專利名稱：抗癌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌劑，尤其涉及含有輪烷化合物作為有效成分的抗癌劑。
背景技術(shù)：
與30年前相比，日本的平均壽命延長了 10歲以上，開發(fā)出大量腦卒中、 心臟病(以往多發(fā)的死亡原因)的治療藥被認為是其重要原因之一。但隨著 作為死亡原因的腦卒中、心臟病的減少，癌癥(惡性贅生物)導致的死亡逐 年增加?，F(xiàn)今，居于第一位的死亡原因是癌癥，因此現(xiàn)在很多研究者在進行 抗癌劑的研究。
由于多數(shù)抗癌劑是被癌細胞攝入后才開始發(fā)揮作用，為了使受體介導的 攝入容易，以往認為分子量小且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的藥物是有效的。 專利文獻l:日本專利第3741706號說明書
非專利文獻l:高田十志和，木原伸浩，古莊義雄，"0夕一口、乂夕 卜化合物O合成K上3于/材料C0機能設(shè)計(基于互鎖化合物合成的納米材
料的功能設(shè)計)"，高分子，2001年，50[11]， p.770 773
非專利文獻2:古莊義雄，木原伸浩，高田十志和，"7 y :y匕°乂夕、、二 上3口夕年廿y、求y 口夕年廿y(D合成-新LV、高分子合成法^考乏3 -(基于滑動的輪烷、巨輪烷的合成——新高分子合成方法的思考)"，高分子 加工，2001年，50[3]， p.114 120
非專利文獻3:木原伸浩，高田十志和，"水素結(jié)合^基。、〈一y夕一 口、乂夕卜化合物O合成-口夕年廿y、力亍于y合成O最近O進歩-(基于氫 鍵的互鎖化合物合成——輪烷、索烴合成的最新進展)"，有機合成化學協(xié)會 誌，2001年，59[3], p.206~218

發(fā)明內(nèi)容
然而，易于由受體介導攝入的抗癌劑也多易于從細胞排出，于是存在很 難存留于癌細胞內(nèi)的問題。而且，由于曾排出抗癌劑的癌細胞對該抗癌劑具有抗藥性，存在相同抗癌劑失效的問題。
此外，易于由受體介導攝入的抗癌劑也易于被正常細胞攝入，存在很難 用于局部治療、易產(chǎn)生副作用的問題。
鑒于以上問題，為了開發(fā)出不易由癌細胞排出的新的抗癌劑，本發(fā)明者
潛心進行了反復研究，結(jié)果成功地開發(fā)了含有索烴(力亍于y， catenane)作為 有效成分的抗癌劑(參考專利文獻1 )。具有抗癌作用的索烴是被稱為酰胺型 [2]索烴的化合物的一種，其具有下述結(jié)構(gòu)非共價結(jié)合的2個分子環(huán)呈鏈狀連接。
認為像索烴這樣部分未通過共價鍵結(jié)合的高分子新型化合物，由于分子 量比較大且分子易變形， 一旦被細胞攝入就不易被排出。而且，這樣的高分 子新型化合物本來就不易被吸收入細胞內(nèi)。因此，將其局部用于癌細胞時， 不僅可使其對正常細胞的作用降至極小，而且^可有效抑制癌細胞的增殖。
作為這樣的高分子新型化合物，除了索烴外，已知的還有被稱為輪烷 (Rotaxane)的化合物(參考非專利文獻1 3 )。在專利文獻1中，本發(fā)明者 預言了輪烷的抗癌作用，為了證實該預言，進行了潛心研究。
的^t癌劑。
為了尋找具有抗癌作用的輪烷化合物，本發(fā)明者進行了反復研究。結(jié)果 確定部分輪烷具有抗癌作用。
也就是說，本發(fā)明的抗癌劑含有化學式(I)所示的輪烷化合物作為有 效成分。<formula>formula see original document page 4</formula>
該輪烷化合物是被正式稱為[2][雙(2- (3,5-二曱基苯基羰氧基)乙基) 銨三氟曱磺酸鹽]-[二苯并_24-冠-8]輪烷([2][bis(2-(3,5-dimethylphenylcarbonyloxy)ethyl)ammonium
trifluoromethanesulfonate]-[dibenzo-24-crown-8] rotaxane)的化合物,分子量為 819。該輪烷化合物對熱比較穩(wěn)定，可溶于有機溶劑且不溶于水。
如上述化學式(I)所示，該輪烷化合物由兩端結(jié)合有較大分子的棒狀 部分、和環(huán)狀部分(冠醚)這兩部分構(gòu)成，所述棒狀部分插入環(huán)狀部分中。 環(huán)狀部分由于處于插入有棒狀部分的狀態(tài)，因此可以以棒狀部分為軸移動。 但由于在棒狀部分的兩端結(jié)合有較大的分子，其成為擋塊，使環(huán)狀部分無法 由棒狀部分脫離。
這樣，雖然具有棒狀部分和環(huán)狀部分連接的結(jié)構(gòu)，但該棒狀部分和環(huán)狀 部分并不通過共價鍵結(jié)合。因此，分子的形狀易發(fā)生變化，雖然受體介導的 攝入變得較為困難，但若將其導入癌細胞內(nèi)，則可抑制癌細胞的增殖。
為了將該輪烷化合物導入癌細胞內(nèi)，優(yōu)選在癌細胞的細胞膜上開孔，由 該孔導入細胞內(nèi)。作為在細胞膜上開孔的方法，可以使用電穿孔法。使用電 穿孔法可局部導入上述輪烷化合物，因此，可被正常細胞攝入的量降至極低， 其結(jié)果，可減輕副作用等患者的負擔。
目前，經(jīng)本發(fā)明者確認具有抗癌作用的輪烷化合物僅為上述化學式所示 的輪烷化合物。但從輪烷化合物全體所具有的很難被攝入細胞內(nèi)且一旦被攝 入便很難排出的特征考慮，本發(fā)明者預測除上述化學式所示輪烷化合物外， 還存在其它具有抗癌作用的輪烷化合物。
這樣，本發(fā)明可提供不易從癌細胞排出且適于局部治療的抗癌劑。


圖1為表示樣品A0 A5的評價結(jié)果的圖。 圖2為表示樣品B0 B4的評價結(jié)果的圖。 圖3為表示樣品C0 C2的評價結(jié)果的圖。 圖4為表示樣品D0 D2的評價結(jié)果的圖。 圖5為表示與現(xiàn)有抗癌劑比較結(jié)果的表。
發(fā)明的
具體實施例方式
以下，就本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。
本發(fā)明的抗癌劑含有上述化學式(I)所示的輪烷化合物作為有效成該輪烷化合物的合成方法沒有特別限制，可用滑動法(7 y 、;/ t。y夕、'法)合成。 由于這樣得到的輪烷化合物可溶解于二曱基亞砜(DMSO)等溶劑，因 而該溶液可作為抗癌劑使用。溶液中輪烷的濃度沒有特別限制，優(yōu)選為10nM (納摩爾濃度)以上，特別優(yōu)選為100nM以上。這是因為雖然溶液中輪烷 的濃度小于lOnM也具有在一定程度上延緩癌細胞增殖的效果，但溶液中輪 烷的濃度為10nM以上時，表現(xiàn)出明確的延緩增殖效果。此外，溶液中輪烷 的濃度為100nM以上時，對癌細胞的抑制效果明顯，隨著時間的延長，可 j吏癌細力包減少。
構(gòu)成該輪烷化合物的"棒狀部分"和"環(huán)狀部分"不通過共價鍵結(jié)合。于 是，輪烷化合物的形狀易發(fā)生變化，受體介導的攝入較為困難。因此，向癌 細胞內(nèi)導入該輪烷化合物時，優(yōu)選用電穿孔法在癌細胞的細胞膜上開孔。停 止施加電壓時，經(jīng)電穿孔在細胞膜上形成的孔穴迅速被修復。優(yōu)選電穿孔時 的電壓波形為DC脈沖，脈沖電壓為10 40V,脈沖寬度為10毫秒(msec)左 右，脈沖周期為3秒(sec)左右，施加約10次脈沖。
于是，如果通過電穿孔法等使該輪烷化合物被攝入癌細胞內(nèi)，則癌細胞 不易將其排出，因此，不僅可長時間發(fā)揮作用，而且很難表現(xiàn)出對該輪烷化
合物的抗藥性。 實施例
下面，就本發(fā)明的實施例進行說明。
在驗證輪烷化合物的抗癌作用前，對溶劑濃度和電穿孔條件進行設(shè)定。 關(guān)于溶劑濃度的設(shè)定，由于作為溶劑使用的DMSO作為自由基清除劑對癌 細胞發(fā)揮作用，因此有必要在能夠?qū)嵸|(zhì)上忽略DMSO的自由基清除作用的 狀態(tài)下進行驗證。另外，關(guān)于電穿孔條件的設(shè)定，若電穿孔時施加的電壓過 高，則致使細胞損傷，因此有必要在能夠?qū)嵸|(zhì)上忽略電穿孔對癌細胞的影響 的狀態(tài)下進行驗證。
卩容劑濃度的設(shè)定]
首先，準備小鼠惡性黑素瘤細胞系(B16)，將其播種于96孔的微板上， 使孔內(nèi)細胞數(shù)分別為約5000個。然后，向各孔中分別添加DMSO'使其總 量為100pL。對于樣品A0 A5，添加的DMSO的濃度分別按照表1進行設(shè)定。[表l]
樣品名DMSO的濃度
樣品AO0%
樣品Al0.1%
樣品A20.2%
樣品A30.3%
樣品A40.4%
樣品A50.5%
隨后，將這些樣品A0 A5中含有的細胞系在C02孵育器中培養(yǎng)24小時。 設(shè)定C02孵育器的溫度為37.0°C, C02濃度為5.0%。然后，向各樣品中添 加細胞增殖試驗試劑(生化學工業(yè)抹式會社制，商品名"Tetra Color One") lO(iL,在C02孵育器中反應(yīng)2小時。隨后，通過用微板讀取器(Bio-Rad公 司制)測定在波長450nm處的吸光度(對照波長600nm),測定了細胞系 的存活率。分別在與細胞增殖試驗試劑反應(yīng)后24小時、48小時以及72小時 的時間點測定存活率。
測定結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，可以確認溶劑DMSO濃度增大時， 自由基清除作用明顯，可抑制癌細胞的增殖。因此，將DMSO的濃度決定 為對癌細胞影響最小的0.1% (樣品Al)。于是，以下實驗中的DMSO濃度 均固定為0.1%。
向具有一對電極的多個缽(BTX公司制，商品名"ECM399")中加入約 5000個惡性黑素瘤細胞系(B16)和DMSO(0.P/。)，使其總量分別為600fiL。 隨后，在各缽的電極上施加DC脈沖，進行了電穿孔操作。對于樣品B0 B4， 分別按照表2設(shè)定脈沖電壓。各樣品脈沖的施加次數(shù)均為10次，脈沖寬度 為約10毫秒，脈沖周期為約3秒。
7[表2]
樣品名電壓
樣品BO0V
樣品Bl10V
樣品B220V
樣品B330V
樣品B4術(shù)
隨后，將這些樣品B0 B4中含有的細胞系在與上述"溶劑濃度的設(shè)定，， 相同的條件下進行培養(yǎng)，使之與細胞增殖試驗試劑反應(yīng)。然后分別測定24 小時后、48小時后以及72小時后細胞系的存活率。
測定結(jié)果如圖2所示。如圖2所示，樣品B3得到與未進行電穿孔的樣 品BO基本相同的結(jié)果。因此，將電穿孔時的施加電壓定為對癌細胞影響最 小的30V。于是，以下實驗中電穿孔時的施加電壓均固定為30V。 _
樣品名濃度
樣品COOnM
樣品Cl10 nM
樣品C2100 nM
隨后，將這些樣品C0 C2中含有的細胞系在與上述"溶劑濃度的設(shè)定" 相同的條件下進行培養(yǎng)，使之與細胞增殖試驗試劑反應(yīng)。然后分別測定0小 時后、24小時后、48小時后以及72小時后細胞系的存活率。
測定結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，輪烷化合物的濃度越高，培養(yǎng)后的
8細胞數(shù)越少，由此可以確認式(I)所示輪烷化合物具有延遲癌細胞的增殖 的效果。輪烷化合物的詳細作用機制尚不明確，但可以認為輪烷化合物并非 時間依賴性而是濃度依賴性地抑制細胞的增殖，不依賴于細胞周期。 [抗癌作用的驗證2 (進行電穿孔)]
向具有一對電極的多個缽中加入約5000個惡性黑素瘤細胞系(B16)、 DMSO (0.1%)和式(I)所示輪烷化合物，使其總量分別為600(LiL。隨后， 在各缽的電極上施加30V的DC脈沖10次，進行電穿孔操作。對于樣品 D0 D2，添加的輪烷化合物的濃度分別按照表4進行設(shè)定。 [表4]
樣品名濃度
樣品DOOnM
樣品Dl10 nM
樣品D2100 nM
隨后，將這些樣品D0 D2中含有的細胞系在與上述"溶劑濃度的設(shè)定" 相同的條件下進行培養(yǎng)，使之與細胞增殖試驗試劑反應(yīng)。然后分別測定0小 時后、24小時后、48小時后以及72小時后細胞系的存活率。
測定結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，進行電穿孔時對癌細胞增殖的抑制 效果更為明顯。尤其是在輪烷化合物濃度為100nM的樣品D2中，可以確認 隨著時間的推移，癌細胞減少。這樣，確認通過使輪烷化合物濃度為100nM 以上、且進行電穿孔，可以得到顯著的癌細胞增殖抑制效果。
此外，時間或濃度結(jié)果表明，在抗癌劑的分類方面，其以高濃度在短時 間內(nèi)發(fā)揮作用。
關(guān)于凋亡(Apoptosis)抗性基因Bel-2的mRNA的表達、凋亡促進性基因 Bax以及Bad的mRNA的表達、以及細胞死亡相關(guān)基因(細胞死O実行遺伝 子)Caspase-3的mRNA的表達，以作為普通蛋白的(3-肌動蛋白為基礎(chǔ)進行研 究，與現(xiàn)有抗癌劑5-FU進行比較。各mRNA的表達是在提取總RNA后， 通過PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))進行，經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳后，進行焚光測定，求得與未使用抗癌劑的樣品(對照)的熒光比。
結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，在輪烷化合物和5-FU中，所得熒光比大致相同。但很明顯的是輪烷化合物的用量為5-FU的十分之一以下，其 抗肺瘤作用強于現(xiàn)有抗癌劑?；谝陨辖Y(jié)果，認為式(I)所示輪烷化合物 作為抗癌劑是有用的。 工業(yè)實用性
可以認為本發(fā)明作為抗癌劑是有用的。
權(quán)利要求
1. 一種抗癌劑，其含有下述化學式(I)所示的輪烷化合物作為有效成分[化學式1]
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其中，所述輪烷化合物溶解于溶液 中，并且所述輪烷化合物在所述溶液中的濃度為10nM以上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗癌劑，其中，所述輪烷化合物溶解于溶液 中，并且所述輪烷化合物在所述溶液中的濃度為lOOnM以上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的抗癌劑，其中，通過電穿孔法將 所述輪烷化合物導入細胞內(nèi)。
全文摘要
提供不易由癌細胞排出且適于對癌細胞進行局部治療的新的抗癌劑。本發(fā)明的抗癌劑含有化學式(I)所示的輪烷化合物作為有效成分。該輪烷化合物由兩端結(jié)合有較大的分子的棒狀部分、和被該棒狀部分插入的環(huán)狀部分(冠醚)這兩個部分構(gòu)成。由于在棒狀部分的兩端結(jié)合有較大的分子，其成為擋塊，使環(huán)狀部分無法由棒狀部分脫離。該棒狀部分和環(huán)狀部分并不通過共價鍵結(jié)合。因此，分子的形狀易發(fā)生變化，受體介導的攝入變得較為困難，但一旦將其導入癌細胞內(nèi)，則可抑制癌細胞的增殖。
文檔編號A61K31/357GK101522188SQ200780038299
公開日2009年9月2日 申請日期2007年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月14日
發(fā)明者小野信文 申請人:萬斯有限公司