專利名稱：一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18的制作方法
一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18[技術(shù)領(lǐng)域]本發(fā)明涉及動物醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，是一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽 IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。[背景技術(shù)]禽傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是冠狀病毒科冠狀病 毒屬的禽傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，其特征為病雞出 現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降以及腎臟病變等。禽傳染性支氣管炎病毒可感染所有曰 齡的雞，導(dǎo)致生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低；還常常引起霉形體混合感染以及大腸 桿菌病等繼發(fā)感染而提高雞群的死亡率，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來巨大損失。目前，該病呈世界廣泛 流行，是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。禽傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬的代表種，其抗原性異常復(fù)雜，目前世 界上分離的臨床毒株己超過100多株，分屬30種以上血清型。禽傳染性支氣管炎病毒屬于單 股正鏈的RNA病毒，基因組全長27. 6 kb，主要編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、 核蛋白(N)。許多研究表明，S蛋白裂解為SI和S2兩個亞單位，其中SI蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生中 和抗體和血凝抑制抗體,為IBV的主要免疫原。N蛋白攜帶著T細胞表位，在免疫和保護上可 能發(fā)揮作用。M蛋白的免疫原性較低，也有報道M蛋白上可能存在著具有重要免疫作用的抗 原決定簇，能誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(參見殷震，劉景華等.動物病毒學(xué)(第二版).北 京科學(xué)出版社，1997)。禽傳染性支氣管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異，不同血 清型毒株之間交叉保護力弱。在防制上，常規(guī)單一毒株疫苗常有免疫失敗的報道，多價疫苗 可較好解決防治問題。滅活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返強的問題，且能激發(fā)良 好的體液免疫反應(yīng)。其不足之處是使用劑量大，需要配合佐劑，制備比較復(fù)雜，因而成本較 高。加之滅活疫苗不能誘發(fā)機體產(chǎn)生細胞免疫，而一系列的研究證實在IBV的免疫保護中，體液免疫和細胞免疫占有重要地位(參見王紅寧主編.禽呼吸系統(tǒng)疾病.北京農(nóng)業(yè)科技出版社，2002; BW卡爾尼克主編.禽病學(xué)(第九版).北京北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991， 407-418; KustersJG， Niesters, HGM, et al. Virology, 1989, 169:217-221; Avellaneda G E， Villeges P， Jackwood M W， et al. Avian Dis， 1994, 38: 589—597)。近年來許多研究者試圖研究禽傳染性支氣管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的進展。 步志高等(參見步志高，江國托等.中國獸醫(yī)學(xué)報，1998， 18 (6): 527-530)以國內(nèi)類M41地方流行株IBV纖突糖蛋白Sl基因為免疫原基因，構(gòu)建了 DNA免疫表達質(zhì)粒，并對其免疫原 性進行了初步分析。結(jié)果表明該表達質(zhì)?？赏瑫r誘導(dǎo)機體形成針對IBV的細胞免疫和體液免 疫反應(yīng)。陳洪巖等(參見陳洪巖，江國托，楊奇?zhèn)サ?中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999， 21 (4): 250-253)將雞傳染性支氣管炎病毒腎型T株Sl基因cDNA連接于pcDNA3構(gòu)建了真核表達質(zhì) 粒，經(jīng)肌肉注射免疫SPF雞后血清IgG抗體逐漸升高，至35日齡左右達到高峰，但血清IgG 抗體升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40%的雞可耐過強毒的攻擊。劉思國等(參見劉 思國，康麗鵑，江國托等.中國獸醫(yī)學(xué)報，2001， 21 (1): 14-16)將雞傳染性支氣管炎HB 株的N基因亞克隆到pcDNA3，構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA-N。用該質(zhì)粒兩次免疫SPF雛雞一 周后進行攻毒試驗，結(jié)果保護率為40%，表明N蛋白介導(dǎo)的細胞免疫在抗感染中發(fā)揮了作用。 Kapczymki DR等(Kapczynski DR， HiltDA, Shapiro D, et al. Avian Dis， 2003， 47:272—285) 將構(gòu)建的表達S1蛋白的DNA疫苗通過胚內(nèi)接種或肌注，結(jié)果顯示，18日齡的雞胚先用此疫 苗免疫，在雛雞孵出2周后再用弱毒苗加強免疫，可使雞得到100%保護，而單用DNA疫苗 胚內(nèi)接種或弱毒苗肌注雛雞，保護率都小于80%。劉兆球等(劉兆球，姜世金，常維山等.中 國獸醫(yī)學(xué)報，2005， 25(3) : 241-243)用IBV Sl基因構(gòu)建了真核表達載體pcDNA—Sl，研究表明 構(gòu)建的DNA疫苗能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，抵抗強毒感染。DNA疫苗預(yù)防傳染性支 氣管炎的研究發(fā)現(xiàn)，單一抗原的DNA疫苗存在免疫原性差、誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的免疫保護率低等 缺點。因此，如何提高機體免疫應(yīng)答效率，增強DNA疫苗的免疫效果成為當前疫苗研究的關(guān) 鍵問題。隨著對細胞因子研究的不斷深入，許多細胞因子被發(fā)現(xiàn)具有明顯的分子佐劑效應(yīng)，能特 異性增強抗原的免疫原性或增強機體對抗原的免疫反應(yīng)性，而且細胞因子的網(wǎng)絡(luò)化作用能優(yōu) 化宿主的特異性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫保護力。其中IL-18具有多種生物學(xué)活性，可提高NK細胞的細胞毒性，提高T細胞產(chǎn)生IFN-Y 和GM-CSF的能力，促進Thl克隆反應(yīng)。IL-18作為佐劑可顯著增強DNA疫苗的免疫效果。 Marshall (Marshall D丄Rudnick K A， McCarthy S G， et al. Vaccine, 2006,24:244-53) 等將PSADNA疫苗與IL-18質(zhì)粒共同注射小鼠后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-18能顯著提高CD4+、 CD8+T 淋巴細胞應(yīng)答和抗原特異性免疫應(yīng)答及疫苗效能。Billaut等(Billaut-Mulot 0， Idziorek T, Loyens M, et al. Vaccine, 2001,19:2803-11)研究發(fā)現(xiàn)，IL-18 DNA質(zhì)粒與表達HIV-1 Gag， Tat和Nef蛋白的多價DNA疫苗共免疫，可縮短CTL誘導(dǎo)時間2周，增加抗原誘導(dǎo)的IL-2 和IFN-Y的分泌，增強抗原特異性TH細胞的增殖，而降低抗HIV抗體滴度。Kim等(Kira S H, ChoD, Hwang SY， et al. Vaccine, 2001,19:4107-14 )構(gòu)建了 pOVA/IL18、 pOVA、 pIL18 真核表達質(zhì)粒，將以上質(zhì)粒分別或共同肌注免疫小鼠后，檢測0VA特異性IgG2a和IFN-Y的分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p0VA/IL18組免疫效果較pOVA組顯著升高，表明IL-18能增強Thl型免疫應(yīng) 答，且這種增強作用依賴于它與抗原的共表達。[發(fā)明內(nèi)容]本發(fā)明將pIBVN、 pIRES-EGFP/DsRed質(zhì)粒用Nhel和Xhol雙酶切后，膠回收N 基因和載體片段進行連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIRES-N/DsRed。以pDNAIL-18質(zhì)粒為模板， PCR獲取禽源IL-18基因。將IL-18、 pIRES-N/DsRed質(zhì)粒用BamHI和Notl雙酶切后，膠回 收IL-18基因和載體片段進行連接，構(gòu)建了禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株SAIBk株N基 因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。該疫苗可用于預(yù)防禽傳染性支氣管炎。 [具體實施方式
l1. 本發(fā)明所使用的真核表達質(zhì)粒pIBVN、 pDNAIL-18和真核表達載體pIRES-EGFP/DsRed由本 實驗室構(gòu)建并提供；宿主大腸桿菌JM109由本實驗室保存；禽傳染性支氣管炎病毒攻毒用毒 株SAIBk株由實驗室鑒定并保存。2. 引物的設(shè)計及合成是根據(jù)國內(nèi)外已在GenBank中登錄的雞白細胞介素18基因序列經(jīng)多重比 較后設(shè)計。根據(jù)真核表達載體pIRES-EGFP/DsRed上的酶切位點，上游引物設(shè)計在起始密碼子 處，并加上BamHI酶切位點；下游引物設(shè)計在基因末端，并加上NotI酶切位點。引物序列為上游弓l物5'-CTCGG爿rCCACCATGGCCTTTTGTAAG-3';下游弓l 物:5'-AATGCGGCCGCTCATAGGTTGTGC-3'。3. 真核表達質(zhì)粒pIRES-N/DsRed的構(gòu)建，將pIBV N用Nhel和Xhol進行雙酶切處理，膠回收 1. 2kb的條帶，以同樣的方法對pIRES-EGFP/DsRed質(zhì)粒進行雙酶切處理，膠回收5. 3kb左右 DNA片段。分別取5nL雙酶切后膠回收的N基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer 1 u L， T4DNA 連接酶luL，酶切處理載體pIRES-EGFP/DsRed 1 n L， ddH20 2nL， 16。C連接18小時。將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB平板上37'C培養(yǎng)。4. 真核表達質(zhì)粒pIRES-N/DsRed的鑒定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取單個菌落，抽提質(zhì)粒 DNA進行雙酶切鑒定。將pIRES-N/DsRed真核表達質(zhì)粒用Nhel和XhoI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物在 0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pIRES-N/DsRed雙酶切后產(chǎn)生約1. 2kb和5. 3kb的兩條條帶，證明N 基因己經(jīng)替換了pIRES-EGFP/DsRed質(zhì)粒中的綠色熒光基因(EGFP)。5. 共表達質(zhì)粒pIRES-N/IL18的構(gòu)建，以pDNAIL-18質(zhì)粒為模板，PCR獲取禽源IL-18基因，將 IL-18基因的PCR產(chǎn)物用酚氯仿抽提純化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。IL-18基因的PCR純化 產(chǎn)物用BamHI和NotI進行雙酶切處理，膠回收0.5kb的條帶。以同樣的方法對pIRES-N/DsRed 質(zhì)粒進行酶切處理，膠回收5.8kb左右的條帶。分別取5u L雙酶切后膠回收的IL-18基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer 1 u L， T4DNA連接酶luL，酶切處理載體pIRES-N/DsRed 1 u L， ddH20 2yL， 16。C連接18小時。將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB平板上37'C培養(yǎng)。6. 共表達質(zhì)粒pIRES-N/IL18的鑒定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取單個菌落，抽提質(zhì)粒DNA 進行雙酶切鑒定。將pIRES-N/IL18真核表達質(zhì)粒用BamHI和Notl進行雙酶切，酶切產(chǎn)物在O. 8% 瓊脂糖凝膠電泳觀察，pIRES-N/IL18雙酶切后產(chǎn)生約0. 5kb和5. 3kb兩條條帶，證明已經(jīng)成功 構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pIRES-N/IL18 。7. —種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18的研制。 從LB固體培養(yǎng)基中挑取單菌落，接種于盛有10ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37。C震蕩過夜培 養(yǎng)。在1000ml的三角瓶中加入100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5ml的菌種，37°C， 200rpm / min， 培養(yǎng)20h.。用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法進行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法進行純化。 電泳鑒定質(zhì)粒的純度和含量。質(zhì)粒用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，即為一種禽傳染性支氣管炎 病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。該DNA疫苗用肌肉注射的方法進 行預(yù)防接種。
權(quán)利要求
1.一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18，其特征在于用分子生物學(xué)方法將禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株SAIBk株N基因和禽IL-18基因插入真核表達載體pIRES-EGFP/DsRed中，構(gòu)建能表達N基因和禽IL-18基因共表達質(zhì)粒，研制DNA疫苗pIRES-N/IL18，該DNA疫苗pIRES-N/IL18能用于預(yù)防禽傳染性支氣管炎。
2. 權(quán)利要求1所述的一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達 DNA疫苗pIRES-N/IL18,其特征在于用禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株 SAIBk株N基因經(jīng)NheI和XhoI雙酶切，禽IL-18基因經(jīng)Bamffl和Notl雙酶切后， 插入真核表達載體pIRES-EGFP/DsRed中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒，研制DNA疫苗 pIRES-N/IL18。
3. 權(quán)利要求2所述的一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA 疫苗pIRES-N/IL18用于預(yù)防禽傳染性支氣管炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物醫(yī)藥生物工程研究領(lǐng)域，是一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。本發(fā)明將pIBVN、pIRES-EGFP/DsRed質(zhì)粒用NheI和XhoI雙酶切后，膠回收N基因和載體片段進行連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIRES-N/DsRed。以pDNAIL-18質(zhì)粒為模板，PCR獲取禽源IL-18基因。將IL-18、pIRES-N/DsRed質(zhì)粒用BamHI和NotI雙酶切后，膠回收IL-18基因和載體片段進行連接，構(gòu)建了一種禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株SAIBk株N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。該疫苗可用于預(yù)防禽傳染性支氣管炎。
文檔編號A61P11/00GK101235386SQ20081004494
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日
發(fā)明者唐夢君, 夏青青, 毅 張, 曾瑜虹, 李玉玲, 王紅寧, 泰 陽 申請人:四川大學(xué)