專利名稱：抗癌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌劑，尤其是涉及含有索烴化合物作為其活性成分的抗癌劑。
背景技術(shù)：
在日本，平均壽命與30年前相比延長了10歲以上，據(jù)認(rèn)為其主要原因是由于開發(fā)出了大量的用于治療腦卒中和心臟疾病的藥物，其中腦卒中和心臟疾病以往一直是導(dǎo)致死亡的主要因素。然而，隨著作為死亡的主要因素的腦卒中和心臟疾病的減少，癌癥(惡性腫瘤)所致的死亡則逐年增加。在日本，癌癥目前是死亡的主要原因，因此目前有大量的研究人員從事抗癌劑的研究。
由于大多數(shù)抗癌劑只有在被癌細(xì)胞吸收后才起作用，因此過去一直認(rèn)為具有低分子量且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的藥物易于經(jīng)受體介導(dǎo)而被吸收，因而該類藥物是有效的。

發(fā)明內(nèi)容
然而，易于經(jīng)受體介導(dǎo)而被吸收的抗癌劑也經(jīng)常容易從細(xì)胞中排出，因此其具有在癌細(xì)胞中保留欠佳的缺點(diǎn)。一旦抗癌劑從癌細(xì)胞中排出，該細(xì)胞就對該抗癌劑產(chǎn)生抗性，所述抗癌劑就會(huì)失效。
因?yàn)橐子诮?jīng)受體介導(dǎo)而被吸收的抗癌劑也容易進(jìn)入到正常細(xì)胞中，因此難以進(jìn)行局部治療，而且容易產(chǎn)生副作用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新抗癌劑，該抗癌劑難以從癌細(xì)胞中排出。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的抗癌劑，該抗癌劑適于針對癌細(xì)胞進(jìn)行局部治療。
本發(fā)明人致力于將一種獨(dú)特的高分子化合物作為不易被癌細(xì)胞排出的化合物，該類高分子化合物中不存在通過共價(jià)鍵進(jìn)行鍵合的部分，其示例例如索烴或輪烷(見日本特開平No.11-80136號(hào)公報(bào))。這種獨(dú)特的高分子化合物具有相對較大的分子量且其分子易于變形，因此據(jù)信，這種聚合物一旦進(jìn)入至癌細(xì)胞中就難以被排出。由于這種獨(dú)特的高分子化合物實(shí)質(zhì)上難以被細(xì)胞所吸收，因此如果對癌細(xì)胞局部施用該化合物，則可以顯著減少該化合物對正常細(xì)胞的影響。
本發(fā)明人從這一觀點(diǎn)出發(fā)進(jìn)行了集中研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一部分索烴化合物具有抗癌作用。
具體地，本發(fā)明抗癌劑的特征在于，該抗癌劑含有下述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物作為活性成分。
這種索烴化合物是一類被稱為酰胺型[2]索烴的化合物，該化合物的正式名稱為3，11，18，26-四氮雜五環(huán)[26.2.2.213，16.15，9.120，24]三十六烷-5，7，9(36)，13，15，20，22，24(33)，28，30，34-十二烯-4，10，19，25-四酮(9Cl)，(十二烯dodecaene)。如上述化學(xué)式(I)所示，這種索烴化合物具有兩個(gè)分子環(huán)連接成鏈狀的結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)分子環(huán)并未通過共價(jià)鍵相互鍵合。因此該分子的形狀易于變化，并且使其比較難以通過受體的介導(dǎo)而引入至細(xì)胞中，但是已經(jīng)知道該分子一旦被導(dǎo)入到癌細(xì)胞中，就會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖。
用于將所述索烴化合物導(dǎo)入至癌細(xì)胞中的一種優(yōu)選方法為在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上開孔，通過所述孔將該化合物導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)?？梢圆捎秒姶┛追ㄗ鳛樵诩?xì)胞膜上開孔的方法。若采用電穿孔法，則可以局部地導(dǎo)入上述索烴化合物，因此可將導(dǎo)入至正常細(xì)胞中的該化合物的量保持為極低，由此可以減輕患者的副作用和其它痛苦。
目前，已經(jīng)被本發(fā)明人確認(rèn)具有抗癌作用的索烴化合物僅包括上述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物。然而，考慮到索烴化合物一般都具有難以被引入至細(xì)胞內(nèi)并且一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就難以被排出的特性，因而預(yù)計(jì)除上述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物以外，還存在其它具有抗癌作用的索烴化合物，并且還存在具有抗癌作用的輪烷化合物。
如上所述，通過本發(fā)明可以提供難以被癌細(xì)胞排出且適合于局部治療的抗癌劑。


圖1是顯示樣品1至4的評價(jià)結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
下文將描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
本發(fā)明的抗癌劑含有下述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物作為活性成分。
對用于合成所述索烴化合物的方法沒有特別的限制，可以通過使間苯二酰二氯與對亞二甲苯基二胺進(jìn)行反應(yīng)來合成。
將如此得到的索烴化合物溶于二甲亞砜(DMSO)等溶劑中，所得到的溶液可以用作抗癌劑。對于溶液中所述索烴的濃度沒有特別的限制，但是優(yōu)選為300μg/ml以上。這是因?yàn)?，盡管溶液中的索烴濃度即使低于300μg/ml也可以獲得抑制癌細(xì)胞增殖的效果，但是在濃度為300μg/ml以上時(shí)，其效果更加顯著。
構(gòu)成所述索烴化合物的兩個(gè)分子環(huán)未通過共價(jià)鍵進(jìn)行鍵合，因而其形狀易于變化，使其相對難以通過受體的介導(dǎo)而引入細(xì)胞中。因此，為了將該索烴化合物導(dǎo)入至癌細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選采用電穿孔法在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上開孔。在這種情況中，電壓波形優(yōu)選為直流(DC)脈沖的電壓波形，脈沖電壓優(yōu)選為約100V，并且脈沖周期優(yōu)選約為10毫秒(msec)。
一旦將該索烴化合物通過電穿孔法等方法引入至癌細(xì)胞內(nèi)，癌細(xì)胞就不能容易地將該化合物排出，因此該索烴化合物可以長期發(fā)揮作用，并且癌細(xì)胞也很難表現(xiàn)出對所述索烴化合物的抗性。
實(shí)施例以下將描述本發(fā)明的實(shí)施例。
細(xì)胞采樣首先，將小鼠colon-26細(xì)胞(結(jié)腸癌細(xì)胞)附著在培養(yǎng)瓶的內(nèi)壁。
然后放置培養(yǎng)瓶，使得附著有癌細(xì)胞的面處于下部，使不含血清的培養(yǎng)基(RPMI，8mL)流入至培養(yǎng)瓶內(nèi)，連續(xù)培養(yǎng)癌細(xì)胞約一周的時(shí)間，使所述細(xì)胞處于充分附著的狀態(tài)(匯合狀態(tài))。然后棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，進(jìn)一步以不含血清的培養(yǎng)基(RPMI，5mL)沖洗培養(yǎng)瓶的內(nèi)部。由此棄掉幾乎所有沒有附著至培養(yǎng)瓶內(nèi)壁的細(xì)胞，只留下增殖并附著在內(nèi)壁上的那些細(xì)胞。
然后將5mL含有胰蛋白酶的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液加入至培養(yǎng)瓶中，使附著在內(nèi)壁上的細(xì)胞與壁分離，接著將瓶中所有的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中。進(jìn)一步以含有血清的培養(yǎng)基(RPMI，5mL)沖洗培養(yǎng)瓶的內(nèi)部，以中和胰蛋白酶，并將瓶中所有的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中。
然后對所述培養(yǎng)管進(jìn)行離心分離(1000rpm，5分鐘)，接著棄掉上清液，以含有血清的培養(yǎng)基(RPMI，10mL)重懸。由此獲得作為原試樣的懸浮液。
電穿孔操作制備含有720μL前述懸浮液和80μL DMSO的合計(jì)為800μL的樣品(樣品1)，并將該樣品放入具有一對電極的小池(cuvette)中。
制備另外的含有720μL前述懸浮液和80μL DMSO溶液(該DMSO溶液含有濃度為60μg/mL的化學(xué)式(I)所示的索烴)的合計(jì)為800μL的樣品(樣品2)，將該樣品放在另一小池中。
制備另外的含有720μL前述懸浮液和80μL DMSO溶液(該DMSO溶液含有濃度為105μg/mL的化學(xué)式(I)所示的索烴)的合計(jì)為800μL的樣品(樣品3)，將該樣品放在另一小池中。
制備另外的含有720μL前述懸浮液和80μL DMSO溶液(該DMSO溶液含有濃度為300μg/mL的化學(xué)式(I)所示的索烴)的合計(jì)為800μL的樣品(樣品4)，將該樣品放在另一小池中。
然后將直流脈沖(脈沖電壓104V～108V；脈沖周期9毫秒～11毫秒)施加到分別含有樣品1至樣品4的小池的電極上，進(jìn)行電穿孔操作。
電穿孔操作結(jié)束后，分別將樣品1至樣品4轉(zhuǎn)移至15mL的培養(yǎng)管內(nèi)，該培養(yǎng)管中具有含血清培養(yǎng)基(RPMI，5mL)，對培養(yǎng)管中的內(nèi)容物進(jìn)行離心分離(1000rpm，5分鐘)，然后棄掉上清液，以含血清培養(yǎng)基(RPMI，3mL)進(jìn)行重懸。
樣品評價(jià)用不含血清的培養(yǎng)基(RPMI，500μL)沖洗后，準(zhǔn)備4塊加入了含血清培養(yǎng)基(RPMI，500μL)的24孔(培養(yǎng)板)，將各40μL的已經(jīng)進(jìn)行了電穿孔操作的樣品1～4轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的24孔中，將細(xì)胞培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法對各孔中的細(xì)胞進(jìn)行染色，并在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其結(jié)果顯示在圖1中。如圖1所示，培養(yǎng)后的細(xì)胞計(jì)數(shù)與索烴濃度呈反比，索烴濃度越高的樣品培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)越少，因而可以證實(shí)化學(xué)式(I)所示的索烴對癌細(xì)胞增殖的抑制作用。尤其是在索烴濃度為300μg/mL的樣品4中，細(xì)胞計(jì)數(shù)減少到不含索烴的樣品1的1/3，由此證實(shí)了其對癌細(xì)胞增殖的顯著抑制作用。
毒性評價(jià)將化學(xué)式(I)所示的索烴懸浮在0.25％CMC(羧甲基纖維素)水溶液中，并將該溶液以20mg/kg的劑量經(jīng)口施用至約25g的雄性小鼠(兩只)。觀察一周后，兩只小鼠均仍存活，并確認(rèn)在觀察期間沒有異常表現(xiàn)。所述小鼠還攝入與正常小鼠大致相同量的食物，并飲用與正常小鼠大致相同量的水。因而證實(shí)式(I)所示的索烴具有足夠低的毒性。
權(quán)利要求
1.一種抗癌劑，該抗癌劑含有下述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物作為活性成分
2.如權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其中所述索烴化合物溶解在溶液中，并且所述索烴化合物在所述溶液中的濃度為300μg/mL以上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗癌劑，該抗癌劑難以被癌細(xì)胞排出，并適用于癌細(xì)胞的局部治療。本發(fā)明的抗癌劑含有下述化學(xué)式(I)所示的索烴化合物作為活性成分。所述索烴化合物是一類被稱為酰胺型[2]索烴的化合物，這種索烴化合物具有兩個(gè)分子環(huán)彼此連接成鏈狀的結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)分子環(huán)并未通過共價(jià)鍵相互鍵合。因此所述分子的形狀易于改變，使其比較難以通過受體的介導(dǎo)而引入至細(xì)胞中，但是該分子一旦被導(dǎo)入到癌細(xì)胞中，就會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1953966SQ200480042350
公開日2007年4月25日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月8日
發(fā)明者小野信文 申請人:萬斯德勝有限公司