專利名稱：：一種含人bmp重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有含人BMP基因的重組腺病毒載體，更具體地說是基于GatewayTM技術(shù)基礎(chǔ)上的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：骨形成蛋白于1965年由Urist")首次發(fā)現(xiàn)以來，人們發(fā)現(xiàn)BMP家族有20多個成員，BMP1—BMP21["，其中人的7個BMP成員基因已被克隆。BMP和重組人骨形成蛋白(recombinanthumanbonemorphogenticprofein,rhBMP)能誘導(dǎo)骨形成，具有獨特的誘導(dǎo)成骨活性，在修復(fù)骨質(zhì)缺損和促進骨折愈合等方面可以發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外學(xué)者對BMP和rhBMP做的大量研究結(jié)果表明，BMP具有修復(fù)臨界骨缺損、促進骨折愈合的特點。其中rhBMP-2被認為具有最高的生物活性，是最具有前途的骨誘導(dǎo)蛋白，能促使原位和異位成骨，被認為是最具有前途的骨誘導(dǎo)物質(zhì)，BMP-2有效誘導(dǎo)骨前體細胞向成骨細胞分化是其刺激新骨形成的機制[3]。但由于天然BMP-2在體內(nèi)含量極微，半衰期短，提取困難，使得對BMP-2的進一步研究和應(yīng)用受到局限。rhBMP-2與骨組織中提純的BMP具有類似的理化性質(zhì)，單純植入體內(nèi)擴散太快，也易被蛋白酶分解，因而，不能在有效的時間內(nèi)作用于更多的靶細胞，其透骨活性難以得到充分發(fā)揮。成骨的機制可能是植入到動物體內(nèi)的rhBMP-2能誘導(dǎo)軟骨細胞、骨細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的BMP-2。這些內(nèi)源性的BMP-2積聚在軟骨基質(zhì)處，被軟骨細胞吸收，然后與外源性的rhBMP-2—起誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞、成軟骨細胞形成新骨[4]。釆用BMP-2的基因治療手段，可在一定時期內(nèi)獲得持續(xù)的成骨效應(yīng)，有望用于解決臨床上因骨缺損及骨創(chuàng)傷等骨疾病引起的骨修復(fù)問題，目前已有學(xué)者在動物試驗中發(fā)現(xiàn)采用BMP-2進行骨基因治療能加快骨創(chuàng)傷的愈合[5_7]。但由于rhBMP-2比天然BMP-2的誘導(dǎo)成骨活性低，所以至今仍未能在臨床上得到推廣應(yīng)用。究其原因，關(guān)鍵問題是理想的載體的選擇，腺病毒載體是常用載體之一8]。構(gòu)建攜帶有目的基因的重組病毒載體是重要的轉(zhuǎn)基因途徑。在以往采用的載體系統(tǒng)中，棵基因質(zhì)粒直接注射和脂質(zhì)體介導(dǎo)的導(dǎo)人方法存在著基因表達持續(xù)時間短，轉(zhuǎn)染效率低等缺陷，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能轉(zhuǎn)染增殖細胞，而且是通過整合到宿主細胞的基因中產(chǎn)生表達，這會導(dǎo)致插人基因的過表達，而不適合骨修復(fù)中階段性表達的需要，同時這種整合有誘導(dǎo)突變的可能，病毒滴度也不高[5]。重組腺病毒載體具有生物安全性好，轉(zhuǎn)染效率高，靶細胞范圍廣，不僅能轉(zhuǎn)染增殖細胞也可轉(zhuǎn)染非增殖細胞，又不整合到宿主細胞基因組中以及能獲得高滴度等優(yōu)點，是目前廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因載體，其表達的時空差異性更適合應(yīng)用于骨修復(fù)的基因治療。BMP2轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)成骨可實現(xiàn)一定時間內(nèi)的BMP2持續(xù)表達，克服直接應(yīng)用的不足，近十年來受到廣泛關(guān)注。迄今為止，病毒型和非病毒型BMP2表達載體都已被用于BMP2基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)成骨研究，其中BMP2腺病毒表達載體(Ad-BMP2)介導(dǎo)的BMP2轉(zhuǎn)基因方法被認為是其中最有效的手段[9]。目前構(gòu)建重組腺病毒系統(tǒng)的策略主要有三種1.體外直接連接由Clontech公司開發(fā)的Adeno-X系統(tǒng)；2.在細菌中重組的策略1998年He等闊建立的AdEasy系統(tǒng)，將線性化的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進行細菌內(nèi)同源重組，所得重組腺病毒質(zhì)?？梢酝ㄟ^卡那霉素篩選出，并通過質(zhì)粒大小和限制性內(nèi)切酶分析鑒定。最后，Pacl酶切后的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293或911細胞包裝產(chǎn)生重組腺病毒；3.在293細胞中重組的策略(AdMax系統(tǒng))。體外直接連接法是一種傳統(tǒng)的酶切連接法，效率低，并且腺病毒基因組上適宜于克隆的酶切位點有限，因而限制了該法的應(yīng)用，細菌中重組和293細胞中重組是應(yīng)用同源重組的原理，都存在構(gòu)建復(fù)雜，篩選費時，效率低等缺陷，還不能完全避免野生型病毒的產(chǎn)生[11)。因此，嘗試采用一種構(gòu)建方便和高效的腺病毒載體構(gòu)建策略是非常有必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明構(gòu)建了表達人BMP基因的重組腺病毒載體，為釆用BMP基因治療大段骨缺損奠定基礎(chǔ)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BoneMorphogeneticProtein-2,BMP-2)屬于(3-轉(zhuǎn)化生長因子(Transforminggrowthfactor-|3，TGF-p)超家族成員之一，在胚胎發(fā)生和發(fā)育，組織與細胞的增殖分化等方而起著重要作用12]，BMP-2的高效誘導(dǎo)成骨活性已被越來越多的實驗證實，天然BMP-2在體內(nèi)含量極微，半衰期短，難以在體內(nèi)維持持續(xù)的促成骨效應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療應(yīng)用于臨床已有了可行性。而基因治療載體的選擇最為重要，當今運用最廣泛的就是腺病毒(adenovirus,Ad)載體，具有在哺乳動物及其多種細胞上進行基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達的高效性和不整合宿主細胞的性質(zhì)，是一種比較安全，轉(zhuǎn)染效率又高的載體[13]。但是由于傳統(tǒng)方法繁瑣費時，對實驗室條件要求較高并需要一定經(jīng)驗等因素而嚴重束縛了其使用，因此建立簡單、快速的獲得重組腺病毒的方法一直是Ad載體研究的熱點和難點。目前報道的重組腺病毒構(gòu)建方法較復(fù)雜，構(gòu)建周期長，導(dǎo)致重組腺病毒構(gòu)建的成功率較低[14'。BLOCK-iTTM重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，由Invitrogen公司開發(fā)，其核心是GatewayTM技術(shù)，該技術(shù)是基于入噬菌體的位點特異性高效重組系統(tǒng)，其不同于以往的費時及效率低的方法，可實現(xiàn)載體在多個目的表達系統(tǒng)間的平行轉(zhuǎn)移和基因的快速克隆，同時仍保持正確的開放讀碼框和方向，該技術(shù)利用ccdB選擇方法，避免了以往重組過程中的反復(fù)鑒定和純化[11)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種快速高效構(gòu)建重組人BMP(包括BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP12等)腺病毒載體的方法，本實驗采用的Gateway"^技術(shù)是基于不同于既往的重組策略的入(lambda)噬菌體的位點特異性重組系統(tǒng)(attLxattR—attBxattP)，在GatewayLRClonaseII酶介導(dǎo)下，attL總是與attR發(fā)生準確地重組反應(yīng)，形成包含attB，attP位點的產(chǎn)物質(zhì)粒。在本實驗中，將目的基因BMP-2片段亞克隆到包含兩個attL(attLl、attL2)位點的穿梭載體pEC3.1(+)中，形成(入門克隆)穿梭克隆pEC3.1-BMP2，用穿梭克隆和帶有兩個attR(attRl、attR2)位點的復(fù)制缺陷性腺病毒骨架載體pAd/BLOCK-iTTM-DEST，在GatewayLRClonaseII重組酶作用下在體外發(fā)生重組反應(yīng)，其實質(zhì)是在pEC3.1-BMP2中的attL(sttLl、attL2)位點與pAd/BLOCK-iTTM-DEST中的attR(attRl、attR2)位點--兩特異性位點間發(fā)生重組反應(yīng)，BMP-2轉(zhuǎn)入pAd/BLOCK-iT-DEST中，替換其中包含的attR基因，反應(yīng)嚴格保守，保持方向和ORF(開放閱讀碼框)不變，避免了反應(yīng)過程中因堿基突變而導(dǎo)致構(gòu)建失敗的可能，整個反應(yīng)只需在25。C下持續(xù)一小時，具有相當?shù)母咝?。該技術(shù)還利用ccdB選擇方法，目的載體pAd/BLOCK-iT-DEST和穿梭克隆pEC3.l-BMP2發(fā)生重組反應(yīng)時,pAd/BLOCK-iT-DEST中的ccdB被BMP-2基因取代，生成Ad-hBMP2和帶attP的副產(chǎn)物，將這些反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5a后，經(jīng)搖菌擴增，氨千LB培養(yǎng)基平板上只能篩選出帶表達克隆Ad-hBMP2的細胞，帶attR的目的載體pAd/BLOCK-iT-DEST和帶attP反應(yīng)副產(chǎn)物的細胞都不會生長，這就避免了以往構(gòu)建策略中復(fù)雜的重組子篩選和反復(fù)純化過程，由此高效率地分離出重組克隆Ad-hBMP2。因此本實驗利用GatewayTM技術(shù)，快速高效的構(gòu)建了Ad-hBMP2，有效縮短了構(gòu)建周期，提高了構(gòu)建效率，為進一步采用BMP-2進行骨基因治療奠定了實驗基礎(chǔ)。腺病毒載體的優(yōu)點使它在眾多載體系統(tǒng)中脫穎而出，本發(fā)明構(gòu)建的Ad-BMP是E1區(qū)和E3區(qū)缺失的第二代復(fù)制缺陷型病毒，E1和E3缺失，病毒基因最大量的減少，增加了生物安全性，同時使插入的外源基因增大，可達6.5kb，提高了載體的適應(yīng)性和穩(wěn)定性。E1區(qū)和E3區(qū)基因是腺病毒復(fù)制必需的基因，這就要求這種完整腺病毒的復(fù)制必須在E1區(qū)和E3區(qū)基因轉(zhuǎn)染的細胞中進行，而293細胞正是為適應(yīng)這一需要而轉(zhuǎn)化了E1區(qū)和E3區(qū)基因的包裝細胞，病毒在不能夠才是供E1區(qū)的細胞中只能實現(xiàn)外源基因的表達而承身不具備增殖能力，這就決定了復(fù)制缺陷型病毒在靶細胞中只有一次感染機會而無復(fù)制能力，從而完成復(fù)制缺陷型病毒載體的功能，避免腺病毒本身對靶細胞的損害，達到基因轉(zhuǎn)移的目的，該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后持續(xù)表達目的基因的時間可達1—2周時間[4'8]，適合我們后續(xù)實驗骨基因治療的需要。Gateway技術(shù)說明在BP反應(yīng)中基因轉(zhuǎn)移形成入門克隆(穿梭克隆)，在LR反應(yīng)中入門克隆可以作為反應(yīng)物產(chǎn)生最終的表達克隆。TA反應(yīng)是利用目的基因片段與克隆載體pMDx-T反應(yīng)，形成一個TA克隆，便于DNA測序，然后通過酶切消化、連接，將目的基因BMP-2片段亞克隆到包含兩個attL(attLl、attL2)位點的穿梭載體pEC3.1(+)中，創(chuàng)建一個入門克隆。LR反應(yīng)是一個attL入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應(yīng)。LR反應(yīng)用來在平行的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移目的序列到一個或更多個目的載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這個基因存在于Gateway目的載體、供載體(donorvector)和一些入門載體。當目的載體和入門克隆發(fā)生重組時，ccdB基因被目的基因取代。攜帶有ccdB基因的未反應(yīng)載體、或保留有ccdB基因副產(chǎn)品的細胞將不會生長。這將允許高效回收那些想要的克隆。表2:反應(yīng)和術(shù)語總結(jié)圖1為Gateway4支術(shù)流程示意圖2為pMD-19Tsimplevector克隆載體圖i普；圖3為p0TB7-BMP2克隆報告；圖4為pEC3.1(+)腺病毒穿梭質(zhì)粒圖譜；圖5為pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒骨架質(zhì)粒圖譜；圖6為BMP2PCR電泳結(jié)果；圖7為TS-BMP2酶切電泳結(jié)果；圖8為pEC3.1-BMP2酶切電泳結(jié)果；圖9為pAd-BMP2PCR電泳結(jié)果；圖10為圖10pAd-BMP2酶切電泳結(jié)果；圖11為rAd5-BMP2PCR電泳結(jié)果；圖12為TS-證2基因測序相關(guān)圖。具體實施例方式以下通過實施例來描述本發(fā)明，應(yīng)該指出的是，所列舉的實施例不應(yīng)理解對發(fā)明的限制。重組人BMP-2腺病毒載體的構(gòu)建1.1主要試劑DMEM-LG(GIBIC0，USA);FBS(GIBIC0，USA);GatewayLRClonaseIIEnzymeMix(Invitrogen,USA);pMD19-TSimpleVector克隆載體(TaKaRa，Japan),見圖2;METAFECTENEPRO轉(zhuǎn)染試劑(Biontex，Germany);質(zhì)粒提取試劑盒(特維潔)；DNA回收純化試劑盒(TaKaRa，Japan);DNAMaker2000(TaKaRa，Japan);TaqDNA聚合酶;EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶(TaKaRa，Japan)。1.2主要4義器PCR儀(BiometraTpersonal)、雙穩(wěn)電泳儀(北京市六一儀器廠)、多功能紫外線透射儀(上海顧村電光儀器廠)、低溫高速離心機、倒置顯微鏡(OLYMPUS)、恒溫氣浴搖床(北京市六一儀器廠)。1.3質(zhì)粒、細胞與菌4朱pOTB7-BMP_2質(zhì)粒(ATTC，USA),GenBankAccession:BC069214,克隆4良告見圖3;BLOCK-iT系統(tǒng):AdenovirusExpressionSystem(Invitrogen):pEC3.1(+)腺病毒穿梭質(zhì)粒,質(zhì)粒圖譜見圖4;pAd/BL0CK-iTTM-DEST腺病毒骨架質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜見圖5;HEK293(ATTC,USA);大腸桿菌DH5a(ATTC，USA);1.4引物i殳計與引物合成以GenBank中已發(fā)表的人BMP-2的cDNA序列為模板，借助計算機引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0，設(shè)計2條引物(由Invitrogen公司上海分部合成)BMP2-f:5'-CGGGATCCGCCACCATGGTGGCCGGGACCCGCTGTCTT-3',含BamHI酶切位點及相應(yīng)保護石咸基；BMP2-r:5'-GGAATTCTGCTGTACTAGCGACACC-3、含EcoRI酶切位點及相應(yīng)J呆護A威基。1.5PCR擴增BMP-2基因以上述pOTB7-BMP2基因為模板，PCR擴增BMP2基因片段。在EP管中依次加入以下反應(yīng)物10xLAPCRBuffer(Mg2+plus)2.5|nl、LATaq0.25|ul、dNTP(2.5mM)l|al、BMP2-f(IOjuM)0,25jul、BMP2-r(IOjuM)0,25|il、p0TB7—BMP2ljul、力。dH20至25pi反應(yīng)體系中進行反應(yīng)；反應(yīng)條件94°C、5min;94°C、20s，53°C、25s，72。C、75s，30個循環(huán);72。C延伸3min,置4。C水箱保存。將PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用DL2000Marker做分子量標準，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照，并用DNA膠回收純化試劑盒回收BMP2條帶。1.6連接PCR產(chǎn)物至T載體中并測序以上回收的PCR產(chǎn)物亞克隆入pMD19-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，才兆耳又陽性克隆用BamHI和EcoRI進行雙酶切鑒定。選取酶切鑒定正確的克隆(重組質(zhì)粒TS-BMP2)委托Invitrogen7>司上海分部進行測序，乂人上、下游兩端進行核苷酸全序列分析，其結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析及BLAST軟件分析，以驗證重組質(zhì)粒TS-BMP2的^確性。1.7亞克隆BMP2至穿梭載體pEC3.1(+)上用BamHI和EcoRI將TS-BMP2及目的載體pEC3.1(+)兩步法雙酶切，然后在T4DNALigase作用下進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5cc中，挑取An^抗性單菌落，提耳又質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI雙酶切進4亍鑒定，荻4尋陽性重組子pEC3.1-證2。1.8將BMP2表達框轉(zhuǎn)移至pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒表達栽體上通過LR體外同源重組將BMP2表達框轉(zhuǎn)移至pAd/BLOCK-iT-DEST腺病毒表達載體上，LR體外同源重組反應(yīng)體系pEC3.1-BMP23ju1，pAd/BLOCK-iT-DEST腺病毒載體(0.25jng/p1)0,5ju1，GatewayLRClonaseIIEnzymeMix2|ul,力oTEBuffer(50ng/|i1,PH8.0)至lO)il;反應(yīng)條件25。C反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后加入1ju1蛋白酶K消化重組酶，37。C反應(yīng)15min。將5ju1上步反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a,涂布于含Ampr抗性(終濃度為100jug/ml)的LB平板上，37。C恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于5Qml含Ampr抗性(終濃度為lOOjug/ml)的LB培養(yǎng)液中，37。C恒溫搖床("0rpm)培養(yǎng)過夜。用中提試劑盒提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進行酶切鑒定，對鑒定正確的質(zhì)粒命名為pAd-BMP2。1.9包裝重組腺病毒為確保pAd-BMP2被復(fù)制和包裝的效率，質(zhì)粒首先用Pacl進行酶切線性化，然后用酚/氯仿/異戊醇依次抽提純化，離心后上清吸至另一管，乙醇沉降，洗滌，加dH20充分溶解。將PacI線性化的腺病毒DNA用METAFECTENETM轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書轉(zhuǎn)染HEK293細胞，7d后觀察到細胞病理變化(cytopathiceffect,CPE)。待有>50%細胞脫壁時，將細胞收集至離心管中，反復(fù)凍融3次后，-74。C保存?zhèn)溆谩?.10重組腺病毒的擴增與鑒定將上步的裂解上清感染HEK293,出現(xiàn)明顯細胞病變時回收細胞，反復(fù)凍融，離心取上清，重復(fù)進行多次后可得到高滴度腺病毒；用TCD5。方法測定病毒滴度。提取病毒DNA為模板，用BMP-2基因引物檢測BMP-2基因。2結(jié)果2.1目的基因BMP-2的PCR擴增以pOTB7-BMP-2質(zhì)粒為才莫板，將BMP2經(jīng)PCR大量擴增后，1°/。瓊脂糖凝膠電泳，所得產(chǎn)物與分子量標準參照物比較，獲得約1.2kb的片段，與預(yù)期大小一致，見圖6。2.2重組質(zhì)粒TS-BMP2的構(gòu)建PCR產(chǎn)物回收后連于克隆載體pMD19-TSimpleVector中，經(jīng)雙酶切鑒定其產(chǎn)物與預(yù)期大d、一致，見圖7。之后進行測序分析，結(jié)果與GenBank中已知序列完全一致，見圖12。再對其結(jié)果進行BLAST分析，表明成功地獲得了TS-BMP2重組質(zhì)粒。2.3重組pEC3.1-BMP2的構(gòu)建將TS-BMP2重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后克隆入經(jīng)相應(yīng)處理的pEC3.1(+)穿梭質(zhì)粒中，得到pEC3.1-BMP2重組質(zhì)粒。經(jīng)HindIII和EcoRI酶切鑒定可切出4400bp和1200bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證明成功構(gòu)建BMP-2基因的穿梭質(zhì)粒，見圖8。2.4重組pAd-BMP2的構(gòu)建pEC3.1-BMP2與pAd/BLOCK-iT-DEST腺病毒載體在LRClonaseII重組酶介導(dǎo)下相連接，轉(zhuǎn)化E.coLiDH5a感受態(tài)細胞，挑取Ampr抗性的單克隆，提取腺病毒DNA，進行PCR鑒定，其中2個克隆能擴增出目的片段，再進行XbaI酶切，結(jié)果可以切出3kb13和大于15kb的條帶，與預(yù)期相符，表明成功地構(gòu)建陽性重組子pAd-BMP2，見圖9及10。2.5重組腺病毒的制備與鑒定將pAd-BMP2經(jīng)Pacl單酶切線形化，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，與對照組相比觀察細胞病變。提取重組腺病毒DNA，分別以BMP-2引物及腺病毒引物做PCR，見1.2kb處有帶，以BMP-2片段相符，證實為攜帶BMP-2基因的重組腺病毒，見圖11。表明成功獲得BMP-2重組腺病毒，其滴度為1x1011PFU/ml，能滿足下一步BMP-2成骨作用的實驗研究。參考文獻UristMR.Bone:formationbyautoinduction[J〗.Science,1965，150(698):893-899,馬寧，歐陽喈，孫宏晨.應(yīng)用組織工程修復(fù)牙周組織缺損的研究進展[J].吉林大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版,2004,30(6):997-1000.[3]PeterTenDijke，JingyuanFU,PeterSchaap，etal.Signaltransductionofbonemorphogeneticproteinsinosteoblastdifferentiation^].BoneJointSurgAm,2003,85:34—38[4]NakagawaT,SugiyamaT，KameiT，etal.Animmunolightandelectronmicroscopicstudyoftheexpressionofbonemorphogeneticprotein-2duringtheprocessofectopicboneformationintherat[J].ArchOralBiol,2001，46(5):403-411.A.w.A.Baltzer,C.Lattermarm，J.D.Whalen,etal.Geneticeancementoffracturerepair:healingofanexperimentalsegmentaldefectbyadenoviraltransferoftheBMP-2gene[J].GeneTherapy,2000,7:734—739Russel1L.AshinofMD，CurtisL，etal.Bonemorphogenicprotein—2genetherapyformandibulardistractionosteogenesis[J]-AnnalsofPlasticSurgery,2004，52(6):585-591WangII.,HuangII.Adenovirustechnologyforgenemanipulationandfunctionalstudies[J〗IDrugDiscoveryToday,2000,5:10-16ChenY，LukKD，CheungKM,etal.Combinationofadeno—associatedvirusandadenovirusvectorsexpressingbonemorphogeneticprotein—2producesenhancedosteogenicactivityinimmunocompetentrats[J].BiochemBiophysResComm叫2004，317(3):675-681.HeTC，ZhOHS,Costa1,etal.AsimHedsystemforgenerationreombinantadenovirus.ProeNatlAcadSciUSA,1998.95:2509-2514.[11]BeRaJ，HaddaraW,PrevecL，GrahamFL.Aneficientandflexiblesystemforconstructionofadenovirusvectorswithinsertionsordeletionsinearlyregions1and3,proe[J]Natl.AcadSciUSA,1994,91(7):8802-8806MtmdyGR,ChenD，ZhaoM，etal.Growthregulatoryfactorsandbone[J]RevEndocrMetabDisord,2001,2:105-115MajhenD，mbriovicRistovA.Adenoviralvectors-Howtousethemincancergenetherapy[J]VirusRes，2006,119(2):121-133。A.W丄Baltzer，C.Latte函rm,J.D.Whalen，etal.Geneticenhancentoffracturerepair:healingofanexperimentalsegmentaldefectbyadenoviraltransferoftheBMP-2gene[J]GeneTherapy,2000，7:734-739權(quán)利要求1.一種重組腺病毒載體，其特征在于含有人BMP基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征還在于BMP基因是人BMP2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征還在于腺病毒載體為El區(qū)和E3區(qū)缺失的第二代復(fù)制缺陷型病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征還在于包裝細胞是HEK293。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的重組腺病毒載體，其特征還在于其滴度為lx1011PFU/ml，能夠強表達BMP基因。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括用PCR方法擴增BMP目的基因，并插入克隆載體pMD19-Tsimplevector中獲得了TS-BMP重組質(zhì)粒，并進行測序分析；將BMP基因亞克隆到穿梭載體pEC3.1(+)中，構(gòu)建pEC3.l-BMP穿梭質(zhì)粒，再將其中的表達盒克隆入pAd/BL0CK-iTTM-DEST腺病毒載體中，獲得pAd-BMP重組質(zhì)粒，線性化后轉(zhuǎn)HEK293細胞進行包裝獲得重組腺病毒Ad-BMP顆粒。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征還在于該構(gòu)建技術(shù)是基于A噬菌體的位點特異性重組系統(tǒng)(attLxattR—attBxattP)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組腺病毒栽體的構(gòu)建方法，其特征還在于位點特異性重組系統(tǒng)(attLxattR—attBxattP)，是在LRClonaseII酶介導(dǎo)下，attL總是與attR發(fā)生準確地重組反應(yīng)，形成包含attB,attP位點的產(chǎn)物質(zhì)粒。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征還在于LR體外同源重組反應(yīng)體系，反應(yīng)條件是在25。C反應(yīng)1小時。10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的重組腺病毒載體，其特征還在于其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因組織工程骨治療骨缺損的應(yīng)用，用于解決臨床上因骨缺損及骨創(chuàng)傷引起的骨修復(fù)問題。全文摘要一種含人BMP重組腺病毒載體，可用于加快骨創(chuàng)傷的愈合。方法是用PCR方法擴增BMP目的基因，并插入克隆載體pMD19-Tsimplevector中獲得了TS-BMP重組質(zhì)粒，并進行測序分析。將BMP基因亞克隆到穿梭載體pEC3.1(+)中，構(gòu)建pEC3.1-BMP穿梭質(zhì)粒，再將其中的表達盒克隆入pAd/BLOCK-iT^TM-DEST腺病毒載體中，獲得pAd-BMP重組質(zhì)粒，線性化后轉(zhuǎn)HEK293細胞進行包裝獲得重組腺病毒Ad-BMP顆粒。以PCR方法擴增法鑒別Ad-BMP的正確與否，根據(jù)TCD₅₀方法測定病毒滴度。結(jié)果BMP成功插入穿梭載體pEC3.1(+)中，以重組腺病毒基因組為模板，擴增出了1.2kb的BMP片段，證實了Ad-BMP的正確性，測得滴度為1×10¹¹PFU/ml。文檔編號A61P19/08GK101319228SQ200810068539公開日2008年12月10日申請日期2008年7月16日優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日發(fā)明者凱任,何春耒,劉建全,可周,彭亮權(quán),徐小平,朱偉民,歐陽侃,熊建義,王大平,偉陸申請人:深圳市第二人民醫(yī)院