專利名稱：新的甾族化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，并打算制備化合物和藥物組合物用于調(diào)節(jié)哺乳動物腦的興奮性，該調(diào)節(jié)作用是通過γ-氨基丁酸受體-氯離子載體(GABAA-R)復(fù)合物和其它直接或間接與GABAA-R復(fù)合物相關(guān)的神經(jīng)介質(zhì)系統(tǒng)進行的。已發(fā)現(xiàn)多種甾族化合物具有有效的GABA信號調(diào)節(jié)和激發(fā)作用，從而表現(xiàn)出各種生理學(xué)作用。包括3α-羥基-5α/β-孕烷-20-酮/醇或雄烷-17-酮/醇結(jié)構(gòu)的甾族化合物，顯示出特異性GABA-A{γ-氨基丁酸(A)}受體增強作用。表I已經(jīng)列出了3α-羥基-5α/β-孕烷類甾族化合物實施例。這些甾族化合物中的一些化合物十分有效，例如它們在高藥理學(xué)劑量下表現(xiàn)出誘導(dǎo)麻醉的作用。由于上述的這些性質(zhì)，這些自然產(chǎn)生的壓力甾體激素和性甾體激素具有副作用并引起一定的病癥。3α-羥基-孕烷-20-酮/醇和雄烷-17-酮/醇-甾族化合物的副作用正是它們所引發(fā)的CNS負面影響的基礎(chǔ)。
早期已經(jīng)公開了某些3β-羥基孕烷酮類化合物可以阻斷這些有副作用的壓力或性甾體激素對大腦的不良影響。但是早期發(fā)現(xiàn)的化合物所存在的問題是，它們關(guān)鍵的3位在體內(nèi)易于被代謝并且這些化合物難溶于水。
由于這些3α-羥基-孕烷-甾族化合物在體內(nèi)生成而且是生命所必需甾族化合物激素的代謝物，所以它們的生成很難被阻止。在急性或慢性應(yīng)激反應(yīng)時，月經(jīng)周期的黃體期以及妊娠時，人體會持續(xù)幾天到幾周產(chǎn)生大量的上述甾族化合物。大腦也會生成這些化合物。因此需要特異性阻斷劑用作治療。
由于GABAA-R復(fù)合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，該受體位點的直接作用機理還沒有被完全闡明。GABA受體家族包括幾個亞基成分，它們中的一些亞基已知與CNS的特異性功能和病癥有關(guān)。本發(fā)明的一個目的就是找到一種新的化合物用于治療GABA受體或者其它與GABA受體有關(guān)的神經(jīng)介質(zhì)的不規(guī)則興奮，一定程度上這些化合物對一些亞基和功能有廣譜性或特異性。內(nèi)源性3α-羥基-5α甾族化合物或者3α-羥基-5β甾族化合物作用于GABA-A受體所引起的病癥已經(jīng)很好地被人們所描述和理解。同時人們也認識到，在接觸人體以后3α-羥基-5α/β-甾族化合物可以誘發(fā)人體對它們本身和其它類似化合物的耐藥性，以及3α-羥基-5α/β-甾族化合物停止給藥后的戒斷反應(yīng)。下面將對此作進一步闡述。
總之，人們已經(jīng)認識到3α-羥基-Δ4-5，5α/β-甾族化合物可以通過如下所述三種可能的機理引起CNS功能障礙a)直接作用，b)誘導(dǎo)耐藥性，和c)戒斷反應(yīng)。本發(fā)明所述化合物屬于孕烷-，孕烯-，雄烷-，雄烯-系列甾族化合物，具有適宜的附加功能。這些化合物可以單獨使用或用作前藥和/或與制劑和其它組分聯(lián)合使用，用于增強或調(diào)節(jié)對CNS作用。本發(fā)明領(lǐng)域所述組合物包括所有組合物，只要它們中含有有效量的本發(fā)明化合物從而達到預(yù)期目的。
3α-羥基-孕烷(孕烯)/雄烷-甾族化合物引起的疾病 a)直接作用 現(xiàn)在已經(jīng)確認3α-羥基-5α/β-甾族化合物可以直接引起CNS功能的障礙。由3α-羥基-5α/β-甾族化合物通過直接作用引起的障礙和癥狀的例子有月經(jīng)前焦慮障礙，月經(jīng)前期綜合征，癡呆，阿爾茨海默(氏)病，鎮(zhèn)靜作用，疲勞，慢性疲乏綜合征，記憶障礙，學(xué)習(xí)障礙，運動功能障礙，骨折，笨拙，胃口和食欲增加，肥胖癥，酗酒和濫用藥物癥狀的復(fù)發(fā)，緊張、易怒和抑郁等負面情緒的產(chǎn)生，聽力和視力的減退，癲癇小發(fā)作的惡化，心身耗竭綜合征。
b)耐藥性 持續(xù)、長期地與3α-羥基-5α/β-甾族化合物接觸會導(dǎo)致GABA-A受體系統(tǒng)的機能障礙。一種耐藥性從而產(chǎn)生并且這種耐藥性是最終導(dǎo)致壓力敏感性，難以專心，和沖動控制喪失以及抑郁的疾病過程的初期階段。3α-羥基-5α/β-甾族化合物的作用已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是增強藥物依賴性的一個因素。下面是進一步研究的重點 c)戒斷 如果身體持續(xù)、短期地與3α-羥基-5α/β-甾族化合物接觸，當(dāng)這種接觸結(jié)束后會導(dǎo)致戒斷反應(yīng)。也就是說，這一現(xiàn)象會在月經(jīng)期卵巢黃體生產(chǎn)3α-羥基-5α/β-甾族化合物的過程被打斷時發(fā)生。這種停藥現(xiàn)象同樣會發(fā)生在生育期間(產(chǎn)后)，這時胎盤生成3α-羥基-5α/β-甾族化合物被阻斷。當(dāng)一個時期的壓力結(jié)束后，也可以觀察到同樣的現(xiàn)象。作為對壓力的反應(yīng)，腎上腺會合成3α-羥基-5α/β-甾族化合物。當(dāng)這一生成被阻斷后，停藥癥狀也有可能會發(fā)生。被這種停藥/戒斷現(xiàn)象所影響的病癥例子是部分性癲癇，這種病的患者在大腦皮層有一個癲癇病灶，當(dāng)月經(jīng)期停藥時病癥會加重。這種現(xiàn)象稱為“經(jīng)期性癲癇”。
其它的例子有月經(jīng)相關(guān)的偏頭痛和壓力相關(guān)的偏頭痛，產(chǎn)后情緒變化和周末頭痛。戒斷是耐藥性發(fā)生初期的一個征兆。
從上述內(nèi)容可以清楚地看出甾族化合物是重要的候選藥物。但是自然生成的甾族化合物易于在體內(nèi)被劇烈代謝，因此通常不適用于口服。其它的給藥途徑的代謝作用也十分強烈，所以這類化合物用作藥物或治療是不可能的，因為這類化合物的活性部分首先會被代謝作用破壞。
甾族化合物的第二個問題是它們難溶于水，因而難以通過體內(nèi)給藥。
上述和其他問題在本發(fā)明的化合物中得到解決。
發(fā)明概述 在描述本發(fā)明前，需要了解的是在此處所使用的術(shù)語僅僅是為了描述的具體化并沒有用此進行限制，因為本發(fā)明領(lǐng)域?qū)H通過所附加的權(quán)利要求和它的同等物進行限制。
特別地，必須認識到，在說明書和所附的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”同樣包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文明確指出了其它青形。
在以下描述中，在“甾族化合物相關(guān)疾病”中的術(shù)語“甾族化合物相關(guān)的”和“甾族化合物引起的”意味著包含三種甾族化合物作用于神經(jīng)系統(tǒng)可能的機制，a)直接作用，b)誘導(dǎo)耐藥性，c)戒斷反應(yīng)。這些病癥的例子在上文中已經(jīng)給出，但是這些例子僅僅是為了說明每個機理，并不意味著對本發(fā)明進行限定。
術(shù)語“阻斷”被認為是定義了一種作用，其中3α-羥基-5α/β-甾族化合物對GABA-R受體的作用被阻止。需要了解的是“阻斷”與“調(diào)節(jié)”或“抑制”或相類似的術(shù)語所表達的含義完全不同，后面這些術(shù)語暗示作用仍然發(fā)生，僅僅是范圍更小或速度更慢。
術(shù)語“藥物組合物”使用它最寬的含義，它包括所有的藥學(xué)上可用的含有至少一種活性物質(zhì)的組合物，和可選擇的載體，輔料，組分等。術(shù)語“藥物組合物”同樣包括一種含有所述活性物質(zhì)的衍生物或前藥形式的組合物，比如藥學(xué)可接受鹽，硫酸鹽和酯類形式。不同給藥途徑藥物組合物的生產(chǎn)都落入到化學(xué)制劑領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
術(shù)語“給藥”和“給藥方式”以及“給藥途徑”都是用它們最寬的含義。本發(fā)明藥物組合物的給藥方法可以有許多種，主要取決于這種局部、表面或系統(tǒng)的給藥方式是否是最適合需要治療的病癥。這些不同給藥方式的例子有表面(比如經(jīng)皮)，局部(包括通過眼和各種粘膜比如陰道和直腸遞送)，口服或腸道外給藥和肺部給藥，包括上下呼吸道。
所述組合物的制備和劑型對于藥學(xué)和制劑領(lǐng)域技術(shù)的人員來說是已知的，并可以用于本發(fā)明的組合物的形成。
術(shù)語“拮抗劑”表示一種物質(zhì)阻礙其它物質(zhì)，如激動劑，從而誘發(fā)它自己的作用。本申請中的術(shù)語拮抗劑和阻斷劑同時使用。
本發(fā)明者們合成了一類新的甾族化合物，它們在甾核的3-位得到保護避免被代謝。它們通過改變結(jié)構(gòu)特征從而極大地提高了水溶性，比如在前面提及的孕烷、孕烯、雄烷和雄烯系列的甾體母核上加入雙鍵，以及在20、21或17位上用肟基來代替酮基。
總之，3α-羥基-Δ4-5，5α/β-甾族化合物現(xiàn)在被認識到通過如上所述三種可能的機理引起CNS功能障礙a)直接作用，b)誘導(dǎo)耐藥性，c)戒斷反應(yīng)。本發(fā)明所述化合物屬于孕烷-、孕烯-、雄烷-、雄烯-系列甾族化合物，具有適宜的附加功能。這些化合物可以單獨使用或用作前藥并且/或者與制劑和其它組分聯(lián)合使用，用于增強或調(diào)節(jié)對CNS作用。本發(fā)明領(lǐng)域所述組合物包括所有組合物，只要它們中含有有效量的本發(fā)明化合物從而達到預(yù)期目的。
據(jù)本發(fā)明人的了解，這是首次發(fā)明抗代謝作用增強和水溶性增加的甾族化合物。此外，根據(jù)權(quán)利要求以及此處所結(jié)合的參考文獻，這些物質(zhì)現(xiàn)在可用于制備治療許多特異性的甾族化合物引起或相關(guān)的CNS功能障礙的藥物制劑，同時也可用于治療方法。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及具有抗代謝作用和水溶性增加的新化合物，和生產(chǎn)對能引起CNS功能障礙的3α-羥基-孕烷(孕烯)-甾族化合物具有拮抗和阻斷作用的化合物的方法。本發(fā)明始于發(fā)現(xiàn)式I或II所表示的甾族化合物具有GABA受體信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)器的作用，它們可以用作激動劑、拮抗劑或反向激動劑。
3位叔醇基團的存在顯示能通過防止體內(nèi)代謝氧化或分解作用，延長甾族化合物在人體內(nèi)半衰期。鍵合于甾體分子D環(huán)的氫鍵受體/供體基團的存在對甾族化合物調(diào)節(jié)GABA信號傳導(dǎo)的能力有很大的影響。
本發(fā)明涉及式I或II所表示的甾族化合物或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物
其中 R1為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子； R2為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子； R3為5α-或者5β-H； R4為硝基，羥基，所述羥基呈游離形式或者與酯、醚、糖鍵合；且 R5為質(zhì)子。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，這些化合物為上述式I或II所表示的甾族化合物，和其藥學(xué)可接受衍生物、鹽、前藥或溶劑化物，其中 R4、R5為O或肟＝NOH形式的N，或者碳環(huán)或雜環(huán)。
R6為甲基、烷基或者-CH2OR，其中R為H、羧酸殘基、烷基基團或糖類；-CH2X，其中X為氟或其它鹵素； R7、R10為位于7位的OH、CH3或H。
R8、R9或者R11、R12表示兩個Me-基團，或分別代表Me-和H，或者是兩個-H。
根據(jù)一個實施方案，R7、R10為位于7位的OH或CH3。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，這些化合物為上述式I所表示的甾族化合物或其藥學(xué)可接受鹽，其中R1為乙炔基；羥基，所述羥基呈游離形式或與羧酸殘基結(jié)合；氟；或質(zhì)子；R2為乙炔基；羥基，所述羥基呈游離形式或與羧酸殘基結(jié)合；氟；或質(zhì)子；R3為5α-或者5β-H；R4為羥基，且R5為質(zhì)子，或者R4、R5一起是O或肟＝NOH形式的N；R6為甲基；R7為H；且R8＝R9＝甲基或H。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，這些化合物為上述式II所表示的甾族化合物或其藥學(xué)可接受鹽，其中R1為乙炔基或者羥基；R2為乙炔基或者羥基；R3為5α-或者5β-H；R4，R5一起是O或肟＝NOH形式的N；R10為H；且R11＝R12＝H。
根據(jù)其中一個實施方案，不飽和鍵可以位于C4-C5或C5-C6之間或者分子的其它位置。R8、R9或者R11、R12表示兩個Me-基團，或者分別表示Me-和H，或者兩個-H，或者如果上述不飽和鍵位于C4-C5之間，則R8、R9或者R11、R12其中之一分別為Me-或H，而另一個不存在。根據(jù)該實施方案的一個方面，這些化合物為上述式I所表示的甾族化合物，其中R1為乙炔基或者羥基；R2為乙炔基或者羥基；R3不存在；R4為羥基；R5為質(zhì)子；或者R4，R5一起是＝O或肟＝NOH形式的N；R6為甲基；R7為H；且R8、R11為甲基或H；R9、R12為甲基，H，或者，如果所述不飽和鍵在C4-C5之間，則不存在。
一些式I和II的化合物可以存在旋光異構(gòu)體；本發(fā)明包括可以通過常用的色譜技術(shù)以及其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分離方法分離獲得的單個異構(gòu)體。
本發(fā)明也包括所有功能相當(dāng)?shù)难苌锖颓八?，其中酯類和醚類被加到甾族化合物的羥基基團上。合適的衍生物例子包括，但不限于，硫酸酯，甲酸酯，乙酸酯，丙酸酯，同糖類或低聚糖的糖基化物，甲醇化物，乙醇化物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認識到其它不包括在上面列出例子中的官能團也可以被選擇使用。
表2和3公開了根據(jù)本發(fā)明所述一系列化合物的結(jié)構(gòu)的例子，它們通過將乙炔基、乙烯基或者乙酸酯結(jié)構(gòu)添加到這一甾族化合物分子的3-位上或者用氟原子代替羥基從而保護孕烷、孕烯、雄烷或雄烯類甾族化合物的3-羥基的位置不被代謝。
表2基于式I的具有代謝保護作用的新化合物

表3基于式II的具有代謝保護作用的新化合物
表4公開了與5-飽和化合物(US2024)相比水溶性增加的一系列化合物的結(jié)構(gòu)實例，它們是通過加入相對于酮基的肟基或簡單的羥基而增加其水溶性的，如UC2027、UC2029。
表4水溶性增加的新化合物實例

發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藥學(xué)上和實踐上適用劑量的具有3β位為乙炔基3α位為羥基和20位為酮基或羥基或21位為肟基平面結(jié)構(gòu)的甾族化合物可以抑制3α-羥基-5α/β-甾族化合物的體外作用，但是對GABA自身的效應(yīng)僅有十分弱的拮抗作用。因此這些化合物阻止了3α-羥基-5α/β-甾族化合物負面效應(yīng)的加劇，但是對GABA自身的作用僅有很小的影響。3α-羥基-5α/β-甾族化合物在CNS功能障礙的加劇過程中的作用機制以及3β-乙炔基-3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物和3β-乙炔基-3α-羥基-5α/β-雄烷-甾族化合物與3α-羥基-5α/β-甾族化合物的相互作用機制都已經(jīng)被發(fā)表出來。這些化合物的實例都已經(jīng)在表2和表3中給出。
此外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藥學(xué)上和實踐上適用劑量的甾族化合物能夠抑制GABA-甾族化合物對GABA介導(dǎo)的氯離子流量的作用，這些化合物在3位上有氟和/或在20或21位上有酮基或羥基基團。因此這些甾族化合物可以用作治療物質(zhì)，用于預(yù)防和/或治療GABA自身功能過度刺激引起的疾病如阿爾茨海默(氏)病。表2給出了這些化合物的實例。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些甾族化合物為拮抗物，可以拮抗3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用，但是對GABA自身在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的作用僅有十分弱的影響。令人驚訝的是，3α-羥基-孕烷-甾族化合物和表2/3和表4公開的這些甾族化合物的合并治療，可以抑制由3α-羥基-孕烷-甾族化合物引起的氯離子流量穿過HEK-細胞(人胚腎，HEK)中表達的人類GABA-A受體重組體，但是對GABA單獨誘導(dǎo)的氯離子流量卻僅有非常低的作用。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具有3β-乙炔基和3α-羥基的甾族化合物實際上為拮抗劑(見表4)。現(xiàn)在同樣發(fā)現(xiàn)有3α-氟的甾族化合物也對3α-羥基-孕烷甾族化合物有拮抗作用(見表5)。
本發(fā)明的一個優(yōu)點在于3β-乙炔基-3α-羥基-孕烷-20-酮或肟-甾族化合物，特別是3β-乙炔基-3α-羥基-Δ4-孕烯-20-酮，3β-乙炔基-3α-羥基-5α孕烷-20-酮-肟基，3β-乙炔基-3α-羥基-Δ4-孕烯-20-酮-肟基有效地拮抗3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的GABA-A受體調(diào)節(jié)作用，但是對GABA導(dǎo)致的GABA-A受體激活卻僅有很弱的影響。本發(fā)明一個特別的優(yōu)點在于這種阻斷作用可以以藥學(xué)和生理學(xué)合適的濃度達到。
本發(fā)明的一個令人驚訝的新發(fā)現(xiàn)是，可以通過同時給予藥學(xué)上和生理上可接受劑量的3β-氟-5β-孕烷-20-酮、3β-氟-5β-孕烷-20-(R)-醇、3β-氟-5β-孕烷-20-(S)-醇、3β-氟-5α-孕烷-20-(S)-酮和3α-氟-5α-孕烷-20-(S)-酮肟選擇性阻斷3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用，而對GABA卻僅有很小的影響作用。
本發(fā)明的另一個令人驚訝的新的優(yōu)點在于一些有雄烷骨架的甾族化合物可以通過與3β-乙炔基-3α-羥基-雄烷-17-酮、3β-乙炔基-3α-羥基-雄烷-17-酮-肟、3α-乙炔基-3β-羥基-雄烷-17-酮-肟同時給藥選擇性地阻斷3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用。一個特別的優(yōu)點在于這種阻斷作用可以通過藥學(xué)和生理學(xué)合適的濃度達到。
GABA-A受體為一種氯離子通道，而且這種GABA-A受體通過改變該通道中的氯離子內(nèi)向通量來產(chǎn)生它的作用。眾所周知，當(dāng)GABA-A受體打開大量的氯離子流入神經(jīng)元細胞，大腦中的神經(jīng)元活性就會降低。同時人們也認識到氯離子流入的量和GABA-A受體活性藥物的臨床作用之間存在著聯(lián)系。
苯二氮雜

類，巴比妥類和酒精的一些作用是通過上述機制來產(chǎn)生它們的作用。但是，這同時也是這些藥物產(chǎn)生副作用的原因。GABA-A受體的一個問題在于它的作用對大腦的大部分都有影響。因此GABA-A受體的完全阻斷劑是十分危險的并且可能會引起精神病癥狀和驚厥。當(dāng)要阻斷3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用時，希望使用一種能特異性拮抗3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用而不拮抗GABA自身作用的物質(zhì)。
本發(fā)明中用于檢驗甾族化合物的GABA-A受體為在HEK-細胞中穩(wěn)定重組表達的人類受體。這種受體包括三種不同的蛋白質(zhì)和mRNA，因為在上述實驗條件下受體亞基α1、β2、γ2L被表達。這三個GABA-A受體亞基在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見。這些GABA-A受體在體外表現(xiàn)的與它們在正常位置一樣，因此被本領(lǐng)域技術(shù)人員認為是GABA-A受體活性藥物作用于大腦的一個很好的體外試驗系統(tǒng)。氯離子通量通過氯離子通道是GABA-A受體上的GABA活性作用結(jié)果，而且GABA的這種作用可以被如3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物之類的GABA-A受體調(diào)節(jié)劑所加強。通過受體的氯離子流量可以通過膜片鉗技術(shù)測得。一個化合物的效能可以被測量，并且化合物之間可以通過規(guī)格化這些數(shù)據(jù)來比較它們的準確劑量，在本發(fā)明中劑量為10μm。
正如上面所討論過的，有很多癥狀和疾病同3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物相關(guān)，阻斷3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物的作用將會是正在談?wù)摰那樾蔚囊环N治療方法?，F(xiàn)在，本發(fā)明創(chuàng)造了可用于上述阻斷作用的有用物質(zhì)和治療方法。
發(fā)明人已經(jīng)確定了由3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物引起的疾病中作用機理。在本技術(shù)中已經(jīng)確定3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物通過三種可能的機制引起CNS功能障礙a)直接作用，b)誘導(dǎo)耐藥性，和c)戒斷反應(yīng)。
本發(fā)明總體上來說，發(fā)明人制備出有效的化合物能夠阻斷3α-羥基-孕烷-甾族化合物對GABA-A受體的作用但是不阻斷GABA的作用，以及對gGABA作用的部分拮抗劑。
本發(fā)明的另一個方面是包含一種化合物的藥物組合物，該化合物能阻斷3α-羥基-孕烷-甾族化合物對人體GABA-A受體的作用。這些化合物可以選自表4和5，并可以以合適且藥學(xué)可接受鹽的形式存在，如鈉鹽。
該組合物的成分可以依照正常的藥理學(xué)操作進行選擇或調(diào)整，它包括在化學(xué)形態(tài)方面藥學(xué)上有效的化合物，適用于選擇好的途徑，并同對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常用且熟知的適合輔料和載體結(jié)合。
口服給藥的常用輔料和載體舉例來說，可以是填充劑或懸浮劑，如二氧化鈦、乳酸、二氧化硅、膠態(tài)二氧化硅、甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素等等。
靜脈注射的常用輔料和載體舉例來說，可以是注射用水(WFI)，無菌緩沖液(如通過緩沖作用將溶液調(diào)至pH7，4)白蛋白溶液，脂質(zhì)溶液等等。
經(jīng)皮給藥的常用輔料和載體舉例來說，可以是凡士林、液體石蠟、甘油、水等等。
本發(fā)明的一個實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的化合物在制備用于緩解、預(yù)防或治療CNS障礙病癥特別是月經(jīng)前期綜合征的藥物組合物中的應(yīng)用，其中通過給予至少一種如本發(fā)明所述化合物來預(yù)防耐藥性的發(fā)生和GABA-A受體的下調(diào)。這一治療方法可以維持GABA-A系統(tǒng)的敏感性并在黃體期阻止發(fā)生敏感度的降低。在長期黃體酮治療中，大鼠體內(nèi)已經(jīng)顯示出GABA-A受體的變化。本發(fā)明使用3β-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物或3β-硫酸酯-5α/β-孕烷/孕烯-甾族化合物進行了治療，它顯示可以預(yù)防耐藥性的發(fā)生，因此當(dāng)停止給予3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物后可以阻止戒斷反應(yīng)。
耐藥性的發(fā)生將會降低如3α-羥基-5α-孕烷-20-酮或苯二氮

類化合物這種內(nèi)源性GABA-A增強物質(zhì)的敏感性。當(dāng)藥物迅速地停止使用，如在月經(jīng)周期的黃體期末期，在3α-羥基-5α-孕烷-甾族化合物停止給藥后反彈作用就會到來。在月經(jīng)期間緊隨著體內(nèi)停止生成和停止給予甾族化合物，發(fā)現(xiàn)人的偏頭痛和癲癇性發(fā)作會增加。
3α-羥基-5α/β-甾族化合物的直接作用引起的病癥的例子有鎮(zhèn)靜作用，疲勞，慢性疲乏綜合征，記憶障礙，學(xué)習(xí)障礙，運動功能障礙，骨折，笨拙，胃口和食欲增加，肥胖癥，酗酒和濫用藥物癥狀的復(fù)發(fā)，緊張、易怒和抑郁等負面情緒的產(chǎn)生且這是月經(jīng)前期綜合征的主要癥狀，以及癲癇小發(fā)作的惡化。
在長期(數(shù)天)接觸3α-羥基-5α/β-甾族化合物后發(fā)生的耐藥性所引起的病癥有，例如壓力敏感性，難以專心，壓力或月經(jīng)周期相關(guān)的注意力不集中，睡眠障礙，疲勞，沖動控制的喪失和抑郁，記憶和學(xué)習(xí)障礙。3α-羥基-5α/β-甾族化合物同樣會增強藥物依賴性。根據(jù)本發(fā)明，可以通過給予至少一種選自表4或者表5的上述優(yōu)選甾族化合物來預(yù)防、緩解或治療這些條件或癥狀。最優(yōu)選的上述化合物以合適的且藥學(xué)可接受鹽的形式使用，最優(yōu)選鈉鹽。
如果身體持續(xù)、短期地與3α-羥基-5α/β-甾族化合物接觸，當(dāng)這種接觸結(jié)束后會導(dǎo)致戒斷反應(yīng)。這一現(xiàn)象會在月經(jīng)期卵巢黃體生產(chǎn)3α-羥基-5α/β-甾族化合物被阻斷時發(fā)生。這種停藥現(xiàn)象同樣會發(fā)生在生育期間(產(chǎn)后)，這時胎盤生成3α-羥基-5α/β-甾族化合物被阻斷。當(dāng)一個時期的壓力結(jié)束后，也可以注意到同樣的現(xiàn)象，此時在壓力期間腎上腺所合成的3α-羥基-5α/β-甾族化合例被阻斷。被這種停藥/脫癮現(xiàn)象所影響的病癥例子是部分性癲癇，這種病的患者在大腦皮層有一個癲癇病灶，當(dāng)月經(jīng)期停藥時病癥會加重。這種現(xiàn)象稱為“經(jīng)期性癲癇”。其它的例子有月經(jīng)相關(guān)的偏頭痛和壓力相關(guān)的偏頭痛、產(chǎn)后情緒變化。停藥現(xiàn)象是耐藥性發(fā)生初期的一個征兆。
被認為與甾類相關(guān)或甾類引起的這些疾病例子包括如下幾種癲癇，月經(jīng)周期依賴性癲癇，抑郁，壓力相關(guān)的抑郁，偏頭痛，疲勞尤其是與壓力有關(guān)的疲勞，月經(jīng)前期綜合征，月經(jīng)前期焦慮征，月經(jīng)周期相關(guān)的情緒波動，壓力相關(guān)的記憶力改變，月經(jīng)周期相關(guān)的注意力難以集中，月經(jīng)周期相關(guān)的睡眠障礙和疲勞。有可信的證據(jù)表明肥胖和食欲增加，以及酗酒或藥物濫用等一些平衡被打破的形式也是甾類引起或甾類誘發(fā)的。
因此本發(fā)明提供了化合物和用于治療、緩解或預(yù)防這些病癥的方法。
本發(fā)明的一個具體方案涉及如本發(fā)明所述化合物在制備用于緩解、預(yù)防或治療抗炎甾體副作用以及在患者中進行絕經(jīng)后治療的藥物組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明，可以通過給予至少一種選自表4或者表5的上述優(yōu)選甾族化合物來預(yù)防、緩解或治療這些情況或癥狀。最優(yōu)選的上述化合物以合適的且藥學(xué)可接受鹽的形式使用，最優(yōu)選鈉鹽。
本發(fā)明的一個實施方案涉及如本發(fā)明所述化合物在制備用于緩解、預(yù)防或治療口服避孕藥對患者副作用的藥物組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明，可以通過給予至少一種選自表4或者表5的上述優(yōu)選甾族化合物來預(yù)防、緩解或治療這些條件或癥狀。最優(yōu)選的上述化合物以合適的且藥學(xué)可接受鹽的形式使用，最優(yōu)選鈉鹽。
因而，本發(fā)明的一個特殊實施方案是一種藥物組合物，它包含一種口服避孕藥和至少一種能夠阻斷3α-羥基-孕烷-甾族化合物對人類GABA-A受體作用的治療合適劑量的化合物，其中上述化合物優(yōu)選自表4或者表5中的化合物。最優(yōu)選的上述化合物以合適的且藥學(xué)可接受鹽的形式使用，最優(yōu)選鈉鹽。
更進一步的，在上面的實施方案中，一些能夠阻斷3α-羥基-孕烷-甾族化合物對人類GABA-A受體作用的化合物的劑量優(yōu)選同在壓力或月經(jīng)期間內(nèi)源性甾類的濃度相一致。根據(jù)本發(fā)明，能夠阻斷3α-羥基-孕烷-甾族化合物對人類GABA-A受體作用的化合物可以同口服避孕藥合用以緩解或消除口服避孕藥的副作用，或者緩解或消除內(nèi)源性甾族化合物的周期性變化的不利作用。
大體上，本發(fā)明包括3β-乙炔基-3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物、3β-乙炔基-3α-羥基-5α/β-雄烷-甾族化合物或3β-氟-5α/β-孕烷-甾族化合物單獨或聯(lián)合用于制備治療或預(yù)防發(fā)明書所述任一3α-羥基-5α/β-孕烷-甾族化合物相關(guān)或引起的疾病的藥物組合物中的用途，尤其是一種或幾種下列的疾病癲癇，月經(jīng)周期依賴性癲癇，抑郁，壓力相關(guān)的抑郁，偏頭痛，疲勞尤其是與壓力有關(guān)的疲勞，月經(jīng)前期綜合征，月經(jīng)前期焦慮征，月經(jīng)周期相關(guān)的情緒波動，月經(jīng)周期相關(guān)的的記憶力改變，壓力相關(guān)的記憶力改變，阿爾茨海默氏病，月經(jīng)周期相關(guān)的注意力難以集中，月經(jīng)周期相關(guān)的睡眠障礙和疲勞，胃口增加和肥胖，酗酒和藥物濫用的復(fù)發(fā)。優(yōu)選的上述藥物是以合適的且藥學(xué)可接受鹽的形式使用，最優(yōu)選鈉鹽。
本發(fā)明還涉及下述的與生物學(xué)評價有關(guān)的新細胞系。
如本發(fā)明所述化合物的合成、分離以及鑒定可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含乙炔基的格氏試劑同3、20/17二酮基甾族化合物的反應(yīng)對3位有高度選擇性并且不需要對其它酮基的官能團進行保護/脫保護。通過色譜方法和重結(jié)晶可以分離形成α和β異構(gòu)體。
本發(fā)明所述化合物的起始原料是3-羥基取代且在20或17位上有酮基的相應(yīng)甾族化合物。它們可以通過IBX試劑氧化轉(zhuǎn)化為各自的二酮。該反應(yīng)順利且轉(zhuǎn)化完全。需要時也可使用其它合適的甾族化合物作為起始原料。
這些反應(yīng)可以在合適的溶劑中實現(xiàn)，如甲醇、乙醇、水、THF、乙醚、二氯甲烷或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員認為合適的溶劑。
如果可能避免選擇使用甚至是微量也有毒性或在反應(yīng)條件中難以完全清除的試劑，如重金屬試劑。
涉及對空氣或水敏感的試劑或產(chǎn)品的反應(yīng)在如氮氣或氬氣等惰性氣體環(huán)境中進行，并有無水溶劑的存在。在二苯甲酮的存在條件下，乙醚和四氫呋喃通過Na進行干燥，。已用惰性氣體除去其它氣體的注射器用于轉(zhuǎn)移試劑和無水溶劑。通過使用合適的色譜技術(shù)如TLC或GC/MS來監(jiān)測產(chǎn)物的形成和原料的損耗從而決定該反應(yīng)優(yōu)選的時間和溫度。
利用如快速分離硅膠色譜法或通過HPLC裝置進行的制備用高效液相色譜法(HPLC)等色譜技術(shù)進行產(chǎn)物純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認識到兩種純化方法的任一種都可使用，并且可以通過使用適合大量生產(chǎn)的色譜柱將實驗色譜技術(shù)用于工業(yè)規(guī)模。
產(chǎn)品的確證通過使用合適的分析技術(shù)進行，如1H-NMR、13C-NMR、質(zhì)譜法、IR光譜以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員認為適用于本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)確證和純度測定的分析方法。
附圖簡述 附

圖1顯示本發(fā)明的一個細胞系對GABA的反應(yīng)性，α1β2γ2L，其中是應(yīng)用了GABA； 附圖2顯示本發(fā)明的一個細胞系對THDOC的反應(yīng)性，α1β2γ2，其中是在300nm-1μM THDOC存在下應(yīng)用30μM GABA。
下面提供了本發(fā)明中甾族化合物的實施例。這些實施例是用于說明本發(fā)明，但不對本發(fā)明的方法和組合物進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到相類似的試劑、溶劑、條件和參數(shù)可以在本發(fā)明中使用，這取決于底物。NMR數(shù)據(jù)通過使用Bruker 400MHz光譜儀進行記錄。
基于式I的實施例 實施例1 UC2016 3β-氟，5α-孕烷-20-酮 3α-OH 5α-孕烷-20-酮(3mmol)，在N2條件下溶于20mL無水二氯甲烷。在室溫條件下緩慢滴加DAST(700mg，4.33mmol)，反應(yīng)生成的淡黃色溶液繼續(xù)在室溫條件下攪拌1h。隨后進行TLC。緩慢加入5％NaHCO3溶液(60mL)結(jié)束溶液反應(yīng)。使用二氯甲烷(3×20mL)對水相進行萃取，收集有機相，用MgSO4進行干燥，并在減壓條件下除去有機溶劑，用硅膠快速分離色譜法(戊烷∶乙酸乙酯9∶1)進行純化，獲得淡黃色的油狀物。產(chǎn)物依次如下2、3位H2O的消除(收率67％)；3-OH的氟化作用伴隨著30％的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)(UC2016)；3-OH的氟化作用后構(gòu)型保持(3％-微量)。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ4.57-4.37(dm，1H)；2.51(t，1H)；2.12(m，1H)；2.11(s，3H)；2.02-1.99(m，2H)；0.83(s，3H)；0.67(m，1H)；0.61(s，3H). 實施例2 UC2018 3α-乙炔基，5α-孕烷-3β，20(R)-二醇 在一個有空氣出口的燒瓶中，3α-乙炔基，3β-羥基，5α-孕-20-酮(0.3mmol)室溫條件下溶解于2mL的二氯甲烷溶液和5mL的MeOH，加入一部分NaBH4(2.1當(dāng)量)然后該混懸液室溫下繼續(xù)攪拌3h。無色溶液在真空條件下干燥獲得白色殘留物，再用20+20mL H2O乙醚對殘留物進行提取。水相用30mL二氯甲烷∶乙醚1∶1溶液進行萃取，收集有機相，用MgSO4進行干燥，并在真空條件下除去有機溶劑。用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對白色固體進行純化。定量總收率。通過NMR測量確定，在20-C具有(R)-構(gòu)型的化合物是主要的產(chǎn)物(90％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ3.72(m，1H)；2.41(s，1H)；2.02(m，1H)；1.86(2m，2H)；1.12(d，3H)；0.80(s，3H)；0.74(s，3H). 實施例3 UC2019 3β-乙炔基，5α-孕烷-20-酮3α-乙酸酯 3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮(0.25mmol)和吡啶(2當(dāng)量)溶于無水二氯甲烷中，隨后在氮氣條件下于室溫滴加醋酸酐(4當(dāng)量)。混合物在40℃連續(xù)攪拌不超過3天。通過加入50m L 10％的HCl，該深色混合物的反應(yīng)被停止，隨后用10％NaHCO3水溶液(2×30mL)洗至pH＝7。收集有機相，用MgSO4進行干燥并且濃縮。用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對淡黃色殘留物進行純化，以87％收率得到這一酯類化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.60(s，1H)；2.51(t，1H)；2.45(m，1H)；2.11(s，3H)；2.03(s，3H)；0.82(s，3H)；0.60(s，3H). 實施例4 UC2024 3β-乙炔基，3α-羥基，Δ4-孕烯-20-酮 黃體酮(1mmol)在N2條件下于室溫(rt)溶于25mL的無水THF中。乙炔溴化鎂(1.1當(dāng)量)于室溫在攪拌過程中加入，隨后該溶液在N2保護下于室溫攪拌過夜。用飽和NH4Cl(aq)來停止淡黃色溶液的反應(yīng)，并且用二氯甲烷(3×30mL)對水相進行萃取。將收集得到的有機相減壓蒸發(fā)，獲得的黃色油狀物溶于二氯甲烷，用飽和鹽水洗并用MgSO4進行干燥。溶液在真空條件下蒸發(fā)減少，并用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對殘留物進行純化，一般收率為30％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ5.32(s，1H)；2.51(m，2H)；2.14(m，2H)；2.11(s，3H)；1.05(s，3H)；0.64(s，3H). 實施例5 UC2026 3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮肟 3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮 3，20-5α-孕烷二酮(1.580g，5.0mmol)在N2保護下于室溫(rt)溶于50mL的無水THF中。乙炔溴化鎂(1.1當(dāng)量)在室溫攪拌過程中滴加入該溶液，隨后在N2保護下于室溫攪拌過夜。
用飽和NH4Cl(aq)來停止淡黃色溶液的反應(yīng)，并且用二氯甲烷(3×30mL)對水相進行萃取。將收集得到的有機相減壓蒸發(fā)，獲得的黃色油狀物溶于二氯甲烷，用飽和鹽水洗并用MgSO4進行干燥。溶液在真空條件下蒸發(fā)減少，并用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對殘留物進行純化，一般收率為72％?？梢酝ㄟ^在乙醚中的進一步重結(jié)晶將最終的少量副產(chǎn)物去除。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.51(t，1H)；2.47(s，3H)；2.14(m，1H)；2.11(s，3H)；0.81(s，1H)；0.60(s，3H). 3α-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮 該化合物為在上述反應(yīng)中得到的副產(chǎn)物，通過硅膠快速分離色譜法分離獲得。一般收率為13％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.52(t，1H)；2.43(s，1H)；2.11(s，3H)；0.80(s，3H)，0.60(s，3H). 3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮肟 3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮(10mmol)于室溫在空氣條件下溶于裝有5mL二氯甲烷和50mL乙醇的250mL圓底燒瓶中。4當(dāng)量的NH2OH鹽酸鹽和4當(dāng)量的醋酸鈉溶于5mLH2O，后再將其加入甾族化合物溶液。加入20mL的乙醇，混合物回流過夜。然后將反應(yīng)混合物低溫冷卻并減壓除去溶劑。白色殘留物隨后用50mL H2O和50mL二氯甲烷進行處理，水相用3×30mL二氯甲烷進行萃取。收集得到的有機相然后用MgSO4進行干燥，過濾并減壓除去溶劑。最終殘留物通過硅膠快速分離色譜法進行純化用二氯甲烷∶乙醚4∶1洗脫，一般收率95-100％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.47(s，1H)；2.22(t，1H)；2.05(m，1H)；1.88(s，3H)；1.86(m，1H)；0.81(s，3H)，0.62(s，3H). 實施例6 UC2029 3β-乙炔基，3α-羥基，Δ4-孕烯-20-酮肟 3β-乙炔基，3α-羥基，Δ4-孕烯-20-酮(10mmol)于室溫在空氣條件下溶于裝有5mL二氯甲烷和50mL乙醇的250mL圓底燒瓶中。4當(dāng)量的NH2OH鹽酸鹽和4當(dāng)量的醋酸鈉溶于5mLH2O，后再將其加入甾族化合物溶液。加入20mL的乙醇，混合物回流過夜。然后將反應(yīng)混合物低溫冷卻并減壓除去溶劑。白色殘留物隨后用50mL H2O和50mL二氯甲烷進行處理，水相用3×30mL二氯甲烷進行萃取。收集得到的有機相然后用MgSO4進行干燥，過濾并減壓除去溶劑。最終殘留物通過硅膠快速分離色譜法進行純化用二氯甲烷∶乙醚4∶1洗脫，一般收率85％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ5.32(s，1H)；2.51(s，1H)；2.19(m，2H)；2.06(m，1H)；1.88(s，3H)；2.03(s，3H)；1.05(s，3H)；0.65(s，3H). 實施例7 UC2030 3α-氟，5α-孕烷-20-酮肟 3α-氟，5α-孕烷-20-酮 3α-OH 5α-孕烷-20-酮(3mmol)，在N2條件下溶于20mL無水二氯甲烷。于-78℃緩慢滴加DAST(700mg，4.33mmol)，反應(yīng)生成的淡黃色溶液繼續(xù)在室溫條件下攪拌1h。隨后進行TLC。小心地加入5％NaHCO3溶液(60mL)結(jié)束溶液反應(yīng)。使用二氯甲烷(3×20mL)對水相進行萃取，收集有機相，用MgSO4進行干燥，并在減壓條件下除去有機溶劑，用硅膠快速分離色譜法(戊烷∶乙酸乙酯9∶1)進行純化，獲得淡黃色的油狀物。產(chǎn)物依次如下2、3位H2O的消除(收率67％)；3-OH的氟化作用伴隨著30％的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)；3-OH氟化作用后構(gòu)型保持(3％-微量)。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ4.87-4.75(d，1H)；2.53(t，1H)；2.11(s，3H)；2.00(m，1H)；0.95(m，1H)；0.80(m，1H)；0.78(s，3H)；0.60(s，3H). 3α-氟，5α-孕烷-20-酮肟 3α-氟，5α-孕烷-20-酮(10mmol)于室溫在空氣條件下溶于裝有5mL二氯甲烷和50mL乙醇的250mL圓底燒瓶中。4當(dāng)量的NH2OH鹽酸鹽和4當(dāng)量的醋酸鈉溶于5mLH2O，后再將其加入甾族化合物溶液。加入20mL的乙醇，混合物回流過夜。然后將反應(yīng)混合物低溫冷卻并減壓除去溶劑。白色殘留物隨后用50mL H2O和50mL二氯甲烷進行處理，水相用3×30mL二氯甲烷進行萃取。收集得到的有機相然后用MgSO4進行干燥，過濾并減壓除去溶劑。最終殘留物通過硅膠快速分離色譜法進行純化(二氯甲烷∶乙醚4∶1)。定量收率。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ4.90-4.78(d，1H)；2.26(t，1H)；2.10(m，1H)；1.90(s，3H)；0.98(m，1H)；0.82(s，3H)；0.65(s，3H). 實施例8 UC2034 3β-氟，5α-孕烷-20-酮肟 從相應(yīng)的3β-氟，5α-孕烷-20-酮異構(gòu)體作為起始原料，通過與實施例7合成UC2030相同的方法獲得該化合物。
實施例9 UC2032 3-二甲基，Δ5-孕烯-3β，20(R)-二醇 3-二甲基，Δ5-孕烯-3，20-二酮 525mg黃體酮于室溫溶于10mL無水甲苯。在攪拌和N2氛圍條件下，3.4mL(2當(dāng)量)的1.0M溶于無水甲苯的叔丁醇鈉溶液滴加入黃體酮溶液。淡黃色溶液繼續(xù)攪拌20分鐘。2當(dāng)量的MeI隨后滴加入混合物，并在室溫和N2條件下攪拌過夜。加入10mL水和10mL二氯甲烷結(jié)束混合物反應(yīng)，用2×30mL二氯甲烷對水相進行萃取。收集有機層，用MgSO4進行干燥，在真空條件下去除溶液獲得淡黃色殘留物，該殘留物通過硅膠快速分離色譜法進行純化(1∶4乙醚∶二氯甲烷)。目標成分的進一步純化通過硅膠快速分離色譜法(1∶9乙酸乙酯∶戊烷)來完成。收率25％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ5.56(m，1H)；2.54(m，3H)；2.13(s，3H)；1.23(s，6H)；0.86(s，3H)；0.64(s，3H). 3-二甲基，Δ5-孕烯-3β，20(R)-二醇 在一個有空氣出口的燒瓶中，91mg的3-二甲基，Δ5-孕烯-3，20-二酮室溫條件下溶解于3.0mL二氯甲烷3.0mL二氯甲烷和15mLMeOH。加入一部分NaBH4(2.1當(dāng)量)然后該混懸液室溫下繼續(xù)攪拌3h。無色溶液在真空條件下干燥獲得白色殘留物，再用20+20mL H2O乙醚對殘留物進行提取。水相用30mL二氯甲烷∶乙醚1∶1溶液進行萃取，收集有機相，用MgSO4進行干燥，并在真空條件下除去有機溶劑。用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對白色固體進行純化。95％收率。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ5.60(m，1H)；3.75(m，1H)；3.26(m，1H)；2.09-2.13(m，2H)；1.18(s，6H)；1.21(s，3H)；1.10(s，3H)；0.80(s，3H). 基于式II的實施例 實施例10 UC2021 3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮 3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮 3，17雄烯酮(5.0mmol)在N2保護下于室溫溶于50mL的無水THF中。乙炔溴化鎂(1.1當(dāng)量)在室溫攪拌過程中滴加入該溶液，隨后在N2保護下于室溫攪拌過夜。
用飽和NH4Cl(aq)來停止溶液的反應(yīng)，并且用二氯甲烷(3×30mL)對水相進行萃取。將收集得到的有機相減壓蒸發(fā)，獲得的黃色油狀物溶解于二氯甲烷，用飽和鹽水洗并用MgSO4進行干燥。溶液在真空條件下蒸發(fā)減少，并用硅膠快速分離色譜法(1∶4乙醚∶二氯甲烷)對殘留物進行純化，一般收率為65％?？梢酝ㄟ^在乙醚中的進一步重結(jié)晶將最終的少量副產(chǎn)物去除。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.47(s，1H)；2.42(m，1H)；2.10-2.04(m，2H)；1.02(m，1H)；0.86(s，3H)；0.83(s，3H). 3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮 該化合物為在上述反應(yīng)中得到的副產(chǎn)物，通過制備用HPLC色譜法分離獲得。一般收率為8％。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.43(s，1H)；0.86(s，3H)，0.83(s，3H). 實施例11 UC2025 3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮肟 3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮(10mmol)于室溫在空氣條件下溶于裝有5mL二氯甲烷和50mL乙醇的250mL圓底燒瓶中。4當(dāng)量的NH2OH鹽酸鹽和4當(dāng)量的醋酸鈉溶解于5mLH2O，后再將其加入甾族化合物溶液。加入20mL的乙醇，混合物回流過夜。然后將反應(yīng)混合物低溫冷卻并減壓除去溶劑。白色殘留物隨后用50mL H2O和50mL二氯甲烷進行處理，水相用3×30mL二氯甲烷進行萃取。收集得到的有機相然后用MgSO4進行干燥，過濾并減壓除去溶劑。最終殘留物通過硅膠快速分離色譜法進行純化用二氯甲烷∶乙醚4∶1洗脫，一般收率95-100％(定量)。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.56-2.41(m，2H)；2.48(s，1H)；1.87(m，2H)；1.00(m，1H)；0.80(m，1H)；0.90(s，3H)，0.83(s，3H). 實施例12 UC2027 3α-乙炔基，3β-羥基，雄烷-17-酮肟 該目標化合物是以相應(yīng)的3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮作為起始原料通過與UC2025一樣的上述操作步驟獲得，其中3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮是所述合成UC2021反應(yīng)中獲得的副產(chǎn)物。
1H NMR(400MHz，CDCl3-d6)δ2.51-2.47(m，2H)；2.43(s，1H)；1.00(m，1H)；0.80(m，1H)；0.90(s，3H)，0.83(s，3H). 生物學(xué)評價 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了一種表達功能α1β2γ2L GABAA受體的人類α1β2γ2 GABAA受體的HEK-293細胞。
穩(wěn)定地表達了一種功能性人類GABA-A受體的本發(fā)明細胞系通過下列步驟得到。該GABA-A受體的亞基α1(308-1727 NM_000806)、β2(214-1679NM_000813)、和γ2L(290-1785 NM_198904)含有引入的位于起始密碼子前的Kozac序列，這些亞基各自被克隆到含有遺傳霉素、潮霉素B、和Zocin耐藥性的哺乳動物表達載體上。在亞克隆不同亞基中所使用質(zhì)粒的生產(chǎn)方法已經(jīng)在Rahman，M，Borra，VB，Isaksson，M，Johansson，IM，Ragagnin，G，

T andWang，MD Clin Exp Pharmacol Physiol 2008，PMID 18430052，打印前的電子出版物中公布。表達載體-pcDNA 3.1+/遺傳霉素，pcDNA 3.1-/潮霉素，和pcDNA3.1+/Zeocin都購買自Invitrogen。所使用方法的簡略描述GABA-A受體亞基α1、β2、和γ2L的編碼區(qū)伴隨著限制性內(nèi)切酶的識別序列EcoR I(α1和γ2L)和NotI+BamH I(β2)，它是由早期生成(Rahman et al 2008)并經(jīng)純化的質(zhì)粒切斷得到的。切斷的亞基編碼區(qū)連接于哺乳動物表達載體pcDNA 3.1+/遺傳霉素(α1)，pcDNA 3.1-/潮霉素(β2)，和pcDNA 3.1+/Zeocin，和同樣的限制性內(nèi)切酶的識別序列線性化來作為編碼區(qū)。穩(wěn)定表達三個GABA-A受體亞基的HEK-293細胞系通過一次轉(zhuǎn)染一個亞基被生產(chǎn)出來。通過使用Lipofectamine和DNA-Plusreagent(都來自Invitrogen)完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后用適當(dāng)?shù)目股剡M行選擇，并用亞基特異性抗體(β2和γ2)進行細胞分離。生產(chǎn)的細胞系通過免疫細胞化學(xué)對三個GABA-A受體亞基進行了分析。細胞離心涂片器用于聚集細胞。標準的ICC實驗設(shè)計使用了被德克薩斯紅和Alexa flour 488這兩種熒光團所標記的次級抗體。細胞然后用免疫熒光法進行分析。用于實驗設(shè)計中的裝置為細胞離心涂片器，和用于分析所期望GABA-A受體蛋白的存在的熒光顯微鏡。當(dāng)一個穩(wěn)定的細胞系被建立，進行選擇的實驗以顯示對對GABA(圖1)和THDOC(圖2)有正常而有效反應(yīng)的GABA-A受體的功能。
實施例，UC-甾族化合物的GABA(A)受體效應(yīng) 目的在GABAA受體激動劑四氫脫氧皮質(zhì)甾酮(THDOC)不存在或存在條件下，通過HEK-293細胞系中的DynaflowTM系統(tǒng)來研究UC-甾族化合物對GABA(A)受體功能的作用。在這些實驗中，實驗設(shè)計優(yōu)選同突觸間隙中的生理條件相類似。
細胞培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人類α1β2γ2LGABAA受體亞型的HEK-293細胞以3×104/25cm2的密度種植在cellbind培養(yǎng)瓶中。該被轉(zhuǎn)染的細胞系在種植3天后用于膜片箝實驗。當(dāng)這種細胞用于膜片箝實驗時，用O2泡EC-溶液(見下文)沖洗兩次。隨后加入大約5mL的EC并將細胞在培養(yǎng)箱中保留15分鐘。15分鐘后細胞在燒瓶的底部變得松散并用巴斯德吸管小心地抽吸幾次。
DynadowTM系統(tǒng)帶有DF-16Pro II芯片的DynadowTM系統(tǒng)用于所有的膜片箝實驗。DF-16Pro II芯片的孔有非粘性的嵌入物。該通道寬150μm高50μm?？椎娜莘e為280μL。實驗時間以26μL/min的流速計算為180分鐘。注入裝置如下使用內(nèi)徑9.65mm的特氟酸2mL注射器。注射器泵用于DF-16Pro II芯片時流速為26μL/min。
甾族化合物和GABA在室溫條件下，GABA通過超聲溶于EC-溶液，大概需要40分鐘達到10mM的溶液濃度。所有的甾族化合物以6mM的濃度溶于DMSO。在所有終溶液中DMSO濃度為0.1％，它包括洗液(EC)和僅僅含GABA的溶液。終溶液是加入到芯片孔中的溶液。
電生理學(xué)膜電極從沒有細絲的1.5mm O.D.、0.86mm I.D.硼硅玻璃中被提升。當(dāng)充滿細胞內(nèi)溶液時，有代表性的電極具有2-5MΩ的電阻。細胞內(nèi)的溶液包括以下組分(以mM計)140Cs-葡萄糖酸銻鈉，3.0NaCl，1.2MgCl2，1.0EGTA，10HEPES，pH用CsOH調(diào)到7.2。在記錄時所使用的細胞外(EC)的溶液含有(以mM計)137NaCl，5.0KCl，1.0CaCl2，1.2MgCl2，10HEPES，10葡萄糖。pH用NaOH調(diào)到7.4。在補償液體接界電勢之后，在所有實驗中使用穩(wěn)定的保持電位-17mV。在生理條件下，HEK-293在-40mV有一個靜止電位且細胞內(nèi)有低濃度的氯離子。當(dāng)受體被活化時，通過使用-17mV的保持電位和含低濃度氯離子的細胞內(nèi)溶液氯離子流入細胞中。所有實驗在室溫下進行(21至23℃)。標準的實驗設(shè)計用于所有的實驗。
實驗設(shè)計 GABA應(yīng)用通過使用Dynaflow儀器，在幾乎所有生理條件下研究被轉(zhuǎn)染的HEK-293都成為可能。Dynaflow系統(tǒng)允許溶液的使用時間從40ms這么短延長至以分鐘計。生理學(xué)上來說，在突觸間隙中，大約2ms的時間GABA被釋放達到mM的濃度范圍。在這些實驗中我們使用GABA±甾族化合物已經(jīng)用了40ms的時間。我們發(fā)現(xiàn)在幾乎所有的細胞中，首次GABA應(yīng)用比第二次GABA應(yīng)用的反應(yīng)要弱。在第二次和的三次GABA應(yīng)用中的反應(yīng)沒有什么區(qū)別。因此第一次的GABA應(yīng)用總是重復(fù)兩次而第二次的反應(yīng)用于分析。
清洗GABA在水中有很好的溶解性并易于從受體中清洗。在單獨使用GABA后清洗時間被設(shè)定為1min.。而另一方面甾族化合物難溶于水且難以從受體中清洗。在我們的實驗中，我們將THDOC用作GABA激動劑。用了2分鐘的清洗時間，200nM的THDOC已經(jīng)被完全清洗，完全清洗后表現(xiàn)出既沒有積累也沒有脫敏作用。
培養(yǎng)我們發(fā)現(xiàn)為了了解甾族化合物的作用并得到穩(wěn)定的結(jié)果，在使用GABA前甾族化合物必須先在受體中培養(yǎng)一段時間。對不同的培養(yǎng)時間進行研究以期獲得穩(wěn)定結(jié)果的最優(yōu)時間并使清洗時間縮至最短。20s.的培養(yǎng)時間顯示為最優(yōu)的時間，此時清洗時間為2min。
結(jié)論優(yōu)化的實驗設(shè)計如下20s.的甾族化合物培養(yǎng)，40ms.的GABA±甾族化合物，2min.的清洗。首次GABA應(yīng)用重復(fù)兩次并在第一次和第二次應(yīng)用之間有一個1min.的清洗時間。
結(jié)果我們注意到如果細胞在不利的條件下它們之間的結(jié)果可以不同。因此，在細胞內(nèi)緩沖液中有一些小的變化并且對甾族化合物做了一些補充實驗。
實驗在體外完成以證實GABA(A)受體作為激動劑或者拮抗劑的作用，它可阻斷具有孕烷(孕烯)或雄烷甾體母核和3α/β-乙炔基、3β/α-羥基基團的甾族化合物的作用(表4)。在體外完成進一步的實驗以證實GABA(A)受體作為激動劑或者拮抗劑的作用，它可以阻斷具有孕烷甾體母核和3α-或3β-氟甾族化合物的作用(表5)。
表4以通過GABA-A受體的氯離子通量變化來判斷受試的帶有3α/β-乙炔基、3β/α-羥基基團的UC-甾族化合物在1μM的濃度條件下對200nM GABA-甾族化合物THDOC(3α-羥基-5α-孕烷-20-酮-21-醇)+30μM GABA的對抗作用 表5以通過GABA-A受體的氯離子通量變化來判斷受試的帶有3α/β-氟的UC-甾族化合物在1μM的濃度條件下對200nM GABA-甾族化合物THDOC(3α-羥基-5α-孕烷-20-酮-21-醇)+30μM GABA的對抗作用 本發(fā)明化合物的HPLC保留時間 HPLC條件 HPLC系統(tǒng)(水)Column

C18 3.5μm 4.6x75mm(水)；T45℃；流量1.0mL/min；無梯度洗脫液條件40∶60v/v H2O∶MeOH。注入體積；100μL。
用于洗脫液的溶劑為HPLC等級，水通過微孔器進行過濾；所有的溶劑通過0.45μm的微孔過濾器進行過濾并先使用N2氣流去除氣體。
由于該分析是在反相條件下進行，因此保留時間更短相應(yīng)的親水性更高。
表7 表8 從上面的表7和8可以看出本發(fā)明化合物的保留時間較參照物的更短，表明前者具有比后者更高的親水性。
權(quán)利要求
1、一種式I表示的化合物，
或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中
R1為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖類、雜環(huán)、飽和或不飽和烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R2為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R3為5α-或者5β-H；
R4為硝基，羥基，所述羥基呈游離形式或者與酯、醚、糖鍵合，并且R5為質(zhì)子，或者
其中R4、R5為O或肟＝NOH形式的N，或者碳環(huán)或雜環(huán)；
R6為甲基、烷基或者-CH2OR，其中R為H、羧酸殘基、烷基基團或糖；-CH2X，其中X為氟或其它鹵素；
R7＝在7-位上的OH、CH3或H；且
R8、R9＝兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中R7＝在7位上的OH或者CH3。
3、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽，其中
R1為乙炔基；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基結(jié)合；氟；或者質(zhì)子；
R2為乙炔基；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基結(jié)合；氟；或者質(zhì)子；
R3為5α-或者5β-H；
R4為羥基，且R5為質(zhì)子，或者
R4、R5一起為O或肟＝NOH形式的N；
R6為甲基；
R7為H；且
R8＝R9＝甲基或者H。
4、根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述化合物選自
3α-乙炔基，3β-羥基，5β-孕烷-20-酮，
3α-乙炔基，5β-孕烷-3β，20(R)-二醇，
3β-乙炔基，5α-孕烷-3α，20(R)-二醇，
3β-氟，5β-孕烷-20-酮，
3β-氟，5β-孕烷-20-(R)-醇，
3β-氟，5β-孕烷-20-(S)-醇，
3β-氟，5α-孕烷-20-酮，
3α-氟，5α-孕烷-20-(R)-醇，
3α-乙炔基，5α-孕烷-3β，20(R)-二醇，
3β-乙炔基，3α-乙酰基，5α-孕烷-20-酮，
3β-乙炔基，3α-羥基，5α-孕烷-20-酮肟，
3α-氟，5α-孕烷-20-酮肟，和
3β-氟，5α-孕烷-20-酮肟。
5、一種如式I表示的化合物，
所述化合物在分子的C4-C5或C5-C6或其它位置之間具有不飽和鍵，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中
R1為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R2為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R3不存在，或者當(dāng)不飽和鍵位于該分子的其它位置時，為5α-或5β-H；
R4為硝基，羥基，所述羥基呈游離形式或者與酯、醚、糖鍵合，并且R5為質(zhì)子，或者
其中R4、R5為O或肟＝NOH形式的N，或者碳環(huán)或雜環(huán)；
R6為甲基、烷基或者-CH2OR，其中R為H、羧酸殘基、烷基基團或糖；-CH2X，其中X為氟或其它鹵素；
R7＝在7-位上的OH、CH3或H；且
R8、R9為兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H，或者如果所述不飽和鍵位于C4-C5之間，則R8、R9中的一個為Me-或H，且另一個不存在。
6、根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中R7＝在7位上的OH或者CH3；并且R8、R9為兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H。
7、根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，所述化合物在C4-C5或C5-C6之間具有不飽和鍵，或其藥學(xué)可接受鹽，其中
R1為乙炔基或者羥基；
R2為乙炔基或者羥基；
R3不存在；
R4為羥基；R5為質(zhì)子；或者
R4、R5一起為O或肟＝NOH形式的N；
R6為甲基；
R7為H；
R8為甲基或者H；且
R9為甲基，H，或者，如果所述不飽和鍵位于C4-C5之間，則不存在。
8、根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，所述化合物選自
3β-乙炔基，3α-羥基，Δ4-孕烯-20-酮，
3β-乙炔基，3α-羥基，Δ4-孕烯-20-酮肟，和
3-二甲基，Δ5-孕烯-3β，20(R)-二醇。
9、一種式II的化合物，
或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中
R1為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R2為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R3為5α-或者5β-H；
R4為硝基，羥基，所述羥基呈游離形式或者與酯、醚、糖鍵合，并且R5為質(zhì)子，或者
其中R4、R5為O或肟＝NOH形式的N，或者碳環(huán)或雜環(huán)；
R6為在7位上的OH、CH2或者H；且
R7、R8為兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H。
10、根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中R6＝在7位上的OH或者CH3。
11、根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽，其中
R1為乙炔基或者羥基；
R2為乙炔基或者羥基；
R3為5α-或者5β-H；
R4、R5一起為O或肟＝NOH形式的N；
R6為H；且
R7＝R8＝H。
12、根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，所述化合物選自
3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮，
3β-乙炔基，3α-羥基，雄烷-17-酮肟，和
3α-乙炔基，3β-羥基，雄烷-17-酮肟。
13、一種式II的化合物，
所述化合物在分子的C4-C5或C5-C6或其它位置之間具有不飽和鍵，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中
R1為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R2為乙炔基、乙烯基、乙基或者其它飽和或不飽和烷基基團；羥基，所述羥基呈游離形式或者與羧酸殘基、糖、烷基基團結(jié)合以形成酯或醚或糖基化化合物；氟或者其它鹵素；質(zhì)子；
R3不存在，或者當(dāng)不飽和鍵位于該分子的其它位置時，為5α-或5β-H；
R4為硝基，羥基，所述羥基呈游離形式或者與酯、醚、糖鍵合，并且R5為質(zhì)子，或者
其中R4、R5為O或肟＝NOH形式的N，或者碳環(huán)或雜環(huán)；
R6為在7位上的OH或者CH3；且
R8、R9為兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H，或者如果所述不飽和鍵位于C4-C5之間，則R8、R9中的一個為Me-或H，且另一個不存在。
14、根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，或其藥學(xué)可接受鹽、前藥或溶劑化物，其中R7、R8為兩個Me-基團，或者分別為Me-和H，或者為兩個-H。
15、一種藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1-14任一項的化合物和藥學(xué)可接受載體。
16、權(quán)利要求1-14任一項的化合物在制備用于緩解、預(yù)防或者治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的藥物組合物中的用途。
17、一種制備3-乙炔基取代且在20或者17位上有一個酮基的甾族化合物，而不破壞17-或者20-酮基官能度的方法。
18、一種制備在20、21或者17位上有一個肟基且被取代的甾族化合物，而不破壞17-，21-或者20-酮基官能度的方法。
19、一種制備3-氟取代且在20或者17位上有一個酮基的甾族化合物，而不破壞17-或者20-酮基官能度的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗代謝能力增強和水溶性增加的甾族化合物，并公開了它們的制備方法。這些化合物適合用于制備治療由甾族化合物引起或與甾族化合物有關(guān)的CNS障礙以及用于緩解、預(yù)防或者治療所述CNS障礙的藥物。
文檔編號A61K31/56GK101585862SQ20081012774
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者T·巴克斯特倫, G·拉加金 申請人:梅克芳股份公司