專利名稱：：枸杞在預防尿結石中的應用的制作方法枸杞在預防尿結石中的應用
技術領域：
：本發(fā)明公開了枸杞多糖在預防尿結石疾病中的應用，尤其是在預防尿結石方面在藥品、食品和保健品生產領域的應用。
背景技術：
：泌尿系結石是一個全球性疾病，也是最常見的泌尿外科疾病之一，尿石癥的高復發(fā)率一直困擾著患者和醫(yī)生，由于尿石癥的產生機制十分復雜，造成預防的研究進展十分緩慢。傳統(tǒng)觀點認為草酸以草酸鈣結晶的形式參與腎結石的形成。因此早期的研究僅關心尿中的pH值、離子強度和各種蛋白對草酸鈣結晶形成的影響。最新研究顯示腎小管上皮細胞損傷是結石形成最早期的基礎病變。腎小管上皮細胞因某些致病因子造成損傷后，脫落的細胞碎片，崩解的線粒體等各種細胞器排入管腔，為晶體的異相成核提供了條件，更為重要的是腎小管上皮細胞的損傷可促進晶體與上皮細胞的粘附。Randal和Carr最早發(fā)現(xiàn)結晶的粘附和滯留對結石的形成有著重要的作用，正常情況下，尿中的游離草酸鈣結晶無法停留而長成結石，需首先黏附在尿路上皮細胞表面，再逐漸生長，聚集成石。Khan和Mandel等發(fā)現(xiàn)受損的細胞表面有更多的結晶附著，因此推測細胞損傷有利于結晶的粘附。高濃度的尿草酸對腎小管上皮細胞有直接的毒性作用，實驗表明，草酸可明顯加重腎細胞的氧化應激反應，表現(xiàn)為服用誘石劑誘發(fā)高草酸尿的動物模型，尿中脂質過氧化物的水平隨著尿草酸排泄量的增加而增加，腎組織中抗氧化酶的水平和活性卻相應降低。采用單層腎小管上皮細胞培養(yǎng)法研究草酸的氧化活性，發(fā)現(xiàn)草酸可以促進腎小管上皮細胞氧自由基的產生。Rashed等發(fā)現(xiàn)予以過氧化氬酶、超氧化物歧化酶、VitE等抗氧化劑時，均能減少草酸引起的腎小管上皮細胞的死亡。因此目前認為草酸鈣腎結石形成的主要機制是由于尿草酸具有細胞毒作用，它通過破壞腎組織中的抗自由基物質，增加腎組織中自由基而使腎小管上皮細胞受損，促進結石的生成。若能有效地提高腎小管上皮細胞對尿草酸毒性的耐受力，清除自由基對腎小管上皮細胞的損傷，則有可能預防腎草酸鈣結石的生成。枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有補腎養(yǎng)肝等功效，一直受到中外醫(yī)家與食療專家的高度重視。枸杞很早就被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用，能清除體內自由基，減少自由基對細胞的損害。近年發(fā)現(xiàn)枸杞中的主要活性成分為枸杞多糖，體外實驗證明枸杞多糖可直接清除自由基，并能抑制自發(fā)或自由基引發(fā)的脂質過氧化反應，多項研究確定枸杞多糖能有效提高超氧化物岐化酶(SOD)活性，降低脂質過氧化物(LPO)的含量；能改善自由基過氧化造成的對細胞膜的損害，因而枸杞多糖的應用十分廣泛。如CN1355022公開了枸杞多糖在制備治療脂肪肝藥物中的新用途；CN1546054公開了枸杞多糖在制備治療胃潰瘍藥物中的應用；CN1470196公開了"一種洋參枸杞飲料及其生產方法"，旨在提供一種具有保健功能的飲料；CN1465359公開了"由茶葉才是取物及枸杞子才是耳又物組成的組合物"，該組合物能減少內臟脂肪而不影響體重，可用于防冶"脂肪代謝綜合癥"；CN1670036公開了"一種枸杞多糖才是取方法及枸杞多糖減肥制品"。至于枸杞能否通過抗氧化作用，有效地對抗高濃度尿草酸的細胞毒性，減少腎小管上皮細胞的損傷，從而防止腎草酸鈣結石的形成，目前還未見相關報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提出枸杞多糖預防尿結石方面的應用。同時提出枸杞多糖在制作預防尿結石方面的藥品、食品和保健品中的應用。為臨床提供適合尿結石患者及易患人群長期服食的預防尿結石的藥品或是食品或是保健品。本發(fā)明的技術要點是枸杞在預防尿結石中的應用，其特征在于它是通過枸杞中的枸杞多糖的抗氧化作用，減少高尿草酸對腎小管上皮細胞的傷害，從而阻斷了腎草酸鈣結石形成鏈中的關鍵環(huán)節(jié)。所述的枸杞是以其浸泡劑作為干預劑，其重量百分比濃度不低于2.5%;其重量百分比濃度優(yōu)選為12-25%。所述的枸杞是以其煎劑作為干預劑，其重量百分比濃度不低于2.5%;其重量百分比濃度優(yōu)選為12-25%。草酸釣尿結石的主要形成機制之一是尿草酸的細胞毒作用破壞了腎組織中的抗自由基物質，增加腎組織中的自由基，使腎小管上皮細胞受損，促進結石的生成。本發(fā)明表明，枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分，具有抗氧化作用，能清除體內自由基，減少自由基對細胞的損害。通過其抗氧化作用，有效對抗高濃度尿草酸的細胞毒性，減少腎小管上皮細胞的損傷，從而防止草酸鈞尿結石的形成，具有預防草酸4丐腎結石形成的作用。本發(fā)明通過動物實驗，證實枸杞多糖確可減少草酸鈣腎結石的生成，由于枸杞兼具多種明顯的保健功能和藥食同源的特性，服食方便，價廉而無副作用，患者依從度高，本發(fā)明將為臨床4是供一種非常適合患者長期服食的結石預防良品。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞損傷是結石形成的主要機制，高濃度尿草酸是一個重要的導致腎小管上皮細胞損傷的毒性因素，它能使腎小管上皮產生大量的自由基，形成MDA等脂質過氧化物，損害細胞膜，最終造成細胞的損傷，結晶附壁黏結。枸杞作為一種傳統(tǒng)中藥，具有滋補肝腎之功效，枸杞多糖是其主要活性成分?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明枸杞多糖能抑制和清除體內自由基的產生，減少抗氧化酶的損失，能明顯減少大鼠血清及肝、腎組織中的MDA,增加血清及肝、腎組織中SOD和其它抗氧化酶的活性。有較強的細胞保護作用，并能使受損細胞得到一定的修復。有報道枸杞多糖可明顯抑制小鼠過氧化脂質(LPO)的生成，并使血中GSH-Px活力增高；有學者用枸杞多糖通過對非洲爪蟾卵母細胞電學功能的測試，觀察到枸杞多糖能有效地對抗自由基過氧化造成的膜電學參數(shù)的損害。體外研究顯示枸杞多糖對氧自由基和羥自由基清除率分別可達58.6%和49.7%，且與濃度成正相關性。5由于枸杞多糖提取不易及價格的昂貴，不易廣為推廣，但枸杞作為一種保健藥物被廣為使用，已報道枸杞水提液具有清除自由基的作用。本發(fā)明使用枸杞的浸泡劑和煎劑作為干預劑，來進一步了解不同濃度和不同使用方法的枸杞對腎草酸鈣結石形成的影響和效果差別。通過實驗發(fā)現(xiàn)，從統(tǒng)計學結果看，雖然2.5。/。濃度的枸杞浸泡液和煎劑其結晶評分和乙二醇對照組相比無顯著性差異(P〉0.05),但12%和25%濃度的浸泡液和煎劑結晶評分和單純誘石組相比降幅分別為38.7%,54.8%，48.4%和58.1%,有顯著性差異(P<0.01)。說明較高濃度的枸杞浸泡液和煎劑具有抑制草酸鈣腎結石的作用。同時通過和腎組織SOD,MDA和腎細胞凋亡指數(shù)相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)它們之間有著良好的相關系數(shù)，這說明了枸杞浸泡液和煎劑主要是通過對抗自由基的毒性反應，增強組織的抗氧化活性，減少腎小管上皮細胞的凋亡來實現(xiàn)抑制草酸鈣腎結石的效果。隨著濃度的增高，其抗氧化能力和預防結石的效果也增強，有著良好的量效關系。通過進一步對不同濃度的枸杞浸泡液和煎劑中的枸杞多糖含量檢測，發(fā)現(xiàn)煎劑中的枸杞多糖含量比浸泡液的要高，說明保持較高的溫度對才是取枸杞中的枸杞多糖是有效的，能使枸杞發(fā)揮更大的作用。實驗還表明枸杞煎劑比浸泡液的抗氧化作用和抑石效果略好，通過對枸杞多糖含量的檢測，發(fā)現(xiàn)枸杞浸泡液和煎劑所含的枸杞多糖含量與腎組織自由基相關指標水平及腎小管上皮細胞凋亡水平關系密切，這說明枸杞浸泡液和煎劑的抗氧化作用主要是通過它們所含的枸杞多糖來實現(xiàn)的，進一步證明了先前所研究的枸杞多糖具有抗氧化作用，它通過提高機體的抗氧化能力，來抑制草酸鈣腎結石的形成。圖1空白對照組大鼠腎組織切片(HE染色X200)圖2單純誘石組大鼠腎組織切片(HE染色X200)圖3誘石+枸杞多糖10mg/kg.d干預組大鼠腎組織切片(HE染色X200)圖4誘石+枸杞多糖50mg/kg.d干預組大鼠腎組織切片(HE染色X200)圖5誘石+枸杞多糖100mg/kg.d干預組大鼠腎組織切片(HE染色X200)圖6空白對照組大鼠腎組織切片(TUNEL染色X200)*黑箭頭指向TUNEL染色陽性細胞圖7單純誘石組大鼠腎組織切片(TUNEL染色X200)*黑箭頭指向TUNEL染色陽性細胞圖8誘石十枸杞多糖10mg/kg.d千預組大鼠腎組織切片(TUNEL染色X200)*黑箭頭指向TUNEL染色陽性細胞圖9誘石+枸杞多糖50mg/kg'd干預組大鼠腎組織切片(TUNEL染色X200)*黑箭頭指向TUNEL染色陽性細胞圖10誘石+枸杞多糖100mg/kg.d干預組大鼠腎組織切片(TUNEL染色X200)*黑箭頭指向TUNEL染色陽性細胞圖11實施例2中各組大鼠腎小管草酸鈣結晶情況圖12實施例2中各個濃度枸杞浸泡劑和煎劑的枸杞多糖含量具體實施方式實施例1在結石的形成過程中，結晶黏附于腎小管是個必要環(huán)節(jié)。腎小管上皮細胞受損可以明顯促進結晶的黏附，而過氧化損傷是導致高草酸誘導的腎小管上皮細胞損傷的主要機制。若能有效地阻止或減輕尿草酸對腎小管上皮細胞的損傷，將有助于腎草酸鈣結石的預防。研究發(fā)現(xiàn)枸杞中的主要活性成分枸杞多糖在體外可直接清除自由基，并能抑制自發(fā)或自由基引發(fā)的脂質過氧化反應，具有一定的細胞保護作用，本發(fā)明通過動物活體實驗，表明枸杞多糖能有效地拮抗高濃度尿草酸的細胞毒作用并減少腎草酸鈣結石的形成。一、材料與方法1.動物分組及給藥方法選用復旦大學實驗動物科學部提供的健康清潔級成年雄性SD大鼠50只，體重160200g，隨機分成5組，每組10只，在同一環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周，隨后按下列方法處理4周A組(空白對照組)飲去離子水；B組(單純誘石組)以1%乙二醇溶液為唯一飲用水源；C組E組(誘石+枸杞多糖干預組)以1%乙二醇溶液為唯一飲用水源，同時分別灌喂枸杞多糖10mg/kg.d、50mg/kg.d、100mg/kg.d。1%乙二醇溶液的配制乙二醇分析純溶液購于上海實驗試劑有限公司，去離子水配制。枸杞多糖購于上海康舟真菌多糖有限公司。2.檢測指標和方法2.1實驗結束前l(fā)d用代謝籠收集24h尿液并計量，加濃鹽酸防腐，4t:保存。測尿草酸(鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法[17]，SmartSpecPlus分光光度計，具體方法同上)、尿鈣、尿鈉(美國BeckmanLX200生化分析僅)。2.2實驗結束日，將大鼠稱重，用4%戊巴比妥鈉(40mg/kg)經腹腔麻醉后，斷頸處死。2.3切取雙腎，縱向剖開，左腎用10%甲醛固定，HE染色石蠟切片，200倍光鏡下觀察腎組織草酸鈣結晶沉積情況，按文獻報道的標準分級固。2.4采用脫氧核糖核苦酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)對腎組織切片進行免疫組化染色，試劑盒購于美國R&DSystem公司，200倍光鏡下觀察腎小管，藍棕色核為凋亡細胞。用圖像分析軟件Imagine-ProPhs5.0計數(shù)凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)(每個視野計數(shù)100個細胞中凋亡的細胞數(shù))。T麗EL實驗操作方法上述石蠟切片—加熱器57°C5min—100%二甲苯中孵育20min(脫臘)8—100%、95%、70%乙醇各洗5min—雙蒸水中洗2次，每次2min—PBS中孵育10min—蛋白激酶K(蛋白激酶K1u1，雙蒸水50u1)，24°C，15min(修復抗原)—雙蒸水中洗2minX2次—終止液(乙醇45ml，30%H2O25ml)，24°C，孵育5min(封閉內源性過氧化物酶反應)—PBS中，24°C，lmin—1XTdT標記緩沖液，5min—切片滴加標記反應混合液(TdT-dNTPly1，50XCationstock1u1，TdT酶1u1，1XTdT標記緩沖液)，24°C，孵育5min—PBS緩沖液洗2minX2，24°C—切片滴加1:50稀釋的str印-HRP，24°C，lOmin(進行免疫反應，擴大信號)—1XPBS洗5minX2次—DAB顯色—胞核呈深褐色即用自來水流水沖洗中斷反應—曱基綠復染，24°C，3min—雙蒸水洗1次，70%、95%、100%酒精梯度脫水各3次—二甲苯透明—中性樹膠封片。2.5取右腎皮質，制成10%(w/v)的勻漿，硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA);黃嘌呤氧化酶-氮藍四唑(NBT)還原法測定超氧化物歧化酶(S0D)，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體方法參見文獻[21]及試劑盒說明。3.統(tǒng)計學分析用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料的組間均值比較用方差分析。結晶等級評分與枸杞多糖劑量、自由基相關指標和凋亡水平關系用直線相關分析。二、結果1.各組大鼠腎小管草酸鈣結晶等級評分情況(見表8)光鏡下見A組腎小管結構正常，未見明顯的草酸鈣結晶(見圖1);B組腎小管明顯擴張，多數(shù)管腔內存在無色透明的草酸鈣結晶，部分管腔內結晶聚集成團(見圖2);c組腎小管擴張，管腔內存在無色透明的草酸鈣結晶(見圖3)，D組和E組腎小管結構及草酸鈣結晶沉積情況居于A組(P<0.05)與B組之間(P<0.05)，(見圖4-5)。隨著枸杞多糖灌喂劑量的增加，腎小管結晶有減少的趨勢(r=—0.483，P<0.05)，C組草酸鈣結晶評分與B組之間無統(tǒng)計學差異，D組、E組與B組草酸鈣結晶評分有統(tǒng)計學差異。但D組和E組總的組間結晶等級評分差異尚未達到統(tǒng)計學的顯著性7Jc平(P>0.05)。2.實驗結束日各組大鼠24h尿鈉、鈣、草酸排泄量及尿鈣、草酸濃度情況(見表7)B組E組24h尿草酸排泄量及尿草酸濃度均顯著高于A兩組(P<0.01)，且相互間差異無顯著意義(P〉0.05);大鼠24h尿鈉、鈣無明顯差異(P>0.05)。大鼠24h尿量及體重各組之間無明顯差異(P>0.05)。表7各組大鼠尿生化檢驗結果(；±s)組尿鈉排泄量尿鈣排泄量尿草酸排泄量尿鈣濃度尿草酸濃度別(umol/24h)(麗ol/24h)(umol/24h)(mmol/L)(mmol/L)A1003.27±348.2615.37±5.2724.33±6.680.53±0.110.98±0.23B1212.33±471.4715.26±6.1375.73±14.520.57±0.092.91±0.86C1022.62±394.1716.21±5.9872.50±13.840.59±0.122.80±0.78D1247.23±373.5517.33±7.8372.94±10.040.58±0.152.75±0.66E955.87±408.9316.79±5.5669.34±14.030.62±0.172.69±0.733.各組大鼠腎組織自由基水平及腎小管上皮細胞凋亡水平情況(見表8、圖610)B組為單純誘石組，其腎組織SOD活性最低、腎細胞凋亡指數(shù)最高；c組枸杞多糖劑量最小，其與B組腎組織自由基水平及腎小管上皮細胞凋亡水平無明顯差異(尸>0.05)，但是D組和E組顯示枸杞多糖對此有明顯的干預作用，其效果呈劑量依賴性，C組E組干預劑量與腎組織S0D活性的相關系數(shù)為0.791(尸<0.01)，與腎組織MDA含量的相關系數(shù)為0.670(尸<0.01)，與腎細胞凋亡指數(shù)的相關系數(shù)為0.915(尸<0.05)。C組E組腎組織SOD活性和細胞凋亡指數(shù)的各組間差異均有顯著性意義(,=1688，尸<0.05和尸=63.25，尸<0.05)，但是腎組織MDA含量的各組間差異尚未達到顯著性水平(尸=1.912，尸〉0.05)°A組E組腎小管草酸鈣結晶等級評分與腎組織自由基相關指標水平及腎小管上皮細胞凋亡水平關系密切，結晶等級評分與腎組織SOD活性的相關系數(shù)r=—0.600(尸<0.05)，結晶等級評分與腎組織MDA含量的相關系數(shù)r=0.695(尸<0.05)，結晶等級評分與腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)的相關系數(shù)r二O.826(尸<0.05)。表8.各組大鼠腎組織結晶等級評分、自由基水平及凋亡水平(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*:與空白對照組(A組)比較'戶<0.05*:與單純誘石劑組(B組)比較'尸<0.05實施例2由于枸杞中的主要活性成分是枸杞多糖。本發(fā)明通過分別使用不同濃度的枸杞浸泡劑和煎劑進行干預效果的研究和比較，發(fā)現(xiàn)它們能有效地抑制飲用誘石劑大鼠的腎草酸鈣結石的形成。一、材料與方法1.動物分組及給藥方法選用復旦大學實驗動物科學部提供的健康清潔級成年雄性SD大鼠80只，體重160200g，隨機分成8組，每組10只，在同一環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周，隨后按下列方法處理4周A組(空白對照組)飲去離子水；B組(單純誘石組)以1%乙二醇溶液為唯一飲用水源；C組E組(誘石+不同濃度枸杞浸泡劑組)以1%乙二醇溶液為唯一飲用水源，同時分別灌喂2.5%、12%、25%浸泡劑16ml/kg'd;F組H組(誘石+不同濃度枸杞煎劑組)以1%乙二醇溶液為唯一飲用水源，同時分別灌喂2.5%、12%、25%煎劑16ml/kg.d。1%乙二醇去離子水的配置乙二醇分析純溶液購于上海實驗試劑有限公司，去離子水配制。枸杞逸用寧夏中寧枸杞王(寧夏中寧縣早康枸杞開放有限公司，200g/袋)，枸杞浸泡劑組去離子水煮沸后配制成2.5%、12%、25%濃度浸泡20分鐘，過濾后取上清液灌喂。枸杞煎劑組去離子水配制成2.5%、12%、25%濃度煮沸20分鐘，過濾后取上清液灌喂。2.拾測指標和方法2.124h尿量、尿草酸、尿鈣、鈉含量測定實驗結束前l(fā)d用代謝籠分別收集每只大鼠的24h尿液并計量，加濃鹽酸防腐，4。C保存。測尿草酸(鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法，SmartSpecTMPlus分光光度計，具體方法同前)及尿鈣、鈉含量(BeckmanLX200生化分析儀)。2.2實驗結束日，將大鼠稱重，用4%戊巴比妥鈉(40mg/kg)經腹腔麻醉后，斷頸處死。2.3切取雙腎，縱向剖開，左腎用10%甲酪固定，HE染色石蠟切片，200倍光鏡下觀察腎組織草酸鈣結晶沉積情況，按文獻報道的分級標準進行結晶等級評分，具體同前。2.4采用脫氧核糖核*酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)對腎組織切片進行免疫組化染色，觀察腎小管的凋亡細胞，計數(shù)凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)，具體方法同前。2.5取右腎皮質，制成10%(w/v)的勻漿，硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二酪(MDA);黃噤呤氧化酶-氮藍四唑(NBT)還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)，試劑盒購于南京建成生物工程研究所？具體方法同前。122.6用硫酸一苯酚法測定不同濃度的枸杞浸泡劑和煎劑中的枸杞多糖含量。枸杞多糖含量的測定方法如下準確稱取葡萄糖標準品30mg置于250ml容量瓶中^w蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻°分別移取此溶液O.50、0.75、1.00、1.25、1.50ml與10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，加5%苯酚溶液lml，混勻，迅速加入5.Oml濃硫酸混勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min。取出，自然冷卻至室溫。SmartSpecTMPlus分光光度計于486nm測定吸光度，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。精密吸取不同濃度的枸杞浸泡劑和枸杞煎劑各樣品液lml，按測定標準曲線同樣方法測其吸光度值，按下式計算枸杞多糖含量枸杞多糖含量％=3.17CxD/W式中C為測定的樣品液用標準回歸方程計算出的以葡萄糖為測定結果的含量，D為樣品的稀釋因素，在上述操作中D=l，W為樣品的重量，3.17為國家有關部門實驗確定的葡萄糖換算成枸杞多糖的換算系數(shù)。葡萄糖標準品，苯酚，濃硫酸分析純購與上海實驗試劑有限公司。3.統(tǒng)計學分析用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料的組間均值比較用方差分析。結晶等級評分與枸杞多糖劑量、自由基相關指標和凋亡水平關系用直線相關分析。二、結果1.各組大鼠腎小管草酸鈣結晶情況(見圖11)光鏡下見A組腎小管結構正常，未見明顯的草酸鈣結晶聚集，評分O分；B組腎小管明顯擴張，多數(shù)管腔內存在無色透明的草酸鈣結晶，部分管腔內結晶聚集成微結石，評分為3.10±0.88分；D，E，G，H組腎小管擴張情況及草酸鈣結晶聚集情況明顯輕于B組，與B組相比降幅分別為38.7%，54.8%，48.4%和58.1%(P<0.01)，抑石效果明顯優(yōu)于C組和F組(P<0.05)，但尚未達到A組水平(P<0.01);C組和F組草酸釣結晶聚集情況輕于B組，評分分別為2.70±0.92分和2.50±0.67分，與B組相比降幅分別為12.9%和19.4%，但尚未達到顯著性水平(P>0.05)。2.實驗結束日大鼠尿電解質變化大鼠尿鈣、尿鈉的24h排泄量各組之間差異無顯著意義(P>0.05)，B組H組尿草酸濃度及24h尿草酸排泄量均明顯高于A組(P<0.05)，大鼠24h尿量及體重各組之間無明顯差異(P>0.05)。3.各組大鼠腎組織自由基水平及腎小管上皮細胞凋亡水平情況(見表9)B組為單純誘石組，其腎組織SOD活性最低、腎細胞凋亡指數(shù)最高；浸泡劑C組E組和煎劑F組H組顯示枸杞對此有干預作用，其效果呈劑量依賴性，其干預劑量與腎組,織S0D活性的相關系數(shù)分別為0.733和0.720(P<0.01)，與腎組織MDA含量的相關系數(shù)分別為0.520和0.436(P<0.05)，與腎細胞凋亡指數(shù)的相關系數(shù)分別為0.816和0.821(P<0.01)。浸泡劑C組E組腎組織MDA含量SOD活性和細胞凋亡指數(shù)的各組間差異均有顯著性意義(P<0.05)°煎劑F組H組腎組織SOD活性和細胞凋亡指數(shù)的各組間差異均有顯著性意義(P<0.05)，但是其腎組織MDA含量的各組間差異尚未達到顯著性水平(F=3.354，P=0.054)。A組H組腎小管草酸鈣結晶等級評分與腎組織自由基相關指標水平及腎小管上皮細胞凋亡水平關系密切，結晶等級評分與腎組織SOD活性的相關系數(shù)r=一0.564(P<0.01)，結晶等級評分與腎組織MDA含量的相關系數(shù)r二O.542(P<0.01)，結晶等級評分與腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)的相關系數(shù)r二O.700(P<0.01)。表9各組大鼠腎組織結晶等級評分、自由基水平及凋亡水平(S±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>F2.5±0.6719.1%5.02±0.9717.7%160.78±13.5212.1%14.29±1.07*43.5%G1.6±1.07*48.4%4.53±0.8325.7%180.75±15.51*26.0%12.87±1.03*49.2%H1.3±0.67*58.1%4.01±0.5434.3%195.84±13.38*36.5%10.93±0.88*56.8%:與單純誘石劑組(B組)比較，^<0.054.枸杞浸泡劑和煎劑中枸杞多糖含量的檢測結果(見圖12)C組H組枸杞多糖含量與腎組織自由基相關指標水平及腎小管上皮細胞凋亡水平關系密切，枸杞多糖含量與腎組織S0D活性的相關系數(shù)r=一O.726(尸<0.01)，枸杞多糖含量與腎組織MDA含量的相關系數(shù)r=0.485(尸<0.01)，枸杞多糖含量與腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)的相關系數(shù)r=0.798(尸<0.01)。其最終造成枸杞多糖含量與結晶等級評分的相關系數(shù)r=—0.508(尸<0.01)。三、討論本發(fā)明發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞損傷是結石形成的主要機制，高濃度尿草酸是一個重要的導致腎小管上皮細胞損傷的毒性因素，它能使腎小管上皮產生大量的自由基，形成MDA等脂質過氧化物，損害細胞膜，最終造成細胞的損傷，結晶附壁黏結枸杞中的主要活性成分枸杞多糖能抑制和清除自由基的產生，減少抗氧化酶的損失；有較強的細胞保護作用，可以抑制腎草酸4丐結石的形成，由于枸杞多糖提取不易及價格的昂貴，不易廣為推廣，但枸杞作為一種保健藥物被廣為使用，已報道枸杞水提液具有清除自由基的作用。我們使用枸杞的浸泡劑和煎劑作為干預劑，來進一步了解不同濃度和不同使用方法的枸杞對腎草酸鈣結石形成的影響和效果差別。通過以上實驗我們發(fā)現(xiàn)從統(tǒng)計學結果看，雖然2.5%濃度的枸杞浸泡液和煎劑其結晶評分和乙二醇對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，但12%和25%濃度的浸泡液和煎劑結晶評分和單純誘石組相比降幅分別為38.7%，54.8%'48.4%和58.1%，有顯著性差異(P〈0,01)°說明較高濃度的枸杞浸泡液和煎劑具有抑制草酸鈣腎結石的作用。同時通過和腎組織SOD，MDA和腎細胞凋亡指數(shù)相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)它們之間有著良好的相關系數(shù)，15這說明了枸杞浸泡液和煎劑主要是通過對抗自由基的毒性反應，增強組織的抗氧化活性，減少腎小管上皮細胞的凋亡來實現(xiàn)抑制草酸鈣腎結石的效果。隨著濃度的增高，其抗氧化能力和預防結石的效果也增強，有著良好的量效關系。通過進一步對不同濃度的枸杞浸泡液和煎劑中的枸杞多糖含量檢測，我們發(fā)現(xiàn)煎劑中的枸杞多糖含量比浸泡液的要高，說明保持較高的溫度對提取枸杞中的枸杞多糖是有效的，能使枸杞發(fā)揮更大的作用。研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖的提取和時間、溫度、料水比、浸提次數(shù)及是否進行過預處理皆有很大的關系，隨溫度升高，枸杞多糖的得率也逐漸增大。同時研究還發(fā)現(xiàn)枸杞煎劑比浸泡液的抗氧化作用和抑石效果略好，通過對枸杞多糖含量的檢測，發(fā)現(xiàn)枸杞浸泡液和煎劑所含的枸杞多糖含量與腎組織自由基相關指標水平及腎小管上皮細胞凋亡水平關系密切，這說明枸杞浸泡液和煎劑的抗氧化作用主要是通過它們所含的枸杞多糖來實現(xiàn)的，進一步證明了本發(fā)明先前所提出的枸杞多糖具有抗氧化作用，它通過提高機體的抗氧化能力，來抑制草酸鈣腎結石的形成。1權利要求1.枸杞在預防尿結石中的應用。2.如權利要求l所述的枸杞多糖在預防尿結石中的應用，其特征在于它是通過枸杞中的枸杞多糖的抗氧化作用，減少高尿草酸對腎小管上皮細胞的傷害，從而阻斷了腎草酸鈣結石形成鏈中的關鍵環(huán)節(jié)。3.如權利要求2所述的枸杞在預防尿結石中的應用，其特征在于所述的枸杞的浸泡劑作為干預劑，其重量百分比濃度不低于2.5%。4.如權利要求3所述的枸杞在預防尿結石中的應用，其特征在于所述的枸杞的浸泡劑作為干預劑，其重量百分比濃度優(yōu)選為12-25%。5.如權利要求2所述的枸杞在預防尿結石中的應用，其特征在于所述的枸杞的煎劑作為干預劑，其濃度不低于2.5%。6.如權利要求5所述的枸杞在預防尿結石中的應用，其特征在于所述的枸杞的煎劑作為干預劑，其重量百分比濃度優(yōu)選為12-25%。全文摘要本發(fā)明提出了枸杞在預防尿結石中的應用。枸杞中的主要活性成分是枸杞多糖，它具有抗氧化作用，能清除體內自由基。本發(fā)明通過實驗表明，適量的枸杞多糖可減少飲用誘石劑大鼠的腎草酸鈣結石形成，其作用機制可能是通過抗氧化反應，減少自由基對腎組織的損傷，從而減少腎小管上皮細胞的凋亡。因此具有預防尿結石的功效，而其在藥品、食品和保健品領域也有重要應用。枸杞具多種明顯的保健功能和藥食同源的特性，成本低廉，服食方便，患者依從度高。同時枸杞屬純天然物質，無任何副作用。文檔編號A61K36/185GK101480449SQ20081018189公開日2009年7月15日申請日期2008年11月21日優(yōu)先權日2007年11月22日發(fā)明者建厲,張士青,李文峰申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院