專利名稱：：從羅漢果根中提取的皂苷類化合物、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從羅漢果根中分離得到結(jié)構(gòu)新穎的皂苷類化合物；本發(fā)明還涉及上述皂苷類化合物的制備方法及其用途。(二)
背景技術(shù)：
：羅漢果5Y7^'z^a^ro^e/n7(Swingle)C.Jeffrey為葫戶科羅漢果屬多年生宿根莖性的藤本植物，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)、藥用植物，為廣西桂北地區(qū)傳統(tǒng)特產(chǎn)。羅漢果根系發(fā)達(dá)，塊根肥大，味苦，性微寒，具有清熱祛濕，通絡(luò)止痛之功效。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)表明，羅漢果根的提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解莖、降酶等多種作用，臨床試驗(yàn)證明其對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著。對(duì)羅漢果根的提取物進(jìn)行抗腫瘤篩選，發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤譜均顯示有較強(qiáng)的抗癌活性。前人對(duì)羅漢果根已進(jìn)行的化學(xué)成分的研究，主要有1、廣西中醫(yī)藥研究所的王雪芬等人首先從羅漢果根的脂溶性部位，分離并鑒定了2個(gè)三萜酸(見(jiàn)1996年第27巻第9期《中草藥》第515518頁(yè))，經(jīng)光譜鑒定和X-衍射晶體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)它們?yōu)槭嫉暮J垸型四環(huán)三萜酸，分別命名為羅漢果酸甲(SiraiticacidA)，羅漢果酸乙(SiraiticacidB);之后又分離鑒定了羅漢果酸丙(SiraiticacidC)，羅漢果酸丁(SiraiticacidD)(見(jiàn)1998年第29巻第5期《中草藥》第293295頁(yè))。2、中國(guó)醫(yī)科院藥用植物研究所的斯建勇、陳迪華等人也從羅漢果根提物中分離得到這些成分，并且還另得到一個(gè)新的三萜酸，命名為羅漢果酸戊(SiraiticacidE)，還獲得一些已知成分為a_棕櫚精(a-monopalmiten)、a-菠菜甾醇(spinasterol)及硬月旨酸(stearicacid)(見(jiàn)藥學(xué)學(xué)J艮ActaPharmaceuticaSinica1999，34(12):918920)。至今僅見(jiàn)羅漢果根中脂溶性部位的化學(xué)成分的報(bào)道，未見(jiàn)有對(duì)其水溶性皂苷類化合物的報(bào)道。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供從羅漢果根中提取分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的水溶性皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，并且還提供這兩種皂苷類化合物的制備方法及其用途。本發(fā)明從羅漢果根中提取分離的結(jié)構(gòu)新穎的皂苷類化合物，具體有兩種，分別命名為SiraiticacidIIB(羅漢果酸乙苷II)和SiraiticacidIIC(羅漢果酸丙苷n)，其中，SiraiticacidIIB的結(jié)構(gòu)式如下式(I)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>SiraiticacidIIC的結(jié)構(gòu)式如下式(II)所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(II)本發(fā)明還將提供上述皂苷類化合物的制備方法，它包括以下步驟-(1)提取取羅漢果根碎片用甲醇或乙醇溶液加熱回流提取，提取液回收甲醇或乙醇，得到的浸膏溶于蒸餾水中，過(guò)濾，溶液通過(guò)大孔樹(shù)脂柱，依次用水、50%甲醇和100%甲醇洗脫，收集100%甲醇洗脫液，回收甲醇，得總皂苷提取物；(2)分離上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以氯仿甲醇:水的體積比=20:1:0.15:1:0.1的混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份；再經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含目標(biāo)化合物的流份；最后經(jīng)d8反相柱層析，以甲醇:水的體積比=1:44:2的混合溶劑進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，得到SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC。上述制備方法步驟(1)中，羅漢果根碎片用相當(dāng)于其重量的46倍、體積濃度為80100%的甲醇或乙醇溶液加熱回流提取；提取的次數(shù)為23次，每次提取的時(shí)間為24小時(shí)，優(yōu)選提取3次，每次提取23小時(shí)；所述的大孔吸附樹(shù)脂柱可為D101型、AB-8型或DiaionHP20型。對(duì)于羅漢果根碎片一般是將羅漢果根粉碎至1040目。本發(fā)明還包括:從羅漢果根中提取分離得到的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明是從羅漢果根的甲醇或乙醇提取物中分離得到兩種結(jié)構(gòu)新穎的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，申請(qǐng)人經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物體外對(duì)多種腫廇株具有明顯的抑制作用，為研制新的抗腫瘤藥物提供了先導(dǎo)化合物，對(duì)綜合開(kāi)發(fā)利用羅漢果資源具有重要價(jià)值。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:取干燥的采集于廣西桂林永福龍江鄉(xiāng)的羅漢果根碎片(30目)3000克浸泡于15升體積濃度為80。/q的甲醇中，8(TC回流提取3次，每次3小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收甲醇得浸膏120克。浸膏溶于2升蒸餾水中，過(guò)濾，濾液通過(guò)D101型大孔樹(shù)脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏5.1克，然后用硅膠柱層析，以氯仿甲醇:水=20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以體積濃度為100%的甲醇進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含目標(biāo)化合物的部分，經(jīng)U反相柱進(jìn)行分離，以甲醇:水二3:2(v/v)進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，得到SiraiticacidIIB64.6毫克和SiraiticacidIIC42毫克，經(jīng)HPLC檢測(cè)，Siraiticacid1IB純度為98.1%，SiraiticacidIIC純度為99.0%。實(shí)施例2:取干燥的采集于廣西桂林永福龍江鄉(xiāng)的羅漢果根碎片(20目)2000克浸泡于8升體積濃度為80%的甲醇中，8(TC回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏78克。浸膏溶于l升蒸餾水中，過(guò)濾，濾液過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏3.5克，然后用硅膠柱層析，以氯仿甲醇:水=20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以體積濃度為100%的甲醇進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含目標(biāo)化合物的部分，經(jīng)Ci8反相柱進(jìn)行分離，以甲醇:水=4:2(v/v)進(jìn)行洗脫，薄，層析檢測(cè)，得到SiraiticacidIIB40毫克和SiraiticacidIIC25毫克，經(jīng)HPLC檢測(cè)，Siraiticacid1IB純度為98.40/0,SiraiticacidIIC純度為98.2%。實(shí)施例3:取干燥的采集于廣西桂林永福龍江鄉(xiāng)的羅漢果根碎片(40目)3000克浸泡于18升體積濃度為90%乙醇中，85。C回流提取2次，每次4小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓回收乙醇，得浸膏130克。浸膏溶于2升蒸餾水中，過(guò)濾，濾液過(guò)DiaionHP20型大孔樹(shù)脂柱，依次用水，體積濃度為50%的甲醇，體積濃度為100%的甲醇梯度洗脫，收集100%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，得浸膏5.7克，然后用硅膠柱層析，以氯仿甲醇:水二20:1:0.15:1:0.1(v/v)混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份，再經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含目標(biāo)化合物的部分，經(jīng)d8反相柱進(jìn)行分離，以甲醇:水=1:4(v/v)進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，得到SiraiticacidIIB70.5毫克和Siraiticacid1IC48毫克，經(jīng)HPLC檢測(cè)，Siraiticacid1IB純度為99.0。/。，Siraiticacid1IC純度為98.5%。實(shí)驗(yàn)例1材料與儀器1.1材料干燥的羅漢果根碎片(采集于廣西桂林永福龍江鄉(xiāng))1.2儀器TC-15加熱回流提取儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司)；硅膠200-300目(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠柱S印hadexLH-20(瑞典AmershamBioschiencesAB);C18反相材料(Chromatorex日本富士化學(xué)公司)；JEOLA500MHz核磁共振儀(日本分光株式會(huì)社)；JEOLJMS-DX303HF高分辯質(zhì)譜儀(日本電子株式會(huì)社)；METTLERAT200天平(瑞士梅特勒公司)；DIP-1000KUY旋光儀(日本分光株式會(huì)社)；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Bllchi公司)；2010型酶標(biāo)儀(鄭州安圖生物工程有限公司)。2皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的制備同上述實(shí)施例1。3結(jié)構(gòu)分析3.1SiraiticacidIIB的結(jié)構(gòu)分析化合物SiraiticacidIIB為白色無(wú)定形粉末，[a]25D+10.4°(MeOH，C=0.2)。由快原子轟擊高分辨質(zhì)譜得該化合物的精密質(zhì)量數(shù)為817.4073[M+Na]+，推算其分子式為C41H62015H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表l:化合物SimiticacidIIB的^和"'C的麗R數(shù)據(jù)(inC5D5N)Cno."CNMR'HNMR(J)鵬C(H-C)119,91.13(1H，m)，1.52(1H，m)225.61.52，2.1243209.8450.32.61(d,6.8)590.1625.81.91,2.1728.11.18,1.95845,52.04(1H,br.t,9.7)13,30959.91044.82.79(1H,br.t,9.2)1111209.81233.81.151348.71449.11535.91.291634,81.131749.51.561816.60.65(3H，s)13,171974.63.63(8.6),4.71(8.6)102035.81.302118.20.82(3H,d,6.3)17,202239.92.20，2.322350.62.59,2.7924144.67.06(t,6.8,5.8)25，26，2725127.52612.51.92(3H，s)24，25,2727167.1288.41.34(3H,d，6.8)3,4,53019.91.22(3H,s)8,14,15G-l'96.26.44(1H,d，8.0)272,74.24.12(1H,dd，7.3,6.3)Gl'3,78.54,18(1H,dd,7.9，6.3)G2'，G4'4,70.84,35(1H,dd,5.1,6.3)G5'5,77.94.IO(IH，m)G6'6,69.54.76(1H，11.5),4.31(9,8)G5'G-1"105.35.Ol(lH,d，7.5)G6'2"75.14.02(1H,dd，7.5'6.8)Gl",G3"3"78.43.88(1H，m)G2",G4"4"71.44.19(1H,dd,7.9,6.3)G5"5"78.54.18(1H,dd，7.9，6.3)G6"6"62.54.42(1H，d，8.6)，4.28(9.1)G5"500MHzfor13C，500MHzfor'HG—葡萄糖，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為偶合常數(shù)/(Hz)值。由上述表l中的核磁共振數(shù)據(jù)可確定SiraiticacidIIB的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下o3.2SiraiticacidIIC的結(jié)構(gòu)分析化合物SiraiticacidIIC為白色無(wú)定形粉末，[a]25D+18.4°(MeOH，C二0.2)。由快原子轟擊高分辨質(zhì)譜得該化合物的精密質(zhì)量數(shù)為787.4639[M+Na]+,推算其分子式為C4QH6。0I4。'H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。表2:化合物SimiticacidIIA的^和13C的麗R數(shù)據(jù)(inC5D5N)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>"500MHzforI3C,500MHzfor'HG—葡萄糖，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為偶合常數(shù)/(Hz)值。由上述表2中的核磁共振數(shù)據(jù)可確定SiraiticacidIIC的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下o4體外抗腫瘤試驗(yàn)申請(qǐng)人對(duì)制備得到的化合SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC進(jìn)行了體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明兩種化合物均具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗(yàn)選用的細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株，為A549(肺癌)，H印-G2(肝癌)，試驗(yàn)方法為國(guó)際通用的MTT法。4.1SiraiticacidIIB的體外抗腫瘤試驗(yàn)4.1.1試驗(yàn)方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H印-G2癌細(xì)胞株，細(xì)胞計(jì)數(shù)法后用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)配成濃度為5000個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入190ul腫瘤細(xì)胞，在37。C及5%C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)后加樣品化合物Siraiticacid1IB(10ul/孔)，設(shè)10、20、50、100、150、200ug/ml6個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，在37'C及5%C02條件下培養(yǎng)96小時(shí)后，棄去孔中培養(yǎng)液，每孔加入200ul、0.2mg/mlMTT溶液(用1640培養(yǎng)基配制)，震蕩混勻后繼續(xù)在37。C及5%C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，加DMS0200ul/孔,酶標(biāo)儀測(cè)定其0D,值，計(jì)算抑制率，并通過(guò)濃度-抑制率曲線求IC5Q。抑制率％二(l-實(shí)驗(yàn)組平均0D值/對(duì)照組平均0D值)X100%。4.1.2試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示當(dāng)樣品作用96小時(shí)后，化合物Siraiticacid1IB對(duì)A549和H印-G2癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的半數(shù)抑制濃度IC幼分別為9.2Pg/ml和5.9Pg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物SiraiticacidIIB對(duì)A549和Hep-G2癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。4.2SiraiticacidIIC的體外抗腫瘤試驗(yàn)4.2.1實(shí)驗(yàn)方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印-G2癌細(xì)胞株，方法及設(shè)置同上述SiraiticacidIIB的抗腫瘤試驗(yàn)。4.2.2試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示當(dāng)樣品作用96小時(shí)后，化合物SiraiticacidIIC對(duì)癌細(xì)胞H印-G2的生長(zhǎng)抑制作用的半數(shù)抑制濃度IG。為10.4Pg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物SiraiticacidIIC對(duì)H印-G2癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。權(quán)利要求1、從羅漢果根中提取分離的結(jié)構(gòu)新穎的皂苷類化合物，其特征在于所述皂苷類化合物為SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，其中，SiraiticacidIIB的結(jié)構(gòu)式如下式(I)所示SiraiticacidIIC的結(jié)構(gòu)式如下式(II)所示2、權(quán)利要求1所述皂苷類化合物的制備方法，其特征在于它包括以下步驟(1)提取取羅漢果根碎片用甲醇或乙醇溶液加熱回流提取，提取液回收甲醇或乙醇，得到的浸膏溶于蒸餾水中，過(guò)濾，溶液通過(guò)大孔樹(shù)脂柱，依次用水、50%甲醇和100%甲醇洗脫，收集100%甲醇洗脫液，回收甲醇，得總皂苷提取物；(2)分離上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以氯仿甲醇:水的體積比=20:1:0.15:1:0.1的混合溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC的流份；再經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadexLH-20層析，以100%甲醇進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含目標(biāo)化合物的流份；最后經(jīng)ds反相柱層析，以甲醇:水的體積比=1:44:2的混合溶劑進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)，得到SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的皂苷類化合物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述甲醇或乙醇溶液的體積濃度為80100%，其用量為羅漢果碎片重量的46倍。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂苷類化合物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述提取的次數(shù)為23次，每次提取的時(shí)間為24小時(shí)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂苷類化合物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述大孔吸附樹(shù)脂柱為D101型、AB-8型或DiaionHP20型。6、權(quán)利要求1所述的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SimiticacidIIC在制備抗腫瘤藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為從羅漢果根中提取分離得到的皂苷類化合物SiraiticacidIIB和SiraiticacidIIC，其制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。上述兩種化合物的分子式分別為C₄₀H₆₀O₁₄和C₄₁H₆₂O₁₅，經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是應(yīng)用二維核磁共振譜的綜合解析，確定了這兩種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，化合物SiraiticacidIIB對(duì)肺癌細(xì)胞A549和肝癌細(xì)胞Hep-G2有明顯的抑制作用，化合物SiraiticacidIIC對(duì)肝癌細(xì)胞Hep-G2也有明顯抑制作用。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了先導(dǎo)化合物，對(duì)綜合開(kāi)發(fā)利用羅漢果資源具有重要價(jià)值。文檔編號(hào)A61K31/7048GK101440118SQ20081010742公開(kāi)日2009年5月27日申請(qǐng)日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者劉金磊,盧藝芳,盧風(fēng)來(lái),文永新,李典鵬,野原稔弘,陳月圓,黃永林申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所