加入30mL玻璃培養(yǎng)管中，于氮氣流下干
燥并真空干燥至少6小時，以除去全部殘留的有機溶劑。將干燥的脂膜在總體積為lmL的 無菌去離子水中水合至少12小時。將脂質(zhì)體渦旋2-3分鐘以除去所有粘附的脂膜，并在 室溫下于浴槽型超聲波儀(ULTRAsonik 28X)中聲處理2_3分鐘以產(chǎn)生多層脂質(zhì)體(MLV)。 然后將MLV用Ti-探頭(使用100%占空比(duty cycle)和25W輸出功率的Branson 450 超聲波儀)在冰浴中聲處理1-2分鐘通過形成澄清半透明溶液以產(chǎn)生所述小單層脂質(zhì)體 (SUV)。該溶液依次通過200nm和100nm聚碳酸酯核微孔膜進行加壓過濾以獲得多分散因 子小于0. 1的lOOnm的脂質(zhì)體納米粒。 圖26示出脂質(zhì)綴合物WW-109的合成。將0. 45mg (1 y mol)的IV-199加入100 y L 的10mM DOPE氯仿溶液中。向該溶液中加入來自氯仿原液的O. lmg三乙胺。該混合物于室 溫反應(yīng)24小時，然后旋蒸出氯仿。白色固體殘留物用60% /甲醇/己烷洗滌3次，離心獲 得白色固體。質(zhì)譜的m/z為1086且該化合物的紫外最大吸收波長為268nm。不同鏈長的
17脂肪酸部分可用來制備類似的化合物，包括在羧酸碳鏈的任何合適部位具有1個、2個、3個
或4個不飽和、環(huán)氧化、羥基化或它們的結(jié)合的位點的(:14-(:22羧酸。在一個具體的實施方案 中，脂肪酸部分為在(:8-(:9處具有不飽和位點的(:17羧酸。在另一個實施方案中，脂肪酸部分 為在QrQ。處具有不飽和位點的c^羧酸。各脂肪酸部分的羧酸部分可相同或不同(見例 如圖6)。 圖27示出與TLR激動劑共價相連的二氧化硅顆粒的示意圖。 圖28提供了用于制備本發(fā)明綴合物或用于本發(fā)明方法的示例性化合物。其他 綴合物包括與人血清白蛋白偶聯(lián)的TLR激動劑，例如HSA/UC-1V150或D0PE/UC-1V199。 UC-1X-51使a腫瘤壞死因子(TNF-a )的水平增加3倍(110ng/mL)。
具體實施方式

本文所用術(shù)語"抗體"是指具有一種或多種基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋 白基因片段編碼的多肽的蛋白質(zhì)。已識別的免疫球蛋白基因包括k 、 A 、 a 、 Y 、 S 、 e禾口 P恒定區(qū)基因、以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分作k或A。重鏈分作Y、ii、 a 、 S或e ，而它們又用來限定免疫球蛋白的類別，分別為IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
已知免疫球蛋白(抗體)的基本結(jié)構(gòu)單元包括一種四聚體。每個四聚體由兩對相 同的多肽鏈組成，每對具有一個"輕"鏈(約25kD)和一個"重"鏈(約50-70kD)。各鏈的 N-端限定一個可變區(qū)，所述可變區(qū)具有約100至110或更多個主要引起抗原識別的氨基酸。 術(shù)語可變輕鏈(\)和可變重鏈(VH)分別指代這些輕鏈和重鏈。 抗體可作為完整的免疫球蛋白或各種形式的修飾物存在，所述修飾物包括，例如， FabFC2、Fab、FV、Fd、 (Fab' )2、一種僅含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的Fv片段、一種含有可 變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab) '2片段、一種單鏈抗體例如scFv、CDR移植抗體等。Fv的 重鏈和輕鏈可源自相同的抗體，或不同的抗體從而產(chǎn)生一個嵌合的Fv區(qū)。該抗體可為動物 (特別是小鼠或大鼠)源性或人源性，或可為嵌合的或人源化的。本文所用術(shù)語"抗體"包 括上述各種形式。 組合物包括一種特定化合物的"基本全部"或一種化合物的特定形式(例如異構(gòu) 體)，此時組合物包括至少約90重量％ 、優(yōu)選至少約95重量％ 、99重量％和99. 9重量％的 該具體化合物。組合物包括多種化合物的"混合物"或相同化合物的各種形式的"混合物"， 此時每種化合物(例如異構(gòu)體)以重量計占組合物的至少約10%。本發(fā)明的嘌呤類似物或 其綴合物可以以酸鹽或堿鹽、或以游離酸或游離堿的形式制備。在溶液中，本發(fā)明的某些化 合物可作為兩性離子存在，其中反荷離子由溶劑分子本身提供，或來自溶解或懸浮于溶劑 中的其他離子。 本文所用術(shù)語"分離的"是指在體外制備、分離和/或純化的核酸分子、肽或蛋白 質(zhì)、或其他分子，從而不與體內(nèi)物質(zhì)關(guān)聯(lián)或以不同于天然存在方式存在。因此，當術(shù)語"分離 的"用于核酸、例如"分離的寡核苷酸"或"分離的多核苷酸"時，是指從至少一種通常在來源 中與之關(guān)聯(lián)的雜混物(contaminant)中識別和分離出的核酸序列。分離的核酸存在的形式 和環(huán)境與天然存在時的不同。而非分離的核酸(例如DNA和RNA)以其天然存在的狀態(tài)存 在。例如，給定的DNA序列(例如基因)接近于鄰近基因存在于宿主細胞的染色體上；RNA
18序列(例如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列)作為與編碼各種蛋白質(zhì)的大量其他mRNA的 混合物存在于細胞中。因此，就"分離的核酸分子"而言——其包括染色體組源、cDNA源或 合成源或它們的某種組合的多核苷酸，"分離的核酸分子"(1)不關(guān)聯(lián)所述"分離的核酸分 子"以天然方式存在于其中時的多核苷酸的全部或部分；(2)與在天然狀態(tài)下不與其相連的 多核苷酸可操作連接；或(3)不以較大序列的一部分天然存在。分離的核酸分子可以單鏈 或雙鏈形式存在。當核酸分子將用于表達蛋白質(zhì)時，該核酸至少含有有義鏈或編碼鏈(即 該核酸可為單鏈)，但是也可以同時含有有義鏈和反義鏈(即該核酸可為雙鏈)。
本文所用術(shù)語"氨基酸"，包括D型或L型的天然氨基酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、 Cys、 Glu、 Gln、 Gly、 His、 Hyl、 Hyp、 Ile、 Leu， Lys、 Met、 Phe、 Pro、 Ser、 Thr、 Trp、 Tyr及Val) 殘基，以及非天然氨基酸(例如，磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、Y-羧基 谷氨酸酯；馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、施德丁 (statine)、l，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸、 青霉胺、鳥氨酸、瓜氨酸、_甲基-丙氨酸、對苯甲?；奖彼?、苯甘氨酸、炔丙基甘氨酸、 肌氨酸，以及叔丁基甘氨酸)殘基。該術(shù)語也包括帶有一種常規(guī)氨基保護基(例如，乙?；?或苯甲氧基羰基)的天然及非天然氨基酸類，以及羧基端被保護(例如，以(C「C》烷基、苯 基或苯甲基酯或酰胺；或以-甲基苯甲基酰胺的形式)的天然及非天然氨基酸類。其他合 適的氨基和羧基保護基為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(見，例如，T.W.Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis ;Wiley :New York, 1981，及其中引用的參考文獻)。例如，氨基酸 可以通過羧基端、氨基端，或通過任何其他常規(guī)連接點，例如通過半胱氨酸的硫，連接到式I 化合物的殘余部位。 術(shù)語"類鐸受體"(TLR)是指可以與病原體相關(guān)分子模式(PAMP)結(jié)合并且促進哺 乳動物免疫應(yīng)答的一類受體家族的成員。已經(jīng)知道十種哺乳動物TLR，例如TLRl-lO。
術(shù)語"類鐸受體激動劑"(TLR激動劑)是指可以與TLR結(jié)合的分子。合成TLR激動 劑是被設(shè)計成可以與TLR結(jié)合并且激活該受體的化學化合物。本文提供的示例性合成TLR 激動劑包括"TLR-7激動劑""TLR激動劑"、"TLR-3激動劑"和"TLR-9激動劑"。TLR激動 劑包括咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)、溴匹立明(broprimine)和羅唑利 賓(loxoribine)。 本文所用術(shù)語"核酸"指的是DNA、 RNA、單鏈的、雙鏈的或更高聚集度的雜合基序 (hybridization motif)，及其任何化學修飾物。化學修飾物包括但不限于，為核酸配體堿 基或?qū)φ麄€核酸配體提供附加電荷、極性、氫鍵、靜電相互作用及流變性的化學基團的化學 修飾物。這類修飾物包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酯基修飾物(例如，硫代磷酸酯、甲 基膦酸酯)、2'-位糖修飾物、5-位嘧啶修飾物、7-位嘌呤修飾物、8-位嘌呤修飾物、9-位嘌 呤修飾物、環(huán)外胺的修飾物、4-硫代尿苷的取代物、5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代 物；主鏈修飾物、甲基化物、異常堿基配對的結(jié)合物，例如異堿基、異胞苷(isocytidine)和 異胍等。核酸還可包括非天然堿基，例如硝基吲哚。修飾物還可包括3'位和5'位修飾物， 例如用BHQ、熒光團或其他部分封端。 本文所用術(shù)語"可藥用鹽"是指其中母體化合物通過制成其酸鹽或堿鹽而被修飾 的公開化合物的衍生物?？伤幱名}的實例包括但不限于，堿性殘基(例如胺類)的無機酸鹽 或有機酸鹽、酸性殘基(例如羧酸類)的堿鹽或有機鹽等。可藥用鹽包括，例如，由無毒無 機酸或有機酸形成的母體化合物的常規(guī)無毒鹽或季銨鹽。例如，所述常規(guī)無毒鹽包括，由無機酸衍生的無毒鹽，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有 機酸制備的鹽，所述有機酸例如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、 檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺 酸、2_乙酰氧苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羥乙磺酸等。
適用于本發(fā)明的化合物的可藥用鹽可由含有堿性部分或酸性部分的母體化 合物通過常規(guī)方法合成。通常，所述鹽可通過使這些化合物的游離酸形式或游離堿 形式與化學計量的合適的堿或酸在水或有機溶劑、或二者的混合物中反應(yīng)而制備；通 常，優(yōu)選非水性介質(zhì)，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。合適的鹽的列舉見 Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed. ，Mack Publishing Company,Easton，PA， p. 1418(1985)，其公開內(nèi)容在此通過引用的方式納入。 本文所用詞語"可藥用"是指在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和動物的組 織接觸而無過度的毒性、剌激、變應(yīng)性應(yīng)答、或以合理的有效/風險比例使用時的其他問題 或并發(fā)癥的化合物、材料、組合物和/或劑型。 除非另有指明，使用以下定義鹵代或鹵素指氟代、氯代、溴代或碘代。烷基、烷氧 基、烯基、炔基等表示直鏈和支鏈兩種基團；但涉及具體基團例如"丙基"時，只包括直鏈基 團，支鏈異構(gòu)基團會被具體指明，例如"異丙基"。芳基表示苯基基團或具有約9至10個環(huán)原 子并且環(huán)中至少一個環(huán)是芳香族環(huán)的單邊稠合雙環(huán)碳環(huán)基團。Het可為雜芳基，其包括，經(jīng) 由含5或6個環(huán)原子的單環(huán)芳環(huán)的環(huán)碳原子連接的基團，所述環(huán)原子由碳原子和1-4個雜 原子組成，所述雜原子各自選自非過氧化物型氧、硫和N(X)，其中X不存在或為H、0、 (C「C4) 烷基、苯基或苯甲基；以及由上述基團衍生出的約8至10個環(huán)原子的單邊稠合雙環(huán)雜環(huán)基 團，特別是苯并衍生物，或者通過將丙烯、三甲撐或四甲撐稠合而得到的衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，具有手性中心的本發(fā)明的化合物可以光學活性形式和消 旋形式存在或分離。某些化合物可能具有同質(zhì)多晶現(xiàn)象。應(yīng)理解，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物 的任何消旋、光學活性、多晶態(tài)、或立體異構(gòu)體形式或其混合物，它們具有本文所述的有用 性能，本領(lǐng)域公知如何制備各種光學活性形式(例如，通過采用重結(jié)晶技術(shù)拆分消旋形式、 由光學活性原料進行合成、手性合成、或使用手性固定相進行色譜分離)以及如何使用本 文所述的標準測試或本領(lǐng)域公知的其他類似測試確定激動劑活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理 解，本文所述的化合物包括它們的各種互變異構(gòu)體，其可以各種彼此相互平衡的狀態(tài)存在。
"治療有效量"意欲包括用于例如治療或預(yù)防宿主的疾病或失調(diào)、或治療宿主的疾 病或失調(diào)癥狀的本發(fā)明適用的化合物的量或要求保護的化合物組合物的量。本文使用的 "治療"包括(i)防止病理病癥的發(fā)生(例如預(yù)防)；(ii)抑制病理病癥或阻止其發(fā)展； (iii)緩解病理病癥和/或減輕與病理病癥有關(guān)的癥狀。 本文所用術(shù)語"患者"是指待使用本發(fā)明方法治療的生物體。所述生物體包括但 不限于，哺乳動物，例如人。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"受試者"通常指將接受或已經(jīng)接受 治療(例如給予本發(fā)明的化合物)的個體。"穩(wěn)定化合物"和"穩(wěn)定結(jié)構(gòu)"意指足夠穩(wěn)定以至于在從反應(yīng)混合物分離為適用純 度之后、以及在配置成有效治療劑后仍存在的化合物。本文只考慮穩(wěn)定的化合物。
本發(fā)明的TLR激動劑和綴合物及其應(yīng)用 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療哺乳動物例如人的病理病癥或癥
20狀的治療方法，其中涉及TLR激動劑的活性并且需要其發(fā)揮作用。所述方法包括將有效量 的本發(fā)明化合物或其可藥用鹽給藥至需要所述治療的哺乳動物。適于治療的病理病癥或癥 狀的非限制性實例包括癌癥；胃腸道、腦、皮膚、關(guān)節(jié)和其他組織的炎性疾?。患毦曰虿?毒性疾??；自身免疫性疾?。灰约翱肆_恩病(Crohn' sDisease)。本發(fā)明的化合物也可適用 于制備抵抗細菌、病毒、癌細胞或癌特異性肽的疫苗，或用于增強抗癌的單克隆抗體，用作 CNS興奮物或用于生物防御。因此，本發(fā)明提供用于醫(yī)學療法的本發(fā)明化合物(例如，用作 抗癌劑，用于細菌性疾病的治療、病毒性疾病例如丙型肝炎和乙型肝炎的治療、克羅恩病的 治療，并且通常用作治療免疫性疾病的治療劑)。此外，本發(fā)明化合物可預(yù)防癌變，例如丙型 肝炎病毒和乙型肝炎病毒所致的癌變，并適用于制備適用于治療哺乳動物例如人的癌癥、 病毒性或細菌性感染、克羅恩病和免疫失調(diào)的藥物。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種通過給予本發(fā)明的TLR激動劑綴合物治療 哺乳動物的病毒感染的方法。所述病毒感染可以由RNA病毒、作為TLR激動劑起作用的RNA 病毒的產(chǎn)物和/或DNA病毒引起。DNA病毒例如為乙型肝炎病毒。在一個實施方案中，所述 病毒感染是由可導(dǎo)致嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)的冠狀病毒、乙型肝炎病毒或丙型 肝炎病毒引起。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過給予有效量的本發(fā)明的TLR激動劑綴合 物來治療癌癥的方法。所述癌癥可為干擾素敏感性癌癥，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素 瘤或腎癌?？芍委煹木唧w癌癥包括黑素瘤、淺表性膀胱癌(superficial bladder cancer)、 光化性角化癥、上皮內(nèi)瘤樣病變(intra印ithelial neoplasia)，以及基底細胞皮膚癌、鱗 狀細胞癌(squamous)等。此外，本發(fā)明的方法包括治療癌癥前期病癥，例如，光化性角化 癥或上皮內(nèi)瘤樣病變、家族性息肉病(息肉)、宮頸非典型增生(cervical dysplasia)、 宮頸癌、淺表性膀胱癌，以及與感染有關(guān)的任何其他癌癥(例如淋巴瘤、卡波西氏肉瘤 (Karposi， ssarcoma)或白血病)等。 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過給予治療有效量的本發(fā)明的TLR激動 劑綴合物或這種化合物的可藥用鹽來治療自身免疫性疾病的方法。示例性的自身免疫性疾 病包括多發(fā)性硬化癥、狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。 在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過給予本發(fā)明的TLR激動劑綴合物來治 療克羅恩病的方法。 所述TLR激動劑綴合物可包括一種同功能性(homofunctional)TLR激動劑聚合 物，例如由TLR7激動劑或TLR3激動劑形成。TLR7激動劑可為7-硫代-8-氧鳥苷基(T0G) 部分、7-去氮雜鳥苷基(7DG)部分、瑞喹莫德部分或咪喹莫特部分。在另一個實施方案中， TLR激動劑可包括雜功能性(heterofunctional)TLR激動劑聚合物。雜功能性TLR激動劑 聚合物可包括TLR7激動劑和TLR 3激動劑或TLR9激動劑或所有這三種激動劑。雜功能性 TLR激動劑聚合物可包括TLR8激動劑和TLR9激動劑。 本發(fā)明包括使選定的大分子與合成TLR激動劑共價綴合，以滿足例如所需形狀、 尺寸和價態(tài)，從而最優(yōu)化所得綴合物的免疫性能、以及/或者使該綴合物靶向或送遞至所 需細胞或組織。如本文所述，綴合物被設(shè)計為適用于多種醫(yī)療用途，例如但不限于變應(yīng)性哮 喘、病毒性呼吸道感染(流行性感冒和RSV)、狼瘡和其他自身免疫性疾病；以及適用作癌癥 和傳染病疫苗的抗原_佐劑結(jié)合物。所述綴合物可提供最優(yōu)化的免疫應(yīng)答，同時通過將免
21疫激活劑(合成TLR激動劑)以穩(wěn)定共價鍵系于大分子上而限制不良的全身性副作用。所 述大分子可起到免疫應(yīng)答的靶向?qū)嶓w和/或組成部分的作用，例如作為佐劑_抗原綴合物 中的抗原。在局部環(huán)境中給予穩(wěn)定綴合物的主要優(yōu)點在于僅隨時間釋放極少量的TLR激動 劑進入全身性環(huán)境。 在一個實施方案中，所述大分子選自各種產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)類、脂質(zhì)類或樹突狀 物，或其表面具有氨基基團的聚合物，例如聚苯乙烯"氨基珠"，其各自具有可用與接頭例如 SANH綴合、或與合成TLR7激動劑直接綴合的伯氨基。例如，在接頭與大分子綴合之后，TLR7 激動齊U，例如UC-1V150，與SANH-大分子綴合物的NHS酯反應(yīng)以提供TLR7激動劑-SANH-大 分子綴合物。 疫苗通常不能用于急性環(huán)境，這是因為(l)它們需要長時間才能發(fā)揮作用；以及 (2)它們對于免疫受損患者無效。例如金黃色葡萄球菌(SA)感染是住院患者發(fā)病和死亡的 主要原因。特別的高危組群是由于燒傷、創(chuàng)傷、導(dǎo)管布置、透析而導(dǎo)致免疫抑制的群組，或療 養(yǎng)院中的因高齡而導(dǎo)致免疫抑制的組群。此外，許多院內(nèi)獲得性SA的菌株對常規(guī)的抗生素 具有耐藥性。 本發(fā)明克服上述兩方面障礙以進行治療。本文提供了包括合成TLR7激動劑和合 成TLR7激動劑的綴合物、并結(jié)合革蘭氏陽性細菌抗原的組合物的應(yīng)用。TLR7配體通常具有 不佳的藥物代謝動力學，以及快速的全身性吸收和排泄。由于全身性擴散，它們導(dǎo)致細胞因 子綜合征。有效的佐劑必須產(chǎn)生對細胞因子和趨化因子的"免疫梯度(immunegradient)"。 在一個實施方案中，強效的合成TLR7激動劑與大分子的綴合可增強送遞特性，改善藥物代 謝動力學，并通過局域化曝露避免全身性毒性。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或抑制哺乳動物革蘭氏陽性細菌感染 的方法，包括給予所述哺乳動物一種有效量的含有革蘭氏陽性細菌的細菌抗原和一定量的 合成TLR7激動劑的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或抑制哺乳動物 革蘭氏陽性細菌感染的方法，包括給予所述哺乳動物一種有效量的與革蘭氏陽性細菌抗原 綴合的合成TLR7激動劑。例如，1V150-MSA綴合物保留了其TLR7激動劑活性，具有增強的 藥效和降低的毒性，引起先天性免疫的局部激活，并于單次免疫接種細菌抗原后6天誘發(fā)T 細胞依賴性免疫保護。 在一個實施方案中，合成TLR7激動劑與一種或多種金黃色葡萄球菌抗原一起給 藥，或與一種或多種金黃色葡萄球菌抗原綴合。表1提供了與合成TLR7激動劑一并使 用——特別是在急性治療環(huán)境中——的金黃色葡萄球菌的示例性抗原。本發(fā)明的疫苗意想 不到地可獲得快速有效的免疫應(yīng)答。
表l
22金黃色葡萄球菌免疫原_
攻擊手段_
剝脫毒素B 剝脫毒素A 毒性休克綜合征毒素 腸毒素A-E， H-U 骨唾液蛋白結(jié)合蛋白 膠原結(jié)合蛋白 聚集因子A 聚集因子B oc -溶血素 y-溶血素
蛋白A
聚集因子A
纖連蛋白結(jié)合蛋白A
纖連蛋白結(jié)合蛋白B
膠原結(jié)合蛋白
脂磷壁酸
肽聚糖
蛋白A
纖連蛋白結(jié)合蛋白B oc -溶血素
潘頓一瓦倫丁殺白細胞素(panton valentine leukocidin)
膠原結(jié)合蛋白 脂磷壁酸 肽聚糖 [Q122] 莢膜多糖 聚集因子A 蛋白A
纖連蛋白結(jié)合蛋白_ 在一個實施方案中，本發(fā)明提供以下的綴合物或其可藥用鹽
<formula>formula see original document page 24</formula>式(III)化合物 嘌呤 式(II)化合物 噻唑并嘧啶
X1為-0-、 -S-或-NIT-; 其中RE為氫、(V1Q烷基或被C3—6環(huán)烷基取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子 一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中取代基為羥基、C卜e烷基、羥基C卜e亞烷基、(V6烷 氧基、C卜6烷氧基(V6亞烷基、或氰基； 其中R1為(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、C6—1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基、C5—9 雜環(huán)基、取代的(V9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、(V6烷 基、羥基C卜6亞烷基、(V6烷氧基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；
f各自獨立地為氫、-0H、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(C「Ce)烷氧基、取代的
(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。) 芳基(芳?；?、取代的-c (o) -o (c6-c10)芳基、-c (0) OH(羧基)、-c (0) 0 (c「c6)烷基
(烷氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (C「C6)烷基、-NRaRb、 -C (0) NRaRb (氨基甲?；?、_0_C (0) NRaRb、 - (C「C6)亞烷基-NRaRb、 - (C「C6)亞烷基_C (0) NRaRb、鹵素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自獨立地為氫、(Q-Ce)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、(Q-Ce)烷氧基、鹵代 (C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基(C「C6)烷基、(C「C6)烷?；⒘u基(C「C6)烷基、芳基、芳基 (CrC6)烷基、芳基、芳基(Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(Q-C;)烷氧基羰基；其中X2 為一個鍵或一個連接基團；其中R3為一種大分子；其中n為1、2、3或4 ;其中m為1或2 ;其 中q為1至1，000、104、105、106或更大。所述大分子可包括由碳、氧、氫、氮、硫、磷或其結(jié)合 物構(gòu)成的有機分子，其對機體組織無害(例如它們無毒和/或不會引發(fā)炎癥)，并且可包括 但不限于，具有或不具有接頭(X2基團)的樹突狀物、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或它們的制劑(例如 脂質(zhì)體納米粒)；及氨基修飾的聚合物，例如聚苯乙烯珠；以及a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(見 圖1)。 本發(fā)明化合物可使用具有式(IA-1)的化合物制備
<formula>formula see original document page 24</formula>
其中X2為一個可反應(yīng)至例如美國專利6， 329， 381 (Kurimoto etal.)中所述的化合物的特定基團上、或形成與連接基團連接的鍵、或反應(yīng)而形成與大分子連接的鍵的基團， 剩余的變量如上述式(IA)所定義。大分子的非限制性實例包括具有能增加溶解性的側(cè)鏈 的大分子，例如含有嗎啉代環(huán)、哌啶子基環(huán)、吡咯烷環(huán)或哌嗪環(huán)等的基團；氨基酸類、氨基酸 聚合物類(蛋白質(zhì)或肽)，例如二肽或三肽等；碳水化合物(多糖)；核苷酸，例如PNA、 RNA 和DNA等；有機物質(zhì)聚合物，例如聚乙二醇、聚交酯等；單體脂質(zhì)和聚合脂質(zhì)；不溶性有機納 米粒；無毒的機體物質(zhì)，例如細胞類、脂質(zhì)類、維生素類、輔因子類、抗原類，例如微生物，所 述微生物例如病毒、細菌、真菌等。所述抗原類可包括失活的整個生物體或其亞組成部分， 例如細胞等。 在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物具有式(IC)的結(jié)構(gòu)；或一種其可藥用鹽，所
述可藥用鹽包括其水合物，
其中 X為N或CRX，其中RX為氫、鹵素、取代的烷基、未取代的烷基、取代的雜烷基或未取
代的雜烷基； Y為S或N; 虛線(一一)表示任選的鍵；其中 當Y和標星號的碳之間的鍵是雙鍵時，Q2不存在； 當Q1和標星號的碳之間的鍵是雙鍵時，Q1為0、 S、 NY1或NNY2Y3 ;并且 當Q1和標星號的碳之間的鍵是單鍵時，Q1為氫、氰基、硝基、0-Y2、 S-Y2、 NYY或
NY2NY3Y4 ;其中 W為氫、取代的烷基、未取代的烷基、取代的環(huán)烷基、未取代的環(huán)烷基、取代的雜烷
基、未取代的雜烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的雜芳基、未取代的雜芳基、-c(= 0)-取代的烷基、-c( = 0)-未取代的烷基、-C( = o)o-取代的烷基、-c( = 0)0-未取代的
烷基、氰基、硝基、羥基或0-Y2; Y2、 Y3和Y4各自獨立地為氫、取代的烷基、未取代的烷基、取代的雜烷基、未取代的 雜烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的雜芳基、未取代的雜芳基； Z為0、S或NYS，其中YS為氫、取代的焼基、未取代的烷基、取代的雜烷基、未取代的
雜烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的雜芳基、未取代的雜芳基； 92和93各自獨立地為氫、取代的烷基、未取代的烷基、取代的雜烷基、未取代的雜
烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的雜芳基、未取代的雜芳基； X1為-O-、 -S-或-NIT-;
25
RE為氫、Q—1Q烷基或取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起形成一個雜環(huán) 或一個取代的雜環(huán)； R1為氫、(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜 環(huán)基或取代的(V9雜環(huán)基； f各自獨立地為氫、-OH、 (Q-Ce)烷基、取代的(Q-Ce)烷基、(C「Ce)烷氧基、取代的
(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)
芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(Ce-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷 氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (C「C6)烷基、-NRaRb、 -C (0) NRaRb (氨基甲?；?、_0_C (0) NRaRb、 - (C「C6)亞烷基-NRaRb、 - (C「C6)亞烷基_C (0) NRaRb、鹵素、硝基或氰基；
Ra和Rb各自獨立地為氫、(Q-Ce)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、雜烷基、烷
氧基、鹵代(Q-Ce)烷基、((:3-(:8)環(huán)烷基(CrC6)烷基、(C「C6)烷?；⒘u基(CrC6)烷基、芳 基、芳基(C「C》烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(CrC6)烷氧基羰基； 其中位于任何烷基、環(huán)烷基、雜烷基、氨基、烷氧基、烷酰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基 團上的取代基為一個或多個(例如1、2、3、4、5或6個)羥基、C卜6烷基、羥基C卜6亞烷基、 (V6烷氧基丄3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素、雜環(huán)基(例如哌啶基或嗎 啉基)、或芳基； X2為一個鍵或一個連接基團；
k為0、l、2、3或4;
n為0、l、2、3或4; R3為一種大分子，其包括細胞、病毒、維生素、輔因子、肽、蛋白質(zhì)、核酸分子、脂質(zhì)、 珠或顆粒例如聚苯乙烯珠或納米粒、或者樹突狀物。 在某些實施方案中，基團f-RS可構(gòu)成一個與另一個式(IC)部分相連的接頭，從而 形成二聚物。例如，所述接頭可為本文所述的任何接頭，例如二價的芳基或雜芳基、雙酰胺 芳基、雙酰胺雜芳基、雙酰肼芳基或雙酰肼雜芳基等?；蛘?，(^可構(gòu)成一個與另一個式(ic) 部分相連的接頭，從而經(jīng)由二硫鍵形成二聚物。見例如圖28。 在化合物的堿性或酸性足以形成酸鹽或堿鹽的情況下，將所述化合物以鹽的形式 使用可能是合適的。可藥用的鹽的實例為與能形成生理上可接受的陰離子的酸形成的有機 酸加成鹽，例如，甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、丁二酸鹽、 苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、a-酮戊二酸鹽和a-甘油磷酸鹽。也可形成合適的無機鹽，包括 鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽。 可藥用的鹽可用本領(lǐng)域公知的標準方法制備，例如通過使一種具有足夠堿性的化 合物(例如一種胺)與一種適宜的可提供生理上可接受的陰離子的酸反應(yīng)來制備。還可制 備羧酸的堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)鹽或堿土金屬(例如鈣)鹽。 烷基包括直鏈或支鏈的(Vw烷基基團，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、異丙基、 異丁基、1_甲基丙基、3_甲基丁基、己基等。 低級烷基包括直鏈的或支鏈的C卜e烷基，例如，甲基、乙基、丙基、1_甲基乙基、丁 基、1_甲基丙基、2_甲基丙基、1， 1-二甲基乙基、戊基、1_甲基丁基、2_甲基丁基、3_甲基丁 基、l，l-二甲基丙基、l，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基等。 術(shù)語"亞烷基"指的是二價的直鏈的或支鏈的烴鏈(例如亞乙基-CH廠CH廠)。
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c3—7環(huán)烷基包括例如環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基等基團和烷基取代的(:3—7環(huán)烷
基，優(yōu)選直鏈的或支鏈的C卜6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基或戊基)與(V7環(huán)烷基(例 如環(huán)戊基或環(huán)己基等)。 低級烷氧基包括C卜6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基或丙氧基等。 低級烷酰基包括C卜e烷?；?，例如甲?；?、乙酰基、丙?；?、丁?；?、戊酰基或己?；?。
C7—n芳?；ɡ绫郊柞；蜉良柞；然鶊F； 低級烷氧基羰基包括C2—7烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或丙氧基羰基 等。 低級烷基氨基意指被C卜6烷基取代的氨基，例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁
基氨基等。 二 (低級烷基)氨基意指被相同或不同的(Ve烷基取代的氨基(例如二甲基氨基、 二乙基氨基、乙基甲基氨基)。 低級烷基氨甲酰基意指被(V6烷基取代的氨甲?；?例如甲基氨甲?；⒁一?甲?；?、丙基氨甲?；⒍』奔柞；?。 二 (低級烷基)氨甲?；庵副幌嗤虿煌腃卜6烷基取代的氨甲?；?例如二
甲基氨甲?；⒍一奔柞；?、乙基甲基氨甲?；?。 鹵原子意指例如氟原子、氯原子、溴原子或碘原子等鹵原子。 芳基指C6—1Q單環(huán)或稠環(huán)芳基，例如苯基、茚基或萘基等。 雜環(huán)基或雜環(huán)指含有至少一個雜原子的飽和的單環(huán)雜環(huán)基或不飽和的單環(huán)或稠 環(huán)雜環(huán)基，所述雜原子例如為0-3個氮原子(-NRd-，其中Rd為H、烷基或本文所定義的Y2)、 0-l個氧原子(-0-)禾P0-1個硫原子(-S-)。飽和單環(huán)雜環(huán)基的非限制性實例包括5元或6 元的飽和雜環(huán)基，例如四氫呋喃基、吡咯烷基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基或吡唑烷基。不飽和 單環(huán)雜環(huán)基的非限制性實例包括5元或6元的不飽和雜環(huán)基，例如呋喃基、吡咯基、吡唑基、 咪唑基、噻唑基、噻吩基、吡啶基或嘧啶基。不飽和稠雜環(huán)基的非限制性實例包括不飽和的 雙環(huán)雜環(huán)基，例如吲哚基、異吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并二氫吡喃基、苯并呋喃基等。 Het可為飽和雜環(huán)基或不飽和雜環(huán)基，例如雜芳基。 IT和R1可與其所連接的氮原子一起形成一個雜環(huán)。雜環(huán)的非限制性的實例包括5 元或6元的飽和雜環(huán)，例如1-吡咯烷基、4_嗎啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基或1-吡唑烷基，5 元或6元的不飽和雜環(huán)例如1-咪唑基等。 R1的烷基、芳基、雜環(huán)基可任選被一個或多個取代基取代，其中所述取代基可相同 或不同，并且包括低級烷基；環(huán)烷基、羥基；羥基(V6亞烷基，例如羥基甲基、2_羥基乙基或
3- 羥基丙基；低級烷氧基；C卜e烷氧基C卜e烷基，例如2_甲氧基乙基、2_乙氧基乙基或3-甲 氧基丙基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；氰基；硝基；酰基；羧基；低級烷氧基羰基；鹵素； 巰基；C卜6烷硫基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基或丁硫基；取代的C卜6烷硫基，例如甲氧基乙 硫基、甲硫基乙硫基、羥基乙硫基或氯代乙硫基；芳基；取代的C6—1Q單環(huán)或稠環(huán)芳基，例如
4- 羥基苯基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基或3， 4- 二氯苯基；5-6元的不飽和雜環(huán)， 例如呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噻吩基、吡啶基或嘧啶基；以及不飽和的雙環(huán) 雜環(huán)基，例如吲哚基、異吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并二氫吡喃基、苯并呋喃基或鄰苯
27二甲酰亞氨基。在某些實施方案中，可明確排除一種或多種上述基團作為各式的各種其他 基團的取代基。 在一些實施方案中，所述式的5元環(huán)為噻唑環(huán)，例如，其中上述式IA的Y為S且Q2 不存在。 f的烷基、芳基、雜環(huán)基團可任選被一個或多個取代基取代，其中所述取代基可相 同或不同，并且包括羥基；(V6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基或丙氧基；羧基；C2—7烷氧基羰 基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或丙氧基羰基；和鹵素。 Re的烷基、芳基、雜環(huán)基團可任選被一個或多個取代基取代，其中所述取代基可 相同或不同，并且包括(V6環(huán)烷基；羥基；C卜6烷氧基；氨基；氰基；芳基；取代的芳基，例如
4-羥基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯苯基或3， 4- 二氯苯基；硝基和卣素。 由RE和R1以及它們所連接的氮原子一起形成的雜環(huán)可任選被一個或多個取代基
取代，其中所述取代基可相同或不同，并且包括C卜6烷基；羥基(V6亞烷基；C卜6烷氧基(V6 亞烷基；羥基；C卜6烷氧基；和氰基。 在一些實施方案中，當Q'為0-^時，f不為氫。 X的一個具體含義為N。 X的另一個具體含義為CH。 當然，在所示式化合物的一個分子中，虛線示出的兩個鍵只可能存在一個。在一個
實施方案中，Y和標星號的碳原子之間的鍵為雙鍵。在另一個實施方案中，Q工和標星號的碳
原子之間的鍵為雙鍵。 Q^勺一個具體含義為0。 Q1的另一個具體含義為S。 Q1的另一個具體含義為NY、例如，=NH。 Q1的另一個具體含義為NNY2Y3。 在一個實施方案中，Q1和標星號的碳之間的鍵為單鍵。 Q1的一個具體含義為氫。 Q1的另一個具體含義為NH2。 Q1的另一個具體含義為O-Y2。 Y1的一個具體含義為氫。 Y1的另一個具體含義為烷基，例如(CrC6)烷基，例如甲基。 Y1的另一個具體含義為芳基，例如苯基。 Y2、Y3和y4各自的一個具體含義為氫。 Y2、 f和f各自的另一個具體含義(獨立地)為烷基，例如(C「C6)烷基，例如甲基。 f、f和f各自的另一個具體含義(獨立地)為芳基，例如苯基。 Z的一個具體含義為0。 Z的另一個具體含義為S。 Z的另一個具體含義為NY 其中Y5為氫、甲基或苯基。 Q2的一個具體含義為氫。 Q2的另一個具體含義為甲基或苯基。
Q3的一個具體含義為氫。 Q3的另一個具體含義為甲基或苯基。 X1的一個具體含義為硫原子、氧原子或-NRE-。 另一個具體的X1為硫原子。 另一個具體的X1為氧原子。 另一個具體的X1為-NRe-。 另一個具體的X1為-NH-。 Y的一個具體含義為N。 Y的另一個具體含義為S。 RE的一個具體含義為氫、C卜4烷基或取代的C卜4烷基。 連接在一起的R1和RE的一個具體含義為它們形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)。
連接在一起的R1和RE的另一具體含義為取代的或未取代的嗎啉代環(huán)、哌啶子基 環(huán)、吡咯烷基環(huán)或哌嗪基環(huán)。 R1的一個具體含義為氫、C卜4烷基或取代的C卜4烷基。 另一個具體的R1為2-羥基乙基、3_羥基丙基、4_羥基丁基、2_氨基乙基、3_氨基 丙基、4-氨基丁基、甲氧基甲基、2_甲氧基乙基、3_甲氧基丙基、乙氧基甲基、2_乙氧基乙 基、甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、3-甲硫基丙基、2-氟乙基、3-氟丙基、2，2，2-三氟乙基、氰 基甲基、2_氰基乙基、3-氰基丙基、甲氧基羰基甲基、2-甲氧基羰基乙基、3-甲氧基羰基丙 基、苯甲基、苯乙基、4-妣啶基甲基、環(huán)己基甲基、2-噻吩基甲基、4-甲氧基苯基甲基、4-羥 基苯基甲基、4-氟苯基甲基或4-氯苯基甲基。 另一個具體的R1為氫、CH3_、 CH3-CH2_、 (^3(^2(^2-、羥基C卜4亞烷基或C卜4烷氧基
C卜4亞烷基。 R1的另一具體含義為氫、CH3_、 CH3-CH2_、 CH3-0_CH2CH2-或CH3-CH2-0_CH2CH2-。
R2的一個具體含義為氫、鹵素或(V4烷基。
R2的另一具體含義為氫、氯、溴、CH3_或CH3-CH2_。 適用于烷基、芳基或雜環(huán)基上取代的具體取代基為羥基、6烷基、羥基(V6亞烷
基、C卜6烷氧基、(V6烷氧基C卜6亞烷基、C3—6環(huán)烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基。 X2的一個具體含義為鍵或具有最多約24個原子的鏈；其中所述原子選自碳、氮、
硫、非過氧化物型氧及磷。 X2的另一具體含義為鍵或具有約4至約12個原子的鏈。
X2的另一具體含義為鍵或具有約6至約9個原子的鏈。
X2的另一具體含義為
<formula>formula see original document page 30</formula> 在某些實施方案中，所述接頭或基團X2不是公布號為W02007/024707的PCT申請 中所述的接頭。此外，在一些實施方案中，R3不是公布號為WO 2007/024707的PCT申請中 所述的輔助基團。 —種具體的大分子為氨基酸、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)、抗原、核酸、脂質(zhì)、樹突狀 物、機體物質(zhì)或細胞例如微生物。 —種具體的肽具有2至約20個氨基酸殘基。
另一種具體的肽具有10至約20個氨基酸殘基。
—種具體的大分子包括碳水化合物。
—種具體的核酸為DNA、 RNA或PNA。 —種具體的大分子為細胞、脂質(zhì)、維生素、脂質(zhì)或輔因子。
—種具體的抗原為微生物。
—種具體的微生物為病毒、細菌或真菌。
另一種具體的微生物為病毒或細菌。 具體的細菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、單核細胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、沙門氏菌 (Salmonella)或葡萄球菌(Staphylococcus)。 具體的沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)或腸炎沙門氏菌 (S. enteritidis)。 具體的葡萄球菌包括金黃色葡萄球菌。 具體的病毒為RNA病毒，包括RSV和流感病毒；RNA病毒的產(chǎn)物；或DNA病毒，包括 —種具體的DNA病毒為乙型肝炎病毒。 在另一些實施方案中，所述大分子不為氨基酸；碳水化合物；肽；抗原，例如微生 物，例如病毒(例如RNA病毒，例如SIV、丙型肝炎病毒或冠狀病毒；RNA病毒的產(chǎn)物；或DNA 病毒例如乙型肝炎病毒；真菌；或細菌例如炭疽桿菌(炭疽(anthrax))、單核細胞增生性李 斯特菌、土拉熱弗朗西絲氏菌或沙門氏菌(例如鼠傷寒或腸炎))；核酸，例如DNA、RNA、PNA ; 或機體物質(zhì)，例如細胞或脂質(zhì)。 k的一個具體值為0。 k的另一個具體值為1。 k的另一個具體值為2。在一些實 施方案中，k不為1。 本發(fā)明的具體化合物具有以下通式 IA-L-A1 ; IA-L-(A"2; IA—L-A1—A1 ; IA-L-A^L-A1 ; (IA) 2-L-A^A1 ; (IA)廠L-A^L-A1 ; (IA)2-L-A、或 (IA) 2_L-(A1) 2 ; 其中I A如本文所公開；L不存在或為一個連接基團；并且W基團各自獨立地代 表一種大分子。 本發(fā)明包括任選與其他活性劑結(jié)合的本發(fā)明化合物的組合物，所述活性劑例 如三氣卩坐核昔(ribavirin)、味卩坐立賓(mizoribine)禾口麥考酷酸莫酉旨(mycophenolate mofetil)。其他非限制性實例是已知的并公開于美國公開的專利申請20050004144中。
制備本發(fā)明的化合物制備適用于制備本發(fā)明化合物的中間體的方法于本發(fā)明的 以下實施方案中提供。適用于制備本發(fā)明化合物的中間體也于本發(fā)明的以下實施方案中提 供。 例如，本發(fā)明的化合物(綴合物)可用本領(lǐng)域公知的標準合成方法制備。以下對 常規(guī)的酯和醛合成進行了說明。UC-1V150由2，6-二氯嘌呤經(jīng)7個步驟合成。UC-1V150芐 基部分上的游離醛基使我們可以通過含有肼基和氨基的接頭分子將該激動劑與許多不同 的輔助化學實體偶聯(lián)，所述輔助化學實體包括蛋白質(zhì)類、寡核苷酸類、芳香族分子、脂質(zhì)類、
31病毒類和細胞類。
常規(guī)合成
<formula>formula see original document page 32</formula>
4-6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲 4-((6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧 氧基-乙氧基)-嘌呤-9-基甲 基)-9W-嘌呤-9-基)甲基)苯甲酸甲酯 基-苯基氰 NHS酯的合成
4-((6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧 基)-9W-嘌吟-9-基)甲基)苯甲酸甲酯
4-((6-氨基-8-羥基-2-(2-屮氧基乙氧 基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯H'酸
4-((6-氨基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤 -9-基)甲基)苯甲酸2,5-二氧代吡咯垸-1-酯 醛的合成
氫化N，N' -(二甲基 亞乙基H氨基)鋁鋰 四氫呋喃
4- [6-氨基-8-甲氧基-2- (2-甲氧基 乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛
4- [6-氨基-8-羥基-2- (2-羥基 乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛 UC-1V150化學。UC-1V150的合成和所示化合物2_8的制備如下。
化合物2 :4-(2，6-二氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰。將2，6_ 二氯_9H_嘌呤(1， 16mmol)溶解在匿F(50mL)中并加入碳酸鉀(50mmol)。加入a -溴-對甲苯基腈(22mmol)， 然后將該混合物在室溫下攪拌16小時。過濾除去不溶性無機鹽后，將濾液倒入水(1500mL) 中并用乙酸乙酯萃取(2x400mL)，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)得到剩余物，該剩余物通過使用 1:2: 10的乙酸乙酯/丙酮/己烷進行快速硅膠色譜純化。產(chǎn)率3. 33g(69% )。 UV、NMR 和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 化合物3 :4-(6-氨基-2-氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰。將化合物2(1.9g)放入鋼 反應(yīng)容器中并加入氨甲醇溶液(80mL，7N)。將密封的容器在6(TC下加熱12小時，在冰中冷 卻并濾除固體產(chǎn)物。產(chǎn)率1.09g。 UV、NMR和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 化合物4:4-[6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰。首先將 金屬鈉(81mg)在加熱條件下溶解于2-甲氧基乙醇(30mL)中以生成2_甲氧基乙醇的鈉 鹽。然后向該溶液中加入溶解在甲氧基乙醇(300mL)中的化合物3(1. 0g)(加熱條件下)。 將反應(yīng)混合物在115t:浴槽溫度下加熱8小時，真空濃縮至近干燥狀態(tài)，將剩余物在乙酸乙酯和水之間分配。將有機層通過使用含5 %甲醇的二氯甲烷溶液進行快速硅膠色譜純化，得 到763mg產(chǎn)物。NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。 化合物5 :4-[6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤_9_基甲基]苯基氰。將 化合物4(700mg)溶解在二氯甲烷(400mL)中并逐滴加入溴(7mL)。混合物在室溫下攪拌過 夜并先用硫代硫酸鈉水溶液(0. 1M，2L)萃取，然后用碳酸氫鈉水溶液(500mL，飽和)萃取。 有機層剩余物通過使用含3%甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠色譜純化，得到460mg溴代產(chǎn) 物。NMR、 UV和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 化合物6 :4-[6-氨基-8_甲氧基-2_(2_甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基 氰。通過鈉金屬(81mg)在無水甲醇(30ml)中的反應(yīng)生成甲醇鈉。將化合物5 (700mg)溶解 在無水二甲氧基乙烷中，將其與上述甲醇鈉混合，并將溫度升至10(TC。反應(yīng)過夜后，將混合 物真空濃縮，剩余物通過使用含5%甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠色譜純化，產(chǎn)量120mg。 NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。 化合物7 :4-[6-氨基-8_甲氧基-2-(2_甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲 醛。將化合物6(100mg)溶解于無水THF(3mL)中并在氬氣下冷卻至0°C 。使用還原劑氫化 N， N' -(二甲基亞乙基二氨基)鋁鋰將腈轉(zhuǎn)化成醛官能團。制備含0.5M該還原劑的無水 THF溶液并將0. 72mL該溶液加入反應(yīng)燒瓶中。將混合物在0-5。C攪拌1小時，加入3MHC1 終止反應(yīng)，依次用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，然后真空濃縮，得到85mg產(chǎn)物。NMR與所示結(jié) 構(gòu)一致。 化合物8 :4-[6-氨基-8-羥基_2_(2_甲氧基乙氧基)嘌呤_9_基甲基]苯甲醛 (UC-1V150)。將化合物7(800mg)與碘化鈉(504mg)和乙腈(40mL)混合，然后緩慢加入三 甲基氯硅烷(0. 5mL)。將混合物在7(TC下加熱3. 5h，冷卻并過濾。固體產(chǎn)物用水洗滌，然后 用乙醚洗滌，得到406mg產(chǎn)物。NMR、 UV、 MS與所述結(jié)構(gòu)一致。
制備特定化合物的附加實施例也包括在本文。 如本文實施例中所述，制備了能夠在生理條件下與伯胺共價偶聯(lián)的可溶性TLR7 激動劑。然后使用骨髓來源鼠類或外周血液單核細胞來源的樹突細胞(DC)測試多種化合 物和抗原佐劑復(fù)合物的體外活性，以表征DC的成熟和細胞因子的分泌(例如，IL-12、IL-6、 TGF-13和IFN- y )。同源免疫活性C57/B1小鼠用皮內(nèi)抗原-TLR7激動劑復(fù)合物預(yù)防性接 種，并用表達cOVA轉(zhuǎn)基因的B16黑色素腫瘤細胞攻擊。 各化合物的有效濃度(EC5。)總體上呈鐘形分布，而較高的劑量具有抑制性。最大 剌激發(fā)生在10至1000nM之間。與TLR激動劑共價偶聯(lián)的佐劑分子保留了活性，但通常具 有較低的ECs。值。與單獨的雞卵清蛋白相比，被皮下瘤攻擊后，UC-1V199與雞卵清蛋白偶 聯(lián)時的存活中值從22天延長至35天，幾乎翻倍。 因此，TLR7激動劑與腫瘤抗原的共價連接剌激了 DC細胞因子的產(chǎn)生并保護小鼠 免受腫瘤攻擊。與大分子(例如抗原)偶聯(lián)后在生理條件下保留其免疫剌激性的合適的 TLR7激動劑的應(yīng)用可能會對實體瘤治療的原位疫苗的開發(fā)有意義。 已發(fā)現(xiàn)分子量為200-400kD的各種嘌呤、吡啶和咪唑喹啉可激活TLR7，以摩爾為 單位，特異性的TLR7配體化合物比咪喹莫特要強100-1000倍(Lee at al.，見下文)。因 為這些TLR激動劑與正常核苷酸組分的結(jié)構(gòu)非常相似，故它們在反復(fù)給藥后極難誘發(fā)半抗 原免疫反應(yīng)。
基于腺嘌呤的TLR7藥物核心(pharmacore)可能需要共價連接至一種"輔助基 團"(大分子)上以促進表達TLR7的樹突細胞內(nèi)體進行攝取以及保存TLR激動劑。因此， 制備了TLR7激動劑UC-1V150并經(jīng)由其醛基官能團和接頭與多種蛋白質(zhì)(包括小鼠白蛋白 MSA)上的游離氨基偶聯(lián)(圖3)。該綴合物在體內(nèi)和體外的藥效比未偶聯(lián)的腺嘌呤類似物 強100倍。此外，白蛋白綴合物(UC-1V150/MSA)的小鼠肺內(nèi)給藥誘發(fā)了支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中局部細胞因子的產(chǎn)生，而非全身性的細胞因子釋放。與此明顯不同的是，未予連接 的藥物在氣道中的送遞迅速引發(fā)了血流中細胞因子的釋放。 在一個實施方案中，與TNFa和IL-1相比，TLR7激動劑能夠最大限度地產(chǎn)生Thl 剌激細胞因子(干擾素和IL-12) 。 TLR7位于DC中不斷合成和成熟的內(nèi)體小泡的內(nèi)表面。 例如，對于預(yù)防哮喘而言，優(yōu)選運輸至樹突細胞早期內(nèi)體并主要誘導(dǎo)I型干擾素的穩(wěn)定有 效的TLR激動劑。將TLR激動劑與磷脂輔助基團共價連接，期冀該綴合物即UC-1V199/L(圖 6)可快速并穩(wěn)定地嵌入細胞的脂質(zhì)膜，包括內(nèi)體小泡中。值得注意的是，僅30皮摩爾的 UC-1V199/L即誘導(dǎo)了骨髓來源小鼠單核細胞中的細胞因子的合成。圖7-8示出IL-12合成 的數(shù)據(jù)。 TLR7配體嘌呤或咪唑喹啉具有特有的性質(zhì)，即雙相劑量反應(yīng)曲線。在高濃度時，該 藥物不能誘發(fā)細胞因子合成。這種雙相作用在高純度的樹突細胞中可觀測到，并似乎為細 胞自發(fā)性的。然而，使用可藥用藥物濃度時，UC1V199/L的顯著效力使該現(xiàn)象得到重新審視 (圖9)。濃度為10nM UC-1V199/L時觀測到最多細胞因子的產(chǎn)生，而更高的濃度逐漸誘發(fā) 更低的IL-12(和TNF)釋放。 已經(jīng)知道持續(xù)高濃度的TLR7激動劑能夠誘發(fā)可持續(xù)24小時或更長時間的對TLR 重復(fù)剌激的不應(yīng)性。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)體系顯然構(gòu)成防止細胞和組織在炎癥應(yīng)答期間自我 毀滅的保險機制的一部分。因此，重要的是確定無法誘發(fā)顯著細胞因子合成的UC-1V199/L 濃度是否仍然會誘發(fā)"TLR耐受性"。實際上，當骨髓來源的單核細胞暴露在非激活濃度的 UC-lV199/L(liiM)下，然后再用相同的化合物、UC-1V150或pam3Cys(P3C，一種TLR2激活 劑)重復(fù)剌激24小時時，它們表現(xiàn)出明顯減弱的細胞因子響應(yīng)。相反地，經(jīng)UC-1V199/L治 療的細胞通過TRIF途徑仍對TLR3和TLR4配體保持響應(yīng)(結(jié)果未示出)。初步試驗表明， 不應(yīng)答性也在體內(nèi)引發(fā)。因此，UC-lV199/L及相關(guān)藥物的每日給藥可抑制由依賴MyD88的 剌激誘發(fā)的炎癥，同時沒有與TLR激活有關(guān)的全身性副作用。 在一個實施方案中，本發(fā)明的綴合物可適用于預(yù)防、抑制或治療哮喘。哮喘的特征 在于間歇性可逆氣道收縮、支氣管平滑肌增生和慢性炎癥的發(fā)生。盡管特應(yīng)性疾病容易誘 發(fā)哮喘，但達到半數(shù)的受侵襲患者不具有特應(yīng)性。哮喘的其他環(huán)境風險因素包括煙草煙霧 和空氣污染物。此外，受侵襲的哮喘患者的疾病爆發(fā)不只是變應(yīng)原所致，還可以是氣道剌激 物、溫度變化和感染導(dǎo)致。 最初發(fā)生的變應(yīng)性應(yīng)答部分地通過Thl和Th2淋巴細胞之間的平衡、以及它們各 自的細胞因子(特別是干擾素和IL-4)間的平衡來調(diào)節(jié)。使用與TLR7或TLR9激動劑結(jié)合 的變應(yīng)原對動物接種會優(yōu)先擴增變應(yīng)原特異性Thl記憶細胞。因此，使用與Th2為主的佐 劑連接的抗原進行后續(xù)免疫不易引發(fā)IgE應(yīng)答。用抗原和TLR7或TLR9激動劑接種的小鼠 能抵抗實驗性的哮喘。 用TLR激動劑治療哮喘與預(yù)防哮喘需要的方法不同。在患病患者中，氣道和肺部組織已有多種炎性細胞群浸潤，包括許多淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性 細胞和中性粒細胞亞群。在這種情況下，TLR激動劑可能通過增加炎性介質(zhì)例如TNF-a和 IL-1釋放而加重疾病。實際上，各種微生物制劑激活TLR的能力可解釋它們引起哮喘發(fā)作 的原因。 與TNF-a和IL_1相比，用于預(yù)防哮喘的TLR激動劑優(yōu)選局限于肺部，但也能最大 限度地產(chǎn)生Thl剌激細胞因子(干擾素和IL-12) 。 TLR7和TLR9都位于樹突細胞中不斷合 成和成熟的內(nèi)體小泡的內(nèi)表面。聚集的TLR9激活寡核苷酸即磷酸二酯寡核苷酸在早期內(nèi) 體小泡中保留時間較長，并因而誘發(fā)與成熟小泡中未聚集的磷酸二酯寡核苷酸相比更多的 I型干擾素。結(jié)果顯示了 TLR激動劑的空間結(jié)構(gòu)決定了其運輸和其誘發(fā)細胞因子合成的模 式。對于預(yù)防哮喘而言，優(yōu)選可輸送至樹突細胞早期內(nèi)體并主要誘發(fā)I型干擾素的穩(wěn)定、強 效且具有分子特征的TLR激動劑。 為了研究本發(fā)明的綴合物對變應(yīng)性哮喘的作用，通過在第0天和第7天對每只小 鼠皮下注射20 g沉浸于500 g明礬中的卵清蛋白的鹽水溶液以敏化小鼠誘發(fā)氣道炎癥。 在第16天和第21天，以每只小鼠5ii g卵清蛋白的量鼻內(nèi)給藥以攻擊小鼠。在第16天首 次卵清蛋白激發(fā)之前，綴合物在不同的時間點以鼻內(nèi)、口服或靜脈注射方式給藥。在最后一 次激發(fā)(第22天)后24小時，測量氣道反應(yīng)性，處死小鼠，并收集BALF細胞、肺和脾樣品。 用未經(jīng)用藥的小鼠和卵清蛋白/鋁敏化小鼠作為對照。計算BALF中細胞的總數(shù)并進行瑞 特-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色以確定嗜酸性細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和肥大細胞。 通過Luminex分析確定BALF中的細胞因子水平。在最后一次激發(fā)后24小時，使用單室整 體體積描記器(whole bodyplethysmogr即h)評估對乙酰甲膽堿的氣道反應(yīng)性。Penh-即一 個通過常規(guī)雙室描記器測量的與肺阻力密切相關(guān)的無量綱值_用來監(jiān)測氣道反應(yīng)性。
本發(fā)明化合物以治療有效量給藥至需要治療的受試者。本發(fā)明組合物的給藥可通 過合適的任何給藥途徑進行，特別是胃腸外給藥，例如靜脈、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、 尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑的給藥。所述給藥可為單次快速濃注、多次注射、或 短期或長期持續(xù)輸注。植入式醫(yī)療器械(例如植入式輸液泵)也適用于具體劑型的劑量隨 時間不變或改變的周期性胃腸外送遞。對于所述胃腸外給藥而言，化合物優(yōu)選配制成一種 以水、其他合適溶劑或多種溶劑的混合物作為溶劑的無菌溶液。所述溶液可含有使溶液與 血液等滲的諸如鹽類、糖類(特別是葡萄糖或甘露醇)等其他物質(zhì)，緩沖劑——例如乙酸、 檸檬酸和/或磷酸和它們的鈉鹽，以及防腐劑。 本發(fā)明的化合物可配制成藥物組合物并以與選擇的給藥途徑相適應(yīng)的各種形式 給予哺乳動物宿主，例如人類患者，所述給藥途徑即，口服或通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下 途徑進行腸胃外給藥。 因此，本發(fā)明化合物可與一種可藥用的載體(例如惰性稀釋劑或可吸收的可食用 載體)相結(jié)合進行全身給藥，例如口服給藥?？蓪⒒衔锇胗矚せ蜍洑っ髂z膠囊中，可壓 縮成片劑，或可直接與患者飲食的食物相混合。對于治療性口服給藥，活性化合物可與一種 或多種賦形劑混合并以可吸收的片劑、口含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、薄片劑 等形式使用。所述組合物和制劑應(yīng)該含有至少O. 1%的活性化合物。組合物和制劑的百分 數(shù)當然是可以變化的，通常可方便地為給定單位劑型重量的約2%至約60%。在這類治療 有用的組合物中活性化合物的量應(yīng)為能夠獲得有效劑量水平的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可含有以下物質(zhì)粘合劑，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸氫二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或增香劑，例如薄荷、冬綠油，或可以添加櫻桃調(diào)味劑。單位劑型為膠囊時，除上述類型的物質(zhì)外，其還可含有一種液體載體，例如植物油或聚乙二醇。各種其他物質(zhì)可以包衣形式存在，或用以改變固體單位劑型的物理形態(tài)。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可用明膠、蠟、紫膠或糖等進行包衣。糖漿或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、染料及調(diào)味劑例如櫻桃或橙味調(diào)味劑。當然，制備任何單位劑型所用的所有物質(zhì)應(yīng)該是可藥用的并且在所使用的量下是基本上無毒的。此外，可將活性化合物引入持續(xù)釋放的制劑和裝置中。 活性化合物也可通過輸注或注射進行靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥?；钚曰衔锘蚱潲}的溶液可在水中制備，水任選地與一種無毒的表面活性劑混合。分散劑也可在甘油、液態(tài)聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中，以及油中制備。在常規(guī)貯存及使用條件下，所述制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。 適于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散系，或者含有活性成分的適于臨時配制為無菌可注射或可輸注的溶液或分散系的無菌粉末，所述無菌粉末任選地被包封在脂質(zhì)體中。在所有情況下，最終劑型在生產(chǎn)和貯存條件下均應(yīng)該是無菌的、流動的并且穩(wěn)定。液體載體或運載體可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯、以及它們的合適的混合物?？衫缤ㄟ^形成脂質(zhì)體、在分散劑情形下通過維持所需的粒度或通過使用表面活性劑從而保持適當?shù)牧鲃有??？赏ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酉旨、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在許多情況下，還優(yōu)選地含有等滲劑，例如糖類、緩沖劑或氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，從而延長可注射組合物的吸收。 無菌注射溶液通過將所需量的活性化合物，根據(jù)需要與多種以上所列舉的其他成分一起加入適當溶劑中，接著進行過濾滅菌來制備。在制備無菌可注射溶液用無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，該方法產(chǎn)生前述過濾滅菌溶液的活性成分與任何其他所需成分的粉末。 對于局部給藥，本發(fā)明化合物可以純的形式施用，S卩，此時為液體。但是，通常希望將本發(fā)明化合物與一種皮膚學上可接受的載體相結(jié)合，以組合物或制劑形式給藥至皮膚上，所述皮膚學上可接受的載體可為固體或液體。 可用的固體載體包括精細分散的固體，例如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等。可用的液體載體包括水、醇或二醇或水_醇/ 二醇摻合物，本發(fā)明化合物可任選借助無毒的表面活性劑以有效水平溶解或分散于液體載體中?？商砑虞o劑例如芳香劑及其他抗微生物劑來優(yōu)化針對給定用途的性質(zhì)。得到的液體組合物可通過吸收襯墊施用，用于浸漬繃帶及其他敷料，或用泵型噴霧器或氣溶膠噴霧器噴灑在病患區(qū)域。 增稠劑例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物材料，也可與液體載體一起使用來形成可延展的膏劑、凝膠劑、軟膏、皂劑等，直接應(yīng)用至使用者的皮膚。
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此外，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了多種用于綴合物吸入送遞的劑型。例如， 制劑可設(shè)計成通過例如定量劑量吸入器、干粉吸入器和噴霧器等裝置使用的氣霧劑。
適用于將本發(fā)明化合物送遞至皮膚的皮膚學上可用的組合物的實例為本領(lǐng)域已 知；例如，見Jacquet等人的美國專利4， 608， 392、 Geria的美國專利4， 992， 478、 Smith等 人的美國專利4， 559， 157和Wortzman的美國專利4， 820， 508。 本發(fā)明化合物的可用劑量可通過比較它們在動物模型中的體外活性和體內(nèi)活性 而確定。將小鼠及其他動物的有效劑量外推至人類的方法是本領(lǐng)域已知的；例如，見美國專 利4， 938， 949。本發(fā)明化合物作為TLR激動劑的能力可使用本領(lǐng)域公知的藥理學模型確定， 所述藥理學模型包括Lee et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :6646 (2003)中公開的方 法。 通常，本發(fā)明化合物在液體組合物例如洗劑中的濃度可為約0. 1-25重量％ 、優(yōu)選 約0. 5-10重量％。在半固體或固體組合物例如凝膠或粉末中的濃度可為約0. 1-5重量％， 優(yōu)選約O. 5-2. 5重量％。 可施用活性成分以獲得約O. 5至約75iiM，優(yōu)選約1至50 y M，最優(yōu)選約2至約 30 ii M的活性化合物峰值血槳濃度。這可以通過例如靜脈內(nèi)注射0. 05至5%活性成分的溶 液，任選其鹽溶液而實現(xiàn)，或者通過口服含有約l-100mg活性成分的大丸劑進行給藥?？赏?過連續(xù)輸注提供約0. 01-5. 0mg/kg/h的活性成分，或通過間歇性輸注含有約0. 4-15mg/kg 的活性成分，從而保持需要的血液水平。 用于治療所需的化合物或其活性鹽或其衍生物的量，不僅隨所選的具體的鹽而變 化，而且隨給藥途徑、所治療病癥的性質(zhì)及患者年齡及狀況而變化，并最終應(yīng)由治療的內(nèi)科 醫(yī)生或臨床醫(yī)生決定。但是，通常的適宜劑量為每天約0. 5至約100mg/kg體重，例如約10 至約75mg/kg體重的范圍，例如每天3至約50mg/kg受治療者體重，優(yōu)選6至90mg/kg/天 的范圍，最優(yōu)選15至60mg/kg/天的范圍。 化合物通常方便地以單位劑型給藥；例如，每單位劑型含有5至1000mg、通常10 至750mg、最常用的為50至500mg的活性成分。 所需劑量通?？梢詥蝿┝炕蛞院线m的時間間隔給藥的分劑量存在，例如每天兩 次、三次、四次或更多次的亞劑量。所述亞劑量本身還可再分成例如多個不連續(xù)的疏散間隔 的給藥；例如通過吹藥器多次吸入或通過多次滴入眼中來施用。所述劑量還應(yīng)根據(jù)患者個 體的年齡、體重、狀況和反應(yīng)而改變，劑量頻率可能也是如此。通常，對于本文所述病癥而 言，式(I)化合物的日總劑量范圍可為約50至約5000mg，并以單劑量或分劑量給藥。優(yōu)選 地，日劑量范圍應(yīng)為約100mg至約4000mg、最優(yōu)選為約1000-3000mg，并以單劑量或分劑量 給藥，例如每6小時750mg 口服化合物。這可達到約500-750uM的血漿水平，該血漿水平可 有效地殺死癌細胞。在處理患者過程中，治療應(yīng)當以較低劑量開始并根據(jù)患者的整體反應(yīng) 而增加。 如上所述，含有本發(fā)明化合物的組合物適用于治療或預(yù)防例如人類或其它哺乳動 物(例如牛、犬、馬、貓、羊和豬等動物)以及可能的其它動物的疾病或失調(diào)。根據(jù)具體的化 合物，所述組合物將例如用于治療癌癥、感染，作為疫苗用于增強適應(yīng)性免疫(例如抗體的 產(chǎn)生、T細胞的活化等)，和/或剌激中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明將通過以下非限制性實施例進行進一步說明。
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實施例I 給出了作為本發(fā)明的又一些實施方案的制備式(I)化合物的方法，并且通過以下步驟進行說明，在以下步驟中除非另有指明，一般的基團含義如上所述。
普通化學。試劑和溶劑購于Aldrich,Milwaukee, WI.。未校正的熔點用LaboratoryDevice Mel-Temp II毛細管熔點裝置測定。用Varian Unity 500NMR光譜儀記錄499. 8MHz處的質(zhì)子核磁共振光譜或用Varian Mercury NMR光譜儀記錄400. 06MHz處的質(zhì)子核磁共振光譜?；瘜W位移以ppm記錄距離指定參考基準的標度。陽離子和陰離子回路質(zhì)譜由Department of Chemistry UCSD，San Diego， CA進行。兀素分析由NuMega Resonance Labs，San Diego，CA進行。柱色譜分析用指定的溶劑體系在E Merck硅膠(230-400目)上進行。分析性薄層色譜(TLC)在硅膠60F-254板(EM Reagents)上進行。 4-(2,6-二氯嘌呤-9-某甲某)苯某氰的制備。將2，6-二氯-9H-嘌呤(16mmo1)溶解在DMF(50mL)中并加入碳酸鉀(50mmol)。然后加入a -溴-對甲苯基氰(22mmol)，并將該混合物在室溫下攪拌16小時。過濾除去不溶性無機鹽后，將濾液倒入水(1500mL)中并用乙酸乙酯萃取(2x400mL)，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)得到剩余物，該剩余物通過使用1 : 2 : 10的乙酸乙酯/丙酮/己烷進行快速硅膠色譜純化。產(chǎn)量3. 33g(69% ) 。 UV、NMR和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 4- (6-氨某-2-氯嘌呤-9-某甲某)苯某氰的制備。將上述產(chǎn)物(1. 9g)放入鋼反應(yīng)容器中并加入氨甲醇溶液(80mL，7N)。將密封的容器在6(TC下加熱12小時，在冰中冷卻并濾除固體產(chǎn)物。產(chǎn)量1.09g。 UV、NMR和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 4-「6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰的制備。將金屬鈉(81mg)在加熱條件下溶解于2-甲氧基乙醇(30mL)中以生成2-甲氧基乙醇的鈉鹽。向該溶液中加入溶解在甲氧基乙醇(300mL)中的實施例2的產(chǎn)物(1. 0g)(加熱條件下)。將反應(yīng)混合物在115t:浴槽溫度下加熱8小時，真空濃縮至近干燥狀態(tài)，將剩余物在乙酸乙酯和水之間分配。將有機層通過使用含5%甲醇的二氯甲烷溶液進行快速硅膠色譜純化，得到763mg產(chǎn)物。NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。 4-「6-氨某-8-浪-2-(2_甲氧某乙氧某)嘌呤_9_某甲某]苯某氰的制備。將上述產(chǎn)物(700mg)溶解在二氯甲烷(400mL)中并逐滴加入溴(7mL)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜并用硫代硫酸鈉水溶液(0. 1M，2L)萃取，然后用碳酸氫鈉水溶液(500mL，飽和)萃取。有機層剩余物通過使用含3%甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠色譜純化，得到460mg溴代產(chǎn)物。NMR、 UV和MS與所示結(jié)構(gòu)一致。 4-「6-氨某-8_甲氧某-2-(2_甲氧某乙氧某)嘌呤_9_某甲某]苯某氰的制備。通過鈉金屬(81mg)在無水甲醇(30ml)中的反應(yīng)生成甲醇鈉。將上述產(chǎn)物(700mg)溶解在無水二甲氧基乙烷中并將溫度升至IO(TC。反應(yīng)過夜后，將混合物真空濃縮，剩余物通過使用含5%甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠色譜純化，產(chǎn)量120mg。 NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。
氡化N, N' -(二甲某亞乙某二氨某)鋁鋰的制備。該用于將腈轉(zhuǎn)化成醛官能團的還原劑大致按Bull. Korean Chem. Soc. ，23 :1697(2002)中所述進行制備。制備含0. 5M該還原劑的無水THF溶液。 4-「6-氨基-8_甲氧基-2-(2_甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛的制備。將4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰(100mg)溶解于無水THF(3mL)中并在氬氣下冷卻至0°C 。將上述產(chǎn)生的氫化鋁試劑(0. 72mL)加入反應(yīng) 燒瓶中。將混合物在0-5t:攪拌1小時，然后加入3M HC1終止反應(yīng)。依次用乙酸乙酯和二 氯甲烷萃取混合物，然后真空濃縮，得到85mg產(chǎn)物。NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。
4-「6-氨某-8-羥某-2-(2_甲氧某乙氧某)嘌呤-9-某甲某]苯甲醛(UC-1V150) 的制備。將上述產(chǎn)物(800mg)與碘化鈉(504mg)和乙腈(40mL)混合，然后緩慢加入三甲基 氯硅烷(0. 5mL)。將混合物在7(TC下加熱3. 5h，冷卻并過濾。固體產(chǎn)物用水洗滌，然后用乙 醚洗滌，得到406mg產(chǎn)物。NMR、 UV、 MS與所述結(jié)構(gòu)一致。該材料適用于接頭和大分子之間 的綴合反應(yīng)。 4-「6-氡某-8-甲氣某-2-(2-甲氣某乙氣某)嘌呤-9-某甲某]苯甲酸甲酯的制 備。該方法按Jayachitra et al. , Synth. Comm. , 33 :3461 (2003)中所述制備。將4-[6-氨 基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]節(jié)腈(lmmol)溶解于無水甲醇 (5mL)中，并將新蒸的BF3乙醚合物(4mmo1)加入該溶液中。所得混合物在氬氣下回流20 小時。真空除去溶劑，將剩余物溶解在二氯甲烷(lOmL)中，并用稀的碳酸氫鈉水溶液萃取 (2 X lOmL)，有機層用硫酸鎂干燥。蒸發(fā)后，產(chǎn)物使用含5%甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠色 譜純化，產(chǎn)量0. 8mmo1。 4-「6-氡某-8-羥某-2-(2-甲氣某乙氣某)嘌呤_9_某甲某]苯甲酸的制備。將 4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲酸酯(100mg)與碘化 鈉(63mg)和乙腈(lOmL)混合，然后緩慢加入三甲基氯硅烷(120mL)。將該混合物在70°C 下加熱6小時，冷卻并過濾。固體產(chǎn)物用水洗滌，然后用乙醚洗滌，得到51mg產(chǎn)物。
4-「6-氨基-8-羥基_2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9基甲基]苯甲酸2， 5_ 二氧代 吡咯烷-l-基酯的制備。將4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲 基]苯甲酸酯(2mmo1)溶解于二氯甲烷或二噁烷(10mL)中并加入EDC(2mmo1)。向該溶液 中加入N-羥基丁二酰亞胺(2mmo1)，并將所得混合物在室溫下攪拌1小時。將混合物真空 干燥，并將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜純化，得到2mmo1產(chǎn)物，該產(chǎn)物適用于與伯胺有關(guān)的綴合 反應(yīng)。 實施例II UC-1V150與首先經(jīng)丁二酰亞胺基6-肼基-煙酰胺丙酮腙(SANH)接頭修飾的MSA 共價偶聯(lián)，得到一種UV光譜特征改變了的穩(wěn)定分子。UC-1V150/MSA綴合物通過由于腙的 形成而出現(xiàn)在342nm處——而SANH本身的吸收峰在322nm處——的UV吸收峰識別。每 分子MSA綴合的UC-1V150分子的量由UC-1V150-SANH標準曲線(圖1)外推得出。相應(yīng) 地，UC-1V150/MSA綴合物以約5 : l的比例得到。本文所報道的生物研究使用5 : l的 UC-1V150/MSA完成。 SANH對MSA的修飾。將200 ii 1 MSA(25mg/ml)與100 ii 1綴合緩沖液(1M NaPi， pH = 7. 2)和690 ii 1 PBS進行混合。將含844 ii g SANH的10 ii 1 DFM溶液(40倍摩爾過量 于MSA)添加至蛋白溶液中(反應(yīng)混合物中MSA的最終濃度為5mg/ml)。稍作混合后使反應(yīng) 在室溫下進行2小時。將反應(yīng)混合物裝載至用PBS平衡的NAP-10柱上，用1. 5ml的PBS洗 脫經(jīng)修飾的MSA，以除去過量的SANH。 IV150與經(jīng)SANH修飾的MSA的連接。將460 ii g IV150溶解在10 iU的DMF中， 并加入經(jīng)SANH修飾的MSA中，該反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)過夜。首先將反應(yīng)混合物用微旋柱(Millipore :BI0MAX 5K)濃縮至lml，然后裝載至如上所述的NAP-10柱上，以除去過量 的IV150。 同樣使TLR7激動劑與寡聚脫氧核苷酸(0DN)(圖20-21)、病毒(圖18-19)以及一 種隨后可納入脂質(zhì)體中的脂質(zhì)成分(圖24-25)綴合。 苧間調(diào)控(spatially regulated)TLR7激動劑的合成。綴合物各自通過牛物綴合 化學領(lǐng)域公知的標準技術(shù)制備。通過定量UV、 LC/MS和PAGE方法表征各綴合物，來確定與 輔助基團(大分子)綴合的TLR激動劑的"價態(tài)"或比例。由該信息，可通過建模技術(shù)容易 地估計出綴合物的尺寸和形狀。綴合物的尺寸、形狀和價態(tài)的多樣化可通過對大分子的選 擇實現(xiàn)，所述大分子在結(jié)構(gòu)示意圖中表示為R3。例如，當R3為樹突狀物、例如常規(guī)聚(氨 基胺)類時，用于連接TLR激動劑的表面官能團的數(shù)量可以基于該具體樹突狀物的分支點 和分級(generation)的數(shù)量而精確地確定。第一分級(Gl)具有8個表面氨基基團，G2具 有16個等等，從而導(dǎo)致對綴合物價態(tài)和尺寸的高度控制(見圖2)。此外，一些樹突狀物納 米粒可同時含有靶向配體和TLR7激動劑。TLR7激動劑-脂質(zhì)綴合物也可根據(jù)選擇的脂質(zhì) 而具有多種"價態(tài)"。例如，強效綴合物UV-1V199/L(圖6)通過使TLR7激動劑(UV-1V199) 的羧基衍生物與市售可得的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的乙醇氨基基團偶聯(lián)而制備。
這些脂質(zhì)綴合物通過與膽固醇、DOPE和其它脂質(zhì)混合而配制成各種脂質(zhì)體納米 粒，以制備流體動力學直徑為約100nm的顆粒(圖24-25)。該圖中的六邊形代表UV-1V199/ L和相關(guān)的具有磷脂尾基的TLR7激動劑。 通過諸如本文公開的分析試驗測定，TLR7激動劑和二聚物以及TLR綴合物已經(jīng)表 現(xiàn)出具有體內(nèi)細胞因子釋放和/或細胞因子活性。例如，所有以下物質(zhì)均表現(xiàn)出活性咪喹 莫特、溴匹立明、UC-1V138、 UC-1V136、 UC-1V150、 UC-1X105、 UC-1V199、 UC-1W236、 UC-1X51、 UC-1W247、 UC-1X113、 UC-1V199/L、 UC-1V150/BSA，以及具有或不具有接頭的UC-1V150與 MSA、 0VA、病毒體和/或ODN的綴合物，以及UC-1V199與DOPE、二氧化硅、脂質(zhì)或經(jīng)輻射的 芽孢的綴合物，以及UC-1V1043和UC-1V1018與OVA的綴合物。
實施例III
材料和方法 化合物體外評估。評估了 TLR7綴合物剌激和/或抑制鼠骨髓來源的單核細胞 (BMDM)中以及人外周血液單核細胞(PBMC)中的細胞因子產(chǎn)生的能力，所述鼠骨髓來源單 核細胞高度富集樹突細胞。將BMDM置于96孔板中并用賦形劑或以三倍增量稀釋的起始于 10 ii M至皮摩爾濃度的各種劑量處理，進行三次平行重復(fù)操作。24小時后，收集上清液并使 用Luminex珠分析系統(tǒng)和市售可得的試劑，對最多達30種不同的細胞因子、化學趨化因子 和其它介質(zhì)進行檢測。用定量mRNA表達測定和二維磷蛋白分析補充細胞因子/趨化因子 ELISA結(jié)果，以深入探討耐受性誘導(dǎo)的范圍和機制。在收集上清液時，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換 為MTT，以作為細胞存活的比色評估。人PBMC從市售的袋裝血液中分離，并類似地進行處 理。 各納米粒用一種熒光染料加載或修飾，以評估TLR激動劑綴合的納米脂質(zhì)體和樹 突狀物的運輸。亞細胞定位通過顯微鏡確定，在某些情況下是在已經(jīng)過內(nèi)體成熟抑制劑處 理的細胞中。 首先用最強效的化合物在預(yù)先確定的對促炎細胞因子剌激(TNFa ， IL_1)作用最小的濃度下對BMDM進行處理，以比較具有不同輔助基團的TLR7綴合物的抗炎活性。24 小時后，更換培養(yǎng)基，并且在能有效引發(fā)模擬處理細胞中的細胞因子產(chǎn)生的濃度下用不同 TLR家族成員(TLR2為Pam3Cys、 TLR3為聚(I:C) 、 TLR4為LPS、 TLR5為鞭毛蛋白、TLR6為 Malp-2、 TLR7為UV-1V150、 TLR7/8為R848、 TLR9為CpG寡核苷酸等)的激活配體激發(fā)細 胞。所述細胞通過多重免疫測定法、定量PCR和磷蛋白印跡進行測定。TLR綴合物致敏的細 胞也以不同的時間間隔激發(fā)并分析細胞因子產(chǎn)生的模式，以更好地了解耐受性誘發(fā)和維持 的動力學。 化合物體內(nèi)評估。在小鼠氣道給藥后評估支氣管肺泡灌洗液(BALF)相對于全身 細胞因子的產(chǎn)生。經(jīng)麻醉的年齡相當?shù)拇菩訡57BL/6小鼠用不同量的上述TLR7綴合物、或 合適賦形劑中的脂質(zhì)體或樹突狀物進行鼻內(nèi)(i.n.)、口服(p.o.)或靜脈內(nèi)(i.v.)給藥。 麻醉恢復(fù)后在不同的時間點收集血清和BALF，并用Luminex分析細胞因子和趨化因子。記 錄經(jīng)處理動物的重量、體溫和液體攝入模式作為全身性"細胞因子綜合征"的臨床指標。
通過血清和BALF細胞因子的測定，隨后的實驗評估了不同藥劑在高劑量鼻內(nèi)、口 服或靜脈給藥后產(chǎn)生TLR活化的局部或全身不應(yīng)性(TLR耐受性)的能力。選擇不會顯著 誘發(fā)體內(nèi)細胞因子以及細胞因子綜合征臨床癥候的各種高劑量的TLR7綴合物。小鼠用選 定的高劑量以不同的給藥途徑處理，然后在多個時間點用不同的TLR激活劑激發(fā)。收集并 分析血清和BALF并記錄臨床癥狀。綴合物抗炎活性用之前用于研究LPS和CpG的致死性 休克模型確認。在該模型中，預(yù)先經(jīng)D-半乳糖胺腹膜內(nèi)(i.p.)注射給藥的Balb/c小鼠在 用不同的TLR激活劑全身性激發(fā)后因細胞因子剌激和肝損傷而死亡。活性抗炎藥物不會誘 發(fā)致敏動物的臨床癥狀，而且還能防止由其它TLR配體引起的休克。在有確定的終點時，該 模型尤其適用于確定TLR耐受性的動力學和持續(xù)時間。
實施例IV
材料和方法 小鼠。雌性C57BL/6小鼠(5-6周齡)從Harlan West Coast (Germantown， CA)獲 得，雌性A/J小鼠(6-8周齡)購自The JacksonLaboratories (Bar Harbor, ME) 。 A/J小 鼠用于接受炭疽桿菌Sterne菌株感染(Kenney et al. ，.T. Infect. Dis. ， 190 :774(2004))。 小鼠在標準條件下于加利福尼亞大學的圣迭戈動物中心飼養(yǎng)，該動物中心經(jīng)美國實驗動物 管理認證協(xié)會(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care) 認證。所有動物實驗方案均經(jīng)過試驗機構(gòu)倫理委員會(Institutional Review Board)預(yù) 先批準。對于H1N1流感的研究，從Charles River Laboratories (Wilmington,MA)獲得雌 性BALB/c小鼠(16-18g)，并在經(jīng)美國實驗動物管理認證協(xié)會認證的猶他州立大學實驗動 物研究中心飼養(yǎng)。 BMDM的體外刺激。從各品系的小鼠中分離BMDM并以每孔5X 104細胞的密度接種 于96孔板中。將化合物加入最終濃度為0. 01至10 M或另外指明的濃度的10日齡培養(yǎng) 物中。培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)上清液，并使用Beadlyte Mouse MultiCytokine定制試劑 盒(Upstate, Charlottesville, VA和eBiosciences， SanDiego， CA)根據(jù)制造商的說明書 通過夾心酶聯(lián)免疫分析法(BD Pharmingen，San Diego，CA)或多重Luminex (Austin, TX)分 析法分析了細胞因子的誘導(dǎo)。 化合物的小鼠給藥。年齡相當?shù)拇菩訡57BL/6小鼠通過尾靜脈注射100 y L含有UC-1V150或UC-1V150/MSN的鹽溶液，每一種溶液含有0. 38_38nmol當量的藥物核心。對 于肺內(nèi)給藥而言，小鼠用阿佛丁溶液實施腹膜內(nèi)麻醉并沿著頸部脫毛。氣管切開一個小切 口并注射50 ii L含有不同量的UC-1V150/MSA或非綴合藥物的鹽溶液。麻醉恢復(fù)后在不同 的時間點收集血清和BALF，并通過Luminex分析法分析IL_6、IL_12p40、IFN- y 、RANTES和 MCP-1。在其它實驗中，小鼠用氯胺酮/ 二甲苯溶液肌內(nèi)麻醉，并以鞘內(nèi)注射(i. t. )50 i！ L 的劑量或鼻內(nèi)給藥(i.n.)20iiL的劑量給予相同量的UC-lV150/MSA。由于以任何方法給藥 后24小時在BALF中均觀測到相似的細胞因子水平，故在感染模型研究中采用更方便的鼻 內(nèi)給藥(i.n.)途徑。 A/.T小鼠的炭疽桿菌芽孢感染。芽孢由炭疽桿菌Sterne菌株(pX01+pX02—)按照前 人方法(Sabet et al. ,FEMS Immunol. Med. Microbiol. ,47 :369(2006) ;Guidi-Rontani et al. , Mol. Microbiol. ,42 :931(2002))制備。純化的芽孢于4°C以1 X 108至4X 108cfu/mL 儲存在PBS中。注射前，將芽孢在65t:加熱30分鐘以引發(fā)萌芽。A/J小鼠用氯胺酮/二甲 苯溶液肌內(nèi)麻醉，并在感染炭疽前1天以每只小鼠0. 75nmol的UC-1V150或UC-1V150/MSA 的量鼻內(nèi)給藥(i. n.)。對照小鼠以與UC-1V150/MSA中相同的量僅接受鹽溶液或含MSA的 鹽溶液。感染使用20 L體積的2X 105至8X 105的炭疽桿菌芽孢進行。觀測13天存活情 況，這是因為大多數(shù)經(jīng)鹽溶液處理的小鼠在3-6天內(nèi)死亡。結(jié)果通過每組8只小鼠測得。
Balb/c小鼠的流感病毒感染。流感A/New Caledonia/20/29 (H1N1)病毒從美國 疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control andPrevention) (Atlanta, GA)獲得。 將該病毒在馬-達二氏犬腎(MDCK)細胞中增殖兩倍，并在小鼠中進一步傳代7次以使其 具有致命毒力，然后再在細胞培養(yǎng)物中進行又一次傳代而擴增。小鼠用氯胺酮(100mg/kg) 腹膜內(nèi)(i.P.)麻醉，并用病毒以每只小鼠約105°細胞培養(yǎng)感染劑量使用50iiL的接種量 鼻內(nèi)(i.n.)感染。在暴露于病毒前24h，每只小鼠以75iiL的單純的鹽溶液或含有5nmo1 UC-1V150/MSA的鹽溶液的單次鼻內(nèi)劑量給藥。觀察每個處理組的IO只受感染的小鼠以及 20只安慰劑對照動物的21天存活情況。 Mt。通過非參數(shù)秩和檢驗(Mann Whitney U-test) (p《0. 05)比較各細胞因 子水平以確定統(tǒng)計學顯著性。使用Gr即hPd Prism軟件(4.0c版，San Diego， CA)獲得 K即lan-Meier存活曲線并進行時序檢驗以比較存活差異。
題 UC-1V150/MSA綴合物導(dǎo)致的體外和體內(nèi)有效細胞因子釋放。單獨使用UC-1V150 對骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)的培養(yǎng)剌激了細胞因子的釋放(圖10)。當與MSA綴合時， 以10倍低于TLR7激動劑等量濃度的濃度檢測到相似或更高的細胞因子水平。如前所述實 施的使用TLR轉(zhuǎn)化株的實驗證實了，與缺少醛基修飾的化合物(UV-1V136)類似，UC-1V150 是一種特異性TLR7激動劑(Lee et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 103 :1828 (2006))。在 對小鼠靜脈給藥(i.v.)后，UC-1V150誘發(fā)了血清細胞因子水平，該細胞因子水平在注射后 約2小時達到峰值，然后快速下降至接近基線水平(數(shù)據(jù)未示出)。以不同劑量i.v.注射 UC-1V150與UC-1V150/MSA后2小時的細胞因子產(chǎn)生曲線間的比較證實了 ， MSA綴合物的藥 效增強了 10至IOO倍(圖11)。鹽水或MSA對照組的血清未表現(xiàn)或幾乎未表現(xiàn)出可檢測的 細胞因子水平(未示出)。 UC-1V150/MSA綴合物提供肺部延長的局部活性。首先使TLR7激動劑直接進入氣
43管以確保藥物在呼吸系統(tǒng)的充分送遞。在從經(jīng)過UC-1V150/MSA鞘內(nèi)(i.t.)給藥處理的小 鼠中提取的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中發(fā)現(xiàn)了大量的細胞因子誘導(dǎo)，而相同動物中血清 細胞因子的量極低且接近基線水平(圖12)。明顯不同的是，在用小分子TLR7激動劑進行 鞘內(nèi)注射(i.t.)注射的小鼠的BALF和血清中觀測到了相似的細胞因子水平，該激動劑有 時誘導(dǎo)行為變化，例如毛發(fā)直立和顫抖，這暗示了細胞因子綜合征(表2)。隨后用UC-1V150 進行的研究表明，可能是由于藥物的吸入，鼻內(nèi)(i.n.)送遞也誘導(dǎo)了BALF中選擇性細胞 因子的產(chǎn)生。因此，使用鼻內(nèi)(i.n.)給藥在兩種肺炎感染動物模型中評估UC-1V150綴合 物。與對照小鼠(P< 0.025)的5天平均存活壽命相比，在炭疽桿菌芽胞感染之前一天用 UC-1V150/MSA鼻內(nèi)預(yù)處理的小鼠的平均存活壽命延長至7.5天(圖14A)。與此相反，在 用鹽水、等量的MSA或單獨的UC-1V150處理的小鼠中，未觀測到明顯差異。這些數(shù)據(jù)證實 了 ， UC-1V150綴合物而非游離藥物，具有肺內(nèi)免疫治療活性。因此，在呼吸道局部送遞之后， TLR7激動劑與MSA的綴合增強了它的藥效，并降低了它的毒性。 在另一項研究中，在流感病毒感染(H1N1株)前1天，BALB/c小鼠用UC-1V150/ MSA綴合物進行鼻內(nèi)(i.n.)預(yù)處理。與未處理的對照(P< 0.0001)的7天平均壽命相比， 經(jīng)處理的小鼠的平均壽命延長至11. 5天(圖14B)。所有的這些結(jié)果表明，在呼吸道局部送 遞之后，TLR7激動劑與MSA的綴合增強了它的藥效，并降低了它的毒性。
在炭疽感染前，用UC-1V150/MSA鼻內(nèi)(i. n.)給藥，然后在第4天時用環(huán)丙沙星 (ciprofloxacin) (25mg/kg)處理。安慰劑處理后接著用環(huán)丙沙星處理導(dǎo)致了約15-25%的 存活率，而用綴合物和環(huán)丙沙星進行的處理導(dǎo)致了約90%的存活率。因此，所述綴合物特別 適于用作一種炭疽疫苗的協(xié)佐劑(coadjuvant)。
討論 化合物UC-1V150是目前發(fā)現(xiàn)的一種最強效且通用的合成小分子TLR7配體，這是 因為(i)其在納摩爾濃度即具有活性；(ii)其可與多種大分子偶聯(lián)且在某些情況下具有 增強的活性；以及(iii)其藥物代謝動力學特性可通過輔助基團的修飾而改變。TLR7-蛋白 質(zhì)綴合物UC-1V150/MSA的特征在于，具有約5個與各MSA蛋白質(zhì)分子共價連接的小分子。 所述綴合物保留了 TLR7激動劑的活性，而且與游離單體藥物相比，所述綴合物確實更高效 且具有更長的作用持續(xù)時間。此外，所述綴合物可通過鼻內(nèi)(i.n.)給藥或鞘內(nèi)(i.t.)給 藥有效地送遞至呼吸系統(tǒng)。已證實了通過鼻內(nèi)(i.n.)給藥的藥物送遞在細菌感染的小鼠 模型中的有效性。當考慮向呼吸系統(tǒng)送遞時，制備作為大分子綴合物的TLR7激動劑的潛在 重要優(yōu)點在于，可通過將免疫剌激活性限制在局部粘膜環(huán)境內(nèi)而避免全身性副作用。
預(yù)計所述大分子綴合物與游離藥物相比，被體循環(huán)吸收的速度更慢，并且，事實上 它可通過表達TLR7的定居巨噬細胞和樹突細胞貪婪地清除。因此，所述綴合物應(yīng)當可以減 少與TLR7/TLR8激動劑的全身送遞有關(guān)的嚴重副作用的類型。當給藥至粘膜部位、例如泌 尿生殖道和胃腸道時，UC-1V150/MSA綴合物還可提供有益的免疫治療活性，以防治傳染病、 變應(yīng)性疾病或惡性疾病。TLR7激動劑的大分子載體還可提供用于對特定的器官或組織進行 免疫治療的改善的選擇性送遞方法。例如，UC-1V150的脂質(zhì)綴合物可納入不同尺寸和組成 的脂質(zhì)體中，而TLR7激動劑的蛋白質(zhì)綴合物可靶向不同的樹突細胞亞群。與用TLR9-活性 寡核苷酸觀察到的作用(Rothenfusser et al. ， Hum. Immunol. ，63 :111(2002))類似，不同 的UC-1V150綴合物的細胞內(nèi)運輸可誘發(fā)不同的細胞因子產(chǎn)生模式。
—個使用與蛋白質(zhì)綴合的藥物時所觀察到的潛在的問題是，針對分子的低分子量 類半抗原(hapten-like)部分的抗體的發(fā)展。然而，與早期研究的TLR7/TLR8疫苗不同， UC-1V150具有簡單的類腺嘌呤(adenine-like)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)不太可能誘發(fā)超敏反應(yīng)。事實 上，在施用蛋白質(zhì)綴合物后，除使用完全弗氏佐劑(Freud' s adjuvant)中的鑰孔蟲戚血蘭 素載體反復(fù)給藥外，未觀察到抗UC1V150抗體(未公布數(shù)據(jù))。 人們一直尋求預(yù)防和治療流感病毒感染的新藥物，特別是隨著來自亞洲的高致病 性株系的傳播。每年由普遍流行的株系造成的發(fā)病率和死亡率都很高。這類感染的治療可 通過使用經(jīng)批準的早期開始即具有中度有效性的抗病毒藥物來完成。人們還一直研究免疫 系統(tǒng)的強化，將其作為能夠促進保護性抗病毒反應(yīng)的策略，特別是對于免疫功能受損宿主 而言。通過TLR信號傳導(dǎo)的全身免疫激活有可能不會產(chǎn)生將免疫細胞調(diào)動到感染部位所需 的局部細胞因子和趨化因子梯度。未綴合的UC-1V150可通過粘膜迅速吸收，但卻不能保護 小鼠免受炭疽桿菌感染，而UC-1V150綴合物則是有效的這一事實支持了上述假設(shè)。
炭疽桿菌已成為一種生物恐怖性試劑。對微生物病原體的迅速反應(yīng)是有效生物 防御的關(guān)鍵。通常，抗體或細胞免疫反應(yīng)可抵抗這些病原體；然而，快速產(chǎn)生這些保護性反 應(yīng)需要早先即暴露在各生物體的特定抗原下。雖然已知流感病毒可接合TLR7(Barchet et al. ,Eur. .T. Immunol. ,35 :360 (2005)),但是炭疽菌最可能接合的是TLR2、TLR4和TLR9。除 了作為TLR的常規(guī)信號傳導(dǎo)媒介外，MyD88也已表現(xiàn)出是抵抗炭疽小鼠模型感染所必需的 (Hughes et al. , Infect. Immun. ,73 :7535(2005))。因為UC-1V150綴合物作為抵抗不同涂 徑的感染的佐劑非常有效，其可作為一種生物防御策略使用而無需特異地針對特定微生物 的抗原，并可適用于混合藥劑或單獨藥劑的攻擊。
實施例V 尚未獲悉存在效力強或作用快至足以在住院治療之前預(yù)防"高危"患者SA感染的 SA疫苗。強效TLR7激動劑和滅活的革蘭氏陽性細菌(例如SA或其亞單位)的單次注射可 在給藥一周內(nèi)增強對細菌的保護性免疫。所述注射可包括，例如l) 一種直接與滅活的革 蘭氏陽性細菌的游離氨基綴合的TLR7激動劑，例如UC-IV199 ;2) —種與結(jié)合滅活的革蘭氏 陽性細菌的白蛋白綴合的TLR7激動劑，例如UC-IV199 ;3) —種與重組革蘭氏陽性細菌蛋白 質(zhì)綴合的TLR7激動劑，例如UC-IV199 ;或4) 一種與革蘭氏陽性細菌多糖綴合的TLR7激動 齊U，例如UC-IV199(例如，經(jīng)由本領(lǐng)域已知的接頭，例如使用31&9^&義@的接頭)。
如上文所述，TLR7激動劑與炭疽桿菌(BA) Sterne疫苗株的經(jīng)致死性輻射的芽孢 綴合。同SA—樣，BA是一種革蘭氏陽性細菌。通過細胞因子(IL-12和IL-6)分泌測量可知， 與單獨的芽孢相比，綴合的細菌是一種小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDB)的強效激活劑。在 另一個實驗中，BA的Sterne菌株的經(jīng)致死性輻射的芽孢_混合了與小鼠白蛋白(MSA)綴 合的TLR7激動劑-對小鼠的單次注射僅在6天后即保護了該動物免受施予的肺內(nèi)BA致死 性攻擊。相反地，僅用BA芽孢、或用BA加一種常規(guī)佐劑即霍亂毒素(CT)對該動物的注射 則不能保護該動物。因此，TLR7-激動劑白蛋白/經(jīng)輻射的芽孢疫苗在6天內(nèi)誘發(fā)抵抗炭 疽桿菌的保護性免疫。在未經(jīng)用藥的動物中的反應(yīng)快速程度完全出乎意料。相同的疫苗技 術(shù)將很可能保護人類免受院內(nèi)獲得性SA感染。 本說明書中引用的所有出版物、專利及專利文獻以引用的方式納入本文，如同逐 一地通過引用而納入的一樣。對于任何不一致的情況，以本發(fā)明公開的內(nèi)容為準，包括其中的任何定義。已參照多種具體的和優(yōu)選的實施方案和技術(shù)對本發(fā)明進行了描述。但應(yīng)理解， 可作出多種變化方案和改進方案而依然在本發(fā)明的主旨和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種預(yù)防或抑制哺乳動物的革蘭氏陽性細菌感染的方法，包括對所述哺乳動物施用一種有效量的組合物，所述組合物包含一種革蘭氏陽性細菌的細菌抗原和一定量的式(IA)化合物或其可藥用鹽，所述可藥用鹽包括其水合物，其中X1為-O-、-S-、或-NRc-；其中Rc為氫、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可與氮原子一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C1-6烷基、羥基C1-6亞烷基、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基C1-6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R1為氫、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9雜環(huán)基、取代的C5-9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C1-6烷基、羥基C1-6亞烷基、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基C1-6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R2各自獨立地為氫、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷?；?、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳?；?、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲?；?、取代的-C(O)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C1-6烷基、羥基C1-6亞烷基、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基C1-6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；Ra和Rb各自獨立地為氫、(C1-C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C1-C6)烷氧基、鹵代(C1-C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷?；⒘u基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；X2為一個鍵或一個連接基團；n為1、2、3或4；并且R3為一種大分子，其包括異源肽、異源蛋白質(zhì)、異源脂質(zhì)、珠例如聚苯乙烯珠、異源核酸分子或樹突狀物。F2008800115258C00011.tif
2. —種預(yù)防或抑制哺乳動物的革蘭氏陽性細菌感染的方法，包括對所述哺乳動物施用一種有效量的式(IB)化合物，或者其可藥用鹽，所述可藥用鹽包括其水合物， <formula>formula see original document page 2</formula>其中X1為-0-、-5-、或-服^-;其中RE為氫、C卜1Q烷基或取代的(V1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R1為氫、(C「C10)烷基、取代的(C「C10)烷基、C6—10芳基、或取代的C6—10芳基、C5—9雜環(huán)基、取代的C5—9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、6烷基、羥基c卜6亞烷基、cv6烷氧基、c3—6環(huán)烷基、cv6烷氧基cv6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R2各自獨立地為氫、-0H、 (Q-Ce)烷基、取代的(Q-Ce)烷基、(Q-Ce)烷氧基、取代的(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳酰基)、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(0) 0(C「C6)烷基、-NRaRb、 -C(0)NRaRb(氨甲?；?、取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；Ra和Rb各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代(C「C6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷?；?、羥基(c「c6)烷基、芳基、芳基(c「c6)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(Q-C;)烷氧基羰基；X2為一個鍵或一個連接基團；n為1、2、3或4 ;并且W為所述革蘭氏陽性細菌、一種所述革蘭氏陽性細菌的分離的抗原性蛋白質(zhì)或肽、或一種所述革蘭氏陽性細菌的分離的多糖；其中所述革蘭氏陽性細菌不是桿菌屬(Bacillus)或李斯特菌屬(Listeria)。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中X1為硫原子。
4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中X1為氧原子。
5. 權(quán)利要求1或2的方法，其中X1為-服、其中Re為氫、(Ve烷基或取代的(V6烷基；其中所述烷基取代基為C3—6環(huán)烷基、羥基、C卜6烷氧基、氨基、氰基或芳基。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中X1為-NH-。
7. 權(quán)利要求1至6之一的方法，其中R1和RE —起形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中R1和RE —起形成一個取代或未取代的嗎啉代環(huán)、哌啶子基環(huán)、吡咯烷環(huán)或哌嗪環(huán)。
9. 權(quán)利要求1至6之一的方法，其中R1為氫、(V4烷基或取代的(V4烷基。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中R1為氫、(^3-、(^3-(^2-、(^3(^2(^2-、羥基C卜4亞烷基或4烷氧基C卜4亞烷基。
11. 權(quán)禾U要求10的方法，其中R1為氫、CH3-、 CH3-CH2-、 CH3-0-CH2CH2-或CH3-CH2_0-CH2CH2-。
12. 權(quán)利要求1至11之一的方法，其中R2為氫、鹵素或C卜4烷基。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中R2為氫、氯、溴、CH3-或CH3-CH2-。
14. 權(quán)利要求1至13之一的方法，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥 、 G卜6 ^g、^5g (V6 M;^g、 G卜6 ;^^g、 (V6 ;^^g G卜6 M;^g、 C3—6 ^F^g、M,、^tg、鹵素或芳基。
15. 權(quán)利要求1至14之一的方法，其中X2為一個鍵或一個具有最高至約24個原子的鏈；其中所述原子選自碳、氮、硫、非過氧化物型氧和磷。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中X2為一個鍵或一個具有約4至約12個原子的鏈。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中X2為一個鍵或一個具有約6至約9個原子的鏈。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中X2為
19. 權(quán)利要求1或3至18之一的方法，其中所述大分子為一種磷脂、一種脂質(zhì)體或一種 樹突狀物。
20. 權(quán)利要求1或3至18之一的方法，其中所述異源肽具有2至約200個氨基酸殘基。
21. 權(quán)利要求2至18之一的方法，其中所述肽具有2至約200個氨基酸殘基。
22. 權(quán)利要求1或3至18之一的方法，其中所述異源肽具有10至約200個氨基酸殘基。
23. 權(quán)利要求2至18之一的方法，其中所述肽具有10至約200個氨基酸殘基。
24. 權(quán)利要求1或3至18之一的方法，其中所述大分子包括碳水化合物。
25. 權(quán)利要求1或3至18之一的方法，其中所述核酸分子包括DNA、 RNA或PNA。
26. 權(quán)利要求1至25之一的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌為金黃色葡萄球菌。
27. 權(quán)利要求1至26之一的方法，其中所述哺乳動物為人。
28. 權(quán)利要求1至27之一的方法，其中所述哺乳動物有革蘭氏陽性細菌感染的風險。
29. 權(quán)利要求1至28之一的方法，其中所述哺乳動物為免疫系統(tǒng)受損者。
30. 權(quán)利要求1至29之一的方法，其中所述哺乳動物在給藥后約6天對給藥具有有效 的免疫應(yīng)答。
31. 權(quán)利要求1或3至30之一的方法，其中所述組合物包括一種滅活的革蘭氏陽性細 菌的制劑。
32. 權(quán)利要求1至31之一的方法，其中所述量在給藥后約6天對預(yù)防感染有效。
33. 權(quán)利要求2或3至32之一的方法，進一步包括施用一種滅活的革蘭氏陽性細菌的 制劑。
34. 權(quán)利要求1、3至25或27至33之一的方法，其中所述組合物包括一種革蘭氏陽性 細菌的芽孢。
35. —種疫苗，包含一種組合物，所述組合物包含一種金黃色葡萄球菌的細菌抗原和一 定量的式(IA)化合物或其可藥用鹽，所述可藥用鹽包括其水合物，其中X1為-0-、-5-、或-服^-;其中RE為氫、C卜1Q烷基或取代的(V1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起形成一個雜 環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基 (V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R1為氫、(C「C10)烷基、取代的(C「C10)烷基、C6—10芳基、或取代的C6—10芳基、C5—9雜環(huán) 基、取代的C5—9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、6烷基、羥 基c卜6亞烷基、cv6烷氧基、c3—6環(huán)烷基、cv6烷氧基cv6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R2各自獨立地為氫、-0H、 (Q-Ce)烷基、取代的(Q-Ce)烷基、(Q-Ce)烷氧基、取代的(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷氧 基羰基)、取代的-C(0) 0(C「C6)烷基、-NRaRb、 -C(0)NRaRb(氨甲?；?、取代的_C(0)NRaRb、 鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6 亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；Ra和Rb各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代(C「C6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷?；?、羥基(c「c6)烷基、芳基、芳基(c「c6)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(Q-C;)烷氧基羰基；X2為一個鍵或一個連接基團；n為1、2、3或4 ;并且R3為一種大分子，其包括異源肽、異源蛋白質(zhì)、異源脂質(zhì)、珠例如聚苯乙烯珠、異源核酸 分子或樹突狀物。
36. —種疫苗，包含一種式(IB)化合物，或者其可藥用鹽，所述可藥用鹽包括其水合物，其中X1為-0-、-5-、或-服^-;其中RE為氫、C卜1Q烷基或取代的(V1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起形成一個雜 環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基 (V6亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R1為氫、(C「C10)烷基、取代的(C「C10)烷基、C6—10芳基、或取代的C6—10芳基、C5—9雜環(huán) 基、取代的C5—9雜環(huán)基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、6烷基、羥 基c卜6亞烷基、(V6烷氧基、c3—6環(huán)烷基、(V6烷氧基(V6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；R2各自獨立地為氫、-0H、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(C「C6)烷氧基、取代的(c「c6)烷氧基、-c(o)-(c「C6)烷基(烷?；?、取代的-c(o)-(c「Ce)烷基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳酰基)、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0)0(C「C6)烷基(烷氧 基羰基)、取代的-C(0) 0(C「C6)烷基、-NRaRb、 -C(0)NRaRb(氨甲?；?、取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或雜環(huán)基上的取代基為羥基、C卜e烷基、羥基(V6 亞烷基、C卜6烷氧基、C3—6環(huán)烷基、C卜6烷氧基C卜6亞烷基、氨基、氰基、鹵素或芳基；Ra和Rb各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3_C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代(C「C6)烷基、(c3-c8)環(huán)烷基(c「c6)烷基、(c「c6)烷?；?、羥基(c「c6)烷基、芳基、芳基(c「c6)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(Q-C;)烷氧基羰基；X2為一個鍵或一個連接基團；n為1、2、3或4 ;并且R3為金黃色葡萄球菌細菌、一種所述金黃色葡萄球菌細菌的分離的抗原性蛋白質(zhì)或 肽、或一種所述金黃色葡萄球菌細菌的分離的多糖。
37. —種式(I)化合物，或者其可藥用鹽，其中X1為-0-、-5-、或-服^-; 其中Y為S或NH;其中RE為氫、(V1Q烷基或被C3—6環(huán)烷基取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起 形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中所述取代基為羥基、C卜e烷基、羥基C卜e亞烷基、(V6烷氧基、C卜6烷氧基(V6亞烷基或氰基；其中R1為(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜環(huán) 基、取代的(V9雜環(huán)基；其中R2各自獨立地為氫、-OH、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(CrC6)烷氧 基、取代的(C「C6)烷氧基、-C (0) - (C「C6)烷基(烷?；?、取代的-C (0) - (C「C6)烷 基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0) 0 (CrC6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (CrC6)烷基、-NRaRb、-C (0) NRaRb (氨甲?；?、 取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中If和W各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代 (C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基(C「C6)烷基、(C「C6)烷酰基、羥基(C「C6)烷基、芳基、芳基 (Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基；其中X2為一個鍵或一個連接基團；其中R3為一種大分子；其中n為1、2、3或4 ;其中m為1 ;其中q > 2。
38. —種式(ID)化合物，或者其可藥用鹽，NH2 N、)=。<formula>formula see original document page 7</formula>其中X1為-0-、-5-、或-服^-;其中Y為S或NH;其中RE為氫、(V1Q烷基或被C3—6環(huán)烷基取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起 形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中所述取代基為羥基、C卜e烷基、羥基C卜e亞烷基、(V6烷氧基、C卜6烷氧基(V6亞烷基或氰基；其中R1為(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜環(huán) 基、取代的(V9雜環(huán)基；其中R2各自獨立地為氫、-OH、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(CrC6)烷氧 基、取代的(C「C6)烷氧基、-C (0) - (C「C6)烷基(烷?；?、取代的-C (0) - (C「C6)烷 基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0) 0 (CrC6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (CrC6)烷基、-NRaRb、-C (0) NRaRb (氨甲?；?、 取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中If和W各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代 (C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基(C「C6)烷基、(C「C6)烷酰基、羥基(C「C6)烷基、芳基、芳基 (Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基；其中X2為一個鍵或一個連接基團；其中R3為一種大分子；其中n為1、2、3或4 ;其中m為1 ;其中q為1、2、3或最多至約1，000、約10， 000或更大，例如約105、約106或更大;其中R3為一種除乙型肝炎病毒以外的DNA病毒， 一種除SIV、丙型肝炎病毒或冠狀病毒 以外的RNA病毒，一種納米粒，一種除聚苯乙烯珠以外的珠，或一種除桿菌屬、李斯特菌屬、 土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)或沙門氏菌屬(Salmonella)之外的細 菌，或為一種包括連接至X2的脂質(zhì)的脂質(zhì)體。
39. 權(quán)利要求38的化合物，其中所述病毒為一種慢病毒或皰疹病毒。
40. 權(quán)利要求37或38的化合物，其中R3為一種二氧化硅珠。
41. 權(quán)利要求37的化合物，其中R3為一種納米粒。
42. 權(quán)利要求38或41的化合物，其中所述納米粒包括二氧化硅、聚丙烯酸酯、聚(丙交 酯共乙交酯)、多聚谷氨酸或多聚賴氨酸。
43. 權(quán)利要求38或41的化合物，其中所述納米粒為一種聚合物膠束或碳納米管。
44. 一種預(yù)防、治療或抑制哮喘的方法，包括對需要預(yù)防、治療或抑制哮喘的哺乳動物施用一種有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽，<formula>formula see original document page 8</formula>其中X1為-0-、-5-、或-服^-;其中Y為S或NH;其中RE為氫、(V1Q烷基或被C3—6環(huán)烷基取代的C卜1Q烷基，或者RE和R1可與氮原子一起 形成一個雜環(huán)或一個取代的雜環(huán)，其中所述取代基為羥基、C卜e烷基、羥基C卜e亞烷基、(V6烷氧基、C卜6烷氧基(V6亞烷基或氰基；其中R1為(C「Q。)烷基、取代的(C「Q。)烷基、(V1Q芳基、或取代的C6—1Q芳基丄5—9雜環(huán) 基、取代的(V9雜環(huán)基；其中R2各自獨立地為氫、-OH、 (C「C6)烷基、取代的(C「C6)烷基、(CrC6)烷氧 基、取代的(C「C6)烷氧基、-C (0) - (C「C6)烷基(烷?；?、取代的-C (0) - (C「C6)烷 基、-C(0)-(C6-Q。)芳基(芳?；?、取代的-C(0)-(C6-Q。)芳基、-C(0)0H(羧基)、-C(0) 0 (CrC6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C (0) 0 (CrC6)烷基、-NRaRb、-C (0) NRaRb (氨甲?；?、 取代的_C(0)NRaRb、鹵素、硝基或氰基；其中If和W各自獨立地為氫、(C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基、(C「C6)烷氧基、鹵代 (C「C6)烷基、(C3-C8)環(huán)烷基(C「C6)烷基、(C「C6)烷?；⒘u基(C「C6)烷基、芳基、芳基 (Q-Ce)烷基、Het、Het(C「C6)烷基或(C「C》烷氧基羰基；其中X2為一個鍵或一個連接基團；其中R3為一種大分子；其中n為1、2、3或4 ;其中m為1、2、3或更大，例如5、10、15或更大;其中q為1、2、3或最高至約1，000、約10， 000或更大，例如約105、約106或更大。
全文摘要
本發(fā)明提供了適用于疫苗以及預(yù)防、抑制或治療多種疾病包括病原體感染和哮喘的TLR激動劑及其綴合物。
文檔編號A61K39/39GK101790380SQ200880011525
公開日2010年7月28日 申請日期2008年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日
發(fā)明者D·A·卡森, G·A·丹尼爾斯, H·B·科塔姆, W·蘭希多拉, 吳正寧 申請人:加利福尼亞大學董事會