專利名稱：：克力托辛在制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及克力托辛在制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤化療是治療腫瘤的一種基本手段，但腫瘤化療的效果會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞獲得抗藥性而失敗，多藥耐藥(multipledrugresistanceMDR)指腫瘤細(xì)胞對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的多種藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，是化療失敗的主要原因。MDR的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，其中一個(gè)原因與MDR1基因編碼產(chǎn)物--ATP能量依賴性藥物外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)過度表達(dá)有關(guān)，致使藥物外排增加，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少；此外，也與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，缺失凋亡蛋白Bax或過表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2均會(huì)導(dǎo)致某些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性。目前臨床上使用的抗癌藥物，阿霉素，表阿霉素，絲裂霉素，柔紅霉素，紫杉醇，長春新堿，順鉑等，均為P-糖蛋白的底物，為耐藥腫瘤細(xì)胞所抗，因此，當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)P-gp高表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞獲得的抗藥性，并不針對(duì)一種抗癌藥，而是對(duì)多種抗癌藥，即多藥耐藥，要增加P-gp高表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，最有效的辦法就是抑制這種蛋白的功能，使其不能發(fā)揮"藥泵"作用，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此研制抑制這種蛋白功能的藥物對(duì)腫瘤的化療有重要意義，目前臨床上還沒有一種針對(duì)P-gp的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供克力托辛(clitocine)在制備抗腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應(yīng)用，該clitocine是從高等真菌大白樁燕菌(丄ewco/oxz7/w子實(shí)體中分離所得，分子式為C9H13N506，分子量287。所述藥物由克力托辛與制劑允許的藥物賦形劑或載體組成。本發(fā)明所述的高等真菌大白樁菇菌awC0;7axZ//W<$g/gaw^^)屬白蘑科，夏秋季于草原上單生或群生，有時(shí)生于林中草地上。分布于河北、內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、山西、黑龍江、青海、新疆等地。本發(fā)明提供的藥物，其制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑或注射劑。本發(fā)明提供的藥物，制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥?？肆ν行翆?duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯優(yōu)于紫杉醇，阿霉素，順鉑等臨床常用藥，克力托辛殺死高表達(dá)P-糖蛋白腫瘤細(xì)胞的機(jī)理是抑制P-糖蛋白的功能并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與其親本藥敏細(xì)胞一致，目前臨床上缺乏能逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物，因此克力托辛具有很好的制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物的應(yīng)用前景。圖1是克力托辛的液相色譜分析。圖2是耐藥腫瘤細(xì)胞及親本藥敏細(xì)胞的P-糖蛋白表達(dá)量比較。圖3是不同濃度克力托辛抑制HepG2和R-HepG2體外增殖比較。圖4是克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2細(xì)胞產(chǎn)生DNA梯狀條帶的凝膠電泳比較圖。圖5是克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2細(xì)胞凋亡的AnnexinV-PI雙染凋亡比較圖。圖6是克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2細(xì)胞線粒體膜電位變化的JC-1染色比較圖。圖7是克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2細(xì)胞釋放細(xì)胞色素c的免疫印跡比較。圖8是Caspase-8抑制劑逆轉(zhuǎn)克力托辛誘導(dǎo)的HepG2和R-HepG2凋亡作用比較圖。圖9是Caspase-9抑制劑逆轉(zhuǎn)克力托辛誘導(dǎo)的HepG2和R-HepG2凋亡作用比較圖。圖10是克力托辛抑制R-HepG2的P-糖蛋白表達(dá)免疫印跡圖。圖11是克力托辛部分逆轉(zhuǎn)R-HepG2對(duì)阿霉素的抗藥性。具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例與附圖詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例一從新鮮大白樁菇菌子實(shí)體提取分離純化抗腫瘤活性化合物及其結(jié)構(gòu)鑒定實(shí)驗(yàn)方法l.提取和純化將原料新鮮大白樁菇菌子實(shí)體(2.7kg)真空冷凍干燥，粉碎機(jī)粉碎，所得340g菌粉浸于1.5L95%(v/v)酒精中，其間更換新鮮溶劑一次，合并兩次浸提液，減壓濃縮得酒精浸膏(25.7g)，浸膏經(jīng)乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏(15.7g)。取15g乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，CH2Cl2/MeOH(10:0-0:10)梯度洗脫，收集細(xì)胞篩選有活性的洗脫峰(6.5g)，然后上反相株RP-18(ODS,50pm，025x420mm)，MeOH/H20(1:9)洗脫，細(xì)胞篩選有活性的部分再經(jīng)過反相株RP-C8制備[5020x250mm;MeOH/H20(5:95);8ml/min]，得到目的化合物克力托辛(815mg)。其液相色譜分析圖參見附圖1，在洗脫時(shí)間9.0分時(shí)出現(xiàn)單一峰即為克力托辛。2.結(jié)構(gòu)鑒定核磁共振儀(INOVA-400)，質(zhì)譜儀(BrukerEsquire3000plus)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果克力托辛，分子式為C9H13N506，ESI-MS:m/z287。其一維的二維的核磁數(shù)據(jù)列于表1，根據(jù)這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)比較所得克力托辛的化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>表1克力托辛的核磁數(shù)據(jù)<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>C3'70.4(d)71.7(d)4.09(1H,t,9.83)3.94(1H,t,9.98)C4'84.4(d)83.6(d)3.81(lH，dd,3.11,6.98)3.82(1H,dd,4.60,8.64)C5'60.9(t)62.0(t)3.46(2H，dd,5.16,10.45)3,44(2H,dd，6.80,11.55)N49.30(1H，d,7.52)9.9680(1H，d,8.45)N68.57(2H,brs)8.60(2H,brs)02'5.23(1H，brs)5.64(m,brs)03'5.08(1H，brs)5.26(1H,brs)05'4.78(1H,brs)4.77(1H,brs)實(shí)施例二肝癌HepG2細(xì)胞和R-HepG2對(duì)臨床抗腫瘤藥的敏感性及P-糖蛋白表達(dá)量的比較實(shí)驗(yàn)材料和方法肝癌細(xì)胞HepG2購自美國AmericanTypeCultureCollection,耐藥細(xì)胞R-HepG2的建立，系由HepG2加抗癌藥物阿霉素培養(yǎng)，存活下來的細(xì)胞繼續(xù)添加較高濃度的阿霉素繼代培養(yǎng)，不斷培養(yǎng)一段時(shí)間后，挑選抗藥性克隆建系即R-HepG2。兩株細(xì)胞均培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(Invitrogene)，添加5%小牛血清(Invitrogene)，2mM谷氨酰胺，37°C，10%0)2培養(yǎng)箱。四甲基偶氮唑鹽(簡稱MTT法)檢測藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1><104的密度接種于96孔板中，置37"C，10%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后加入不同濃度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔6個(gè)，培養(yǎng)48小時(shí)，吸出孔板中培養(yǎng)液，往每孔中加入濃度為lmg/ml的MTT50^，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，取出加過MTT的96孔板，每孔加入150|il的DMSO，輕輕震蕩孔板10min，待孔底部的結(jié)晶物完全溶解后，將孔板放入酶標(biāo)儀中測波長在570nm的各孔的光吸收值，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，用IC5Q軟件計(jì)算半數(shù)增殖抑制濃度IC5o。Westernblot實(shí)驗(yàn)3xl(^個(gè)對(duì)數(shù)生長期的HepG2和R-HepG2細(xì)胞與克力托辛共同孵育48h，用RIPA裂解液裂解，14,000xg離心7min后，用Bradfor測定蛋白濃度，在12%SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，膠上的斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后與P-糖蛋白抗體在室溫下孵育，清洗后再與二抗共同孵育。最后用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行顯色觀察。阿霉素，順鉑，紫杉醇，MTT均購自Sigma公司，P-糖蛋白抗體購自SantaCruz?？肆ν行寥芙庠贒MSO中配成lmg/ml母液，置于-2(TC冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度供用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和附圖2。表2為不同濃度的臨床抗腫瘤藥阿霉素，順鉑和紫杉醇分別作用于HepG2和R-HepG2，其半數(shù)增殖抑制濃度IC5o和耐藥指數(shù)RI的比較。由表中可見，三種抗腫瘤藥作用于HepG2的ICso小于作用于R-HepG2，均表現(xiàn)出HepG2細(xì)胞對(duì)這些藥物敏感而R-HepG2細(xì)胞耐藥，相應(yīng)的耐藥指數(shù)(RI)，即耐藥株R-HepG2與親本敏感株HepG2的IC5Q值之比對(duì)阿霉素，順鉑和紫杉醇分別是50，3.3和2.5。說明R-HepG2是來自HepG2的多藥耐藥細(xì)胞株，且對(duì)多種抗癌藥物有耐受性，尤其抗阿霉素。表2.HepG2和R-HepG2對(duì)抗腫瘤藥的敏感性抗腫瘤藥IC50(pM)HepG2R-HepG2RI阿霉素4〉200〉50順鉑501673.3紫杉醇20502.5Clitocin60.490.350.7為了進(jìn)一步說明耐藥株R-HepG2所以耐藥的分子基礎(chǔ)，我們用WesternBlot的方法檢測P-糖蛋白在兩種腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果見附圖2，圖A、B分別表示HepG2和R-HepG2細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)量的免疫印跡圖，可見，P-糖蛋白在耐藥株R-HepG2中表達(dá)量高，而在其親本藥敏株HepG2中幾乎不表達(dá)，因此得出結(jié)論R-HepG2為P-糖蛋白高表達(dá)的耐藥細(xì)胞株，換言之，P-糖蛋白高表達(dá)是R-HepG2腫瘤細(xì)胞耐藥的主要原因。實(shí)施例三克力托辛對(duì)HepG2和R-HepG2的體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)材料和方法細(xì)胞來源和MTT法同實(shí)施例二實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖3?？肆ν行翆?duì)HepG2細(xì)胞和R-HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制均呈劑量依賴性，且R-HepG2細(xì)胞對(duì)其更敏感，克力托辛作用48h，對(duì)HepG2和R-HepG2的半數(shù)增殖抑制濃度IC5o分別是0.49pM和0.35pM，抗藥指數(shù)RI為0.71，遠(yuǎn)小于阿霉素50(表2)，表明R-HepG2對(duì)clitocine沒有抗藥性。實(shí)施例四克力托辛抑制HepG2和R-HepG2體外增殖分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例二方法1:DNA梯狀條帶實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞HepG2和R-HepG2經(jīng)不同濃度的clitocine處理48h后收集細(xì)胞，加裂解液在45""C裂解lh(5mMTris-HCl,100mMEDTA,1%(w/v)SDS,and蛋白酶K)，基因組DNA用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，70%酒精-20匸下沉淀，用RNA酶除去RNA后，加40嗎DNA在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳并經(jīng)凝膠成像儀拍照。方法2:AnnexinV-PI雙染實(shí)驗(yàn)約3xl05個(gè)對(duì)數(shù)生長期的肝癌HepG2和R-HepG2細(xì)胞與clitocine共同孵育48h，，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗一次，加入500^1的AnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液，含25^1的AnnexinV-FITC和5^1的PI緩沖液，然后避光孵育15min，用FACSCanto流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖4-5。細(xì)胞凋亡最典型的特征之一，是細(xì)胞在接受藥物作用后，DNA會(huì)被核酸酶在核小體連接處切斷，產(chǎn)生180-200bp或其整數(shù)倍大小的DNA碎片，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)有規(guī)則的梯狀體條帶，這是區(qū)分凋亡與壞死的重要標(biāo)志[1()]。附圖4中，圖A表示HepG2細(xì)胞，圖B表示R-HepG2細(xì)胞的凝膠電泳圖，從左至右每一條帶分別代表100bp標(biāo)記、clitocine濃度0、0.3jiM、0.6pM和0.9pM處理，可以看出clitocine可誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2都產(chǎn)生典型的凋亡條帶，且R-HepG2對(duì)其更敏感，在低濃度0.3pM時(shí)條帶已清晰可辨，而HepG2則在較高濃度0.6|liM才依稀可見。細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外，AnnexinV可與其結(jié)合，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然保持完整，染料PI不能進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行染色，因此通過AnnexinV-PI雙染實(shí)驗(yàn)，可區(qū)分凋亡與壞死細(xì)胞。附圖5中，圖A、C、E代表HepG2細(xì)胞的三個(gè)不同clitocine濃度0、0.3pM、0.6pM處理，B、D、F則代表R-HepG2相同的三個(gè)處理濃度，每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表示該細(xì)胞在對(duì)應(yīng)藥物濃度下的凋亡百分率，而右上角百分?jǐn)?shù)則代表相同條件下的死亡百分?jǐn)?shù)，可以看出，clitocine均誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞株產(chǎn)生凋亡，但對(duì)R-HepG2誘導(dǎo)更多的細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，在相同濃度0.3)nM時(shí)，HepG2和R-HepG2產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞百分比分別是6.24。/。和15.89%而0.6pM時(shí)，HepG2和R-HepG2產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞百分比分別是8.22%和26.71%。實(shí)施例四表明，clitocine抑制HepG2和R-HepG2體外增殖是通過誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2產(chǎn)生凋亡，且耐藥株R-HepG2的敏感性高于其親本藥敏細(xì)胞HepG2。實(shí)施例五clitocine誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的途徑實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例二方法1，線粒體膜電位(A甲m)變化HepG2和R-HepG2細(xì)胞(2xl05)分別與不同濃度的克力托辛共孵育48h后，收集細(xì)胞與10pMJC-1在37。C黑暗中共孵育15min，用FACSCanto流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)分析結(jié)果。方法2，細(xì)胞色素c的變化HepG2和R-HepG2細(xì)胞(2xl0"分別與不同濃度的克力托辛共孵育一段時(shí)間后，收集細(xì)胞用裂解液室溫下破膜30秒(75mMNaCl,1mMNaH2P04,8mMNa2HP04,250mMsucrose,1mMPMSF，5mg/mlleupeptin,21mg/mlaprotinin)含狄吉寧(25|ig/106個(gè)細(xì)胞)，10000rpm離心lmin，取上清液中的蛋白在12%SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，膠上的斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后與細(xì)胞色素c抗體在室溫下孵育，清洗后再與二抗共同孵育。最后用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行顯色觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖6-7。凋亡早期往往伴隨著線粒體膜的破裂，導(dǎo)致線粒體膜電化學(xué)的變化。使用線粒體特異性染料JC-1，可以檢測這種變化。當(dāng)膜電位高時(shí)，JC-1以聚合體形式發(fā)出紅色熒光，當(dāng)膜電位降低時(shí)，線粒體膜破裂，JC-1可選擇性進(jìn)入線粒體并以單體形式發(fā)出綠色熒光，兩種熒光的百分比可以反映出線粒體膜電位的變化[12]。附圖6中，圖A、B、C分別代表HepG2細(xì)胞的三個(gè)不同濃度處理即0、0.3laM和0.6iaM，圖D、E、F則代表R-HepG2同樣的三個(gè)處理濃度，每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表示該細(xì)胞在對(duì)應(yīng)藥物濃度下綠色熒光百分率，可見，克力托辛作用于HepG2和R-HepG2，導(dǎo)致兩者綠色熒光百分率上升，表明細(xì)胞線粒體膜電位下降，線粒體膜破裂，在0.3pM時(shí)，JC-1綠色熒光百分?jǐn)?shù)在HepG2和R-HepG2細(xì)胞中的百分率分別是19.44%，31.29%，而0.6iiM時(shí)，HepG2和R-HepG2細(xì)胞綠色熒光百分率23.93%，40.37%，表明R-HepG2對(duì)克力托辛更敏感，線粒體受損程度更大。伴隨著線粒體膜電位下降，線粒體膜破裂。線粒體內(nèi)膜蛋白如細(xì)胞色素c外流。細(xì)胞色素c外流也被認(rèn)為是線粒體依賴的凋亡過程中一個(gè)關(guān)鍵的特征^。附圖7中，圖A、B分別表示HepG2和R-HepG2的細(xì)胞色素c表達(dá)量的免疫印跡圖，從左至右依次代表clitocine濃度和時(shí)間分別為0、24h(0.3pM、0.6pM、0.9^iM)、48h(0.3j^M、0.6)LiM、0.9]LiM)，可見克力托辛作用于HepG2和R-HepG2，與對(duì)照相比，細(xì)胞色素c從破裂的線粒體中釋放到細(xì)胞液，在其中的表達(dá)量隨克力托辛作用時(shí)間延長和濃度增加而逐漸增多，并且R-HepG2對(duì)克力托辛更敏感，同樣處理下細(xì)胞色素c的表達(dá)量更多，這與其線粒體受損程度大是一致的。實(shí)施例五從線粒體膜電位變化和細(xì)胞色素c釋放的角度進(jìn)一步表明，克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2產(chǎn)生凋亡，通過線粒體依賴途徑，并且耐藥株R-HepG2的敏感性高于其親本藥敏細(xì)胞HepG2。實(shí)施例六caspase家族抑制劑對(duì)克力托辛誘導(dǎo)凋亡的作用實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例二方法約3xl()S個(gè)對(duì)數(shù)生長期的HepG2和R-HepG2細(xì)胞分別與clitocine/caspase-8抑制齊!j(Z-正TD-FMK)或clitocine/caspase-9抑制劑(Z-LEHD-FMK)共同孵育48小時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗一次，加入500^1的AnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液，含25^1的AnnexinV-FITC和5^1的PI緩沖液，然后避光孵育15min，用FACSCanto流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖8-9。在細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過程中，caspase(半胱氨酸水解酶)起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，因此它們的激活是凋亡的重要特征[14]，兩個(gè)主要的caspase家族成員caspase-8和caspase-9分別代表了兩條凋亡信號(hào)通路即死亡受體通路和線粒體通的執(zhí)行者[14]。附圖8中，圖A、B、C分別代表HepG2細(xì)胞的對(duì)照、clitocine0.3單獨(dú)處理和clitocine加caspase-8抑制劑組合，D、E、F則代表R-HepG2細(xì)胞同樣的三個(gè)處理，每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表示該細(xì)胞在對(duì)應(yīng)處理下的凋亡百分率，而右上角百分?jǐn)?shù)則代表相同條件下的死亡百分率，可以看出，克力托辛0.3|uM作用于HepG2和R-HepG2分別誘導(dǎo)兩株細(xì)胞產(chǎn)生凋亡4.45%，11.85%，而添加caspase-8抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)這種凋亡的誘導(dǎo)，凋亡細(xì)胞百分比相應(yīng)下調(diào)至2.52%,9.55%。同樣，附圖9中，圖A、B、C分別代表HepG2細(xì)胞的對(duì)照、clitocine0.3pM單獨(dú)處理和clitocine加caspase-9抑制劑組合，D、E、F則代表R-HepG2細(xì)胞同樣的三個(gè)處理，每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表示該細(xì)胞在對(duì)應(yīng)處理下的凋亡百分率，而右上角百分?jǐn)?shù)則代表相同條件下的死亡百分率，可以看出，克力托辛0.3pM作用于HepG2和R-HepG2分別誘導(dǎo)兩株細(xì)胞產(chǎn)生凋亡3.48%，20.06%,而添加caspase-9抑制劑，也可以逆轉(zhuǎn)這種凋亡的誘導(dǎo)，凋亡細(xì)胞百分比相應(yīng)下調(diào)至1.78%,13.14%。實(shí)施例六表明，克力托辛誘導(dǎo)HepG2和R-HepG2凋亡是caspase依賴性的，并可能與死亡受體通路和線粒體通路都有關(guān)。實(shí)施例三至實(shí)施例六，從不同的角度說明了克力托辛可以抑制腫瘤細(xì)胞藥敏株HepG2和耐藥株R-HepG2體外增殖，這種抑制作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到的，且對(duì)多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞R-HepG2的藥效更敏感，表明耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)克力托辛沒有抗藥性，因此克力托辛可在抗腫瘤多藥耐藥性藥物中應(yīng)用。實(shí)施例七克力托辛對(duì)耐藥株R-HepG2高表達(dá)P-糖蛋白的抑制實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例二方法Westernblot實(shí)驗(yàn)，同實(shí)施例二實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖10-11。實(shí)施例三至六說明克力托辛可以抑制多藥耐藥腫瘤細(xì)胞R-HepG2增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且不受其耐藥性影響，進(jìn)一步，我們要檢測克力托辛的這種功能的分子基礎(chǔ),是否與其抑制了P-糖蛋白的功能有關(guān)。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖10所示，圖中，從左到右依次為對(duì)照、clitocine0.3nM、0.6fiM和0.9|iiM處理，可見，對(duì)照P-糖蛋白高表達(dá)，而不同濃度的克力托辛處理R-HepG2細(xì)胞均可以完全抑制其P-糖蛋白的表達(dá)。附圖11說明，低濃度的克力托辛(0.06pM)與阿霉素共同作用于R-HepG2，可以減少R-HepG2細(xì)胞的存活百分率，即提高了R-HepG2對(duì)阿霉素的藥敏性，這與克力托辛能夠抑制R-HepG2高表達(dá)的P-糖蛋白結(jié)果一致。實(shí)施例七說明，克力托辛可以逆轉(zhuǎn)高表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥腫瘤株的耐藥性。綜上實(shí)施例所述，本發(fā)明提供的克力托辛對(duì)多藥耐藥腫瘤株R-HepG2具有強(qiáng)烈的增殖抑制效果，其半數(shù)增殖抑制濃度IC5。為0.35)iM,遠(yuǎn)小于臨床常用抗腫瘤藥阿霉素，紫杉醇,順鉑等，克力托辛殺死多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的機(jī)理是抑制MDR1基因表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白的功能并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與其藥敏細(xì)胞一致。目前臨床上缺乏能逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物，因此克力托辛具有很好的制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物的應(yīng)用前景。權(quán)利要求1.克力托辛在制備抗腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應(yīng)用，所述克力托辛的分子式為C9H13N5O6，分子量287，所述藥物由克力托辛與制劑允許的藥物賦形劑或載體組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式是液體制劑或固體制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述藥物的給藥形式是口服給藥或注射給藥。全文摘要本發(fā)明提供克力托辛在制備抗腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應(yīng)用，所述克力托辛的分子式為C₉H₁₃N₅O₆，分子量287，所述藥物由克力托辛與制劑允許的藥物賦形劑或載體組成，制劑形式是液體制劑或固體制劑。本發(fā)明提供的藥物對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯優(yōu)于紫杉醇，阿霉素，順鉑等臨床常用藥，克力托辛殺死高表達(dá)P-糖蛋白腫瘤細(xì)胞的機(jī)理是抑制P-糖蛋白的功能并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與其親本藥敏細(xì)胞一致，具有很好的制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K31/7064GK101347442SQ20081006343公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年8月5日優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日發(fā)明者馮國培,劉非燕,平吳,吳世華,郭添德申請(qǐng)人:浙江大學(xué)