專利名稱：：一種魚用疫苗及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種魚用疫苗，特別是由豚鼠氣單胞菌Uerofflo朋scava'ae)制備的全菌疫苗或由其外毒素制備的疫苗，及其在魚病防治中的應用。
背景技術(shù)：
：氣單胞菌屬C4ero/wo;7as)的細菌在自然界廣泛存在于水和土壤中，它們大多數(shù)是腐生菌和條件性致病菌，是正常魚體的常居者。當水體嚴重污染或魚體受傷時，這些細菌就可引起魚體發(fā)病，甚至死亡。氣單胞菌屬的細菌分為兩大類一類為嗜冷氣單胞菌群；另一類為嗜溫氣單胞菌群。前者以殺鮭氣單胞菌asaiffloida)為代表，無運動力，只對一些冷水性魚類致病，如虹鱒和大西洋鮭等，目前報道的主要有殺鮭亞種、無色亞種、日本鮭亞種和史氏亞種等。嗜溫氣單胞菌有運動力，1984年版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》只確定了嗜水氣單胞菌04./jycfr叩/n'h'a)、溫和氣單胞菌C4.sobria)和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)3個種。近年來隨著微生物研究的深入，又分離到了一些新的菌種，如中間單胞菌U.Media)、舒氏單胞菌".Sc/7uber"i)、嗜泉水單胞菌U.eurenophi』a)、維里納單胞菌U,verom'i)、簡達U.jandaei)Aa_Z_ZosaccAarop/]iJa、Ae/ic/jeieia禾口AeteropeJogenes等。在這些細菌中以嗜水氣單胞菌C4.Ayc/ro;^iJia)、溫和氣單胞菌Glso/ria)和豚鼠氣單胞菌04.caWae)三個種對魚類的危害最大，特別是嗜水氣單胞菌C4./7ydr叩Mha)是目前危害全球水產(chǎn)養(yǎng)殖動物最大的條件性致病菌[28]，是魚的傳染性的革蘭氏陰性桿菌病的主要病原菌，其經(jīng)過可以是急性、亞急性、慢性或潛伏性[6]。本病廣泛存在于世界各地，國內(nèi)也有許多報道，其發(fā)病率和死亡率皆較高，常引起大批流行和死亡，是當前集約化養(yǎng)魚業(yè)上具有很大威脅的疾病。豚鼠氣單胞菌C4.caWae)在過去被稱為點狀氣單胞菌".pmictata)，在自然界廣泛分布，對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物、鳥類、哺乳動物甚至人類都可感染致病。根據(jù)文獻報道，甲魚、鰻鱺、鯉魚、鯽魚、鰱鳙魚、金魚、虹鱒、胡子鲇和中華絨毛蟹等都有感染豚鼠氣單胞菌致病的報道，其感染后可表現(xiàn)為敗血癥、腸炎、體表潰瘍和豎鱗等病癥。豚鼠氣單胞菌還能能引多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的疾病，如鰱魚的打印病、白皮病、甲魚敗血癥、虹鱒皮膚潰爛病、歐洲鰻鱺敗血癥、鯽魚出血性敗血癥等。目前，還沒有豚鼠氣單胞菌U.caviae)4感染大口鯰(Si^rus/neriaionaJisC72e/7)的報道。大口鯰，原名南方大口鯰，俗稱河鯰、大河鯰魚、鯰巴郎，主要產(chǎn)于我國長江流域的大江河中，是一種肉食性的大型經(jīng)濟魚類，通過人工馴化養(yǎng)殖后，也攝食人工配合飼料。該魚具有肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、無肌間剌、生長特別快、易飼養(yǎng)等特點，受到養(yǎng)殖者和消費者的歡迎。對大口鯰的疾病目前有一些報道，如出血病、腸炎病、爛鰓病、錐體蟲、指環(huán)蟲病、小瓜蟲病和車輪蟲病等。近年來出現(xiàn)的"大口鯰潰瘍綜合癥"給廣大養(yǎng)殖戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失，該病具有發(fā)病率高，死亡率高，不僅危害魚苗、魚種，同時危害成魚的特點，其主要臨床表現(xiàn)是在體表各部位最初形成大小不等的膿腫，隨病程的發(fā)展膿腫破潰，形成大小不等的潰瘍，最后引起發(fā)病魚大量死亡。目前，對該病僅有一些臨床病例報道，對其病因?qū)W、流行病學、病理學和藥物防治及免疫防治等方面都缺乏深入的研究，從而導致該病在生產(chǎn)中不能有的放矢很好的控制。胞外產(chǎn)物(Extracellularproducts,ECP)是細菌在生長繁殖過程中，不斷向外界環(huán)境釋放的代謝產(chǎn)物，包括各種胞外酶、外毒素和色素等。研究表明ECP在一些病原菌致病過程中起著重要的作用，溶血素被認為是許多病原菌的致病因子，在很多的水產(chǎn)動物致病菌中普遍存在，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、愛德華氏菌和溫和氣單胞菌等。有研究表明，病原菌的溶血素能溶解紅細胞致感染動物溶血性貧血，有的還具有腸毒素性[45;46]，且與感染魚的出血癥狀有關(guān)。目前，報道了一些用豚鼠氣單胞菌制備疫苗防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的實例，如毛寧等使用嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌制備的聯(lián)合疫苗防治鱉病(毛寧等，鱉免疫防治的初步研究，淡水漁業(yè)，1999，29(3))，安利國等利用豚鼠氣單胞菌制備疫苗防治鯉豎鱗病(安利國等，鯉豎鱗病病原及其疫苗的研究，水產(chǎn)學報，1998，22(2))，賀蓉等也報道了南方大口鯰對溫和氣單胞菌的免疫反應(賀蓉等，南方大口鯰對溫和氣單胞菌的免疫反應，西南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2005,27(5));刑維賢等還報道了豚鼠氣單胞菌滅活疫苗的安全性及其對鯉魚豎鱗病的防治研究(刑維賢等，豚鼠氣單胞菌滅活疫苗的安全性和免疫防治，山東師大學報(自然科學版)，1998,13(4))。但還未見利用豚鼠氣單胞菌制備全菌疫苗防治南方大口鯰"漬瘍綜合癥"的報道。
發(fā)明內(nèi)容為了防治無鱗魚特別是南方大口鯰的"潰瘍綜合癥"，本發(fā)明提供一種魚用疫苗，含有致免疫有效量的滅活的豚鼠氣單胞菌"ero/Honascaia'ae)，其5產(chǎn)生相對分子量32KD的溶血素，及藥學上可接受的輔料或載體。所述的豚鼠氣單胞菌"ero膨朋scsWae)是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的菌株。所述菌株是從大口鯰病灶處分離得到，經(jīng)鑒定為豚鼠氣單胞菌Uer咖o朋scaWae),命名為DKN—1，并于2007年9月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNO:M207146。所述致免疫有效量為不低于1.7X1()7CFlJ/ml，優(yōu)選的致免疫有效量為L7X107CFU/ml7X109CFU/ml。本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其含有致免疫有效量的由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的豚鼠氣單胞菌"ero膨朋scaWae)菌株所產(chǎn)生的相對分子量為32KD的溶血素及佐劑以及藥學上可接受的輔料或載體；優(yōu)選的佐劑為弗式完全佐劑或弗式不完全佐劑。進一步，還含有由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的豚鼠氣單胞菌Uero膨朋scaWae)菌株的福爾馬林滅活的單純性菌體，所述菌體不低于1.7X107CFU/ml，優(yōu)選范圍為1.7X107CFU/ml7X109CFU/ml。上述疫苗組合物，以水或吸附劑為載體，優(yōu)選的載體為生理鹽水或蒸餾水，吸附劑是沸石或硅藻土。本發(fā)明的再一個方面是提供一種聯(lián)合用藥物，包含權(quán)利要求1或7所述的疫苗組合物以及透皮吸收促進劑且任選一種或多種藥學上可接受的輔料或載體，優(yōu)選的透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。本發(fā)明的另一方面，是提供所述的疫苗組合物或聯(lián)合用藥物在制備預防無鱗魚特別是大口鯰潰瘍癥的藥物中的用途。本發(fā)明的疫苗是通過腹腔注射給藥，來預防無鱗魚特別是大口鯰潰瘍癥的藥物；或者，是通過浸泡的方式給藥來預防無鱗魚特別是大口鯰潰瘍癥的藥物。以下通過具體實施方式進一步說明本發(fā)明的有益效果，但不應理解為是對本發(fā)明的限制，凡是基于本發(fā)明的技術(shù)基本思想所做的其它多種形式的修改、替換或變更所實現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的范圍。附圖簡要說明圖1純化溶血素SDS-PAGE電泳圖1為DNK-1溶血素，2為豚鼠氣單胞菌ATCC15468溶血素圖2SDS-PAGE電泳標準蛋白曲線及回歸方程具體實施例方式試驗例lDKN—1菌株的分離鑒定Io從大口鯰的病灶處，分離到一株細菌，命名為DKN-1，將該分離純化的菌株感染健康南方大口鯰后，出現(xiàn)了與大口鯰"潰瘍綜合癥"自然病例相同的癥狀與病變，確認該菌為南方大口鯰"潰瘍綜合癥"的病原菌。經(jīng)鑒定，其為G-桿菌，無莢膜，無芽孢，極生單鞭毛。在普通營養(yǎng)瓊脂和TSA營養(yǎng)瓊脂上菌落呈灰白色，圓形，表面光滑、濕潤，微凸，邊沿整齊的半透明菌落;在兔血平板上出現(xiàn)明顯的P溶血環(huán)，在肉湯中能生長，均勻渾濁，表面有薄層的菌膜，一搖即散。DKN-1為兼性厭氧發(fā)酵型，具有運動能力的G-桿菌，最適生長溫度為2030'C，在含鹽量5%以下的培養(yǎng)基上能生長，生長的PH范圍為5.09.0最適ra為6.07.0，其他的生理生化特征見表1。表1DNK-1菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"+"為陽性，"-"為陰性，"d"11-89%為陽性，(+)，多數(shù)種陽性;A.c表示豚鼠氣單胞菌(Acaviae);A.v表示維里納氣單胞菌U.verom'i)。DKN-1菌株經(jīng)16SrDNA測序，結(jié)果表明該片段有1417bp。其16SrDNA序列為ATAGCTTMCCTTCGGGAGGGCGTTACCACG將獲得的序列在RDP數(shù)據(jù)庫進行在線Classifer，結(jié)果表明該菌屬于氣單胞菌屬的細菌，再將獲得的序列與Genbank中已報道的16SrDNA序列進行Blast分析，結(jié)果表明DKN-1菌在系統(tǒng)發(fā)育數(shù)上與AcaWaeU.punctat)聚為一簇，其同源性在99.699.7%之間，結(jié)合形態(tài)學和理化特征鑒定其為DNK—1菌株于2007年9月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNO:M207146。對其胞外產(chǎn)物進行檢測，發(fā)現(xiàn)胞外產(chǎn)物具有明顯的溶血活性和對Vero細胞的毒性，從該胞外產(chǎn)物中分離提純到相對分子量為32.2KD的溶血素。提純?nèi)苎貙Υ罂邛T具有明顯的致病作用，且與劑量呈正相關(guān)，經(jīng)7d的試驗，各組的死亡數(shù)和死亡率詳見表2表2溶血素接種大口鯰的發(fā)病和死亡情況組別溶血素稀釋度尾數(shù)死亡數(shù)死亡率ooI155100.0II1:255100.0III1:455100.0IV1:85480.0V1:165240.0VI1:325120.0對照組5008試驗例2本發(fā)明豚鼠氣單胞菌(DKN-1)與豚鼠氣單胞菌模式株(ATCC15468)溶血性外毒素的特性比較研究外毒素是豚鼠氣單胞菌致病的重要原因，外毒素的差異可以表明本發(fā)明分離到的菌株與現(xiàn)有豚鼠氣單胞菌的重要區(qū)別。1.材料與方法1.l材料1.1.l菌株大口鯰豚鼠氣單胞菌(DKN-1)分離并鑒定的來自然感染發(fā)生潰瘍病的南方大口絵(5V/wmsC7ze")。豚鼠氣單胞菌標準菌株(ATCC15468)中國科學院水生生物研究所贈與1.1.2實驗大口鯰來自眉山某養(yǎng)殖場的健康南方大口鯰，平均體重257.4士10.7g，實驗前于水族箱內(nèi)馴養(yǎng)l周。1.2方法1.2.l細菌培養(yǎng)豚鼠氣單胞菌DKN-1與ATCC15468分別接種TSA，28。C培養(yǎng)24h,活化菌接種TSB，28°C，120r/min搖床培養(yǎng)36h，培養(yǎng)物經(jīng)4。C，10000r/min離心20min，取上清，孔徑O.22"m的濾膜過濾備用。1.2.2溶血素的提純1.2.2.l硫酸銨鹽析在經(jīng)過濾膜過濾的細菌培養(yǎng)上清中加入固體硫酸銨至70%的飽和度，置于4。C靜置過夜，4"C，10000r/min離心30min，去上清，沉淀溶于濃度為50mmol/L的Tris-HC1(pH7.8)緩沖液中，對相同緩沖液透析過夜，用聚乙二醇2000濃縮，收獲的濃縮液即為粗提溶血素。1.2.2.2DEAE-S印hadexA50離子交換層析將透析后的粗提溶血素上柱，用0-0.8mol/LNaCl的50mmol/L的Tris-HCl(pH7.8)緩沖液進行梯度洗脫，流速為12ml/h，每管收集3mL，洗脫體積為360mL。樣品的收集與檢測根據(jù)洗脫曲線的蛋白峰，采用微量板法測定溶血活性后，合并有活性的蛋白峰，于濃度為50mmol/L的Tris-HCl(pH7.8)緩沖液透析過夜。用聚乙二醇PEG-6000濃縮膠濃縮，得純化的溶血素。1.2.3分子量測定采用Lae咖li不連續(xù)SDS-PAGE系統(tǒng)，濃縮膠為4.0%，分離膠為12.5%。將分離毒素與樣品緩沖液4:1混合，沸水浴5分鐘，加樣量為25ul，在起始電壓50V的條件下電泳，待樣品進入分離膠后加壓至IIOV，待溴酚藍指示9劑接近底部時停止電泳，用考馬斯亮藍R-250進行染色、脫色。并采用下列公式計算各種蛋白質(zhì)的遷移率(Rf):遷移率(Rf)二蛋白從原點遷移的距離(mm)/從原點到參考點的距離在Excell中以相對遷移率為橫坐標，蛋白分子量Mr的對數(shù)為縱坐標標準曲線，計算回歸方程，并根據(jù)檢測蛋白的Rf計算出其相對分子量。1.2.4溶血價與溶血譜測定提純?nèi)苎赜?0mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.8)在96孔板上倍比稀釋，然后加入等量的1%的人、兔、狗、牛、草魚、鯉魚、鯽魚、云斑鮰、大口鯰、雞和豬等的紅細胞，于37。C放置lh，再于4i:放置4h，判斷結(jié)果，以溶解50%的紅細胞的最高稀釋度為溶血價，從而測定其溶血性與溶血價。1.2.5溶血素對大口鯰致病性將純化的溶血素濃縮成相同的蛋白濃度后，備用。130尾大口鯰平均分成13組，每組10尾，其中12組為試驗組，另1組為對照組。實驗組中的其中6組分別腹腔注射0.2mL倍比稀釋的DNK-1純化溶血素，另外6組分別腹腔注射0.2mL倍比稀釋的ATCC15468純化溶血素，對照組注射0.2mLTris-HCl緩沖液(pH7.8)，觀察7d，記錄發(fā)病死亡情況和表現(xiàn)出的臨床癥狀，并統(tǒng)計各實驗組的發(fā)病死亡情況。2.結(jié)果2.1提純?nèi)苎氐姆肿恿績芍昙毦峒兒蟮娜苎嘏c等體積的栽樣緩沖液混合，沸水浴5min后，采用SDS-PAGE進行電泳后，準確測得溴酚藍遷移距離為50.Omm，標準蛋白遷移距離分別為7mm、13mm、18mm、26mm、35mm和45畫，DNK-1溶血素的遷移距離為26.5mm，而ATCC15468溶血素的遷移距離為18.5mm，(圖l)。依據(jù)下列公式計算其相對遷移率(Rf)。遷移率(Rf)=蛋白從原點遷移的距離(mm)/從原點到參考點的距離以相對遷移率為橫坐標，蛋白分子量Mr的對數(shù)為縱坐標作圖(圖2),其回歸方程式為y二-1.0871x+2.087(X為蛋白質(zhì)遷移率，y為蛋白質(zhì)分子量對數(shù))，相關(guān)系數(shù)為0.9815，求得DNK-1溶血素的相對分子量為32.2KD，而ATCC15468溶血素的相對分子量為48.4KD。2.2溶血素的溶血性與溶血價將純化的DKN-1與ATCC15468溶血素在96孔板上進行其對人、狗、牛、草魚、鯉魚、鯽魚、云斑鮰、大口鯰、雞、金魚、豬和兔等動物紅細胞的溶血性和溶血價測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩株菌的溶血素都對這些動物的紅細胞都具有不同的溶解性，但存在一定差異，DKN-1株對魚類紅細胞的溶解能力明顯強于陸生脊椎動物的紅細胞，而ATCC15468的溶血素則溶解陸2.3溶血素對大口鯰的致病性大口鯰豚鼠氣單胞菌DNK-1株的溶血素對大口鯰都具有明顯的致病作用，且與劑量呈正相關(guān)，經(jīng)7d的試驗，各組的死亡數(shù)和死亡率表2。死亡魚剖解見腹腔內(nèi)充有大量腹水，肝、脾、腎腫大，淤血、出血；胃腸道內(nèi)充有大量粘液，粘膜充血、出血。從表2可知，ATCC15468純化溶血素對大口鯰也具有一定的致病性，但其致病性較DNK-1溶血素對大口鯰的致病性相對弱一些，而對照組魚未實驗魚未發(fā)生死亡。表2溶血素接種大口鯰的發(fā)病和死亡情況組別溶血素稀釋度溶血素類型尾數(shù)死亡數(shù)死亡率(％)I21腿-11010100.0ATCC154681010100.0II22腿-11010100.0ATCC1546810880.0III23腿-11010100.0ATCC1546810330.0IV24DNK-110550.0ATCC1546810110.0V25DNK-110220.0ATCC154681000VI26DNK-11000ATCC154681000對照組10003.結(jié)論(1)大口鯰豚鼠氣單胞菌(DNK-1)與豚鼠氣單胞菌模式菌(ATCC15468)都產(chǎn)生單一多肽的溶血性外毒素，但兩者在分子量存在一定的差異，大口鲇豚鼠氣單胞菌DNK-1株溶血素的相對分子量為32.2KD，而豚鼠氣單胞菌標準株(ATCC15468)為48.4KD。(2)大口餘豚鼠氣單胞菌(DNK-1)與豚鼠氣單胞菌模式菌(ATCC15468)產(chǎn)生的溶血素對多種動物紅細胞均具有溶血作用，但大口鯰豚鼠氣單胞菌(DNK-1)溶血素對魚類紅細胞的溶解能力明顯強于陸生脊椎動物的紅細胞，而豚鼠氣單胞菌模式菌(ATCC15468)溶血素則溶解陸生脊椎動物的紅細胞強于魚類的紅細胞。生脊椎動物的紅細胞強于魚類的紅細胞。表1溶血素的溶血譜與溶血價紅細胞源溶血價/l。g2DNK—1ATCC15468紅細胞源溶血價/log2匿一lATCC154689882S6牛人狗黃豬兔雞魚魚魚慰,魚鯉鯽草云大金11(3)口鯰豚鼠氣單胞菌(DNK-1)與豚鼠氣單胞菌模式菌(ATCC15468)產(chǎn)生的溶血素對大口鯰都具有致病、致死性，但存在一定差異，在相對的濃度情況下，口鯰豚鼠氣單胞菌(DNK-1)產(chǎn)生的溶血素比豚鼠氣單胞菌模式菌(ATCC15468)產(chǎn)生的溶血素對大口鯰的致死性強。因此，本發(fā)明分離到的DNK—1與現(xiàn)有的豚鼠氣單胞菌明顯不同。試驗例3本發(fā)明全菌疫苗與模式菌株制備的疫苗保護性的比較研究1.材料與方法1.1菌種大口鯰豚鼠氣單胞菌(DKN-1)分離并鑒定的來自然感染發(fā)生漬瘍病的南方大口鯰豚鼠氣單胞菌標準菌株(ATCC15468)中國科學院水生生物研究所贈與1.2實驗大口鯰來自眉山某養(yǎng)殖場的健康大口鯰(^7wmsweha/o"a/^)，平均體重100.5士6.3g，實驗前于水族箱內(nèi)馴養(yǎng)l周。1.3疫苗的制備分別將大口鯰豚鼠氣單胞菌(DKN-1)和豚鼠氣單胞菌標準菌株(ATCC15468)分別接種TSA平板，再用PBS洗下接種一系列的TSB肉湯經(jīng)逐級增菌培養(yǎng)，采用平板計數(shù)法確定細菌達到一定數(shù)量后，用濃度為0.5%(V/V)福爾馬林，28'C滅活48h，制成疫苗。1.4疫苗的安全性檢査將菌體疫苗接種兔鮮血TSA瓊脂平板，通過是否有病原菌生長來檢查菌體疫苗中是否含有未滅活的病原菌。采用肌肉注射的方法，將制備的菌體疫苗按正常接種量的5倍與IO倍劑量接種健康南方大口鯰進行人工攻毒感染，檢查菌體疫苗對南方大口鯰的致病性。1.5實驗分組50尾健康大口鯰隨機平均分成5組，每組10尾，大口鯰豚鼠氣單胞菌DNK-1株與豚鼠氣單胞菌ATCC15468株制備的滅活全菌疫苗分別采用浸泡與注射兩種免疫途徑對大口鯰進行免疫，同時用生理鹽水設置對照組。1.6保護性實驗免疫后3周，免疫組與對照組的實驗魚進行人工攻毒感染，每尾實驗魚腹腔注射大口鯰豚鼠氣單胞菌DNK-1株3.2X108CFU/ml病原菌0.2mL，觀察各實驗組的發(fā)病死亡情況，得出保護率。2.結(jié)果2.1疫苗的安全性通過平板計數(shù)法得出福爾馬林滅活疫苗中的含菌量為l.8X10，UF/mL。將該疫苗O.lmL接種于兔鮮血TSA瓊脂平板，在28t:下培養(yǎng)24h，沒有細菌生長。將疫苗對健康大口鯰進行攻毒感染，疫苗對實驗魚沒有致病性。這表明濃度為O.5%(V/V)的福爾馬林在28"C條件下對病原菌進行48h的滅活，能將病原菌徹底滅活，制備的疫苗是安全的。2.2疫苗的保護性將兩種菌株制備的疫苗，按注射與浸泡兩種免疫途徑進行大口鯰3周后，利用病原菌(DKN-1)對免疫后的實驗魚進行攻毒感染。結(jié)果表明D認-l制備的疫苗對大口鯰的保護率明顯高于豚鼠氣單胞菌ATCC15468株制備的疫苗對大口鯰的保護率。另外，從表l也可看出，在兩種免疫途徑中注射的免疫方式的免疫效果好于浸泡免疫途徑。表l豚鼠氣單胞菌(DNK-1)與標準菌株(ATCC15468)制備的疫苗的保護性比較分組il病原菌濃度接種量死亡數(shù)死亡率保護率(尾)(CFU/ml)(ml/尾)(尾)(％)(%)3.結(jié)論本實驗發(fā)現(xiàn)，從自然感染發(fā)生潰瘍綜合癥的大口鯰分離到的豚鼠氣單胞菌(DKN-1)制備的疫苗通過浸泡與注射兩種方式免疫大口鯰后的保護率明顯高于豚鼠氣單胞菌ATCC15468株制備的疫苗的保護率。該結(jié)果表明，豚鼠氣單胞菌(DKN-1)在預防大口鯰潰瘍病的疫苗制備上較豚鼠氣單胞菌ATCC15468株具有更強的針對性和更大的應用價值。上述結(jié)果均說明，本發(fā)明的豚鼠氣單胞菌的全菌疫苗與現(xiàn)有的疫苗是不同的，在防治南方大口鯰"潰瘍綜合癥"方面具有顯著效果試驗例4豚鼠氣單胞菌DNK—1溶血性外毒素制備的毒素疫苗、菌體疫苗與菌體+毒素混合疫苗的免疫保護性比較1.溶血性外毒素的制備按照試驗例2的方法制備得相對分子量為32.2KD的單一多肽，具有溶血活性的外毒素。2.溶血性外毒素的免疫原性按常規(guī)方法，將純化的外毒素與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合制備抗原免疫健康家兔進行毒素抗體的制各，將制備的兔抗血清作倍比稀釋，與等體積的毒索混臺，37'C下作用1小時后，對毒素的溶血性進行了觀察結(jié)果表明，兔抗毒素血清能中和毒素，抑制毒素兔血細胞的溶血性，中和毒素103.2Xl(f103.2X108103.2X108103.2X1081001000.20.20.20.20.20.233070110908802066040101000101000DKN-1疫苗ATCC1546疫苗對照組包針包付包時外身外身外身菱注變生浸注13的兔抗毒素血清最高稀釋度為1:512。表明DNK-1溶血性外毒素具有很強的免疫原性。3.毒素疫苗、菌體疫苗與菌體+毒素混合疫苗的免疫保護性比較3.l疫苗的制備3.1.1菌體疫苗制備DNK-1TSB肉湯，28°C，120r/min搖床培養(yǎng)24h，10000r/min離心30min，用PBS(pH7.2)收集菌體，洗滌細菌懸液3次后制成菌懸液，細菌計數(shù)按比濁法結(jié)合平板計數(shù)法確定。按菌液量加入一定量的福爾馬林溶液，使福爾馬林在菌液中的濃度為0.5X(V/V)，28'C滅活48h。用PBS離心洗滌滅活疫苗3次，最后用PBS制成一定濃度的菌體疫苗懸液。3.1.2毒素疫苗制備將分離純化獲得的溶血性外毒素，用濃度為O.5%的福爾馬林對濃度為4mg/niL的外毒素進行滅活處理，得到的滅活疫苗為毒素苗。3.1.3菌體+毒素混合疫苗的制備將DNK-1先接種TSA平板，再用PBS洗下接種一系列的TSB肉湯經(jīng)逐級放大培養(yǎng)，采用平板計數(shù)法確定細菌達到一定數(shù)量后，用濃度為0.5X(V/V)福爾馬林，28"C滅活24h，制成菌體+毒素混合疫苗。3.2三種疫苗的保護性實驗分為浸泡與注射兩種免疫方式，體重150g左右的健康大口鯰分別進行三種不同疫苗的浸泡與注射免疫，同時用生理鹽水設置對照組。在免疫后3周，免疫組與對照組的實驗魚進行人工攻毒感染，每尾實驗魚注射病原菌0.2mL，檢査三種疫苗的免疫保護性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種疫苗都有不同程度的保護作用，且兩種免疫方式中以注射的效果優(yōu)于浸泡；其中毒素疫苗的免疫效果優(yōu)于單純性的菌體疫苗，表明溶血性外毒素是大口鯰豚鼠氣單胞菌重要的保護性抗原，當其與菌體一起制成混合疫苗免疫大口鯰后，其保護率明顯增強，達70%90%，詳見表l。_表l三種疫苗免疫大口鯰后的保護率_分拍11~~病原菌濃度~~接種量~~"死亡數(shù)"~~死亡率~~保護率"一且(尾)(CFU/ml)(ml/尾)(尾)(％)(%)菌體疫苗毒素疫苗菌體毒素混合疫苗對照組4.小結(jié)102.4X1080.2102.4X1080.2102.4X1080.2102.4X1080.2102.4X1080.2102.4X1080.21000,21000.'770305505055050330703307011090101000101000包時包付包時包付外身外3外身浸注菱注菱注菱注14本試驗發(fā)現(xiàn)，豚鼠氣單胞菌(D認-1)分泌的相對分子量為32.2KD的單一多肽，具有溶血活性的外毒素不僅是一重要致病因子，同時也能制備成疫苗。從上述實驗結(jié)果看出制備的毒素、菌體混合疫苗的保護性明顯高于單純性的菌體疫苗及毒素疫苗對大口鯰漬瘍病的保護性，因此全菌疫苗是防治大口鯰"潰瘍綜合癥"的有效方法。實施例1本發(fā)明全菌疫苗的制備1.材料與方法1.l材料試驗菌從發(fā)病大口鯰分離鑒定的豚鼠氣單胞菌(A.caviae)試驗魚購于雅安市場，健康無病無損傷，體重200g左右，實驗前暫養(yǎng)7d。主要試劑氮酮(化學純，由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn))；鹽酸消旋山莨菪堿注射液(1ml:10mg,05072531，由天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn))。胰蛋白胨、大豆蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂，北京博奧星生物技術(shù)有限公司培養(yǎng)基TSA與TSB1.2方法1.2.l飼養(yǎng)管理采用水族箱詞養(yǎng)，24h連續(xù)增氧；水源為經(jīng)曝氣去氯處理后的自來水，其PH值6.8-7.2，水溫18-23.5°C，溶氧8-12mg/L;其它指標符合漁業(yè)水質(zhì)標準(GB11607-89)。試驗魚正常投喂魚糜，日換水量為1/2。1.2.2疫苗制備將豚鼠氣單胞菌(A.caviae)接種到TSA斜面培養(yǎng)基上28。C恒溫培養(yǎng)24h，挑取菌落接種于TSA平板培養(yǎng)基上28'C恒溫培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗脫，調(diào)整菌液濃度為7X10gCFU/ml，再加入O.6%的福爾馬林在28。C震蕩滅活24h，即為全菌滅活疫苗，4"C環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?.2.3疫苗的安全性檢測取0.lml制成的全菌滅活疫苗在TSA平板上涂布，28"C恒溫培養(yǎng)24h-48h，觀察是否有菌落形成。將滅活疫苗(7X109CFU/ml)腹腔注射接種健康鯰魚，劑量0.2ml/尾，對照組注射無菌生理鹽水，每組10尾，統(tǒng)計7d內(nèi)接種魚的存活率，同時觀察注射后鯰有無體表潰爛。1.2.4免疫途徑與分組將全菌苗分別進行1:10倍稀釋供注射組用和1:400倍稀釋供浸泡組用，注射劑量為0.2ml，浸泡菌液濃度為1.7X107CFU/ml。以浸泡和注射兩種方式進行免疫。浸泡免疫設置四個組和浸泡對照組，同時設置注射組和注射對照組，分組情況如下(見表l):表l浸泡免疫實驗分組情況浸泡免疫菌劑量(CFU/ml)浸泡時間浸泡時間I組1.7X10'CFU/tnl60min120minII組1.7X107CFU/ml+氮酮(5mg/1)60min120rainin組1.7X107CFU/ml+氮酮(10mg/1)60min120minIV組1.7X107CFU/ml+莨菪堿(5mg/1)60min120minv組浸泡對照組用暴氣后的自來水浸泡處理。注射免疫濃度注射量VI組注射組1.7X10'CFU/ml0.2mlvn組注射對照生理鹽水0.2ml1.2.5免疫效果的測定1.2.5.l血清凝集效價的測定于一免后的21d，二免后的8d即32d尾靜脈采血，制備血清測定血清凝集效價。用70%的酒精消毒后，從魚尾靜脈采血，置于Eppendorf管中，靜置2h，待血液凝固后，置于4C冰箱過夜，使血清充分析出后離心(8000r/min，10min)，取上清液。測定效價用96孔板作為載體，每孔加100ul無菌生理鹽水(O.85%NaCI)—第1孔加待測血清lOOul,2倍比稀釋，第9孔棄lOOnl第10為陰性對照一每孔加入100倍稀釋后的滅活菌懸液lOOul—室溫放置2h，4"C過夜低倍顯微鏡觀察，記錄凝集沉淀的最高稀釋度的倒數(shù)為抗體效價。1.2.5.2保護性試驗在二免后的6周，注射攻毒免疫試驗魚和對照魚，采用腹腔注射豚鼠氣單胞菌(A.caviae)活菌攻毒，濃度為1.5X108cfu/ml，每尾魚注射0.2ml。統(tǒng)計l周的死亡率。按下列公式計算免疫保護力(RPS):免疫保護力(%)=(對照組死亡率-試驗組死亡率)/對照組死亡率X100X2.結(jié)果2.1菌苗的安全性將制成的全菌苗劃線接種在TSA斜面上，28'C恒溫培養(yǎng)24h，觀察無菌落生長。將全菌苗(7X109cfu/ml)腹腔注射接種健康鯰魚，劑量0.2ml/尾，對照組注射無菌生理鹽水，每組10尾，7d內(nèi)接種魚無死亡，注射后鯰體表無潰爛。2.2血清凝集效價血清凝集效價實驗結(jié)果見表2。16表2血清凝集效價<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表2可知在首次免疫后，浸泡免疫和注射免疫都產(chǎn)生了一定的血清抗體，但注射免疫組與浸泡組相比血清凝集效價明顯高于浸泡組，且浸泡組的中浸泡2h的效果優(yōu)于浸泡lh的效果，而使用lOppm氮酮的效果優(yōu)于5ppm氮酮和不加氮酮的免疫組；另外使用5ppm莨菪堿的效果也優(yōu)于5ppm氮酮和不加氮酮的免疫組。2.3保護性免疫組及對照組的免疫保護力見表3，結(jié)果表明，各免疫組都具有一定的保護力，強毒攻擊后，各組的死亡率較對照組明顯下降，其保護率在50-100%之間。表3免疫后大口鯰的保護力<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2本發(fā)明疫苗制劑(水劑)的制備及使用方法菌苗制備豚鼠氣單胞菌(DKN-1)經(jīng)復蘇培養(yǎng)后，經(jīng)TSB肉湯初級培養(yǎng)，再經(jīng)TSA次級培養(yǎng)和TSB肉湯擴大培養(yǎng)后，用4-6%。的福爾馬林28°C，110r/min,振蕩滅活36h，經(jīng)檢驗滅活完全后，無菌裝瓶，備用。用時與10mg/l的氮酮促滲劑聯(lián)合應用，可以混合在一起使用，也可以同時分別施用。組成和形狀本品系為南方大口鯰潰瘍綜合癥的滅活全菌苗。疫苗應為棕黃色，靜置有白色沉淀。規(guī)格本品規(guī)格為每瓶500mL，一般情況下，每毫升含菌量在1(TCFU以上，當不能達到10"CFU/ml時，可以根據(jù)計算施用，以保證每次浸泡用量為每方水體1000mL，所含活菌量應不低于107CFU/ml。作用和用途浸泡本疫苗后可刺激魚體產(chǎn)生抗?jié)兙C合癥的免疫力，增強抗病能力。免疫對象大口鯰魚苗、魚種。用法及劑量將大口鯰魚苗、魚種置入小水體，魚的密度不高于魚等耐受的最大密度，每方水體浸泡菌苗1000mL，所含活菌量應不低于107CFU/ml。浸泡時間不低于15min，不超過2h。自首次免疫后的第15天和第45天，進行第二次免疫和第三次免疫。禁忌免疫前2天禁用消毒藥；發(fā)病期間的魚禁止使用疫苗注意事項1.疫苗使用時先搖勻再潑灑；2.疫苗浸泡期間注意增氧；3.整個操作應盡量小心，避免魚體受傷保存，運輸及有效期疫苗在0-4'C保存或放于陰涼通風處避光保存。運輸時輕拿輕放；有效期半年。實施例3本發(fā)明疫苗制劑(粉劑)的制備及使用方法1.疫苗的制備(1)菌種復蘇在無菌條件下，取4'C條件下保存的菌種用接種環(huán)從菌種管中挑取少量細菌接種到10mlTSB肉湯，將接種后的肉湯放入水浴振蕩器中，28°C，110r/min，振蕩培養(yǎng)24h。(2)菌液增殖培養(yǎng)①初級培養(yǎng)把復蘇培養(yǎng)的菌液10ml接種再次分別接種500mlTSB肉湯，將接種后的肉湯放入水浴振蕩器中，28°C，110r/min，振蕩培養(yǎng)24h。②菌液次級培養(yǎng)將次級培養(yǎng)的TSB肉湯均勻的涂布在制備好的普通營養(yǎng)瓊脂平板上，將涂布好的普通平板放入28'C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h(注意培養(yǎng)時間以細菌苔長滿整個平板為度)；在無菌工作室，用滅菌的生理鹽水(0.85%NaCl)沖洗平板上生長的菌苔，將洗下的菌懸液置于滅菌的輸液瓶中。③洗脫菌液擴大培養(yǎng)將從平板上洗脫的菌液按每10ml接種200mlTSB肉湯，進行菌液的擴大培養(yǎng)，28°C，110r/min，振蕩培養(yǎng)24h。得到高濃度細菌懸液。(3)菌液的計數(shù)對增殖培養(yǎng)后的菌液采用平板稀釋細菌計數(shù)方法進行計數(shù)①選取大小一致的平板清洗高壓滅菌后，制備普通營養(yǎng)瓊脂平板備用；18②無菌操作將在菌苗制備過程中取的菌液進行倍比(10n)稀釋備用；③將稀釋的菌液取0.1mL涂布瓊脂平板，28"C，恒溫箱中培養(yǎng)24小時，計數(shù)菌落個數(shù)；選擇平均菌落數(shù)在30-300個之間稀釋度的平板，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，則為該菌樣的細菌總數(shù)。菌落數(shù)x稀釋度xlO:細菌總數(shù)⑤疫苗中含有的細菌數(shù)合適的濃度為108-101QCFU/ml。(4)菌液的滅活對擴大培養(yǎng)的菌液，按體積比例添加4-6%。的甲醛，放入水浴振蕩器中，28°C，110r/min，振蕩36h滅活。(5)滅活效果檢查滅活后的菌懸液每次需進行滅活效果的檢查，在無菌操作下用接種環(huán)挑取少量滅活的菌苗在TSA平板上劃線，將劃線后的血平置于入28。C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，檢查有無細菌生長，若有細菌生長需再進行滅活處理，若無細菌生長則進行下面的操作程序。(6)菌苗的分裝滅活完全的疫苗，無菌操作進行分裝，分裝量要均勻，厚度適宜，做到蒸發(fā)表面積盡量大以利于水分蒸發(fā)。2.福爾馬林滅活全菌疫苗粉劑的制備(1)冷凍干燥法將無菌操作條件下分裝好的福爾馬林滅活全菌疫苗水溶液，放入真空冷凍千燥機進行預凍，待預凍達到一定溫度時抽真空干燥。凍干結(jié)束后，充入干燥無菌的空氣進入干燥箱，然后盡快地進行加塞封口，以防重新吸收空氣中水分。(2)低溫烘干法將無菌條件下分裝好的福爾馬林滅活全菌疫苗水溶液在低溫條件下進行水分蒸發(fā)烘干，加入吸附劑沸石或硅藻土低溫烘干，烘干后的粉劑存放于無菌的玻璃瓶中。整個操作過程需在無菌條件下進行，烘干溫度不能太高以免影響抗原性。干燥后加入輔料可溶性淀粉，得到全菌苗粉劑。3、用法用量與實施例3相同綜上，本發(fā)明提供了一種全新的疫苗，為防治無鱗魚特別是大口鯰漬瘍癥提供了一種新的途徑，避免了農(nóng)藥的過度施用，是大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖實現(xiàn)安全、生態(tài)的一種有效方法，可以提高大口鯰的品質(zhì)，實現(xiàn)良好的經(jīng)濟效益。19<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>權(quán)利要求1、一種疫苗組合物，其特征是含有致免疫有效量的滅活的豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)，其產(chǎn)生相對分子量32KD的溶血素，及藥學上可接受的輔料或載體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征是所述的豚鼠氣單胞菌"erozno朋scwiae)是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗組合物，其特征是所述致免疫有效量為不低于1.7X107CFU/ml。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其特征是致免疫有效量為1.7X107CFU/ml7X109CFU/ml。5、一種疫苗組合物，其特征是含有致免疫有效量的由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的豚鼠氣單胞菌"eromo朋scaw'ae)菌株所產(chǎn)生的相對分子量為32KD的溶血素及佐劑，以及藥學上可接受的輔料或載體。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征是還含有由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的豚鼠氣單胞菌Uero，朋scaia'ae)菌株的福爾馬林滅活的單純性菌體。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征是所述菌體不低于1.7X107CFU/ml。8、根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的疫苗組合物，其特征是所述輔料或載體為水或吸附劑。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其特征是所述的水為生理鹽水或蒸餾水；吸附劑是沸石或硅藻土。10、一種聯(lián)合用藥物，包含權(quán)利要求1或5所述的疫苗組合物以及透皮吸收促進劑且任選一種或多種藥學上可接受的輔料或載體。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的聯(lián)合用藥物，其特征是所述透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。12、權(quán)利要求1、5或10所述的疫苗組合物或聯(lián)合用藥物在制備預防無鱗魚潰瘍癥的藥物中的用途。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征是所述的無鱗魚類是大口鯰。14、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用途，其特征是預防無鱗魚潰瘍癥的藥物是通過腹腔注射給藥的。15、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用途，其特征是預防無鱗魚潰瘍癥的藥物是通過浸泡的方式給藥的。16、一種豚鼠氣單胞菌UerofflonascaWae)，它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCCNO:M207146的菌株。全文摘要本發(fā)明涉及一種魚用疫苗，特別是由豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)制備的全菌疫苗或由其外毒素制備的疫苗，及其在魚病防治中的應用。所述菌株是從大口鯰病灶處分離得到，經(jīng)鑒定為豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)，命名為DKN-1，并于2007年9月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNOM207146。使用本疫苗后可刺激魚體產(chǎn)生抗?jié)兙C合癥的免疫力，增強抗病能力。文檔編號A61P17/00GK101496897SQ200810175279公開日2009年8月5日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2007年11月12日發(fā)明者匆劉,劉建平,劉海燕,汪開毓,羅遠會,毅耿,丹肖,陳德芳申請人:通威股份有限公司