專利名稱：具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及避孕用具及制備方法，具體是一種具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑。

背景技術(shù)：
艾滋病在我國的流行已進(jìn)入快速增長期，根據(jù)我國衛(wèi)生部2002年報告全國艾滋病病毒感染者近100萬，我國艾滋病、性病的感染人數(shù)正以每年30％的速度增長。在艾滋病病毒感染的女性中，絕大多數(shù)都是育齡婦女，通過性行為感染，她們被感染后還可引起母嬰傳播。為了減少非意愿妊娠和預(yù)防艾滋病等性傳播疾病的傳播，作為一種預(yù)防艾滋病的策略，世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署等國際組織已將由婦女主動使用的殺微生物避孕制劑作為優(yōu)先發(fā)展項目。為了維護(hù)婦女的生殖健康，保護(hù)婦女的合法權(quán)益，研究一種由婦女主動使用和控制的，即能預(yù)防艾滋病、性病傳播又能減少非意愿妊娠的外用殺微生物避孕制劑是非常必要的，這對減少非意愿妊娠和預(yù)防艾滋病、性病的傳播具有雙重意義。
現(xiàn)在此領(lǐng)域的研究非?；钴S，國內(nèi)長江生物藥業(yè)有限公司研制的殺微生物避孕藥-康樂寶殺菌膏是一種復(fù)方凝膠劑，獲得衛(wèi)生部的消字號產(chǎn)品。也有人將其稱“液體避孕套”。
美國拉什-長老會-圣路加醫(yī)學(xué)中心在中國申請的專利號為01809090.7的“捕獲和滅活病原性微生物和精子的組合物和方法”的專利，提供了抗微生物和避孕組合物的方法，能防止和/或減少通過性活動傳播的性傳播疾病。和防止和/或減少懷孕危險，組合物含有①基質(zhì)形成劑，②生物粘合劑，③緩沖劑，④可任選的濕潤劑，⑤可任選的防腐劑，和⑥水；其中組合物適于涂在陰道內(nèi)，在與精液接觸后，形成半固體基質(zhì)(從而捕獲射精釋放的微生物和精子)；其中組合物導(dǎo)致宮頸粘液硬化(從而降低精子進(jìn)入的可能性)，并在陰道表面形成生物粘合層(從而防止或減少導(dǎo)致性傳播疾病的微生物與陰道表面接觸的危險)；組合物在男性射精釋放的精液存在下，維持陰道酸性小于pH5；且其中組合物不會明顯損傷陰道內(nèi)的正常微生物平衡?？刮⑸锖捅茉薪M合物還可以含有其它抗微生物劑和/或避孕藥(如壬苯醇醚、辛苯聚醇、苯扎氯銨、磷酸化的橙皮甙、磺酸化的橙皮甙、聚苯乙烯磺酸酯、取代的苯磺酸甲醛共聚物、H2SO4改性的扁桃酸、聚維酮碘、伊曲康唑、酮康唑、甲硝唑、克霉唑、氟康唑、特拉康唑、咪康唑、替硝唑、伊康唑、氯霉素、制霉菌素、環(huán)吡司胺等)。該專利雖然可組合成眾多配方，但并不是每個配方都能制備出可以應(yīng)用的組合物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中藥物對陰道刺激大，配方原料多，制備方法復(fù)雜的問題而提供一種由女性自主使用既能減少非意愿妊娠又可降低HIV和其他性傳播疾病發(fā)病率，避孕有效率高，預(yù)防生殖道感染效果好，工藝簡單，使用方便，對陰道刺激性小的具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑。
本發(fā)明所涉及的具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，其組分包括殺精子劑、殺菌劑、基質(zhì)、保濕劑、防腐劑及水，并通過以下步驟制得凝膠劑將基質(zhì)加入保濕劑中，邊加入邊攪拌使之分散均勻，再加入殺精子劑，攪拌均勻；取殺菌劑、防腐劑加入制備量的純化水中攪拌成均勻溶液，以上兩種溶液混合在一起，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺撆菁粗频媚z。
該凝膠劑原料重量百分比的配比如下殺精子劑0.1～5、殺菌劑0.1～3、基質(zhì)1～10、保濕劑1～50、防腐劑0.01～0.5，余量為純化水。
該凝膠劑原料重量百分比的配比如下殺精子劑2、殺菌劑1.8、基質(zhì)5、保濕劑20、防腐劑0.15，余量為純化水。
上述的殺精子劑選自壬苯醇醚-9和辛苯聚醇中的一種，殺菌劑選自聚甲酚磺醛、酮康唑、甲硝唑和替硝唑中任意一種或兩種?；|(zhì)選自羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、聚殼糖、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素中任意一種或兩種，保濕劑選自丙二醇、甘油和聚乙二醇中任一種或兩種。防腐劑選自山梨酸、山梨酸鉀、苯甲酸、苯甲酸鈉和對羥基苯甲酸酯類中的一種或兩種。
本發(fā)明的凝膠劑主要包括基質(zhì)、殺菌劑、殺精子劑、保濕劑和防腐劑。
殺精子劑辛苯聚醇與常用的外用殺精子劑壬苯醇醚具有同樣的殺精子效果，但是對陰道的刺激小，讓使用者更容易接受，因此本發(fā)明殺菌劑采用辛苯聚醇。
聚甲酚磺醛是一種強(qiáng)酸，表面帶有負(fù)電荷，它最大的優(yōu)點(diǎn)是選擇性作用于病變組織的同時，仍維持正常的陰道酸性環(huán)境，不利于各種病原微生物生長繁殖，而有利于乳酸桿菌的滋生繁殖，并保護(hù)正常的陰道鱗狀上皮。聚甲酚磺醛具有廣譜抗菌作用，包括革蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、真菌和某些病毒，其中，陰道加特納均、厭氧菌滴蟲和念珠菌對之尤為敏感。但陰道乳酸菌菌叢卻基本不受影響，因此能保持陰道正常微生物的平衡。
能夠用作凝膠基質(zhì)的材料比較多，如卡波姆、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、聚殼糖、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等為幾種常用作凝膠基質(zhì)的高分子材料，但并不是每種材料都適合做本發(fā)明的凝膠基質(zhì)，適合用于本發(fā)明的基質(zhì)應(yīng)該能在較低的pH值范圍內(nèi)保持性能的穩(wěn)定，使藥物與陰道粘膜有良好的生物相容性，同時還應(yīng)具有黏附時間長，粘著力強(qiáng)，不易流失，保持有效時間長，毒性低，刺激性小的特點(diǎn)。本發(fā)明選擇卡波姆、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素三種材料通過以下實驗進(jìn)行篩選，最終選擇羥丙基甲基纖維素(HPMC)作為凝膠基質(zhì)。
1.卡波姆基質(zhì)凝膠劑 配方聚甲酚磺醛1.8g 辛苯聚醇 2.0g 卡波姆934P2.0g 甘油 10g 丙二醇10g 三乙醇胺 適量 純化水適量 總重量100g 制備步驟以下各原料按配方量稱取。
a.稱取甘油、丙二醇倒入燒杯，加入卡波姆攪拌均勻；加純化水60ml，再加入辛苯聚醇，繼續(xù)攪拌均勻，滴加三乙醇胺使pH≈4.5，呈透明，無色凝膠。
b.在上述凝膠中加入聚甲酚磺醛，邊加邊攪拌，凝膠變的稀薄，呈紅棕色液體，無法成形。用pH試紙測得pH值約為2。
結(jié)論卡波姆不適合做含有上述主藥成分的凝膠劑基質(zhì)。
2.羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)基質(zhì)凝膠劑 配方聚甲酚磺醛1.8g 辛苯聚醇 2.0g 甘油 10g 丙二醇10g CMC-Na2.5g 純化水適量 總重量100g 制備步驟以下各原料按配方量稱取。
a.稱取甘油、丙二醇倒入燒杯，加入CMC-Na攪拌均勻，加入辛苯聚醇，繼續(xù)攪拌均勻，制得混合物1。
b.稱聚甲酚磺醛于燒杯中，加入制備量的純化水，攪拌均勻，溶液為紅棕色，制得溶液2。
c.將溶液2倒入混合物1中，邊加入邊攪拌，溶液逐漸變得粘稠，直至呈均勻狀態(tài)。
3.不含藥物的CMC-Na基質(zhì)空白凝膠劑 配方甘油 10g 丙二醇 10g CMC-Na 2.5g 純化水 適量 總重量 100g 制備步驟以下各原料按配方量稱取。
稱取甘油、丙二醇倒入燒杯，加入CMC-Na攪拌均勻，加純化水至總重量為100g，邊加入邊攪拌，直至液體呈半固體凝膠狀態(tài)，無色不透明。
黏度測定 取樣品100ml，放入燒杯中，以NDJ-85型數(shù)字粘度計進(jìn)行測定，空白樣品平均粘度為30.0Pa.S。
兩種CMC-Na基質(zhì)凝膠劑黏度比較
結(jié)論加入藥物后可使以CMC-Na為基質(zhì)的凝膠劑粘度下降。
4.羥丙基甲基纖維素(HPMC)基質(zhì)凝膠劑 配方 聚甲酚磺醛1.8g 辛苯聚醇 2.0g 甘油 10g 丙二醇10g HPMC 3.0g 純化水適量 總重量100g 制備步驟以下各原料按配方量稱取。
a.稱取甘油、丙二醇倒入燒杯，加入HPMC攪拌均勻，加入辛苯聚醇，繼續(xù)攪拌均勻，制得混合物1。
b.稱取聚甲酚磺醛于燒杯，加入制備量的純化水，攪拌均勻，溶液呈紅棕色，制得溶液2。
c.將溶液2倒入混合物1中，邊倒入邊攪拌，溶液逐漸變粘稠，直至呈半固態(tài)狀態(tài)，透明紅棕色。
5.不含藥物的HPMC基質(zhì)空白凝膠劑 配方 甘油 10g 丙二醇 10g HPMC 3.0g 純化水加至總重量 100g 制備步驟同前不含藥物的CMC-Na基質(zhì)空白凝膠劑的制備方法。
黏度測定方法同上。
粘度比較
結(jié)論HPMC適于作上述主要成分的凝膠基質(zhì)。
試驗中對黏度和外觀進(jìn)行比較 1.2、3號配方中以2.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作凝膠基質(zhì)制成的不含主藥的凝膠劑與含主藥成分的凝膠劑相比，動力黏度下降，由30～40Pa.S降至15～20Pa.S。制成的凝膠劑棕紅色，不透明。
2.1號配方中以2％卡波姆934P作凝膠基質(zhì)制成的凝膠劑，加入主藥后，動力黏度急劇下降，溶液變稀薄。因為主藥是酸性物質(zhì)，卡波姆做凝膠基質(zhì)受酸堿度影響很大，pH值過高或過低均影響劑型的形成?？ú沸纬傻哪z在pH 5～11范圍內(nèi)十分穩(wěn)定，在pH 6～12時最為粘稠，當(dāng)pH＜3或＞12時，粘度為1000mPa.S，pH為8時粘度增到50Pa.S。在可制成凝膠的pH范圍內(nèi)主藥的棕紅色變淡，影響含量。
3.羥丙基甲基纖維素對酸堿比較穩(wěn)定，但如超出pH 2～11范圍并同時受較高溫度或存放較長時間，則會使黏度下降。以2.5％至3.2％羥丙基甲基纖維素(HPMC)為凝膠基質(zhì)制成的凝膠劑黏度適中，動力黏度25-30Pa.S適宜陰道應(yīng)用。制成的凝膠劑棕紅色，透明。
本發(fā)明選用高分子材料羥丙基甲基纖維素做凝膠劑基質(zhì)，其在水中溶解不受pH值影響，具有增稠能力，排鹽性、pH穩(wěn)定性、保水性、尺寸穩(wěn)定性、及廣泛的耐酶性、分散性和粘結(jié)性，使藥物與陰道粘膜有良好的生物相容性，具有粘附力強(qiáng)和粘附時間長，不易流失，保持有效時間長，毒性低、刺激性小等優(yōu)點(diǎn)，是一個有效的新的陰道用凝膠劑基質(zhì)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
適合用于本發(fā)明的保濕劑有甘油、丙二醇、聚乙二醇等多元醇，毒性小，無刺激性，一定比例的丙二醇和水的混合溶劑能延緩許多藥物的水解，增加穩(wěn)定性。對藥物在皮膚和粘膜的吸收有促進(jìn)作用，本發(fā)明采用甘油、丙二醇作為保濕劑既可保濕又可增加凝膠的透明度。
本發(fā)明的制作方法簡單，由于聚甲酚磺醛本身是酸性，所以沒有必要再加酸性緩沖劑，再用堿調(diào)ph值，因此降低了成本，減少了工序。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是 本發(fā)明為復(fù)方制劑，除有避孕作用外，還有廣譜抗微生物作用，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和原蟲。該凝膠劑可由婦女自主使用和控制，既有殺精避孕的作用又可降低HIV和其他性傳播疾病發(fā)病率，從而在減少婦女非意愿妊娠和降低婦女HIV感染率兩方面保護(hù)了婦女的生殖健康權(quán)利。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有制劑工藝簡單，使用更加方便，對陰道的刺激性小，舒適感強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

具體實施例方式 實施例1本發(fā)明凝膠劑的制備方法 原料 羥丙基甲基纖維素、丙二醇、甘油、山梨酸鉀均市售。聚甲酚磺醛濟(jì)南齊河合成精細(xì)化工有限公司提供，批號050802；辛苯聚醇西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易公司(ICEPL CA 630)，批號075K0071；純化水自制。
配方 羥丙基甲基纖維素3.0g 丙二醇 10g 甘油10g 聚甲酚磺醛 1.8g 辛苯聚醇2.0g 山梨酸鉀0.15g 純化水 適量 總量100g 制備方法 按配方量稱取丙二醇、甘油，混合均勻后，邊攪拌邊加入羥丙基甲基纖維素使混合液分散均勻，再加入辛苯聚醇，攪拌均勻。分別將山梨酸鉀和聚甲酚磺醛加入制備量的純化水中攪拌成均勻溶液，將溶液倒入上述混合液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺撆菁纯?。制備的凝膠劑為棕紅色半透明的半固體。
下面通過毒理學(xué)、藥理學(xué)的各項試驗，進(jìn)一步說明本發(fā)明凝膠劑的積極效果。
一.急性毒性試驗(LD50) 1.材料 1.1藥物 本發(fā)明的凝膠劑，按實施例1制備；由天津市計劃生育研究所提供。
1.2動物 昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重在18g-22g之間，由天津市藥物研究院提供，實驗動物合格證為大小鼠實驗動物、生產(chǎn)設(shè)施符合屏障級標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)第012號。
2.方法 采用Bliss法測定能滅活微生物的避孕陰道凝膠劑的LD50。動物購入后適應(yīng)環(huán)境一周，先以少量小鼠做預(yù)試驗，測其全死和全不死劑量。小鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。各劑量組間距為0.8，各組給藥劑量分別為66mg/kg、82mg/kg、102mg/kg、128mg/kg和160mg/kg。按0.1ml/10g進(jìn)行一次腹腔注射。給藥后立即觀察小鼠的反應(yīng)，連續(xù)觀察一周，每日記錄動物體重變化、毒性反應(yīng)情況和死亡動物分布。死亡動物及時進(jìn)行尸檢，記錄病變情況，用計算機(jī)算出LD50值。具體數(shù)據(jù)見表1。
表1能滅活微生物的避孕凝膠劑的LD50實驗數(shù)據(jù)
通過以上數(shù)據(jù)可得結(jié)論本發(fā)明凝膠劑腹腔給藥的LD50為95.88mg/kg，可信范圍為83.78-109.71mg/kg。小鼠腹腔注射給藥量為人公斤體重的16.7倍時，仍可耐受。
二.對乳酸桿菌影響的試驗 乳酸桿菌是女性陰道內(nèi)正常菌叢中的優(yōu)勢菌，對維持陰道內(nèi)菌群平衡起著重要作用。本發(fā)明的凝膠劑作為有殺微生物和避孕作用的陰道制劑，觀察其對陰道乳酸桿菌的影響非常有意義。因此以嗜酸性乳酸桿菌為試驗菌株，觀察凝膠劑對培養(yǎng)的乳酸桿菌的影響，為進(jìn)一步評價該凝膠制劑的安全性提供科學(xué)依據(jù)， 材料與方法 1.材料 實驗菌種嗜酸性乳酸桿菌(ATCC4356)購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種中心； 樣品凝膠劑按實施例1制備；天津市計劃生育研究所提供 陰性對照物生理鹽水； 陽性對照物度米芬(溴化N，N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十二烷銨一水合物)青陽藥業(yè)有限公司；批號031003； 乳酸細(xì)菌培養(yǎng)液(MRS)按配方配制； 配方 酪蛋白胨 10.0克牛肉浸取物 10.0克 酵母提取液 5.0克 葡萄糖 20.0克 乙酸鈉 5.0克 檸檬酸三胺 2.0克 吐溫80 1.0克 磷酸氫二鉀 2.0克 七水硫酸鎂 0.2克 四水硫酸錳 0.05克 蒸餾水 1000ml 配制方法將上述配方量物質(zhì)于三角燒瓶中，攪拌均勻后，用高壓鍋在121℃滅菌15min，pH 6.2～6.4，備用。
2.設(shè)備 厭養(yǎng)培養(yǎng)罐bo3-A型2.4升北京東方白信生物技術(shù)有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁? 3.方法 3.1.樣品的配制精密稱取適量凝膠劑樣品，用生理鹽水稀釋凝膠劑使其含聚甲酚磺醛分別為4.5，9，18，36(mg/ml)的溶液為樣品，備用。精密稱取適量度米芬，用生理鹽水配制成濃度分別為4.5，9，18，36(mg/ml)的溶液為陽性對照備用。生理鹽水為陰性對照。
3.2.菌液的培養(yǎng)將MRS培養(yǎng)液121℃，15mi n滅菌。將乳酸桿菌接種于MRS培養(yǎng)液中，37℃厭氧培養(yǎng)48h，應(yīng)用麥?zhǔn)媳葷峁茏鳂?biāo)準(zhǔn)，確定培養(yǎng)的乳酸桿菌濃度為1.5-3.0×108時備用 3.3.實驗方法采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行試驗。將MRS培養(yǎng)液與3％瓊脂液按1∶1比例混合后，121℃20min滅菌。在超凈工作臺中完成下列操作每個培養(yǎng)皿中加入20ml混合液為底層培養(yǎng)基，待凝固后，精取0.3ml新鮮增殖的乳酸桿菌，注滿已鋪好底層的培養(yǎng)皿中。取無菌并干燥的圓形濾紙片(直徑為6mm)，每片上滴加一種濃度的溶液10u l，然后用鑷子將濾紙片輕輕放入培養(yǎng)皿中，對照品的操作類同于樣品，每個培養(yǎng)皿放3個樣品濾紙片，1個陽性對照片和1個陰性對照片，共5片。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平皿表面，蓋好平皿。然后將培養(yǎng)皿放入產(chǎn)生厭養(yǎng)混合氣體的厭養(yǎng)罐中，置于37℃培養(yǎng)箱中厭養(yǎng)培養(yǎng)48小時后取出觀察結(jié)果，用卡尺測量抑菌圈的直徑。試驗重復(fù)3次。結(jié)果見表2 表2樣品對乳酸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑(mm)(n＝3)
4.結(jié)果與討論 本發(fā)明研制的凝膠劑為復(fù)方制劑，曾進(jìn)行的家兔抗生育試驗結(jié)果表明，當(dāng)凝膠劑達(dá)到100％避孕效果時，凝膠劑中的辛苯聚醇濃度為14.4mg/ml，甲酚磺醛的濃度為13mg/ml。本試驗結(jié)果為聚甲酚磺醛濃度在4.5～18mg/ml范圍內(nèi)對乳酸桿菌不產(chǎn)生抑菌圈。結(jié)論本發(fā)明的陰道凝膠劑在抗生育劑量下對陰道乳酸桿菌的生長、繁殖為無抑制作用。
三.對陰道刺激的試驗 1.材料 1.1藥物 ①本發(fā)明凝膠劑，按實施例1配方制備；天津市計劃生育研究所提供。
②空白賦性劑為天津市計劃生育研究所提供。
③樂樂迷凝膠(壬苯醇醚凝膠)購于中國醫(yī)科大學(xué)制藥有限公司。批號050502。。
1.2動物 雌性大耳家白兔16只，體重2.5-3.0kg，購自天津市春樂養(yǎng)殖場，合格證號00666。
2.方法 將兔子隨機(jī)分為四組，1.機(jī)械刺激組；2.空白賦形劑組；3.陽性藥(樂樂醚凝膠)對照組；4.試驗藥組。每天定時用特制的消毒的玻璃套管將凝膠劑緩緩?fù)迫腙幍郎钐?，機(jī)械刺激組只用玻璃套管不加藥，給藥后家兔在特制的鐵絲籠內(nèi)呈仰臥位10分鐘后放回，連續(xù)給藥7天。在末次試驗后24h內(nèi)將家兔處死解剖，肉眼觀察并記錄陰道充血和炎癥情況。將兔子陰道壁組織以10％甲醛液固定24小時后，將陰道壁分上中下三部分取材，經(jīng)石蠟包埋切片，HE染色(用蘇木精和伊紅兩種染料染色)，熒光顯微鏡下觀察。
結(jié)果陰道粘膜病理形態(tài)改變有四種表現(xiàn)①血管充血②水腫③白細(xì)胞浸潤④上皮潰瘍，每個部分病變程度按4級評分。每項刺激程度按四級評分(從無病變至最重)。結(jié)果見表3。
表3陰道刺激試驗各組評分表
評價由本實驗結(jié)果評分可見，本發(fā)明的凝膠劑對陰道刺激四個部分病變總分為4，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)0-8分為可接受范圍，故本發(fā)明凝膠劑的陰道刺激試驗為可接受范圍。
四.抗生育和避孕作用試驗 1.材料 1.1藥物 ①本發(fā)明的凝膠劑，按實施例1制備；由天津市計劃生育研究所提供。
②樂樂迷凝膠(壬苯醇醚凝膠)購于中國醫(yī)科大學(xué)制藥有限公司，批號050502。
1.2動物 大耳白家兔兩性，購自天津市春樂養(yǎng)殖場，體重2.5-3.0kg。合格證號00666。
2.方法 大耳白家兔購入后適應(yīng)環(huán)境1周，按體重隨機(jī)分為5組，每組5只即空白對照組、陽性對照組、本發(fā)明凝膠劑高中低3個劑量組?？瞻讓φ战M給予等量無藥的凝膠，陽性對照組給于樂樂醚凝膠劑48mg/kg，本發(fā)明的凝膠劑高、中、低劑量組分別為本發(fā)明凝膠劑48mg/kg、24mg/kg、12mg/kg 3種劑量。為催家兔發(fā)情，每只雌兔發(fā)情交配前24小時肌注苯甲酸雌二醇0.1mg/只。給藥時用自制的玻璃乳膠注射器套管將凝膠藥液緩慢推入陰道深處，各組均在給藥后10分鐘按1∶2比例與有生育能力的雄兔進(jìn)行交配，交配21天后解剖，記錄卵巢排卵點(diǎn)，子宮著床點(diǎn)，活胎數(shù)，死胎數(shù)和未孕動物數(shù)并計算避孕率，試驗結(jié)果用ins tat軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果與結(jié)論 1.本發(fā)明凝膠劑對家兔的抗生育作用 本發(fā)明的凝膠劑高、中、低3個劑量組卵巢排卵點(diǎn)分別為10.2±1.3，10.2±1.6和10.4±1.5。陽性對照組為10.4±1.1?？瞻讓φ战M為10.4±2.1。統(tǒng)計結(jié)果表明各組家兔卵巢排卵功能正常且無組間差異，見表4。
表4能滅活微生物的避孕凝膠劑對家兔的抗生育的作用。

**與空白對照組相比P＜0.01；*與空白對照組相比P＜0.05 本發(fā)明的凝膠劑高劑量組和陽性對照組一樣子宮著床點(diǎn)均為零，中、低劑量組分別為2.2±4.9和6.0±3.7，空白對照組為8.2±1.9。高劑量組與空白對照組相比有非常顯著的差異(P＜0.01)，中劑量組與空白對照組相比只有顯著的差異(P＜0.05)，低劑量組與空白對照組相比無顯著的差異(P＞0.05)，見表2 本發(fā)明的凝膠劑高劑量組和陽性對照組一樣均無死胎，中劑量組只有一只動物有活胎，活胎數(shù)為2.2±4.9，而低劑量組動物活胎數(shù)為6.0±3.7，空白對照組的活胎數(shù)為8.2±1.9。本發(fā)明的凝膠劑高、中、低3個劑量組與空白對照組相比統(tǒng)計學(xué)上分別為有非常顯著的差異(P＜0.01)，有顯著的差異(P＜0.05)和無顯著的差異(P＞0.05)。實驗各個組均未見死胎，見表2。
2.本發(fā)明凝膠劑對家兔的避孕作用 本發(fā)明的凝膠劑高、中、低3個劑量組家兔未孕數(shù)分別為5只、4只和1只。避孕率分別為100％、80％和20％。與空白對照組相比在統(tǒng)計學(xué)上分別為有非常顯著的差異(P＜0.01)，有顯著的差異(P＜0.05)和無顯著的差異(P＞0.05)。見表5。
表5本發(fā)明凝膠劑對家兔的避孕作用。

**與空白對照組相比P＜0.01；*與空白對照組相比P＜0.05 結(jié)論在試驗劑量下(24-48mg/kg)本發(fā)明凝膠劑對家兔有明顯的抗生育作用和避孕作用。與市售的樂樂醚膠避孕效果相同。
五.體外殺精的試驗 為了觀察能滅活微生物的避孕凝膠劑的殺精效果，我們做了體外殺精試驗。
1.藥品與儀器 1.1藥品 本發(fā)明凝膠劑，按實施例1制備；由天津市計劃生育研究所提供。
辛苯聚醇凝膠劑(實施例1配方中不加聚甲酚磺醛)為天津市計劃生育研究所提供。
樂樂迷(壬苯醇醚凝膠劑)購于中國藥科大學(xué)制藥有限公司，批號050502。。
精液取自禁欲一周健康有生育能力的志愿者。
1.2儀器OLYMPUS CH2顯微鏡、恒溫箱、秒表等。
2.方法 采集禁欲一周的新鮮人精液，待其液化后按WHO指定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行精子總數(shù)和活動度的測定，凡總數(shù)高于20×106/ml，活動率大于80％者用于本試驗。本試驗采用改良Sander-Cramer法，將待測藥物與精液按體積比5∶1混合，充分混勻5秒后，迅速取一滴混合液于載玻片上，在室溫(25℃)用顯微鏡連續(xù)觀察10個高倍視野，記錄20秒內(nèi)有無活動精子。有活動精子的為(+)，無活動精子的為(-)，計算最低殺精濃度。每次試驗采用3個不同志愿者的精液標(biāo)本，每個試驗重復(fù)3次。以樂樂醚做陽性對照藥。
3.結(jié)果與討論 20秒內(nèi)本發(fā)明凝膠劑最低殺精濃度均為0.5mg/ml，與陽性對照藥樂樂醚相同，具體數(shù)據(jù)見表6 表6凝膠劑體外殺精的作用。

注“-”為20秒內(nèi)無活動精子?！?”為20秒內(nèi)有活動精子 試驗結(jié)果表明，辛苯聚醇凝膠劑與樂樂迷最低殺精濃度均為0.5mg/ml與本發(fā)明凝膠劑的殺精效果類同。聚甲酚磺醛不影響辛苯聚醇?xì)⒕饔谩?br> 六.殺菌作用試驗 1、樣品 名稱本發(fā)明凝膠劑按實施例1制備天津市計劃生育研究所提供。
2、培養(yǎng)基及菌種 培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號060323) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號060908) 真菌培養(yǎng)基(批號071017) 瓊脂粉(批號060903)均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn) 菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 大腸埃希菌[CMCC(B)44103] 白色念珠菌[CMCC(F)98001] 均購自中國藥品生物制品檢定所 3、試驗方法 3.1培養(yǎng)基的配制取上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基4g加水至100ml為雙料培養(yǎng)基，取上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2g加水至100ml為單料培養(yǎng)基；取上述真菌培養(yǎng)基5.7g，加水至100ml為雙料培養(yǎng)基，取上述真菌培養(yǎng)基2.85g，加水至100ml為單料培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15分鐘；取上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基6.8g加水至200ml，取上述真菌培養(yǎng)基5.7g及上述瓊脂粉3.8g加水至200ml，121℃高壓滅菌15分鐘，以上各培養(yǎng)基放置約50℃時注入平皿，每個平皿約20ml，凝固后備用。
3.2菌懸液的制備取上述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物1白金耳分別接種于15ml滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24小時；取上述白色念珠菌的真菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)物1白金耳接種于15ml滅菌真菌培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)48小時作為原菌液，取各原菌液1ml分別至盛有9ml滅菌0.9％氯化鈉溶液試管中作為10-1菌液，等倍稀釋至10-6，含菌量為50～100cfu/ml，備用。
3.3樣品處理取凝膠劑2ml各3份，2份分別加至含有雙料營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2ml的滅菌管中，1份加至含有雙料真菌培養(yǎng)基2ml的滅菌管中，混勻，為第一管，濃度為0.9％；取相應(yīng)第一管溶液2ml分別至含有單料營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2ml的滅菌管中及含有單料真菌培養(yǎng)基2ml的滅菌管中，混勻，為第二管，濃度為0.45％；同法依次倍比稀釋至第11管，第3管至第11管的濃度分別為0.225％、0.1125％、0.05625％、0.02812％、0.01406％、0.00703％、0.00352％、0.00176％和0.00088％。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基倍比系列管中的一組每管分別加入含菌量為10-6稀釋級金黃色葡萄球菌菌液0.1ml，另一組每管分別加入含菌量為10-6稀釋級大腸埃希菌菌液0.1ml，35℃培養(yǎng)24小時；真菌培養(yǎng)基倍比系列管中每管分別加入稀釋至10-6的白色念珠菌菌液0.1ml，25℃培養(yǎng)48小時。同時做陽性對照(第12管，培養(yǎng)基2ml中分別加入對照菌0.1ml)、陰性對照(第13管，培養(yǎng)基2ml)及空白凝膠對照(第14管，1ml空白凝膠和1ml雙料培養(yǎng)基中加入對照菌0.1ml)。
4、試驗結(jié)果 滅菌實驗數(shù)據(jù)見表7 表7凝膠劑殺菌效果數(shù)據(jù)
注-表示無菌生長；+表示有菌生長；*表示最低殺菌濃度；#表示最低抑菌濃度 將未見細(xì)菌生長的金黃色葡萄球菌管前5管，大腸埃希菌管前4管培養(yǎng)物各0.1ml分別加入營養(yǎng)瓊脂平皿中，用滅菌棒涂抹均勻，35℃培養(yǎng)24小時；將未見細(xì)菌生長的白色念珠菌前3管培養(yǎng)物0.1ml分別加入真菌瓊脂平皿中，用滅菌棒涂抹均勻，25℃培養(yǎng)48小時。平皿上的菌落數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度為最低殺菌濃度(分別為金黃色葡萄球菌第5管，大腸埃希菌第3管和白色念珠菌第2管)，見表8 5、結(jié)論 本試驗重復(fù)2次，結(jié)果相同。
表8最低殺菌濃度和最低抑菌濃度
空白凝膠對照對本試驗無干擾。
七、殺微生物避孕凝膠劑體外殺滴蟲試驗(可簡化) 1材料 蟲株陰道毛滴蟲采集于天津市南開醫(yī)院婦科 培養(yǎng)基天津醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室配制 樣品①殺微生物避孕凝膠劑按實施例1制備 ②溶液(不含凝膠基質(zhì)) ③替硝唑注射液批號070731 2試驗方法 2.1制備毛滴蟲液培養(yǎng)活躍的800～1000個蟲體/0.1ml。
2.2試驗藥物配制將試驗藥物分別按1∶1，1∶2，1∶4，1∶8稀釋。
2.3按表格所列時間段分別取樣，低倍鏡下觀察蟲體活動情況，高倍鏡下觀察蟲體形態(tài)變化。
3殺蟲效果判定標(biāo)準(zhǔn) ①蟲體活躍、形態(tài)良好(-)；②蟲體微動、形態(tài)正常(±)；③蟲體不活動、形態(tài)變圓(+)；④蟲體完整、顆?；?++)；⑤蟲體裂解(+++) 4試驗結(jié)果 4.1凝膠劑最小抑蟲度1∶1 10分鐘， 最小殺蟲度1∶1 30分鐘 4.2溶液最小抑蟲度1∶8 10分鐘 最小殺蟲度1∶8 30分鐘 試驗結(jié)果表明，凝膠劑在設(shè)計給藥劑量下，給藥10min時能夠滿足殺滅滴蟲的。
八、凝膠劑體外直接殺病毒作用 將不同稀釋度的藥物100μl與100μl HIV上清在EP管中混合，同時設(shè)置陽性藥物次氯酸鈉、陰性對照及陽性對照孔，室溫下孵育0min、5min、10min、30min取出，吸1μl上述混合液到已加好4×104/孔的C8166細(xì)胞的96孔板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體個數(shù)，計算抑制率(％)。試驗結(jié)果表明凝膠劑在1％濃度時，10min和30min抑制率90％左右，表現(xiàn)出較強(qiáng)的直接殺病毒的作用。
九、體外抗淋病抗奈瑟氏菌和抗解脲支原體試驗 試驗結(jié)果表明，凝膠劑在設(shè)計給藥劑量下，還有明顯的抗淋病抗奈瑟氏菌和抗解脲支原體活性作用。
實施例2 原料 羧甲基纖維素、丙二醇、甘油、山梨酸鉀均市售；聚甲酚磺醛濟(jì)南齊河合成精細(xì)化工有限公司提供，批號050802；辛苯聚醇西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易公司(ICEPL CA 630)提供，批號075K0071。純化水自制。
配方 羧甲基纖維素 3.0g 丙二醇 1.0g 甘油 1.0g 聚甲酚磺醛 1.8g 辛苯聚醇 2.0g 苯甲酸鈉 0.15g 純化水 適量 總量 100g 制備方法同實施例權(quán)利要求
1.一種具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，其特征在于該凝膠劑的組分包括殺精子劑、殺菌劑、基質(zhì)、保濕劑、防腐劑及水，并通過以下步驟制得凝膠劑將基質(zhì)加入保濕劑中，邊加入邊攪拌使之分散均勻，再加入殺精子劑，攪拌均勻；取殺菌劑、防腐劑加入制備量的純化水中攪拌成均勻溶液，以上兩種溶液混合在一起，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺撆菁粗频媚z。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，其特征在于該凝膠劑原料重量百分比的配比如下殺精子劑0.1～5、殺菌劑0.1～3、基質(zhì)1～10、保濕劑1～50、防腐劑0.01～0.5，余量為純化水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，其特征在于該凝膠劑原料重量百分比的配比如下殺精子劑2、殺菌劑1.8、基質(zhì)5、保濕劑20、防腐劑0.15，余量為純化水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，其特征在于殺精子劑選自壬苯醇醚和辛苯聚醇中的一種，殺菌劑選自聚甲酚磺醛、酮康唑、甲硝唑和替硝唑中任意一種或兩種?；|(zhì)選自羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、聚殼糖、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素中任意一種或兩種，保濕劑選自丙二醇、甘油和聚乙二醇中任一種或兩種。防腐劑選自山梨酸、山梨酸鉀、苯甲酸、苯甲酸鈉和對羥基苯甲酸酯類中任意一種或兩種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺微生物作用的避孕陰道凝膠劑，屬于避孕用具。本發(fā)明的凝膠劑是由殺精子劑、殺菌劑、基質(zhì)、保濕劑、防腐劑及水組成，并通過以下步驟制得凝膠劑將基質(zhì)加入保濕劑中，邊加入邊攪拌使之分散均勻，再加入殺精子劑，攪拌均勻；取殺菌劑、防腐劑加入制備量的純化水中攪拌成均勻溶液，以上兩種溶液混合在一起，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝竺撆菁粗频谩１景l(fā)明為復(fù)方制劑，除有避孕作用外，還有廣譜抗微生物作用，選用羥丙基甲基纖維素做凝膠劑，使藥物與陰道粘膜有良好的生物相容性，具有粘附力強(qiáng)和粘附時間長，不易流失，保持有效時間長，毒性低、刺激性小等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K47/32GK101606902SQ20081005356
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者沈麗琳, 候慶昌, 邵長風(fēng), 堅 陳, 穎 張, 劉苗苗, 繁 張, 江 王, 賀其剛, 偉 李 申請人:天津市計劃生育研究所