專利名稱：：聚乙二醇修飾的人白介素-2、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾，具體為一種利用分枝型聚乙二醇修飾白細(xì)胞介素一2。
背景技術(shù)：
：聚乙二醇是中性、無毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，并且沒有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們?cè)谒芤褐械纳锓峙湫袨楹腿芙庑?，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別。聚乙二醇類修飾劑的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)因它們的相對(duì)分子量和注射給藥方式而異，分子量越大，半衰期越長(zhǎng)。經(jīng)過細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，經(jīng)膽汁排泄。藥物的聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的聚乙二醇通過化學(xué)方法偶聯(lián)到蛋白、多肽、小分子有機(jī)藥物和脂質(zhì)體上。其中研究得最多的是蛋白質(zhì)的PEG修飾，始于是20世紀(jì)70年代。蛋白質(zhì)的免疫原性是由于其分子表面的抗原簇所決定的,應(yīng)用線性親水惰性的高分子與蛋白質(zhì)的非活性必需基團(tuán)結(jié)合在其表面形成屏蔽，使其不被識(shí)別,不產(chǎn)生相應(yīng)抗體從而抑制相應(yīng)的免疫反應(yīng)，而連接大分子聚合物后藥物的分子量顯著增大,不易被腎小球所過濾,從而延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期，另外由于大分子親水性,聚合物的表面遮蔽作用在一定程度上減少了蛋白藥物與蛋白酶的相互作用，使藥物的穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。PEG修飾后，往往會(huì)具有以下優(yōu)點(diǎn)1、更長(zhǎng)的半衰期2、較低的最大血藥濃度3、血藥濃度波動(dòng)較小4、較少的酶降解作用5、較少的免疫原性及抗原性6、較小的毒性7、更好的溶解性8、用藥頻率減少9、提高病人的依從性，提高生活質(zhì)量，降低治療費(fèi)用9、脂質(zhì)體對(duì)腫瘤有更強(qiáng)的被動(dòng)靶向作用。修飾途徑對(duì)蛋白和多肽主要有氨基修飾(包括N端氨基的?；揎?、賴氨酸側(cè)鏈氨基的酰化修飾、N端氨基的烷基化修飾)、羧基修飾、巰基修飾，還有其它如控制pH實(shí)現(xiàn)SC-mPEG選擇性修飾蛋白質(zhì)中的組氨酸側(cè)鏈的咪唑基團(tuán)和用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶將mPEG-NH2轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的谷氨酰胺側(cè)鏈上，實(shí)現(xiàn)對(duì)谷氨酰胺的選擇性修飾，其中主要是對(duì)N末端或賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行?；揎?，因?yàn)榈鞍谆蛟S多多肽結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)氨基，所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修飾中的難點(diǎn)，肽類化合物的合成中可以通過采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)策略來實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基的定點(diǎn)修飾，而有機(jī)小分子藥物的PEG修飾3途徑主要是將PEG與這些小分子藥物上的-0H，-NH2,-C00H相偶聯(lián)，如待修飾的小分子藥物不具備這些功能基團(tuán)，可通過化學(xué)方法引入。PEG修飾的相關(guān)技術(shù)主要是以下三個(gè)方面1、PEG的相對(duì)分子量的選擇現(xiàn)在普遍采用的是分子量大于20000的高分子量的PEG作為修飾劑。分子量的選擇要綜合考慮生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)兩方面的因素。已有的研究證明，修飾的蛋白藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間與藕聯(lián)的PEG數(shù)量和相對(duì)分子量成正比，在體外的生物活性與偶聯(lián)的PEG數(shù)量和相對(duì)分子量成反比，應(yīng)用分子量過大的PEG修飾蛋白藥物會(huì)導(dǎo)致藥物喪失絕大部分的生物活性。以往采用低分子量(〈20000〉的PEG修飾蛋白藥物結(jié)果顯示出修飾后的蛋白藥物較原型藥物在生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)上沒有本質(zhì)的改變，修飾時(shí)具體的PEG分子量的選擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，一般選擇分子量在4000(T60000范圍內(nèi)的PEG作為修飾劑。2、修飾位點(diǎn)的選擇蛋白質(zhì)PEG修飾時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的分析，選擇不與受體結(jié)合的蛋白質(zhì)表面殘基作為修飾位點(diǎn)，這樣修飾后的蛋白質(zhì)能夠保留較高的生物活性。有機(jī)小分子藥物的修飾位點(diǎn)與生物活性無關(guān)。理想的PEG修飾技術(shù)是根據(jù)要修飾的位點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)腜EG得到均一性的產(chǎn)品。3、其它化學(xué)因素PEG修飾反應(yīng)需要高度的特異性和溫和的反應(yīng)條件，為得到高產(chǎn)率的、均一的目的修飾產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)過程中要控制反應(yīng)體系的pH值、藥物濃度、反應(yīng)物間的計(jì)量關(guān)系、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度。蛋白藥物的PEG修飾已卓有成效，國際知名的制藥公司己經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的PEG修飾，1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG-ADA被FDA批準(zhǔn)上市，近幾年上市的有PEG-干擾素、PEG-GSF、PEG-生長(zhǎng)抑素。目前處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種，處于臨床實(shí)驗(yàn)的有超氧化物歧化酶(即將上市，Enzon公司)、白介素-2(11期，Chiron公司)、水蛭素(II期，BASFAG公司)、抗-TNFa抗體片段(III期，Pharmacia公司)、牛血紅蛋白(I期，Enzon公司)、抗-PDGF抗體片段(II期，Celltech公司)肽類化合物PEG修飾的研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究，近年來也取得了一些進(jìn)展，如畦降鈣素、表皮生長(zhǎng)因子的PEG修飾產(chǎn)物的半衰期和生物活性顯著高于原型藥物。尤其是肽類化合物在聚乙二醇定點(diǎn)修飾方面較蛋白質(zhì)更易于實(shí)現(xiàn)。在肽類化合物的PEG修飾研究中應(yīng)用最普遍的是mPEG，先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基團(tuán)，或者制備經(jīng)mPEG修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法將其偶聯(lián)到肽序列中去，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N端，C端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾。PEG修飾脂質(zhì)體，PEG修飾后的阿霉素脂質(zhì)體較原型藥物相比降低了心臟毒性，增強(qiáng)了病人的耐受性，在體內(nèi)發(fā)揮控釋和靶向藥物的作用PEG修飾有機(jī)小分子藥物，PEG修飾的喜樹堿已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，適當(dāng)?shù)腜EG修飾后的紫杉醇較修飾前有更好的治療效果、溶解性、選擇性和半衰期。隨著PEG化學(xué)的高速發(fā)展以及許多PEG衍生化試劑的商品化、PEG修飾藥物的優(yōu)越性和PEG修飾蛋白藥物的陸續(xù)上市，可以預(yù)測(cè)藥物的PEG修飾研究將得到越來越廣泛和深入的重視，特別在提高蛋白、多肽藥物的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)半衰期，降低抗腫瘤藥、抗真菌藥、抗生素、免疫抑制劑的毒副作用和提高這些藥物的靶向性，PEG修飾更具有持續(xù)的魅力和非常廣闊的前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是一種分枝型聚乙二醇修飾的重組人白細(xì)胞介素一2其制備方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下-一個(gè)重組人白細(xì)胞介素一2上連接一個(gè)Y-NHS-40K、Y-0-NHS-40K或Y-2-NHS-40K，聚乙二醇連接在IL-2的氨基上，連接到蛋白藥物分子上的PEG，通過對(duì)蛋白分子包裹纏繞，屏蔽蛋白的抗原決定簇，從而降低修飾后藥物的免疫原性，同時(shí)由于屏蔽作用也可防止酶解，此外由于蛋白表觀分子量的提高降低了腎小球通過率，增加藥時(shí)曲線下面積。修飾后藥物蛋白通過S-300純化獲得性質(zhì)均一的純品，經(jīng)過檢驗(yàn)達(dá)到預(yù)期的修飾效果。其特征在于所用白介素一2為重組的人白介素一2，其125位氨基酸突變?yōu)锳la，人白介素-2含有133個(gè)氨基酸殘基，分子量為15.5kDa，天然白介素-2在N端含有糖基，但糖基對(duì)白介素-2生物活性無明顯影響，等電點(diǎn)在6.6-8.2。白介素-2分子含有3個(gè)半胱氨酸，分別位于第58，105和125位氨基酸，其中58位和105位半胱氨酸之間所形成的鏈內(nèi)二硫鍵對(duì)于保持白介素_2生物學(xué)活性起重要作用，在白介素-2基因產(chǎn)物的提純和復(fù)性過程中，如二硫鍵配錯(cuò)或分子間形成二硫鍵都會(huì)降低白介素-2的活性，現(xiàn)利用基因重組技術(shù)將白介素-2分子第125位半胱氨酸改為丙氨酸，改構(gòu)后白介素-2比活性比天然白介素-2明顯增加。所用聚乙二醇優(yōu)選的分子量40KD的Y型聚乙二醇NHS酯。每個(gè)白介素一2上連接一個(gè)PEG為目標(biāo)產(chǎn)物。修飾反應(yīng)中Y—PEG—NHS的用量與白介素一2的摩爾比范圍是10:1-2:1，較多的PEG可導(dǎo)致多修飾物產(chǎn)率增加，而太少的PEG使PEG與白介素一2碰撞幾率減小，不利于修飾產(chǎn)物生成，因而本發(fā)明優(yōu)選的Y—PEG—NHS的用量與白介素一2的摩爾比范圍是4:1-2:1;反應(yīng)的pH范圍應(yīng)控制在6.0-8.5，聚乙二醇與Y—PEG—NHS反應(yīng)條件為弱堿性，但較低的PH更有利于N端氨基修飾，本發(fā)明優(yōu)選ra6.0—7.0，以磷酸鹽為緩沖體系；反應(yīng)的溫度范圍在4-37'C，較低的溫度更有利于蛋白質(zhì)活性的保持且更利于形成單修飾產(chǎn)物，所以本發(fā)明優(yōu)選4-25'C;同時(shí)較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間更增加了多修飾產(chǎn)物的產(chǎn)率，所以本發(fā)明更優(yōu)選16-25°C，反應(yīng)6-12h。圖l、Y型聚乙二醇NHS酯修飾的白介素—2及其純化l道為反應(yīng)混合物，2、3、4、5、6、7、8為經(jīng)S—300純化分部收集的樣品。具體實(shí)施方式實(shí)施例1100mg生長(zhǎng)激素純品，溶于20ml20mMPH6.OPB中，加入Y—PEG-NHS酯400mg，25。C反應(yīng)6h，加入2M甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用S—300分離，250咖檢測(cè)，分部收集樣品，可將多修飾物與單修飾物和未修飾的生長(zhǎng)激素分離。7.5X還原型SDS-PAGE檢測(cè)，純度大于95%。依2005年中國藥典檢測(cè)，活性降低60%。免疫動(dòng)物采集抗體血清，測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)修飾后的白介素一2抗體滴度降低，說明修飾后的白介素一2免疫原性降低。Y—PEG-NHS修飾的IL-2藥物致豚鼠全身過敏試驗(yàn)豚鼠60只，雌雄各半，體重250-300g，均分為兩組，將IL-2與Y-PEG-IL-2按人用劑量的三倍腹腔給藥，隔日一次，給藥三次，使其致敏，將IL-2與Y-PEG-IL-2按人用劑量的六倍與致敏后的第14天，21天分別于豚鼠小腿脛靜脈注射激發(fā)，30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。表1豚鼠全身過敏試驗(yàn)級(jí)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注過敏反應(yīng)達(dá)到2級(jí)以上，過敏反應(yīng)為陽性豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果說明，IL-2有較強(qiáng)的全身過敏反應(yīng)，Y-PEG-IL-2具有較低的過敏反應(yīng)。權(quán)利要求1、一種聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素-2，其特征在于采用分枝型聚乙二醇對(duì)白介素-2進(jìn)行修飾。2、如權(quán)利要求1所述聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素一2，其特征在于所述人IL-2是天然人IL-2、基因重組人IL-2或具有天然人IL-2功能的基因突變產(chǎn)物。3、如權(quán)利要求l、2所述的聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素一2，其中的分枝型聚乙二醇為Y-NHS-40K、Y-0-NHS-40K、Y_2-NHS-40K。4、如權(quán)利要求l、2、3所述的聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素一2，其特征在于Y型聚乙二醇NHS酯可在堿性條件下與人白介素一2的自由氨基鍵連接n5、如權(quán)利要求l、2、3、4所述的聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素一2，其特征在于Y型聚乙二醇NHS酯平均分子量為40KD。6、如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價(jià)修飾的人白介素一2，可以通過但不僅限于下述方法制備，該方法主要特征為聚乙二醇與白介素一2用量比(mol/mol)范圍是10:1-1:5;反應(yīng)體系的pH范圍是6.0-8.5;反應(yīng)的溫度范圍是4-37°C。全文摘要本發(fā)明提供一種聚乙二醇修飾的人白細(xì)胞介素-2，以此改善白細(xì)胞介素-2自身的理化特性和生物活性，特別是Y型聚乙二醇NHS酯修飾的白介素-2，與現(xiàn)有技術(shù)相比，Y型聚乙二醇NHS酯在結(jié)構(gòu)與性能上與用于PEGasys上的聚乙二醇NHS相似，但具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性。本發(fā)明優(yōu)選總分子量為40kDa的Y型聚乙二醇，用以提高分子量，從而降低腎小球?yàn)V過率，提高藥物半衰期；采用的分枝型聚乙二醇可增加蛋白藥物分子的空間位阻，從而顯著降低蛋白分子的免疫原性。文檔編號(hào)A61K47/48GK101584866SQ20081011202公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2008年5月21日優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日發(fā)明者吳彥卓,鵬張,徐明波,楊仲璠,王俊玲,連治國申請(qǐng)人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司