專利名稱：：益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及益生菌對食用真菌多糖的抗腫瘤活性的影響，特別是涉及巴西菇多糖經腸道益生菌發(fā)酵，以提高和改善巴西菇多糖的抗腫瘤活性的方法。本發(fā)明進一步涉及巴西菇多糖提取物經腸道益生菌發(fā)酵后制得的發(fā)酵組合物，以及該發(fā)酵組合物在制備用于預防和治療腫瘤的保健品或藥品中的應用。許多研究都已證實，巴西菇所含多糖的抗腫瘤活性是靈芝等15種具有抗腫瘤活性的食用菌中抗腫瘤活性最高的。巴西菇的多糖，特別是低分子量多糖(io萬道爾頓以下)是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分。本發(fā)明的一個目的是提供巴西菇提取物經益生菌發(fā)酵處理后所得到的發(fā)酵產物。本發(fā)明中，由巴西菇提取物經益生菌發(fā)酵處理后得到的發(fā)酵產物常常被簡稱為發(fā)酵組合物。根據本發(fā)明，巴西菇發(fā)酵中所使用的益生菌選自雙歧桿菌和乳桿菌。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中用于發(fā)酵巴西菇的所說的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌；其中所說的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中用于發(fā)酵巴西菇的所說的雙歧桿菌最好選自兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌；其中所說的乳桿菌最好選自干酪乳桿菌和德氏乳桿菌。本發(fā)明的另一個目的是提供制備上述發(fā)酵組合物的方法，該方法包括利用超微粉碎技術，粉碎巴西菇細胞并使其細胞破壁，最大程度的獲取巴西菇的有效成分。以提取的巴西菇多糖或者直接以破壁巴西菇的菌粉作為發(fā)酵底物，接種預培養(yǎng)的各約O.5%(體積/體積)一種或兩種或兩種以上雙歧桿菌菌液。常規(guī)培養(yǎng)約26小時后，再次接種預培養(yǎng)的各約0.5%(體積/體積)的一種或兩種或兩種以上乳桿菌菌液，繼續(xù)發(fā)酵2022小時。當pH值降至4.0以下時，結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵組合物(參見實施例1和2)?！阏f來，制備益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵組合物時，巴西菇用量為每100ml培養(yǎng)物中含巴西燕菌粉2-20克。通常采用超微粉碎技術制備細胞破壁的巴西菇菌粉。以往，大多使用普通粉碎方法制備粗分散狀態(tài)的粉末，這樣有效成分的回收率往往較低，而且生物利用率也比較低。為了在大批量生產過程中最大限度地獲取有效成分，中藥制劑生產領域引入了超微粉碎技術。經過超微粉碎處理后的巴西菇粒度均勻、細密，并且細胞壁也被破碎，因而增加了菌粉的比表面積，從而更有利于藥物有效成分的溶出，大大增加了藥材有效成分的提取率。超微粉碎的破壁巴西菇菌粉粉碎細度在100目以上。可在由已破壁巴西菇構成的菌粉中，加入相當于巴西菇菌粉體積約30倍的純水，并浸泡30分鐘。然后于IO(TC下提取大約1小時。過濾后，再向殘渣中加入大約30倍的水，再次于IO(TC下提取1小時。過濾后，收集濾液，合并兩次提取液，并減壓濃縮至其中巴西菇的濃度為20%(重量/體積)，即得到所需的巴西菇多糖提取液。為了制備用于益生菌發(fā)酵的巴西菇多糖底物，可直接利用破壁的巴西菇菌粉，用量為每100ml培養(yǎng)物中含巴西菇菌粉2-20克，然后再加入葡萄糖0.5%(重量/體積)、無機鹽(硫酸亞鐵7H201.Omg/100ml、硫酸鋅7H204.4mg/100ml、亞硒酸鈉5H200.024mg/100ml、硫酸鎂*7H2070mg/100ml、硫酸錳*H200.5mg/100ml、氯化鈉1.Omg/100ml、磷酸二氫鉀100mg/100ml、磷酸氫二鉀3H20100mg/100ml)，調整pH7.0左右并115。C滅菌40分鐘后，即得到繼后用于益生菌發(fā)酵的巴西菇多糖底物?？衫蒙鲜龇椒ㄌ崛〉陌臀鞴蕉嗵翘崛∫海鳛橐嫔l(fā)酵培養(yǎng)底物，調整pH7.0左右并115t:滅菌40分鐘后，即得到繼后用于益生菌發(fā)酵的巴西菇多糖底物。當按上述方法制備的用于益生菌轉化發(fā)酵的巴西菇多糖底物滅菌后，溫度降至39°〇左右時，接種預培養(yǎng)的各約0.5%(體積/體積)一種或者兩種雙歧桿菌的菌液，常規(guī)培養(yǎng)約26小時后，再次接種預培養(yǎng)的各約0.5%(體積/體積)的一種或者兩種乳桿菌的菌液，繼續(xù)發(fā)酵2022小時。pH值降至4.0以下時結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵組合物(參見實施例1和2)。為了證明益生菌發(fā)酵處理，巴西菇對益生菌生長的影B向，我們實驗觀察了益生菌發(fā)酵處理巴西菇后，益生菌數目的變化。試驗結果表明，經與巴西菇一同發(fā)酵后，益生菌的菌體數目不低于MRS常規(guī)培養(yǎng)基中生長的益生菌數量(參見實施例3)。為了揭示益生菌發(fā)酵對巴西菇分子可能的化學修飾作用，我們的基礎研究實驗還證實，經益生菌發(fā)酵處理后，巴西菇底物溶液的特性粘度[n]明顯降低。這一結果提示，經益生菌發(fā)酵處理后，由于巴西菇多糖分子的裂解，致使多糖分子數目顯著增加，并且多糖的平均分子量減小(參見實施例4)。發(fā)明的再一個目的是提供本發(fā)明的發(fā)酵組合物在提高機體免疫力、預防和治療腫瘤的藥物或者保健品中應用。為檢測本發(fā)明的益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵組合物與未通過益生菌轉化發(fā)酵的巴西菇多糖的抑瘤效果，兩試驗樣品直接投用于攜帶實驗性S18。肉瘤的動物腫瘤模型。經過益生菌發(fā)酵轉化的巴西菇多糖，均對腫瘤具有明顯的抑制作用，高、中、低三個劑量組對小鼠S180的抑瘤率分別為53.71%、38.2%和0.26%。而未經益生菌發(fā)酵轉化的巴西菇多糖，高、中、低三個劑量組對小鼠S180的抑瘤率分別為38.90%、0.69%、-0.37%。可見，經過益生菌轉化發(fā)酵后，巴西菇多糖的抑瘤作用得到明顯的提高(具體見實施例5)。雖然有關機理尚不明了，但這一研究結果證明，巴西菇多糖或其他真菌多糖在腸道有益菌群的體外作用下，經過某些已知或未知的化學修飾或生物轉化后，更利于人體吸收利用，發(fā)揮了更高的生物學功能(參見實施例5)。經體外細胞學和體內動物實驗證實，本發(fā)明的修飾的抗原肽可有效地促進t淋巴細胞和乳腺癌特異性ctl的增殖，激發(fā)免疫系統對瘤細胞的殺傷活性，從而達到抑制腫瘤生長的目的。特別是我們的比較實驗顯示，與野生型序列相比，本發(fā)明修飾的抗原肽能夠更有效地促進t細胞的增殖，提高t細胞分泌ifn-y的能力，從而提高了ctl對腫瘤細胞的殺傷活性。雖然本發(fā)明以巴西菇為例說明巴西菇經益生菌發(fā)酵處理后，顯著改善了巴西菇的生物學活性，特別是其抗腫瘤活性，但本領域技術人員可以理解到，益生菌發(fā)酵處理同樣也適用于發(fā)酵處理包括金針菇、香菇、靈芝等在內的其他真菌。具體實施例方式實施例1:益生菌發(fā)酵巴西菇多糖的發(fā)酵組合物的制備取干燥的巴西菇，采用細胞破壁技術粉碎至孢子破壁(巴西菇菌粉粉碎細度在100目以上)。向巴西菇菌粉中加入相當于菌粉體積30倍的純水浸泡30分鐘，并于10(TC提取1小時后過濾。再向濾渣中加30倍的水，IO(TC提取1小時，再次過濾后，合并兩次提取液，并減壓濃縮至含巴西菇的濃度為20%(重量/體積)，即為巴西菇多糖提取液。將巴西菇多糖提取液115t:下加熱40分鐘滅菌。當溫度降至39t:左右時，接入預培養(yǎng)好的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌液，接種量均為0.5%(體積/體積)。發(fā)酵6小時后，再接入預培養(yǎng)的德氏乳桿菌、干酪乳桿菌菌液各0.5%(體積/體積)。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37t:左右，繼續(xù)發(fā)酵2022小時。pH值降至4.0以下時，結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵巴西菇多糖的發(fā)酵組合物。實施例2:益生菌發(fā)酵巴西菇菌粉的發(fā)酵組合物的制備取干燥的巴西菇，采用細胞破壁技術，粉碎，顯微鏡鏡檢，孢子已破壁。要求巴西菇粉能通過100目篩，用量為每100ml培養(yǎng)物中含巴西菇菌粉2克，再加入葡萄糖0.5X(重量/體積)、無機鹽(硫酸亞鐵7H201.Omg/100ml、硫酸鋅7H204.4mg/100ml、亞硒酸鈉5H200.024mg/100ml、硫酸鎂7H2070mg/100ml、硫酸錳H200.5mg/100ml、氯化鈉1.Omg/100ml、磷酸二氫鉀100mg/100ml、磷酸氫二鉀*3H20100mg/100ml)，調整pH7.0左右并115t:滅菌40分鐘。當溫度降至39t:左右時，接入預培養(yǎng)好的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液，接種量均為0.5%(體積/體積)。發(fā)酵6小時后再接入預培養(yǎng)的德氏乳桿菌和干酪乳桿菌菌液，接種量均為0.5%(體積/體積)。37t:繼續(xù)發(fā)酵2022小時，當pH值降至4.0以下時，結束發(fā)酵，得到益生菌發(fā)酵巴西菇菌粉的發(fā)酵組合物。實施例3:益生菌在巴西菇多糖提取液和巴西菇菌粉底物中的發(fā)酵生長情況在按照實施例1和2制備的培養(yǎng)基中，接種兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液(接種量同前所述)，發(fā)酵6小時后，取樣檢測發(fā)酵菌菌體數目。然后再接入預培養(yǎng)的德氏乳桿菌和干酪乳桿菌菌液(接種量同前所述)，繼續(xù)培養(yǎng)至48小時。其中發(fā)酵第24、32和48小時取樣檢測菌數。按照同樣操作步驟接種MRS培養(yǎng)基，作為對照。檢測按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》GB/T4789.34-2003中所述的方法進行。檢測結果如表1所示。表1:益生菌在巴西菇培養(yǎng)基中的生長菌數發(fā)酵時間益生菌發(fā)酵巴西竊多糖菌數益生菌發(fā)酵巴西菇粉菌數MRS培養(yǎng)基6小時6.5X107cfu/ml3.5X107cfu/ml3.0X107cfu/ml24小時3.2X108cfu/ml1.8X108cfu/ml1.3X108cfu/ml32小時3.0X108cfu/ml1.4X108cfu/ml1.lX108cfu/ml48小時3.0X108cfu/ml1.3X108cfu/ml1.0X108cfu/ml從表1可以看出，同常規(guī)的MRS培養(yǎng)基比較，人體益生菌雙歧桿菌、乳桿菌在巴西菇多糖和巴西菇菌粉為培養(yǎng)基的環(huán)境中生長良好，均能夠達到每毫升含菌體量1億個(108)以上。并且，發(fā)酵生長24小時后菌數達到最高，如繼續(xù)培養(yǎng)則菌體數目逐漸降低。該實驗表明，益生菌在生長過程中，可以分解代謝巴西菇多糖，獲得較好的生長。繼續(xù)培養(yǎng)，由于代謝物的累積和營養(yǎng)物的減少，活菌數量不斷減少。實施例4:粘度法檢測巴西菇多糖益生菌發(fā)酵前后平均分子量的變化巴西菇多糖是一種具有良好抗腫瘤活性的真菌多糖，經過益生菌發(fā)酵后，其抑瘤作用明顯提高。多糖的理化性質尤其是生理活性與其分子量與分布有關。為此，本發(fā)明人6利用粘度法，測定了益生菌發(fā)酵前后巴西菇多糖的相對分子量變化。根據試驗，在足夠稀的溶液中當多糖、溶劑、溫度等確定以后，[n](稱為特性粘度)值只與高聚物的相對分子質量M有關。用半經驗的麥克非線性方程來求得特性粘度值[n]:[n]=KM°式中M—一多糖相對分子質量的平均值；K——比例常數；a—一與高聚物在溶液中的形態(tài)有關的經驗。配制5種不同濃度的樣品溶液，測出各濃度的相對粘度l，利用硫酸-苯酚法檢測檢測巴西菇多糖的含量。發(fā)酵的巴西菇多糖樣品為原濃度，發(fā)酵的巴西菇菌粉發(fā)酵液濃縮10倍，以未發(fā)酵的巴西菇多糖為對照。三個樣品的檢測結果如表2。n「i/c對濃度c作圖，將直線外推，與Y軸的交點為[n]。結果如下列表2所示。表2:巴西燕多糖三個樣品檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表2所示的特性粘度[n]可以看出，巴西菇多糖和巴西菇菌粉經過益生菌發(fā)酵后，其數值明顯減小。根據公式[n]二KMa，[n]值越大，多糖的相對分子量M就越大。因此可以推斷，巴西菇多糖經過益生菌發(fā)酵后，分子被裂解，導致其相對分子量明顯減小。實施例5:益生菌發(fā)酵巴西菇多糖的發(fā)酵組合物與未發(fā)酵的巴西菇多糖抗腫瘤活性比較本實施例利用腫瘤動物模型，舉例描述巴西菇多糖提取物在經腸道益生菌體外發(fā)酵轉化后生物學活性的改善。取實施例1制備的巴西菇多糖提取液樣品，平均分成兩份。一份進行益生菌發(fā)酵，另一份不進行發(fā)酵。發(fā)酵完成后，將兩份樣品減壓濃縮至原體積的一半。然后用硫酸苯酚法(食品科學，2004，25巻，7期，"姬松茸多糖的測定")測定發(fā)酵和未發(fā)酵樣品的多糖含量。結果可見，巴西菇多糖發(fā)酵樣品中，多糖含量為35.lmg/ml，而未發(fā)酵樣品的多糖含量為31.8mg/ml。取平均體重為18-22g的70只昆明種小白鼠隨機分7組，每組10只。第1組為生理鹽水組(空白對照)，動物只接受生理鹽水O.6ml;第2、3、4、組為巴西菇未發(fā)酵樣品大、中、小劑量組，給藥劑量分別為0.8g/kg、0.4g/kg和0.2g/kg;第5、6、7組為巴西菇發(fā)酵樣品大、中、小劑量組，劑量分別為0.8g/kg、0.4g/kg和0.2g/kg。每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥7天。第8天，無菌條件下取荷瘤動物生長良好無潰破的實體瘤塊，用剪刀剪成小碎塊，按瘤塊(g):生理鹽水(ml)為1:3的比例，用玻璃勻漿器研磨成勻漿，計數每毫升漿液中的瘤細胞數。給每只小鼠腋窩下接種2X106細胞懸液0.2ml，接種后繼續(xù)給藥10天。第11日斷頸處死動物，稱體重和瘤重，按下列公式計算腫瘤生長抑制率(％)。陰性對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重腫瘤生長抑制率(％)=-xioo陰性對照組平均瘤重本動物治療實驗中，抑瘤率大于30%視為被試樣品對所說的腫瘤具有抗腫瘤(或腫瘤抑制)活性，而抑瘤率小于30%則視為無抗腫瘤(或腫瘤抑制)活性。每批實驗動物要求同一性別(雄)。實驗結果如下列表3所示。表3:姬松茸對小鼠S180(實體瘤)體內抑瘤作用結果組別動物數(只)體重(g)藥前藥后瘤重(g)抑瘤率(％)NS組1220.766±1.80833.314±5.2041.882±0.857一-未發(fā)酵樣品大1220.667±1.85237.122±2.3941.150±0.513'38.90未發(fā)酵樣品中1220.778±1.78937.756±3.234l.腳土l.1030.69未發(fā)酵樣品小1221.112±1.86538.828±3.4931.889±1.446-0.37發(fā)酵樣品(大)1220.712±1.84835.900±3.2500.871±0.451*53.71發(fā)酵樣品(中)1220.678±1.57235.525±3.0451.162±0.652*38.2發(fā)酵樣品(小)1220.978±1.76335.400±3.1381.877±0.720.26注與陰性對照組比*P<0.05**P<0.01從本試驗的結果中可以看出，巴西菇多糖經過益生菌發(fā)酵轉化后，其各劑量組抑瘤作用明顯高于未發(fā)酵組，推測可能巴西菇多糖經過益生菌的作用，益生菌產生的酶類將姬松茸的大分子量的多糖長鏈水解為小分子的、具有更強抗腫瘤活性的多糖片段，從而增加了巴西菇多糖中發(fā)揮抑瘤作用的活性成分，提高了巴西菇多糖的抑瘤作用。權利要求一種益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵培養(yǎng)組合物，其特征在于該發(fā)酵組合物是在巴西菇多糖提取物中加入選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的兩種或兩種以上的雙歧桿菌，以及選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的兩種或兩種以上的乳桿菌，一同發(fā)酵得到的。2.生產根據權利要求l的發(fā)酵培養(yǎng)組合物的方法，該方法包括利用超微粉碎技術粉碎巴西菇至孢子破壁，然后用IO(TC熱水提取巴西菇多糖，并以所提取的巴西菇多糖作為發(fā)酵底物，接種預培養(yǎng)的各約0.5%(體積/體積)兩種或者兩種以上的雙歧桿菌菌液，常規(guī)培養(yǎng)約26小時后，再次接種預培養(yǎng)的各約0.5%(體積/體積)的兩種或者兩種以上的乳桿菌菌液，37t:繼續(xù)發(fā)酵2022小時，當pH值降至4.0以下時結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵巴西菇的發(fā)酵培養(yǎng)組合物。3.根據權利要求2的方法，其中用于益生菌發(fā)酵的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌，并且用于益生菌發(fā)酵的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。4.根據權利要求2的方法，其中用于益生菌發(fā)酵的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌，并且用于益生菌發(fā)酵的乳桿菌選自干酪乳桿菌和德氏乳桿菌。5.根據權利要求l的發(fā)酵培養(yǎng)組合物在生產用于提高機體免疫力、預防和治療腫瘤的藥物或者保健品中應用。全文摘要本發(fā)明涉及益生菌對食用巴西菇多糖的抗腫瘤活性的影響，特別是涉及巴西菇多糖經腸道益生菌發(fā)酵，以提高和改善巴西菇多糖的抗腫瘤活性的方法。本發(fā)明進一步涉及巴西菇多糖提取物經腸道益生菌發(fā)酵后制得的發(fā)酵組合物，以及該發(fā)酵組合物在制備用于預防和治療腫瘤的保健品或藥品中的應用。文檔編號A61K36/06GK101711775SQ200810157419公開日2010年5月26日申請日期2008年10月8日優(yōu)先權日2008年10月8日發(fā)明者孫筱林,褚新紅申請人:吳炳新