專利名稱：：一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，具體地說涉及一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑。技術(shù)背景河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種由河豚魚內(nèi)臟提取的低分子量生物堿類物質(zhì)。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其成為細(xì)胞鈉離子通道專一阻斷劑。因此其在生物學(xué)研究領(lǐng)域作為生物試劑有著不可替代的位置。河豚毒素在醫(yī)學(xué)臨床上所顯示的藥理學(xué)作用，早在上世紀(jì)30年代就已有用于臨床介斷生物堿類成癮性病癥的報(bào)道。在鎮(zhèn)痛治療方面也不斷有報(bào)道推出。因此，其無論在生物學(xué)研究領(lǐng)域還是在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用方面，都顯示了十分重要的地位。TTX由于在極微量的情況下就能阻斷細(xì)胞鈉離子的通道，而對鉀離子通道沒有影響，具有高度的轉(zhuǎn)移性，因此是十分有用的神經(jīng)生理研究用工具藥。臨床醫(yī)學(xué)上已證明TTX是良好的鎮(zhèn)靜劑、解痙劑、鎮(zhèn)痛劑，特別對癌癥等惡性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，與傳統(tǒng)的杜冷丁、嗎啡等鎮(zhèn)痛藥相比雖然響應(yīng)時間稍長，但其鎮(zhèn)痛作用可達(dá)12-20小時，而且無成癮性。近來TTX在戒毒方面也顯示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射IO嗎TTX—針，5-7天為一個療程，毒癮即可得到控制，并可大大減輕一般戒毒中常常出現(xiàn)的戒毒綜合癥。但河豚毒素注射液(水溶液)對溫度很敏感，容易受溫度的影響而發(fā)生降解，溫度越高，降解越快。一旦有效活性物質(zhì)河豚毒素含量低于其標(biāo)示量的90%或有關(guān)物質(zhì)的相對含量超過醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度(大于對照溶液主峰面積)就不符合臨床使用要求。試驗(yàn)證明，河豚毒素注射液(水針劑)在室溫下不穩(wěn)定，為了保證河豚毒素注射液的質(zhì)量，防止河豚毒素含量下降和有關(guān)物質(zhì)含量升高，必須將其置于4-8'C冰箱中保存。這就給河豚毒素的臨床適用帶來諸多困難和不便，相應(yīng)在貯存、運(yùn)輸、裝卸、批發(fā)、零售、醫(yī)院和應(yīng)用各個環(huán)節(jié)都得注意保持4-8'C低溫，否則溫度偏高可能影響臨床效果，對此，必須設(shè)法盡快予以解決，研制出安全穩(wěn)定，室溫下就能長期貯存的可靠產(chǎn)品。為了解決上述問題，一個簡單的做法是將河豚毒素做成凍干制劑。一般在水溶液中不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)在凍干脫水后貯存期都可延長，待臨床應(yīng)用時，加滅菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于醫(yī)藥時，其每劑量的用量只有0.5-60嗎，如此微量的河豚毒素在溶液中經(jīng)凍干脫水后形成不了所要求的固態(tài)殘留物，必需加入醫(yī)藥上能接受的賦形劑，才能提供微量河豚毒素得以附著的支架，在溶液凍干脫水后能形成固態(tài)物。申請?zhí)枮?3146020.8的中國專利申請公開了一種具有良好穩(wěn)定性的含有符合人體安全注射使用的室溫下能長期貯存的河豚毒素冷凍干燥制劑的組合物及制備方法，是通過在河豚毒素制劑中加入一定量的雙糖如乳糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖，冷凍干燥后制成凍干劑來解決河豚毒素在制劑中穩(wěn)定性的問題。該凍干劑在室溫下貯存1年后，其河豚毒素的含量及有關(guān)物質(zhì)含量均未發(fā)生明顯變化，符合醫(yī)藥用規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于生物活性物質(zhì)河豚毒素幾乎不溶于水，盡管上述專利申請公開的河豚毒素凍干制劑的組合物中加入了一定量的助溶劑，但其凍干制劑的復(fù)溶性依然不太好。為了獲得所需濃度的河豚毒素水溶液，現(xiàn)有技術(shù)中，以河豚毒素為原料將其制備成高水溶性的河豚毒素鹽衍生物，如申請?zhí)枮?00410102449.5的中國專利申請公開了河豚毒素各種以鹽形式制備成的河豚毒素衍生物(包括河豚毒素的酒石酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、枸櫞酸鹽的等當(dāng)量衍生物)及其制備方法。中國專利02117928.X公開了一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素呼吸道給藥制劑，其特點(diǎn)是以河豚毒素枸櫞酸鹽或河豚毒素醋酸鹽為原料藥，按常規(guī)方法制成氣霧劑、噴霧劑或氣溶膠制劑。本發(fā)明呼吸道給藥制劑安全、高效、非成癮性、使用方便。本發(fā)明的河豚毒素呼吸道給藥制劑對癌痛患者有效率達(dá)97%以上，戒毒有效率達(dá)100%，因此是一種很好的戒毒、鎮(zhèn)痛的藥物制劑。但其給藥方式限于呼吸道給藥，包括鼻腔、口腔或舌給藥，最好是鼻腔給藥。然而，鼻腔粘膜的吸收率受多種因素的影響。且該專利的實(shí)施例中所用的酸為緩沖劑，制備用酸的摩爾數(shù)說明多數(shù)TTX仍然未形成鹽，即多數(shù)TTX還是不能形成高水溶性的溶液，未能從根本上解決其水溶性的問題。可見，解決河豚毒素的水溶性和穩(wěn)定性是制備河豚毒素制劑的關(guān)鍵問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，該制劑不僅水溶性良好，而且穩(wěn)定性良好，安全可靠，質(zhì)量穩(wěn)定，不需在特定溫度下的冰箱中保存，室溫下貯存期可達(dá)2年以上，大大節(jié)約了貯藏、運(yùn)輸成本，方便醫(yī)療使用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的制劑包括作為藥物活性成份的小劑量河豚毒素和選自藥學(xué)上允許的助溶劑或支架劑，所述的助溶劑為氨基酸。生物活性物質(zhì)河豚毒素幾乎不溶于水，為了獲得所需濃度的水溶液，現(xiàn)有技術(shù)中，以河豚毒素為原料將其制備成高水溶性的河豚毒素鹽衍生物，如酒石酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、枸櫞酸鹽的等當(dāng)量衍生物。但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在實(shí)際應(yīng)用中，制備這些高水溶性的河豚毒素鹽衍生物時，所用的酸為緩沖劑，多數(shù)TTX仍然未形成鹽，未能從根本上解決河豚毒素的溶解性問題，而且這些酸多數(shù)是強(qiáng)酸，會對河豚毒素的毒性造成破壞。本發(fā)明人在進(jìn)行了大量的試驗(yàn)后驚喜地發(fā)現(xiàn)氨基酸不僅能夠起到助溶劑的作用，還能與河豚毒素形成TTX氨基酸鹽，從而形成高水溶性的鹽溶液，以TTX氨基酸鹽制備的制劑水溶性良好，制劑穩(wěn)定性亦很好。本發(fā)明中，所述的小劑量河豚毒素為每制劑單位含有5-2(^g河豚毒素。本發(fā)明中，所述的制劑單位是指片劑的每片、膠囊劑的每粒膠囊、顆粒劑的每袋等藥學(xué)上常規(guī)制劑的劑型單位。本發(fā)明中，優(yōu)選的制劑方式有以下兩種(1)所述的制劑為由河豚毒素、助溶劑和注射用水配制的每制劑單位含有5-20pg河豚毒素的注射劑。(2)所述的制劑為由河豚毒素、助溶劑、支架劑和注射用水配制的每制劑單位含有5-20pg河豚毒素的凍干粉針劑。本發(fā)明所提供的河豚毒素注射劑采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法制備，優(yōu)選采用如下方法制備向TTX中加入助溶劑，再加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml,過濾，濾液超濾，灌裝，封口制成1000只，滅菌，檢驗(yàn)，即得。本發(fā)明所提供的河豚毒素凍干粉針劑采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法制備，優(yōu)選采用如下方法制備向TTX中加入助溶劑，再加入支架劑和注射用水，加熱過濾，濾液超濾，分裝，冷凍干燥后壓蓋即得。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3-4小時，溫度在-30-45'C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-30-45'C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-15-10°C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在30。C。本發(fā)明采用特有的低溫速凍，分階段升溫干燥的凍干方法，所得河豚毒素凍干成形良好，獲得了穩(wěn)定性能較常規(guī)凍干結(jié)晶優(yōu)良的晶型，有利穩(wěn)定的運(yùn)輸和貯存，徹底解決了河豚毒素凍干粉針劑的穩(wěn)定問題?？傊?，本發(fā)明的冷凍干燥工藝大大提高了河豚毒素凍干粉針劑在制備過程中的穩(wěn)定性，制備所得的河豚毒素凍干粉針劑質(zhì)量均一穩(wěn)定，貯存和運(yùn)輸更加方便。本發(fā)明中，所述的助溶劑為氨基酸或其鹽酸鹽，優(yōu)選天門冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、絡(luò)氨酸、纈氨酸、組氨酸或L-半胱氨酸鹽酸鹽，更優(yōu)選天門冬氨酸。本發(fā)明中選用氨基酸或其鹽酸鹽作為助溶劑，不僅增加了河豚毒素在水中的溶解性，還能與河豚毒素形成TTX氨基酸鹽，從而形成高水溶性的鹽溶液，而且還同時補(bǔ)充了人體所必需的氨基酸。本發(fā)明中，所述的支架劑為甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、葡萄糖或右旋糖酐，優(yōu)選甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更優(yōu)選比為5:l的甘露醇-葡萄糖或4:1的甘露醇-右旋糖酐。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在制備凍干劑時，選用甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酑能更好地解決河豚毒素在制劑中的穩(wěn)定性問題。本發(fā)明中，所述的河豚毒素采用如下方法制備1)將河豚的卵巢或肝臟絞碎、勻漿，用含乙酸的醇溶液攪拌浸泡，將浸泡液過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得粗毒液；2)將上步獲得的粗毒液離心、過濾，得濾液；濾渣用含35%乙酸的水溶液洗滌，將洗滌液合并到濾液中，靜置，分離水層和上層油層，油層放置用于精制河豚魚肝油；3)將上步的水層濾過，濾液過弱酸性陽離子交換樹脂柱，洗脫，收集洗脫液；4)將洗脫液減壓濃縮，所得的濃縮液過葡萄糖凝膠柱，洗脫，收集洗脫液，合并減壓濃縮，得濃縮液；5)將濃縮液用氨水調(diào)pH值至8-9，在51(TC溫度下放置45-50小時后，沉淀過濾、洗滌、干燥、精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮、冷凍干燥即得?，F(xiàn)有技術(shù)中，很多河豚毒素制劑中河豚毒素還屬于毒素原液類型的粗品，其河豚毒素的純度不夠高，直接影響其制劑的質(zhì)量和療效。本發(fā)明中采用特定的方法提取河豚毒素，不僅所得的河豚毒素純度高，而且以其為原料藥所制備的制劑，穩(wěn)定性好，溶解性好，療效顯著。本發(fā)明中采用含乙酸的醇溶液浸泡后再提取，河豚毒素的提取率較高。上述步驟1)中所述的浸泡為含3~5%醋酸的30%-100%甲醇或乙醇溶液攪拌浸泡36次。本發(fā)明中選用含3~5%醋酸的30%-100%甲醇或乙醇溶液浸泡，更有利于TTX的溶解，同時減少了大分子蛋白質(zhì)溶入，因此，可以避免高溫加熱除蛋白質(zhì)。上述步驟2)中所述的洗滌為洗滌2-4次，優(yōu)選3次；步驟2)中所述的靜置為在5-15。C溫度下，放置8-12小時。上述步驟3)中的洗脫為先用水洗脫，再用10%醋酸洗脫；步驟4)中的洗脫為用含5%醋酸的50%乙醇溶液洗脫。本發(fā)明中，兩個步驟中所用的洗脫液不同，一方面是根據(jù)兩次用的柱的填料不同而選擇不同的洗脫劑的，另一方面則是采用本發(fā)明所提供的洗脫方式洗脫效果好。本發(fā)明所用的葡萄糖凝膠柱為本領(lǐng)域常用的葡萄糖凝膠柱，優(yōu)選LH-20葡萄糖凝膠柱。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明所提供的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，不僅水溶性良好，而且穩(wěn)定性良好，安全可靠，質(zhì)量穩(wěn)定，不需在特定溫度下的冰箱中保存，室溫下貯存期可達(dá)2年以上，大大節(jié)約了貯藏、運(yùn)輸成本，方便醫(yī)療使用；(2)本發(fā)明所提供的河豚毒素原料藥，純度大于98%，其水溶性良好，所制備的制劑穩(wěn)定性優(yōu)良，療效好，治療效果明顯；(3)本發(fā)明所提供的河豚毒素的制備方法制備河豚毒素對河豚毒素的破壞少、損耗少、收率高、純度高、穩(wěn)定性好；(4)本發(fā)明所提供的河豚毒素的制備方法中不需采用活性炭吸附，采用兩次柱層析，不僅能有效地除去雜質(zhì)，還減少了提取時間，使河豚毒素的生物活性損失減少到最低限度；(5)本發(fā)明所提供的河豚毒素的制備方法中的提取分離過程中保持較低溫度處理，避免了溫度對河豚毒素造成的破壞；(6)本發(fā)明所提供的河豚毒素的制備方法中提取分離后的油層還可以用于精制河豚魚肝油，除毒和油脂的殘?jiān)ㄟ^發(fā)酵后可作為家禽的飼料，從而避免了不必要的浪費(fèi)和環(huán)境污染；圖1為確定河豚毒素最低共熔點(diǎn)曲線示意圖；圖2為凍干曲線示意圖。具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。[實(shí)施例l]原料藥河豚毒素的制備將河豚的卵巢100kg，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入100升含3%醋酸的60%乙醇，攪拌浸泡3次，過濾、離心過濾，取4次濾液，再減壓過濾，濾液通過D152型弱酸性陽離子樹脂柱，以去離水洗脫柱子，至洗脫液呈無色，然后用10%醋酸水溶液洗脫(洗脫速度50ml/分)。以HPLC檢測，富集含毒液，合并減壓濃縮，濃縮液通過葡萄糖凝膠LH-20柱，以含5%醋酸的50%乙醇液洗脫，HPLC檢測，富集含TTX的洗脫液，合并、減壓濃縮，濃縮物以氨水調(diào)pHH8.0，低溫5。放置48小時，將沉淀過濾、洗滌、干燥，得白色沉淀物TTX。以制備HPLC精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥后，得TTX的毒素2.0g，純度》98%。原料藥河豚毒素的制備將河豚的卵巢100kg，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入120升含5%醋酸的50%甲醇，攪拌浸泡6次，過濾、離心過濾，取4次濾液，減壓過濾，濾液通過D152型弱酸性陽離子樹脂柱，以去離水洗脫柱子，至洗脫液呈無色，然后用10%醋酸液洗脫(洗脫速度50ml/分)。以HPLC檢測，富集含毒液，合并、減壓濃縮，濃縮液通過葡萄糖凝膠LH-20柱，以含5%醋酸的50%乙醇液洗脫，HPLC檢領(lǐng)U，富集含TTX的洗脫液合并、減壓濃縮，濃縮物以氨水調(diào)pH9.0，低溫10。C放置48小時，過濾、干澡，得白色沉淀物TTX。以制備HPLC精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮得濃縮液，冷凍干燥得TTX毒素2.0g，純度》98%。原料藥河豚毒素的制備取河豚的肝臟100kg，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入110升含4%醋酸的60%乙醇，攪拌浸泡4次，過濾、離心過濾，取4次濾液，再減壓過濾，濾液通過D152型弱酸性陽離子樹脂柱，以去離水洗脫柱子，至洗脫液呈無色，然后用10%醋酸水溶液洗脫(洗脫速度50ml/分)。以HPLC檢測，富集含毒液，合并減壓濃縮，濃縮液通過葡萄糖凝膠LH-20柱，以含5%醋酸的50%乙醇液洗脫，HPLC檢測，富集含TTX的洗脫液，合并、減壓濃縮，濃縮物以氨水調(diào)pHN8.5，低溫8。C放置48小時，將沉淀過濾、洗滌、干燥，得白色沉淀物TTX。以制備HPLC精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥后，9得TTX的毒素2.0g，純度>98%。原料藥河豚毒素的制備1)取河豚的肝臟100g，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入115升含3%醋酸的30%甲醇溶液攪拌浸泡2次，將浸泡液過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得粗毒液；2)將上步獲得的粗毒液離心、過濾，得濾液；濾渣用含3%乙酸的水溶液洗滌2次，將洗滌液合并到濾液中，在5。C溫度下靜置8小時，分離水層和上層油層，油層放置用于精制河豚魚肝油；3)將上步的水層濾過，濾液過D152型弱酸性陽離子交換樹脂柱，先用水洗脫，再用10%醋酸洗脫，收集洗脫液；4)將洗脫液減壓濃縮，所得的濃縮液過LH-20葡萄糖凝膠柱，用含5%醋酸的50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，合并減壓濃縮，得濃縮液；5)將濃縮液用氨水調(diào)pH值至8，在5'C溫度下放置45小時后，沉淀過濾、洗滌、干燥、精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮、冷凍干燥即得，純度>98%。原料藥河豚毒素的制備1)取河豚的卵巢100g，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入110升含5%醋酸的100%乙醇溶液攪拌浸泡4次，將浸泡液過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得粗毒液；2)將上步獲得的粗毒液離心、過濾，得濾液；濾渣用含5%乙酸的水溶液洗滌4次，將洗滌液合并到濾液中，在15。C溫度下靜置12小時，分離水層和上層油層，油層放置用于精制河豚魚肝油；3)將上步的水層濾過，濾液過D152型弱酸性陽離子交換樹脂柱，先用水洗脫，再用10%醋酸洗脫，收集洗脫液；4)將洗脫液減壓濃縮，所得的濃縮液過LH-20葡萄糖凝膠柱，用含5%醋酸的50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，合并減壓濃縮，得濃縮液；5)將濃縮液用氨水調(diào)pH值至9，在15'C溫度下放置50小時后，沉淀過濾、洗滌、干燥、精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮、冷凍干燥即得，純度>98%。原料藥河豚毒素的制備1)取河豚的肝臟100g，絞肉機(jī)絞碎，以勻漿機(jī)勻漿，加入115升含3%醋酸的60%乙醇溶液攪拌浸泡2次，將浸泡液過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得粗毒液；2)將上步獲得的粗毒液離心、過濾，得濾液；濾渣用含3%乙酸的水溶液洗滌3次，將洗滌液合并到濾液中，在5'C溫度下靜置8小時，分離水層和上層油層，油層放置用于精制河豚魚肝油；3)將上步的水層濾過，濾液過D152型弱酸性陽離子交換樹脂柱，先用水洗脫，再用10%醋酸洗脫，收集洗脫液；4)將洗脫液減壓濃縮，所得的濃縮液過LH-20葡萄糖凝膠柱，用含5%醋酸的50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，合并減壓濃縮，得濃縮液；5)將濃縮液用氨水調(diào)pH值至8，在10'C溫度下放置45小時后，沉淀過濾、洗滌、干燥、精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮、冷凍干燥即得，純度>98%。河豚毒素凍干粉針劑的制備5.OmgTTX加入5.Og精氨酸，加5.Og甘露醇溶解，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX5.0嗎。其中，上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3小時，溫度在-3(TC;(2)減壓干燥14小時，溫度在-3(TC;(3)升溫干燥4小時，溫度在-15°C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3CTC。河豚毒素凍干粉針劑的制備5.OmgTTX加入5.Og甘氨酸，加入5.Og甘露醇-葡萄糖(5:1)，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX5.Opg。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍4小時，溫度在-45'C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-45'C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-l(TC;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在30。C。河豚毒素凍干粉針劑的制備10.OmgTTX加入5.Og谷氨酸，加入5.Og甘露醇-葡萄糖(5:1)，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX10.0叫。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3.5小時，溫度在-35°C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-35°C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-12'C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備10.0mgTTX加入5.0g賴氨酸，加入5.0g葡萄糖，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX10.0蹄。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3.8小時，溫度在-4(TC;(2)減壓干燥14小時，溫度在-4(TC;(3)升溫干燥4小時，溫度在-13。C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備10.OmgTTX加入5.OgL-半光氨酸鹽酸鹽，加入5.0g葡萄糖，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTXIO.0叫。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3-4小時，溫度在-30-45°C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-30-45°C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-15-l(TC;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備15.OmgTTX加入5.0g谷氨酸，加入5.0g右旋糖苷，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX15.O)ag。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3.6小時，溫度在-33°C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-36°C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-13'C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備15.OmgTTX加入5.0g谷氨酸，加入5.0g甘露醇，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX15.0叫。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3.6小時，溫度在-33'C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-36。C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-13°C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在30。C。河豚毒素凍干粉針劑的制備20.OmgTTX加入5.Og甘氨酸，加入5.Og甘露醇-葡萄糖(5:1)，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX20.(Vg。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3-4小時，溫度在-30-45°C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-30-45°C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-15_10°C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備20.OmgTTX加入5.Og精氨酸，加入5.Og甘露醇-葡萄糖(5:1)，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋，制成1000只。加入注射用水加熱溶解，稀釋至1000m1，，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，每只含TTX20.0嗎。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍3.5小時，溫度在-35'C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-35'C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-12。C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在3(TC。河豚毒素凍干粉針劑的制備5.OmgTTX加入5.Og天門冬氨酸，加入5.0g甘露醇-葡萄糖(5:1)，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只含TTX5.0嗎。上述冷凍干燥分為四個階段(1)預(yù)凍4小時，溫度在-45°C;(2)減壓干燥14小時，溫度在-45。C;(3)升溫干燥4小時，溫度在-10°C;(4)二次升溫干燥4小時，溫度在30。C。河豚毒素注射劑的制備5.0mgTTX加入50mg谷氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX5.0嗎。河豚毒素注射劑的制備5.0mgTTX加入50mg精氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml,，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX5.0嗎。河豚毒素注射劑的制備10.0mgTTX加入50mg甘氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX10.0嗎。河豚毒素注射劑的制備10.OmgTTX加入50mg精氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml,過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX10.0嗎。河豚毒素注射劑的制備15mgTTX加入75mg甘氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX15.0嗎。河豚毒素注射劑的制備15mgTTX加入75mg谷氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX15.0嗎。河豚毒素注射劑的制備20mgTTX加入100mg賴氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX20.0嗎。河豚毒素注射劑的制備10mgTTX加入50mgL-半光氨酸鹽酸鹽，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至1000ml，過濾，濾液超濾，濾液灌裝，封口制成1000只，滅菌、檢驗(yàn)。每只含TTX10.0嗎。以下通過試驗(yàn)例來對本發(fā)明產(chǎn)品的有益效果進(jìn)行更詳細(xì)的說明。[試驗(yàn)例1]穩(wěn)定性試驗(yàn)取制劑實(shí)施例1所制備的河豚毒素凍干粉針劑，根據(jù)《中國藥典》2005年版二部附錄XIXC藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，進(jìn)行了影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)?？疾祉?xiàng)目包括性狀、鑒別、含量。(一)影響因素試驗(yàn)1、光照試驗(yàn)儀器ST-80C照度計(jì)，日光燈條件4500士500LX將制劑實(shí)施例l的樣品，批號20040906，置日光燈下，分別于5天、IO天取樣測定各項(xiàng)有關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見表l。_表1.光照試驗(yàn)_時間(天)外觀鑒別含量(％)0白色，疏松粉末狀符合規(guī)定101.25白色，疏松粉末狀符合規(guī)定83.910白色，疏松粉末狀符合規(guī)定78.92、高溫試驗(yàn)儀器AXGZ-10型醫(yī)用干燥箱取制劑實(shí)施例l的樣品，批號20040906，置6(TC條件下，分別于5天、10天取樣測定各項(xiàng)有關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見2。_表2.高溫試驗(yàn)_時間(天)外觀鑒別含量(％)0白色，疏松粉末狀符合規(guī)定101.25白色，疏松粉末狀符合規(guī)定79.910白色，疏松粉末狀符合規(guī)定72.8經(jīng)試驗(yàn)，本品在強(qiáng)光照射條件下，試驗(yàn)后含量降低。高溫10天時，含量也有降低明顯。加濕試驗(yàn)，因本品的原料易吸潮，故不再檢查此項(xiàng)目。由試驗(yàn)結(jié)果看出本品的C藏條件應(yīng)低溫、遮光、密閉保存。(二)低溫長期放置試驗(yàn)樣品取制劑實(shí)施例l、2、3的樣品，批號20040906、20040919、20040928樣品包裝鋁塑包裝(上市包裝)。試驗(yàn)儀器恒溫恒濕箱試驗(yàn)條件溫度26°C取包裝好的樣品，放入恒溫恒濕箱內(nèi)，分別于3、6、9、12、18、24、36個月取樣測定各項(xiàng)有關(guān)指標(biāo)，測定結(jié)果見表3。表3.低溫長期放置試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>24白色，疏松粉末狀符合規(guī)定97.536白色，疏松粉末狀符合規(guī)定98.3結(jié)果表明，本品在市售包裝條件下，低溫試驗(yàn)前后各項(xiàng)指標(biāo)與0天比較無明顯變化。(三)常溫長期放置試驗(yàn)樣品取制劑實(shí)施例l、2、3的樣品，批號20040906、20040919、20040928樣品包裝鋁塑包裝(上市包裝)。試驗(yàn)儀器恒溫恒濕箱條件溫度30士2。C、相對濕度60±10%取上市包裝樣品，置于留樣室中，分別于3、6、9、12、18、24、36個月取樣測定，測定結(jié)果見表4。表4.常溫長期放置試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果表明，本品常溫長期試驗(yàn)36個月，三批樣品的各項(xiàng)指標(biāo)與O天各項(xiàng)指標(biāo)比較，均無明顯變化。可見，本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑的穩(wěn)定性良好。[試驗(yàn)例2]本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑的鎮(zhèn)痛作用1、小鼠熱板(55°C)鎮(zhèn)痛試驗(yàn)昆明種小鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，符合國家SPF級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。早，體重1822g?；\養(yǎng)，每籠612只。室溫2024'C，自然光照，食水不限。將小鼠隨機(jī)分組，每組15只。陽性對照藥物鹽酸嗎啡(morphinehydrochloride)購自青海制藥廠，批號981101;受試藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑。批號070906，由上海億年生物科技有限公司提供。在熱板測痛儀(GJ-8402型熱板測痛儀)上進(jìn)行熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)。熱板溫度55'C,疼痛反應(yīng)指標(biāo)為舔后足，截止時間(cut-offtime)為60s，測定疼痛反應(yīng)的潛伏期。鎮(zhèn)痛效率計(jì)算公式鎮(zhèn)痛效率(％)=(實(shí)驗(yàn)組的潛伏期-對照組的潛伏期)/(截止時間-對照組的潛伏期)X100%。給藥程序如下皮下注射給予不同劑量的受試藥物或陽性對照藥物，30min后測定小鼠的添后足疼痛反應(yīng)潛伏期。各組均以溶劑為對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，組間比較選用LSD法，并用Bliss法計(jì)算ED50。表5.本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑對小鼠熱傷害刺激(55°C)的鎮(zhèn)痛作用藥物齊懂給藥途徑，？疼^g伏鎮(zhèn)痛效率(。/。)ED:tr溶劑組_皮下注射TTX(ng/kg)1皮下注射2皮下注射4皮下注射8皮下注射16皮下注射嗎啡(mg/kg)2.5皮下注射5.0皮下注射7.5皮下注射1516.0±1.460.0±3.311518,1±1.874.8±4.261521.9±2.4813.3±5.631537.7±3.19***49.2±7.24"*1548.6±2.53"*74.1±5.74***1551.7±2.31***81.1±5.26***1523.3±1.46*16.7±4.50*1540.9±3.08*"56.5±7.01***4.9(3.3-7.8)4.9(2.2-8.1)mg/kg1548.4±2.75***73.6±6.25***__10皮下注射1557.1±1.70***93.5±3.87***__注均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤.*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，與溶劑對照組比較表5結(jié)果顯示，在小鼠熱板(55°C)鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，小鼠皮下注射制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑可以產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑l一16pg/kg呈劑量依賴性延長小鼠在熱板(55°C)上舔后足疼痛反應(yīng)的潛伏期。從低劑量到高劑量，制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑的鎮(zhèn)痛效率分別為4.8%、13.3%、49.2%、74.1%和81.1%。小鼠熱板(55°C)法制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑鎮(zhèn)痛作用ED50及95%可信區(qū)間為4.9(3.3—7.8)嗎/kg。與嗎啡鎮(zhèn)痛作用[4.9(2.2—8.1)mg/kg]相比較，制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)度大約是嗎啡的1000倍。根據(jù)小鼠熱板(55°C)法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑劑量與鎮(zhèn)痛效率的關(guān)系，計(jì)算臨床有效劑量范圍為0.36-0.85pg/kg。研究資料表明，熱板(55°C)疼痛的刺激作用較強(qiáng)。因此，上述推斷的臨床有效劑量適用于中重度疼痛病人。本發(fā)明中其他制劑實(shí)施例的制劑在本試驗(yàn)中具有相似的結(jié)果。2、小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛試驗(yàn)昆明種小鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，符合國家SPF級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。體重1822g?；\養(yǎng)，每籠612只，室溫2024。C,自然光照，食水不限。將小鼠隨機(jī)分組，每組16只，$早各半。陽性對照藥物鹽酸嗎啡(morphinehydrochloride)購自青海制藥廠，批號:981101;受試藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑。批號070906，由上海億年生物科技有限公司提供。試驗(yàn)以0.6%醋酸為致痛劑。皮下注射給予不同劑量的制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑(受試藥物)或鹽酸嗎啡(陽性對照藥物)，以溶劑為陰性對照。30min后，每只腹腔注射0.6%的醋酸0.2ml,立即記錄15min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。以小鼠出現(xiàn)腰部肌肉反復(fù)收縮、拱背、臀部扭轉(zhuǎn)和后肢伸展為扭體反應(yīng)陽性。將給藥組和溶劑組小鼠扭體數(shù)進(jìn)行比較，并式計(jì)算鎮(zhèn)痛效率。計(jì)算公式鎮(zhèn)痛效率(％)=(對照組的扭體次數(shù)-實(shí)驗(yàn)組的扭體次數(shù))/對照組的扭體次數(shù)X100。/。。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，組間比較選用LSD法，并用Bliss法計(jì)算ED50。表6.本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑對小鼠化學(xué)性傷害刺激(0.6。/。醋酸)的鎮(zhèn)痛作用藥物劑量給藥途徑動物數(shù)(只)扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛效率(％)溶劑組一皮下注射1630.4±2.290.1±7.54TTX(嗎/kg)0.5皮下注射1626.2±2.2413.8±7.361.0皮下注射1623.1±3.06*23.9±10.06*2.0皮下注射1614,7±1.59,51.5±5.23***4.0皮下注射167.3土.11***75.9±3.66***8.0皮下注射163.1±0.65***89.9土2,13憎嗎啡(mg/kg)0.25皮下注射1626.9±1.8411.6±6.060.50皮下注射1623.4±2.63*23.1±8.65*1,00皮下注射1614.8±2.08***51.3±6.84***2.00皮下注射168.4±1.23***72.2±4.07*"ED50及95X可信區(qū)間1.9(1.7-2.2)—kg1.0(0.9-1.2)mg/kg注均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤.*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，與溶劑對照組比較表6結(jié)果顯示，在小鼠醋酸(0.6%)扭體的鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，給小鼠皮下注射制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑可以明顯抑制腹腔注射0.6%醋酸所致小鼠扭體的疼痛反應(yīng)，呈劑量依賴性。低劑量0.5Ug/kg制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑的鎮(zhèn)痛效率為13.8%,高劑量8yg/kg可達(dá)到89.9%。小鼠醋酸(0.6扭體法制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑鎮(zhèn)痛作用的ED50及95X可信區(qū)間為1.9(1.7~2.2)wg/kg，嗎啡的ED50及95X可信區(qū)間為1.0(0.9~1.2)ug/kg。相比之下，制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑抗小鼠醋酸(0.6%)扭體疼痛反應(yīng)的作用強(qiáng)度大約是嗎啡的526倍。根據(jù)小鼠醋酸(0.6%)扭體法制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑劑量與鎮(zhèn)痛效率的關(guān)系，計(jì)算臨床有效劑量范圍為0.190.24iig/kg。與熱板(55°C)疼痛刺激相比較，小鼠腹腔注射0.6%醋酸的疼痛刺激較弱。因此，上述推斷的臨床有效劑量適用于中輕度疼痛病人。本發(fā)明中其他制劑實(shí)施例的制劑在本試驗(yàn)中具有相似的結(jié)果。3、本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑鎮(zhèn)痛作用的時效關(guān)系昆明種小鼠,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，符合國家SPF級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。體重1822g?；\養(yǎng)，每籠612只.室溫2024°C,自然光照，食水不限。將小鼠隨機(jī)分組，每組10只，$早各半。陽性對照藥物鹽酸嗎啡(morphinehydrochloride)購自青海制藥廠，批號:981101;受試藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑。批號070906，由上海億年生物科技有限公司提供。試驗(yàn)以0.6%醋酸為致痛劑。皮20下注射給予4pg/kg的制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑。分別于5、10、15、30、60、120、180、240、300、360min后，每只腹腔注射0.6%的醋酸0.2ml，立即記錄15min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。以小鼠出現(xiàn)腰部肌肉反復(fù)收縮、拱背、臀部扭轉(zhuǎn)和后肢伸展為扭體反應(yīng)陽性。將給藥組和溶劑組小鼠扭體數(shù)進(jìn)行比較，并計(jì)算鎮(zhèn)痛效率。計(jì)算公式鎮(zhèn)痛效率(％)=(對照組的扭體次數(shù)-實(shí)驗(yàn)組的扭體次數(shù))/對照組的扭體次數(shù)X100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA),組間比較選用LSD法。根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇鎮(zhèn)痛效率為75.9%的制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑劑量4ug/kg，釆用小鼠醋酸(0.6%)扭體法則測定制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑鎮(zhèn)痛作用的時-效關(guān)系。表3的結(jié)果顯示，給小鼠皮下注射制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑4wg/kg，鎮(zhèn)痛作用在給藥后IOmin起效，60min后達(dá)到最大鎮(zhèn)痛效率72%。制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑的鎮(zhèn)痛作用可持續(xù)6小時。表7.本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑對小鼠醋酸(0.6%)扭體鎮(zhèn)痛作用的時效關(guān)系藥物給藥途徑給藥間隔時間(min)動物數(shù)(只)扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛效率(％)P值溶劑組皮下注射301034.3±3.930.0±11.5TTX(4叱/kg)皮下注射51027.0±3.3621.3±9.80.092101024.7±3.6427.9±10.60.028151019.8±3.3542.3±9.80扁301011.8±2.2665.6±6.60扁60109.6±2.1972.0±6.40細(xì)1201013.5±2.3760.6±6.90.0001801012.9±2.8862.4±8.40.0002401018.0±2.4347.5±7.10細(xì)3001019.6士2.8642.8±8.30扁3601026.6±3.5122.4±10.20.076注均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤.P值與溶劑對照組比較。本發(fā)明中其他制劑實(shí)施例的制劑在本試驗(yàn)中具有相似的結(jié)果。[試驗(yàn)例3]本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑的戒毒作用1、嗎啡依賴小鼠納洛酮催促戒斷治療試驗(yàn)昆明種小鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，符合國家II級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。體重1822g?；\養(yǎng)，每籠612只.室溫2024°C,自然光照，食水不限。藥品及試劑受試藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑，批號070906，由上海億年生物科技有限公司提供。1(^g/ml，用溶劑配成所需濃度；鹽酸嗎啡(morphinehydrochloride)購自青海制藥廠，批號:981101;鹽酸納洛酮Sigma公司產(chǎn)，批號42kll84，用生理鹽水配制。給藥途徑及體積皮下注射，給藥體積0.1ml/10g。試驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，早$各半，5組分別為溶劑對照組、4個制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑組。各組按下表每天皮下注射嗎啡3次(8:00，14:00，20:00)，連續(xù)給藥8d，d8早8:00為嗎啡末次給藥。建立嗎啡依賴模型。建立嗎啡依賴模型的給藥程序表<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>嗎啡末次給藥后2小時用鹽酸納洛酮(2mg/kg，0.1ml/10g，腹腔注射)進(jìn)行催促戒斷，催促前30min進(jìn)行治療給藥。溶劑對照組皮下注射溶劑0.1ml/10g;制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑分別皮下注射1、2、4、8ng/kg。記錄催促后小鼠10min內(nèi)的跳躍次數(shù)，以及催促戒斷前和催促戒斷后30min和60min時的體重，以催促戒斷前的體重為基值，計(jì)算催促后的體重變化率。計(jì)算公式體重變化率(％)=(催促后的體重-催促前的體重)/催促前的體重X100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，組間比較選用LSD法。表8.本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑對嗎啡依賴小鼠戒斷反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與溶劑(0嗎/kg)對照組比較。表8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶劑對照給予納洛酮(2mg/kg)催促后，戒斷跳躍次數(shù)為66.8±9.74,催促戒斷30min和60min后體重均下降2.7%，說明小鼠對嗎啡形成了明顯的軀體依賴。在注射納洛酮前，給予治療藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑，呈劑量依賴性抑制戒斷跳躍行為和體重下降，制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑2iig/kg可以明顯減輕催促戒斷30min后的體重下降，4yg/kg和g/kg明顯降低戒斷跳躍次數(shù)和催促戒斷60min后的體重下降。上述結(jié)果表明制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑對嗎啡依賴小鼠的催促戒斷癥狀具有明顯的脫毒治療作用。根據(jù)嗎啡依賴小鼠納洛酮催促戒斷治療試驗(yàn)制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑劑量與脫毒作用的量效關(guān)系，計(jì)算臨床有效劑量范圍為0.22-0.88^g/kg/day。本發(fā)明中其他制劑實(shí)施例的制劑在本試驗(yàn)中具有相似的結(jié)果。2、嗎啡依賴大鼠納洛酮催促戒斷治療試驗(yàn)Wistar大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，符合國家SPF級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。體重180220g。籠養(yǎng)，每籠56只。室溫2024°C,自然光照，食水不限。藥品及試劑受試藥物-制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑，批號070906，由上海億年生物科技有限公司提供。10^ig/ml，用溶劑配成所需濃度；鹽酸嗎啡(morphinehydrochloride)購自青海制藥廠，批號:981101;鹽酸納洛酮Sigma公司產(chǎn)，批號42kl184，用生理鹽水配制。給藥途徑及體積皮下注射，給藥體積0.1ml/10g。試驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，早$各半，5組分別為溶劑對照組、4個制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑組。采用劑量遞增法建立嗎啡依賴大鼠模型。皮下注射嗎啡，每天2次(8:00,16:00)，連續(xù)6d。嗎啡日劑量d120mg/kg,d240mg/kg,d360mg/kg，d480mg/kg,d5100mg/kg,d68:00AM,皮下注射嗎啡50mg/kg,6h后，皮下注射制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑1、2、4、8嗎/kg。30min后，腹腔注射納洛酮2mg/kg，立即放入12cmX29cmX15cm(長X寬X高)的透明有機(jī)玻璃盒中觀察并記錄15min內(nèi)大鼠的戒斷癥狀評分以及催促前后30min和60min內(nèi)大鼠的體重變化。并以催促戒斷前的體重為基值，計(jì)算催促后的體重變化率。計(jì)算公式體重變化率(％)=(催促后的體重-催促前的體重)/催促前的體重X100%。大鼠的戒斷癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)(1)跳躍、濕狗樣搖體、扭體、搖頭、打哈欠、掃尾、激惹(以尖叫為準(zhǔn))O分-無；1分=1-5次；2分=6-10次；3分>10次。(2)齒顫、咀嚼(次與次之間至少間隔3S):0分=無；1分=1-10次；2分=11-20次；3分>20次。(3)流涎、流淚、毛發(fā)直立、眼瞼下垂、腹瀉0分=無；1分=輕度；2分=中度；3分=重度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，組間比較選用LSD法。表9.本發(fā)明產(chǎn)品河豚毒素制劑對嗎啡依賴大鼠戒斷反應(yīng)的影響TTX動物數(shù)體重變化(％),T:X、給藥途徑，，，戒斷癥狀分-(—kg)(只)30min60min注:均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤.*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，與溶劑(0嗎/kg)對照組比較。在表8的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了嗎啡依賴大鼠模型。表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:溶劑對照組的大鼠給予納洛酮(4mg/kg)催促后，戒斷癥狀的評分達(dá)到12.2土0.91，催促戒斷30min和60min后體重分別下降5.4%和6.7%，說明大鼠對慢性嗎啡給藥形成了明顯的軀體依賴。催促戒斷前，給予治療藥物制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑0.75-6pg/kg呈劑量依賴性降低嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的分值，抑制催促戒斷30min和60min后體重下降，劑量為1.5，3禾口6yg/kg時與溶劑對照組相比較，戒斷癥狀分值和體重下降均明顯減輕，表明制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑對嗎啡依賴大鼠納洛酮催促的戒斷反應(yīng)同樣具有明顯的脫毒治療作用。根據(jù)嗎啡依賴大鼠納洛酮催促戒斷治療試驗(yàn)，制劑實(shí)施例5的河豚毒素凍干粉針劑劑量與脫毒作用的量效關(guān)系，計(jì)算臨床有效劑量范圍為0.230.93yg/kg/da。本發(fā)明中其他制劑實(shí)施例的制劑在本試驗(yàn)中具有相似的結(jié)果。1212.2±0.91-5.4±0.57-6.7±0.55129.8±1.17—4.2±0.99-5.8±1.03128.4±0.67林—2.6±0.49**—4.2±0.74*126.4±1.05林*-1.8±0.40***-2.8±0.34***125.0±0.60*林-1.8±0.38***-2.1±0.40***寸-T寸寸，tj注注注注注皮皮皮皮皮權(quán)利要求1、一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的制劑包括作為藥物活性成份的小劑量河豚毒素和選自藥學(xué)上允許的助溶劑或支架劑，所述的助溶劑為氨基酸。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的小劑量河豚毒素為每制劑單位含有5-20pg河豚毒素。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的制劑為由河豚毒素、助溶劑和注射用水配制的每制劑單位含有5-20pg河豚毒素的注射劑。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的制劑為由河豚毒素、助溶劑、支架劑和注射用水配制的每制劑單位含有5-20pg河豚毒素的凍干粉針劑。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的助溶劑為氨基酸或其鹽酸鹽，優(yōu)選天門冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、絡(luò)氨酸、纈氨酸、組氨酸或L-半胱氨酸鹽酸鹽，更優(yōu)選天門冬氨酸。6、根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的支架劑為甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、葡萄糖或右旋糖酐，優(yōu)選甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更優(yōu)選比為5:l的甘露醇-葡萄糖或4:1的甘露醇-右旋糖酐。7、根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，所述的河豚毒素采用如下方法制備1)將河豚的卵巢或肝臟絞碎、勻漿，用含乙酸的醇溶液攪拌浸泡，將浸泡液過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得粗毒液；2)將上步獲得的粗毒液離心、過濾，得濾液；濾渣用含3~5%乙酸的水溶液洗漆，將洗漆液合并到濾液中，靜置，分離水層和上層油層，油層放置用于精制河豚魚肝油；3)將上步的水層濾過，濾液過弱酸性陽離子交換樹脂柱，洗脫，收集洗脫液；4)將洗脫液減壓濃縮，所得的濃縮液過葡萄糖凝膠柱，洗脫，收集洗脫液，合并減壓濃縮，得濃縮液；5)將濃縮液用氨水調(diào)pH值至8-9，在51(TC溫度下放置45-50小時后，沉淀過濾、洗滌、干燥、精制，富集TTX峰的餾分，減壓濃縮、冷凍干燥即得。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于，步驟l)中所述的浸泡為含3~5%醋酸的30%-100%甲醇或乙醇溶液攪拌浸泡3~6次。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于步驟2)中所述的洗滌為洗滌2-4次，優(yōu)選3次；步驟2)中所述的靜置為在5-15'C溫度下，放置8-12小時。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑，其特征在于步驟3)中的洗脫為先用水洗脫，再用10%醋酸洗脫；步驟4)中的洗脫為用含5%醋酸的50%乙醇溶液洗脫。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于戒毒、鎮(zhèn)痛的河豚毒素制劑。該制劑包括作為藥物活性成份的小劑量河豚毒素和選自藥學(xué)上允許的助溶劑或支架劑，所述的助溶劑為氨基酸。本發(fā)明中選用氨基酸作助溶劑，不僅能起到助溶劑的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，還能與河豚毒素形成高水溶性的鹽溶液。本發(fā)明所用的河豚毒素采用本發(fā)明特定的方法制備，所制備的河豚毒素純度高達(dá)98％，收率高。采用本發(fā)明所提供的方法所制備的河豚毒素和氨基酸形成的制劑不僅水溶性良好，而且穩(wěn)定性良好，安全可靠，質(zhì)量穩(wěn)定，不需在特定溫度下的冰箱中保存，室溫下貯存期可達(dá)2年以上，大大節(jié)約了貯藏、運(yùn)輸成本，方便醫(yī)療使用，治療效果顯著，特別是用于生理脫毒，治愈率達(dá)100％。文檔編號A61K47/16GK101317846SQ20081012704公開日2008年12月10日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日發(fā)明者王開業(yè)申請人:王開業(yè)