專利名稱::含有nmb0606蛋白的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及預(yù)防或治療應(yīng)用的新疫苗制劑的研發(fā),其允許提高對(duì)抗來(lái)自不同來(lái)源的疾病疫苗抗原的免疫應(yīng)答質(zhì)量。本領(lǐng)域之前的情況腦膜炎奈瑟氏球菌(Afe/^er/a/Z7e/7//2^7〃V/s),革蘭氏陰十生雙球菌,其唯一已知的宿主是人,是流行性乙腦的病原菌。通常,該細(xì)菌是在正常人群的無(wú)癥狀攜帶者中發(fā)現(xiàn)的,該小生境是其微生物分離的最常見(jiàn)來(lái)源。以全世界為基礎(chǔ),小于兩歲的幼童對(duì)于接觸流行性乙腦是更為易感的人群,然而,青年和正常成年人群也可以受到感染。未治療的腦膜炎球菌疾病對(duì)于大部分受感染的個(gè)體具有致命的過(guò)程,而接種疫苗,通過(guò)在細(xì)菌定居期盡可能早地使該事件停止可以防止這種狀況。為了獲得能夠滿足所需要求的疫苗以誘導(dǎo)一般人群中對(duì)抗這種疾病的保護(hù),已經(jīng)研發(fā)了幾種策略。為此目的,已經(jīng)考慮了莢膜抗原,因?yàn)樗鼈兊拿庖咛禺愋允沟每梢苑诸惓稍撐⑸锏难褰M。已經(jīng)將這些血清組中的五組確定為全世界大部分腦膜炎球菌疾病的臨床病例的病因。血清組A是撒哈拉沙漠以南非洲的流行病的主要原因。血清組B和C在大多數(shù)情況下與發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率相關(guān)。血清組Y和W135是大部分該疾病的復(fù)發(fā)病例中常見(jiàn)的,并且它們?cè)诿绹?guó)的一些地區(qū)中流行,在過(guò)去幾年中顯著增加。從該數(shù)據(jù)顯而易見(jiàn)使用、研究和評(píng)價(jià)莢膜多糖作為疫苗候選物的理由。美國(guó)已經(jīng)許可了基于莢膜多糖的四價(jià)疫苗,賦予對(duì)抗血清組A、C、Y和W-135的保護(hù)。接種疫苗后誘發(fā)的抗體是血清組特異性的(RosensteinN.等2001.#e////7,o"W4d/se織N.Engl.J.Med,344,1378-1388)。血清組B,它與其余的不同,持續(xù)是地方性和流行性腦膜炎球菌疾病的主要原因,并且這主要是由于完全缺乏能有效對(duì)抗它的疫苗而引起的。已經(jīng)注意到B莢膜多糖免疫原性差,而且由于該化合物與人胎兒神經(jīng)結(jié)構(gòu)中存在的寡糖鏈相似的結(jié)構(gòu),因此基于此的疫苗存在i秀導(dǎo)免疫耐受性和自體免疫性的理論風(fēng)險(xiǎn)。(FinneJ.等1987.j"/Z7ac>c/ar7a/a"t/6oc^fogr0i/;7"/z7e/7//^cocc/cross—reactsw/t力^7/copro/e/i751//"ei/ra_/a/deA^ra/7ez;rs/t/swes.J.Immunol,138:4402-4407)。因此,l吏用亞莢膜抗原(sub-capsularantigen)集中對(duì)抗血清組B的疫苗的研發(fā)。,A應(yīng)f冷和遂發(fā)瘦蘿70年代基于外膜蛋白來(lái)生產(chǎn)疫苗的最初嘗試是基于去污劑引起外膜蛋白制劑的LPS耗盡(FraschCE和RobbinsJD.1978.尸ro&c〃0/2a^3_//wfgrow/"邁e"i/2gococca/d/sease./邁邁"/70ge/7/c/^ro/*sero/7;7e^scc/刀ess;ec//7c_/^F0/protect/0/2i/2ag"/力ea/7ig/z/^/e/.JExpMed147(3):629-44)。然后使外膜蛋白(OMP)沉淀以產(chǎn)生懸浮于氯化鈉中的聚集物。盡管動(dòng)物研究中的結(jié)果是有前景的,但是這些疫苗未能在成人或兒童中誘導(dǎo)殺菌抗體(ZollingerWD,等1978.5^,"/<2/d/鵬"加《e刀/"7/ajVei^eria/z7e/7i/2g272't/2'sfype2protei"yflcc/刀e2./s/7/邊s/sa力d力u邁a/2S.J.Infect.Dis.137(6):728-39)。這些疫苗的性能差很大程度歸因于伴隨沉淀的三級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失。因此,接下來(lái)的合理步驟是產(chǎn)生具有以外膜泡嚢形式展示其天然構(gòu)象的蛋白的疫苗(ZollingerWD,等1"9./z7e邁6ra/2ejwote//2/邁邁w30ge/n'c//J.Clin.Invest.63(5):836-48,WangLYandFraschCE.1984.脅e7o;膽to/"a5ei/a/ii"/an//a/zwwse邁ode厶InfectImmun.46(2):408-14136)。這些外膜蛋白泡嚢疫苗的免疫原性顯著高于OMP聚集物,并且顯示出免疫原性通過(guò)吸附于佐劑氫氧化鋁上而得到進(jìn)一步增強(qiáng)(WangLY和FraschCE.1984.A^e/sser/a/z/en/flg/f/d/s^to"/^ser0f7pe26/rc^e/"^3cc/"ea/7deKa/ua〃o/a節(jié)z/se/zzode/.InfectImmun.46(2):408-"136)。已經(jīng)使用不同配方的可溶性外膜泡囊疫苗進(jìn)行了各種功效試驗(yàn)。最深入研究的兩種疫苗是在80年代為分別應(yīng)答古巴(SierraGV等1991.「acc/z7eaga/z2S^^rou/^A^e/sser/a//^"http://^/t/d/s..prc^ect/o/fr/a/a/7tf邁ass^scc/刀aresi/7ts//7^/6a.NIPHAnnDis.14(2):195-210)和挪威(BjuneG,等1991.f/Te"0/o"&r/7e/z76r3力e卩es2'c/e7acc/刀eaga/力st^TOi/;7"邁e刀2'/7gococca7d/sease//#or^F,Lancet.338(8775):1093-6)的疾病爆發(fā)而研制的。由古巴芬萊學(xué)院生產(chǎn)的OMV疫苗(以VA-MENG0C-BC市售)產(chǎn)自具有血清組C多糖的B:4:P1.19,15的菌林和高分子量OMP的制劑并且吸附于氫氧化鋁上(SierraGV等1991.阮"'/ea^s/zz"^ro"/5iVe/sse了/s/ze/2//7g/fid/s.'profeet2'onfr_/a/a/d/zsss7acci"af_/o/7resu/fs//2NIPHAnnDis.14(2):195-210)。該疫苗使得古巴的流4亍病快速下降(RodriguezAP,等T力ee/7/de邁/o7c^ica7//z/s"o/a/^//ze/7//2gococca/57acc2'/2a2'/7C"6a.7夕夕義MemInst0swaldoCruz.94(4):433-40)。由挪威國(guó)家公共衛(wèi)生院(NIPH)生產(chǎn)的疫苗最初相似地是打算在由來(lái)自ET-5克隆(B:15:PI.7,16)的另一種微生物引起的發(fā)病率高而持續(xù)的疾病期間使用。它還是產(chǎn)自吸附于氫氧化鋁上的純化外膜泡囊的單價(jià)疫苗(BjuneG,等1991.i7Te"ofo"er邁e邁^ra/e7es/c/eracc/刀eagai/7Sf^roi//75頂e/2i/7gococcfl/d/sease//jVor^ra/.Lancet.338(8775):1093-6)。外膜泡囊疫苗似乎有效地呈現(xiàn)足夠自然構(gòu)象的外膜蛋白,使得可以產(chǎn)生功能性殺菌抗體,至少在青少年和成人中。所產(chǎn)生的抗體應(yīng)答還顯示出增加腦膜炎球菌的調(diào)理吞噬作用。疫苗的精確配方(即,0MP含量,LPS含量和佐劑的存在或不存在)對(duì)免疫原性具有顯著的影響(LehmannAK,等1991.//zwzm/2/za〃o"yneasiyredc^e/z//wz//7esce"ce.APMIS.99(8):769—72,GomezJA,等1998.A尸尸ecfo/"atf/f/ra/^y//zt力e/so^F77es<3/7d6acfer/c/da//rc^e7/7so尸iYe/wer/ai!Z7e/72."g/〃^2、.Vaccine.16(17):1633-9,SteeghsL,等1999.//zz/z7W3c^e/ic/0^Oi/ter#e/z76ra"e戶r0fe/i2saZ/pc;7o//saccAar7^e—i7e/7c/e/^#ufa/2to尸Neisseriameningitidis.'//7/7i/e"ceof義力'i/Ka/7"f力e/卿weies/o/3se.InfectImmun.67(10):4988-93)。疾病分離物的抗原特征也是快速變化的并且只包括有限數(shù)量的選定菌林的疫苗很可能在幾年內(nèi)變成無(wú)效的,除非改變疫苗組成以反映出當(dāng)?shù)氐牧餍胁W(xué)。目前比任何其他血清組B疫苗更廣泛地使用0MV疫苗,并且潛在地可用于由單PorA型引起的疾病爆發(fā)中。在菌林之間產(chǎn)生交叉反應(yīng)性的免疫原還有待得到充分限定。來(lái)自芬萊學(xué)院和NIPH疫苗試驗(yàn)的接種后血清的研究表明了對(duì)抗PorA(Pl,1類血清亞型蛋白)和0pcA(另一種主要的0MP,之前稱為Opc)(WedegeE,等1998./邁/z7i/zeies/o^es<2^2//"。wfer#eiZ76rs"e爿/7f/ge/751o尸Neisseriameningitidis/刀F^cc/weesa/7f/Coj7tro7sSerogr卯p_5戶,c^ec〃an7Wa7.InfectImmun.66(7):3223-31)的抗體在血清殺菌活性的介導(dǎo)中都是重要的(PorA免疫原性最高),這兩種抗原都顯示出顯著的菌林與菌林間的變異性。PorA蛋白似乎表位在爆發(fā)之間和爆發(fā)過(guò)程中都經(jīng)歷了連續(xù)的變異(JelfsJ,等2000.i^we/iceFar/"/o/z//zf/eporACe/2eo尸atVaweo/*NeisseriameningitidisdwW/7g勘2'to/cClinDiagnLabImmunol.7(3):390-5),接種疫苗后(和患病后)的大部分殺菌活性涉及到該表位,PorA蛋白的突出和該蛋白的顯著變異性水平提高了由基于單鏈(單價(jià))0MV的疫苗提供的保護(hù)可能受到血清亞型限制(即,取決于PorA類型)的關(guān)注。在克服這個(gè)潛在問(wèn)題的嘗試中,荷蘭RIVM研發(fā)了0MV疫苗,其含有來(lái)自六種不同流行的致病分離物的PorA蛋白(VanDerLeyPandPoolmanJT.1992.Co/z"rwc〃o/o尸azpw/〃><2/e/7t邁e/7/z7^cocca77acc2./jestra/"6asedozt力ec7sss■/oufer邁e/z76ra/7eprote/i7.InfectImmun.60(8):3156-61,ClaassenI,等1996.戶r油c〃叫racc/"e,Vaccine.14(10):1001-8)。在這種情況下,從充分表征的H44/76菌林的兩個(gè)變體中提取出疫苗泡囊,該菌株已經(jīng)被遺傳工程化以表達(dá)三種分開的PorA蛋白。很清楚,外膜蛋白(0MP)可以誘導(dǎo)對(duì)抗血清組B疾病的功能性免疫應(yīng)答,但是由于外膜蛋白表面暴露片段極大的異源性,迄今為止研發(fā)的疫苗沒(méi)有一種能是通用保護(hù)性的。由外膜泡嚢(OVA)疫苗誘導(dǎo)的適度交叉反應(yīng)免疫性刺激了對(duì)外膜抗原(或抗原組)的研究,該抗原或抗原組誘導(dǎo)功能性抗體并且其存在于所有腦膜炎球菌菌林上。如果它們存在于與血清組無(wú)關(guān)的所有菌林上,這樣的抗原可以形成確實(shí)的通用腦膜炎球菌疫苗的基礎(chǔ),這將消除多糖疫苗接種后致病菌林上莢膜轉(zhuǎn)換的潛在問(wèn)題。一旦清楚免疫顯性PorA蛋白的變異性將會(huì)限制其用作通用疫苗,考慮過(guò)各種其他主要外膜蛋白的疫苗潛能,并且這些中的幾種正處于進(jìn)一步的研發(fā)中。已經(jīng)考慮的那些包括5類蛋白(0pcA)、NspA和鐵調(diào)節(jié)蛋白(TbpA和B、FbpA、FetA)。TbpB與TbpA形成轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合復(fù)合物的一部分。最近的工作表明TbpA在鐵結(jié)合(PintorM,等1998.ofvVe/^er/a節(jié)/2/^/"/s.JMedMicrobiol47(9):757-60)中具有較大的功能性作用并且是比TbpB更有效的免疫原。已經(jīng)通過(guò)新的技術(shù)使用來(lái)自不同腦膜炎球菌菌林的外膜蛋白制劑的組合物來(lái)免疫小鼠而發(fā)現(xiàn)了高度保守的次要外膜蛋白(MartinD,等1997."/g///fo/ser7ef/jVeisser/a邁ei3//2^/^y^/s5^r尸sce■Proteinroofers戶rotec^yaa^^2./2sf^r_pei*/zz7e/^<2//"/ecd'on.JExpMedl85(7):1173-83)。使用來(lái)自小鼠的B細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)雜交瘤,然后篩選其對(duì)抗多個(gè)腦膜炎球菌菌林的交叉反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)一種高度交叉反應(yīng)性的單克隆抗體與稱為NspA的22kDa外膜蛋白結(jié)合。用重組NspA蛋白免疫顯示出能誘導(dǎo)小鼠中對(duì)抗來(lái)自血清組A-C的菌林的交叉反應(yīng)性細(xì)菌應(yīng)答。接種疫苗還保護(hù)小鼠對(duì)抗致命的腦膜炎球菌感染(MartinD,等1997.Co"serp^iVe/"er/a邁6刀//2^7"2、57/r尸ace,c^ei"Co刀/ers尸,otec〃o/zags//"^r;7er/iZ7e/^a7//尸ec〃o".)JExpMed185(7):1173-83)。遺傳趨異的腦膜炎球菌菌林中NspA序列的比較證明了該蛋白是高度保守的(97%同源性)(CadieuxN,等1999.As"eWc油7a刀dCroW"戶rofec"Ve^"/f/〃(?51<s#o/7oc7c>/7a7爿/〃Uy"/_re"e〃fl#a//7"jVeisserifl范6/72'/7^7^/^2'51^i/JJ/e/z76ra/7e^Profei".InfectImmun67(9):4955-9)。使用抗NspA單克隆抗體對(duì)來(lái)自血清組A-C的99.2%測(cè)試菌林通過(guò)ELISA檢測(cè)NspA的存在(MartinD,等1997.CarLyerKedAfe/"eWs/Z7ei7/i7g/〃d/515T/r,aceiWe/"Co"尸e"戶iY^ec〃anaga/zzsfiAr/7er//z7e/7t<s////"ecf)JExpMed185(7):1173—83)。這些單克隆抗體已經(jīng)顯示出是殺菌的,對(duì)抗各種腦膜炎球菌菌林,并且能夠降低小鼠模型中的腦膜炎球菌菌血癥(CadieuxN,等1999.Aa"er/c油/a刀dCrc^-尸rc^ec〃VeJc〃f/〃esavJ/o"oc/o/s/j/j〃6oc(f"/re"edflga//7"yVe/sser/s節(jié)"/i7^7'〃V/5"#"乂化fer^e邁6ra"e尸ro/^/".InfectImmun67(9):4955-9。盡管該數(shù)據(jù)似乎表明NspA是一種有前景的疫苗候選物,其能夠保護(hù)整個(gè)血清組,但9是來(lái)自小鼠的多克隆抗重組NspA血清沒(méi)有結(jié)合大約35%致病血清組B腦膜炎球菌菌林的表面,盡管這些生物體中存在基因(MoeGR等1999.//77"ere/7ce^57/r,<sce^/rew/0/7o,iViy;^52z70"giV"e/^er/s衡/7y/7^7'〃d/s(7ro"j3A5Yra//^.InfectImmun67(11):5664-75)。戎^_£遽和瘦芬彰浙之前的工作已經(jīng)表明抗原呈遞的形式很可能是關(guān)鍵性的。膜結(jié)合蛋白上的表位通常取決于正確三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持并且這隨后經(jīng)常取決于疏水膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)表明只是以泡嚢形式呈遞時(shí)。外膜蛋白的制劑才在人體中引發(fā)免疫性(ZollingerWD,等1979.c^Weio尸jrofe//2/邁zffu/20ge/22'c//邁a".JClinInvest63(5):836-48,ZollingerWD,等1978.Sa/Wya/7d/細(xì)w/70ge/2/c/^Fo,a^y^5"er/aInfectDis137(6):728-39)。單個(gè)蛋白疫苗已經(jīng)用于該領(lǐng)域中有數(shù)十年,并且通常顯示出良好的穩(wěn)定性。如果需要以泡嚢的形式呈遞,則使抗原保持膜結(jié)合的、穩(wěn)定性和再現(xiàn)性可能難以保證。外膜泡囊的免疫原性和反應(yīng)原性可能隨著純化過(guò)程中除去的蛋白質(zhì)和LPS含量的變化而改變。泡囊生產(chǎn)中的大量經(jīng)驗(yàn)是在OMV疫苗制造中自然產(chǎn)生的,然而,通常生產(chǎn)的疫苗將接受詳細(xì)的質(zhì)量控制。完全合成的脂質(zhì)體泡囊的構(gòu)建使得進(jìn)一步優(yōu)化和才示準(zhǔn)4匕這些疫苗(ChristodoulidesM,等1998.Zawz/z/in'zsfionw/tftan'd/f7",recog/7/^70/70//7af/re;rc^ei刀a力df力e//7ducf_/o/3ofaMicrobiology144(Pt11):3027-37)。換句話說(shuō),已經(jīng)在泡嚢中和作為純表達(dá)蛋白呈現(xiàn)了外膜蛋白,并且抗體應(yīng)答的產(chǎn)生是適度的。迄今為止主要的努力集中于腦膜炎球菌疫苗的肌內(nèi)注射,導(dǎo)致全身IgG的產(chǎn)生。然而,在通過(guò)鼻上皮入侵宿主的腦膜炎球菌疾病中,分泌性IgA的產(chǎn)生也是重要的。^^度^^遼^球霧差欲逸y^/i/在2000年期間闡明并公開了MC58(血清組B腦膜炎球菌)(TettelinH,等2000.co/z/7/"eCe/70邁eSe《we/7ceofAe/sseWs/e/2//7g/fid/sSerogr^//7_557ralcil/Cy《.Science287(5459):1809-15172)和Z2491(血清組A菌林XParkhi11J,等2000.c卿/"eZJWlNature404(6777):502-6173)的基因組序列。所述基因序列的可用性應(yīng)當(dāng)對(duì)腦膜炎球菌疫苗研究具有強(qiáng)烈的影響。盡管MC58基因組測(cè)序正在進(jìn)行中,Pizza等開始鑒定可讀框,預(yù)測(cè)其編碼膜結(jié)合的、表面暴露的或輸出的蛋白。他們鑒定出570個(gè)這樣的0RF,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增并將它們克隆至大腸桿菌中,使得所編碼的蛋白表達(dá)為His標(biāo)記的或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白(PizzaM,等2000.yJ/e/7i/7g(9coccf/5"6//T力o/e一^e/70邁eSe《we/7cii7g,Science287(5459):1816-20)。成功表達(dá)了61%(350個(gè))選定的0RF,未能表達(dá)的那些通常是含有超過(guò)一個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域的那些(可能排除多個(gè)外膜結(jié)合蛋白)。將重組蛋白純化并用于接種小鼠。然后通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附林的表面結(jié)合,以及使用血清殺菌測(cè)試來(lái)確定對(duì)抗兩個(gè)菌株的殺菌活性。最后基于所有三個(gè)測(cè)定中的陽(yáng)性應(yīng)答選擇了七種蛋白用于進(jìn)一步的研究。使用多種這樣的蛋白與佐劑結(jié)合的試驗(yàn)疫苗制劑已經(jīng)顯示出能在小鼠中誘導(dǎo)對(duì)抗同源腦膜炎球菌菌林(MC58)的顯著殺菌滴度,但是沒(méi)有一個(gè)蛋白能誘導(dǎo)和MC58外膜泡囊疫苗一樣高的SBA滴度(GiulianiMM,等2000.Proceedings12thIPNC.p.22)。另一方面,存在這些蛋白的組合可以在小鼠中呈現(xiàn)出高于單個(gè)蛋白的免疫iiL.等2000.Proceedings12thIPNC.p.25)。在該項(xiàng)工作中排除的多個(gè)可讀框也可能具有疫苗潛能并且需要進(jìn)一步的研究,可能是通過(guò)蛋白表達(dá)的失敗或其免疫特性的改變來(lái)排除這些可讀框的。一旦已經(jīng)理解了單個(gè)抗原對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)病機(jī)理的作用,可以更有效地選擇疫苗組分。抗原自身可以是有效的疫苗候選物,或者,可以考慮將減毒的突變體作為疫苗組分。由于到目前為止用作疫苗的抗原的異源性,腦膜炎球菌疾病預(yù)防和/或治療的一個(gè)重要問(wèn)題是迄今為止沒(méi)有可用的疫苗賦予通用的保護(hù)。發(fā)明描述本發(fā)明致力于通過(guò)提供含有序列高度保守(甚至在不同的致病細(xì)菌屬中)的蛋白的藥物制劑來(lái)解決上述問(wèn)題。本發(fā)明追求的技術(shù)目的是研發(fā)具有提高對(duì)抗不同的新病原體或多種現(xiàn)有病原體的全身和粘膜宿主免疫應(yīng)答的能力的制劑。在本發(fā)明的工作目的中,第一次報(bào)道了麗B0606蛋白用作具有治療或預(yù)防特征的疫苗制劑的組分。更具體地,本發(fā)明涉及含有該蛋白的藥物組合物,目的在于預(yù)防或治療任何由屬于奈瑟氏球菌屬的細(xì)菌引起的感染。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,將這些所述的含有之前所述抗原的藥物組合物用于預(yù)防和治療由腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌(義^/orr力oese)引起的疾病。本發(fā)明的目的更具體地是在可接受的藥物制劑中存在Q.5-100)ag/劑范圍的NMB0606蛋白的藥物制劑。所述制劑任選含有能夠增強(qiáng)對(duì)抗藥物活性成分NMB0606蛋白的免疫應(yīng)答的疫苗佐劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,藥物組合物可以含有一種或幾種合成、重組或天然來(lái)源的抗原。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,組合的藥物組合物可以含有多糖抗原,包括細(xì)菌多糖,更特別地,腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。本發(fā)明的制劑可以舍有綴合的蛋白-多糖,為細(xì)菌來(lái)源的多糖。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,含有NMB0606的藥物制劑還含有12肽性質(zhì)的抗原,目的在于擴(kuò)大由源自所述組合物的疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)范圍。本發(fā)明揭示了藥物制劑,其特征在于是一種疫苗,其具有在宿主生物體內(nèi)引發(fā)對(duì)抗由奈瑟氏菌屬的細(xì)菌引起的感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。更具體地,本發(fā)明的藥物制劑是能夠引發(fā)對(duì)抗由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。通過(guò)非腸道或粘膜途徑,包括口服途徑,來(lái)給藥在此所述的藥物制劑。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,可以將NMB0606用作肽、多糖或任何其他具有較低免疫原性的抗原的佐劑,或栽體,目的在于增強(qiáng)所述成分的免疫原性。實(shí)施例11顯示了所述多肽與NMB0606綴合時(shí),NMB0606蛋白能夠提高對(duì)抗病毒產(chǎn)生的肽的抗體水平。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括的是涵蓋插入NMB0606氨基酸序列的給定蛋白抗原的保護(hù)性決定簇的用途,目的在于誘導(dǎo)提高的對(duì)抗該決定簇的免疫應(yīng)答,因此一部分新雜交蛋白存在于藥物組合物中。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明包括的藥物組合物可以含有麗B0606蛋白片段,其能夠誘導(dǎo)對(duì)抗腦膜炎球菌或奈瑟氏菌屬的任何其他細(xì)菌的保護(hù)性應(yīng)答。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中,藥物組合物含有通過(guò)合成或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的NMB0606模擬表位或NMB0606模擬肽。術(shù)語(yǔ)"模擬表位"在此描述了能夠誘導(dǎo)抗體的任何肽,并且它們結(jié)合NMB0606蛋白,同時(shí)能夠誘導(dǎo)對(duì)抗奈瑟氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還有一部分是腦膜炎球菌疾病的檢測(cè),通過(guò)以單獨(dú)的方式使用含有NMB0606或NMB0606編碼基因(鑒定為Seq.ID.No3)的藥物組分或取自個(gè)體的生物樣品內(nèi)的其他成分。附圖簡(jiǎn)述圖1.用于蛋白NMB0606的克隆和表達(dá)中的克隆栽體pM238。圖2.pM238載體中基因NMB0606的核苷酸序列的最終構(gòu)建。圖3.從細(xì)胞破裂獲得部分的SDS-PAGE分析泳道1,破裂后的13上清液;泳道2,破裂后的沉淀物。MWM:分子量標(biāo)記。圖4.重組蛋白NMB0606純化處理的不同部分的SDS-PAGE分析泳道1,碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中4M脲溶解后的上清液;泳道2,(通過(guò))基質(zhì)的未結(jié)合部分;泳道3;用含有碳酸鹽-碳酸氬鹽、20mM咪唑和O.3MNaCl的緩沖液洗脫的部分;泳道4,用含有碳酸鹽-碳酸氬鹽、100mM咪唑和0.3MNaCl的緩沖液洗脫的部分(純化蛋白)。MWM:分子量標(biāo)記。圖5.對(duì)抗重組蛋白NMB0606的抗體水平(IgG),用弗氏佐劑(Freund)、氫氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖輔助的相同抗原通過(guò)皮下途徑免疫小鼠后獲得。作為加倍預(yù)免疫血清值的最高稀釋度的倒數(shù)來(lái)表示ELISA結(jié)果。圖6.腦膜炎奈瑟氏球菌菌林CU385中存在的抗原決定簇的識(shí)別,用弗氏佐劑(Freimd)、氫氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖輔助的相同抗原通過(guò)皮下途徑免疫小鼠后使用小鼠血清獲得OMV。作為加倍預(yù)免疫血清值的最高稀釋度的倒數(shù)來(lái)表示結(jié)果。圖7.使用BLAST程序進(jìn)行的NMB0606蛋白("query")和來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清組的基因組中的所述序列("Sbjct")之間的同源性檢索結(jié)果。圖8.五個(gè)不同的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中NMB0606蛋白的識(shí)別,通過(guò)皮下途徑對(duì)抗用腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖輔助的重組抗原引發(fā)的血清。用其他佐劑引發(fā)的血清具有相似的特征。將結(jié)果表示為加倍預(yù)免疫血清值的最高稀釋度的倒數(shù)。圖9.幼鼠模型中腦膜炎球菌感染主動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn),使用對(duì)抗用弗氏佐劑(Freund)、氬氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)輔助的重組抗原引發(fā)的血清。用菌林Z4181進(jìn)行感染。C-:未處理動(dòng)物的集合,C+:對(duì)抗Z4181外膜泡囊的超免疫小鼠血清。符號(hào)*表示對(duì)于負(fù)對(duì)照(C-)的顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)于菌血癥的水平,將這些表示為菌落形成單位/mL(cfu/ml)。圖10.通過(guò)產(chǎn)生的mAb(mAbD6/34,3F7/14和8C9/26)識(shí)別蛋白NMB0606和一組不相關(guān)的抗原。Pl,1類蛋白腦膜炎奈瑟氏球菌菌株B:4:P1.15;P64k,來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脫氫酶的E3亞基;T.T,破傷風(fēng)類毒素;HbsAg,乙肝表面抗原。作為ELISA-型測(cè)定中的吸光值(492nm)來(lái)顯示這些結(jié)果。圖11.通過(guò)來(lái)自腦膜炎球菌疾病存活者的人恢復(fù)期血清識(shí)別NMB0606蛋白。作為負(fù)對(duì)照,使用健康捐獻(xiàn)者的血清。作為ELISA型測(cè)試中的吸光值(492nm)來(lái)顯示結(jié)果。圖12.來(lái)自用游離肽(JY1)、重組蛋白(NMB0606)或綴合物JY1-NMB0606免疫的動(dòng)物血清的JT1抗肽滴度。圖13.對(duì)抗用重組NMB0606腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖(NMB0606+PsC)或用整合至脂質(zhì)體中的蛋白(NMB0606一Lip)鼻內(nèi)免疫小鼠的肺沖洗樣品中重組NMB0606蛋白的抗體水平(IgA)。實(shí)施方案實(shí)例/實(shí)施例的詳述實(shí)施例1.檢測(cè)血清組B腦膜炎奈瑟氏球菌外膜泡嚢制劑中的NMB0606蛋白目的在于研究血清組B腦膜炎奈瑟氏球菌(菌林B:4:Pl.19,l5)外膜泡嚢中存在的蛋白,根據(jù)別處(GargA,等1985.Electrophoresis6:599-604)所述的方法進(jìn)行二維電泳。隨后,使用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI,U.S.)對(duì)凝膠提取的蛋白進(jìn)行酶消化。通過(guò)使用微型柱(ZipTips,MUHpore,MA,U.S.)將消化后產(chǎn)生的肽提取至溶液中。為了質(zhì)譜分析,用乙腈60%,甲酸1%從微型柱洗脫肽,接著立即應(yīng)用至納米尖端(nanotip)(Protana,Denmark)。在串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)行測(cè)量,使用四極和飛行時(shí)間(Qtof-2,Manchester,UnitedKingdom),裝備電離源(nanoESI)。在0.98秒中獲取400-2000w/z范圍中的質(zhì)譜數(shù)椐,并在掃描之間使用0.02秒。使用MassLynx程序(3.5版本,Micromass)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和數(shù)據(jù)處理。使用ProFound程序(ZhangW和ChaitBT.2000.尸ro尸o"/^.'a/2s/7e"r咖etr/'c/7e/7"e艦/7/7/'/7《//7/Vi7Z7a〃肌AnalChem72:2482-2489.http://prowl,rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)進(jìn)行基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白鑒定。同意對(duì)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所含的基因和所產(chǎn)生的蛋白序列進(jìn)行檢索,將曱硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脫酰胺和羧氨基甲基化考慮微可能遇到的修飾。使用MASCOT程序(PerkinsDN,等1999./Vo6aWh77-6asetf鵬ss"e"ro膨tiyElectrophoresis20:3551—3567,http://www,matrixscience.com/)進(jìn)4亍基于質(zhì)^普的蛋白鑒定。檢索參數(shù)包括半胱氨酸^f務(wù)飾以及氧化和脫酰胺。從外膜泡嚢制劑中存在的蛋白鑒定獲得的結(jié)果分析開始,選擇歷B0606蛋白作為可能的疫苗候選物來(lái)評(píng)價(jià),通過(guò)質(zhì)譜從其中鑒定出一個(gè)蛋白。實(shí)施例2.NMB0606蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中記栽的基因產(chǎn)物的基于同源性的分析為了鑒定NMB0606蛋白,使用BLAST程序(AltschulSF,等1990./oca7a7/^M7e/7fsearc力JMolBiol215:403-410,http:〃w亂ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性檢索。該程序的結(jié)果表明除了奈瑟氏菌其他血清組中的相應(yīng)蛋白質(zhì),與幾個(gè)^:生物之一的同源性,包括來(lái)自大腸桿菌的yajC,其已經(jīng)被充分表征為該細(xì)菌中SEC機(jī)制的一部分。(Taura,T.,等(1994,GeneticanalysisofSecY:additionalexport-defectivemutationsandfactorsaffectingtheirphenotypes.#0/,Ce".Ge"(^.,243:261-269;Duong,F.和Wickner,W.(1997)TheSecDFyajCdomainofpreproteintranslocasecontrolspreproteinmovementbyregulatingSecAmembranecycling。已經(jīng)表明流產(chǎn)布氏桿菌(Brucellaabortus)中的同源蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠中對(duì)抗該病原體的顯著細(xì)胞應(yīng)答(Vemulapalli,R.,等(1998)CloningandsequencingofyajCandsecDhomologsof_5ri/ce//ss6or/^anddemonstrationofimmuneresponsestoYajCinmicevaccinatedwith及幽rtoRB51./刀/e",/鵬肌66:5684-5691)。然而,這是第一次指出該假定保守蛋白作為有價(jià)值的疫苗抗原的價(jià)值,用疫苗制劑中的該蛋白免疫后能夠誘導(dǎo)保護(hù)性體液應(yīng)答。幾種微生物基因中該蛋白的保守已經(jīng)在NCBI中產(chǎn)生了具有保守結(jié)構(gòu)域的直系同源蛋白組的命名[gnlICDDI11572C0G1862,YajC,蛋白前體移位酶亞基YajC[胞內(nèi)運(yùn)輸和分泌]],可能表示對(duì)于所有的而言共有的系統(tǒng)發(fā)生源自共有的祖先。使用MBGD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些基因的相鄰群體的分析(Uchiyama,I.2003.M67.'邁/crM/a/ge/7。邁ed"a6ase尸orco則jwa〃yea"4NucleicAcidsRes.31,58-62.),揭示了之前所述的微生物中存在的基因組織的顯著相似性,因此證實(shí)了它們?cè)诟髯缘幕蚪M中可能的同源性。實(shí)施例3.在大腸桿菌中編碼來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的NMB0606蛋白的NMB0606基因的克隆和表達(dá)為了克隆和表達(dá)NMB0606基因,使用pM-238克隆栽體。該栽體使得可以使用不同的限制酶來(lái)進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中以包含體的形式高表達(dá)水平地產(chǎn)生異源蛋白。pM-238載體(圖1)具有下列元件色氨酸啟動(dòng)子、編碼來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌菌林B:4:Pl.19,15的P64kDa的Nt-片段的47個(gè)氨基酸穩(wěn)定序列的基因片段、噬菌體T4轉(zhuǎn)錄終止子的序列和賦予作為選擇標(biāo)記的氨芐青霉素抗性的基因序列。由于P-半乳糖苷酶lacZct亞基的存在,該克隆載體還可以通過(guò)轉(zhuǎn)化克隆的藍(lán)色/白色染色來(lái)選擇重組體。17從NMB0606克隆基因核苷酸序列(實(shí)施例l)設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物對(duì)(0606U和0606L),用于從菌林CU385(B:4:Pl.19,15)基因組DNA擴(kuò)增所述基因區(qū)段,消除了信號(hào)肽編碼區(qū)徹I0606U:5、CGGAGCTCTAGATCTTCAAGCTGTTGCAC3、(SEQIDNO.:1)0606L:5、TTACCCGGGATCCACAATCGACTTTTGC3、(SEQIDNO.:2)為了信號(hào)肽的預(yù)測(cè),使用了SingnalPWorldWideWeb服務(wù)器(http://www,cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0)。<吏用引物0606U和0606L將NMB0606-編碼基因PCR擴(kuò)增后(SaikiRK,等(1988).SPrimer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Sc/認(rèn)e239:487-491),使用Xba-I和Bam-II限制酶消化PCR產(chǎn)物,并克隆至之前消化的pM238克隆載體中。最終的構(gòu)建顯示于圖2中,并且將NMB0606蛋白表達(dá)為與P64kDa蛋白的Nt-片段的融合蛋白。使用ALFexpressII自動(dòng)測(cè)序儀(TermoSequenaseCy5DyeTerminadorKit,AmershamBiosciences)以及各自結(jié)合P64穩(wěn)定子和T4轉(zhuǎn)錄終止子的寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)進(jìn)行克隆的基因NMB0606的測(cè)序。將在此所產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pM-NMB0606,用于之后的用途。為了NMB0606基因的表達(dá),通過(guò)化學(xué)方法使用pM-NMB0606質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GC366大腸桿菌菌林(圖2)。在補(bǔ)充1%的葡萄糖、1%胰蛋白胨、0.ImMCaC12、lmMMgS04和50mg/mL氨爺青霉素的基本培養(yǎng)基(M9)中進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)(MillerJH.1972.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NEWYork,USA)。將細(xì)菌培養(yǎng)物在37。C和250rpm培養(yǎng)12小時(shí)。將生長(zhǎng)的培養(yǎng)物離心并進(jìn)行細(xì)胞沉淀的超聲波破碎(IKALABORTECHNIK)。通過(guò)SDS-PAGE加上考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析來(lái)自沉淀和上清液的級(jí)分(LaemmliUK.1970.f77earageo/"sfri/cf"ra//rc^e//7^£/z/r//7gf力eassei26/yo尸f/e力eado尸6actei^o/7力age7V.Nature277:680。通過(guò)凝股密度觀'J定來(lái)進(jìn)行表達(dá)百分測(cè)定(LKBBromma2202Ultrascanlaserdensitometer;AmershamPharmaciaBiotech,UnitedKingdom)。從沉淀級(jí)分獲得NMB0606蛋白,該級(jí)分的總蛋白含量為約15%(圖3)。以不同的摩爾濃度(2M、4M、6M和8M)將細(xì)胞沉淀的樣品溶解于含有脲的碳酸鹽-碳酸氬鹽緩沖劑中(碳酸鈉O.1M,碳酸氫鈉O.1M)。使用4M之前的緩沖液中,溶解了NMB0606蛋白。溶解后,將上清液通過(guò)金屬親和性色i普,以便實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的純化并且獲得一個(gè)樣品,其中以預(yù)期大小遷移的分子約為總蛋白的60%,而其他更高分子量可以認(rèn)為它們對(duì)應(yīng)于相同蛋白的聚集物,如通過(guò)免疫鑒定所證明的。在圖4中,可以在用純化方法獲得的一些樣品中鑒別電泳模式。在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中評(píng)價(jià)之前進(jìn)行最后一步滲析。實(shí)施例4.通過(guò)皮下途徑用NMB0606蛋白免疫后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)蛋白NMB0606的免疫原性,設(shè)計(jì)免疫實(shí)驗(yàn)并在小鼠中進(jìn)行,其中給藥NMB0606,用氫氧化鋁、弗氏佐劑或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖作為佐劑。使用這些制劑,將雌性Balb/C小鼠(8-10周大)免疫,3組中每組分8只小鼠。通過(guò)腹膜內(nèi)途徑使用三次免疫,之間為7天間隔。在第45天賦予使用氫氧化鋁輔助的蛋白質(zhì)的加強(qiáng)劑量。表l中描述了各組的組成表l:免疫實(shí)驗(yàn)中所用的Balb/C小鼠組<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>通過(guò)ELISA測(cè)定加強(qiáng)劑量后所取的血清樣品中對(duì)抗重組蛋白的抗體滴度(IgG)和細(xì)菌中存在的同源蛋白。在圖5中,顯示了對(duì)抗單個(gè)動(dòng)物的重組蛋白的抗體滴度。在第二次接種后立即檢測(cè)特定的抗體水平(數(shù)據(jù)未顯示),在最后一次接種后甚至更高。此外,進(jìn)行了通過(guò)蛋白質(zhì)印跡的免疫鑒定,其中識(shí)別相應(yīng)的蛋白條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。用重組蛋白免疫后獲得的血清識(shí)別菌林CU385的外膜蛋白(OMP)制劑中存在的天然蛋白。圖6中顯示了這些結(jié)果。實(shí)施例5.編碼腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌不同菌林中的蛋白NMB0606的基因序列的表征為了分析編碼奈瑟氏球菌屬的致病種中NMB0606蛋白的基因序列的保守性,使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所述腦膜炎奈瑟氏球菌(血清組A、B和C)和淋病奈瑟氏球菌的基因組進(jìn)行相似性檢索(NC003116.1、NC003112丄NC003221、NC002946),使用BLAST程序(AltschulSF,等1990.^3s/c/oca/3//>/7邁<5/7^sesrc力JMolBiol215:403-410.http:〃w亂ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。圖7顯示了用于那些序列的序列比較的結(jié)果,那些序列在每個(gè)所分析的基因組中產(chǎn)生了有意義的比對(duì)。那些序列在血清組B中具有100%同一性,血清組A中99%同一性,與淋病奈瑟氏球菌具有98%同一性,具有編碼NMB0606蛋白的基因獲得的序列(Seq.ID.No.3)。此外,所述的基因的序列決定3個(gè)古巴分離物(Seq.ID.No.5-7),其屬于血清組B(B:4:P1.19,15),并使用ClustalX程序(http:〃www,ebi.ac,uk/clustalw/)進(jìn)4亍序列比對(duì)。比對(duì)的結(jié)果顯20示所分析的菌林中以及奈瑟氏菌屬中的基因NMB0606的核苷酸序列存在很大的保守性。蛋白NMB0606作為疫苗候選物的用途,考慮了之前所述的序列中存在的高程度相似性,將產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,具有對(duì)抗腦膜炎球菌疾病的廣譜保護(hù)(由交叉反應(yīng)性引起的)。實(shí)施例6.用蛋白NMB0606免疫Balb/C小鼠誘導(dǎo)的具有廣語(yǔ)作用的免疫應(yīng)答的表征為了評(píng)價(jià)用蛋白NMB0606免疫是否誘導(dǎo)了與其他奈瑟氏菌菌林的廣泛交叉反應(yīng)性的應(yīng)答,進(jìn)行了ELISA。用5個(gè)奈瑟氏菌菌株的完整細(xì)胞覆蓋聚苯乙烯平板,這5個(gè)菌林屬于不同的血清型和血清亞型。用針對(duì)蛋白NMB0606,通過(guò)兩種免疫途徑,如實(shí)施例4中所述的獲得的集合血清孵育平板。圖8顯示了用弗氏佐劑輔助的重組NMB0606蛋白免疫后引發(fā)的血清識(shí)別腦膜炎奈瑟氏球菌的血清組A、B和C的菌林中存在的抗原。剩余的血清在該測(cè)試中具有可比較的^f亍為。實(shí)施例7.在幼兒大鼠模型中,通過(guò)蛋白NMB0606特異性的小鼠血清誘導(dǎo)的針對(duì)同源和異源菌株的保護(hù)為了確定所獲得的抗血清的功能性活性,在幼兒大鼠模型中進(jìn)行保護(hù)測(cè)試。將二十四只大鼠(5-6天大)分成每組6只大鼠。測(cè)定通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給予的血清是否保護(hù)了大鼠免受由細(xì)菌(菌林Z4181)引起的感染,一小時(shí)后通過(guò)相同的途徑接種。合并每個(gè)組的血清并在接種幼兒大鼠之前稀釋1/10(在無(wú)菌PBS中)。四個(gè)小時(shí)后,給動(dòng)物取樣并計(jì)數(shù)其血液中的活細(xì)菌。為了解釋結(jié)果,進(jìn)行方差(Anova)分析,接著進(jìn)行Dunnet,s多重比較測(cè)試,其中將測(cè)試組與負(fù)對(duì)照進(jìn)行比較。如圖9中可觀察到的,接受用C多糖輔助的NMB0606免疫的小鼠血清的組與負(fù)對(duì)照組相比較顯示出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此幼兒大鼠模型中的抗體滴度是保護(hù)性的。用菌林CU385(B:4:PI.19,15)感染幼兒大鼠進(jìn)行相似的測(cè)定,并且和之前的實(shí)驗(yàn)一樣,來(lái)自用與C多糖混合的蛋白免疫小鼠的抗體保護(hù)了幼兒大鼠對(duì)抗所用模型中的腦膜炎球菌感染(數(shù)據(jù)未顯示)。使用菌林H44/48和120/90感染幼兒大鼠來(lái)進(jìn)行相似的測(cè)定,該兩個(gè)菌株分離自古巴患者,其血清學(xué)分類與菌林B385同源。此外,使用來(lái)自血清組B的菌林44/76(B:15:P1.7,16)進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。在所有的情況中,用C多糖輔助的目標(biāo)NMB0606蛋白引發(fā)的含抗血清抗體能夠保護(hù)大鼠來(lái)對(duì)抗腦膜炎球菌感染。實(shí)施例8:新生免疫的動(dòng)物模型中蛋白NMB0606的免疫原性為了評(píng)價(jià)蛋白NMB0606在新生兒階段接種后是否能夠誘導(dǎo)抗體應(yīng)答,在新生的0F1小鼠中進(jìn)行了免疫實(shí)驗(yàn)。認(rèn)為7天大的小鼠的免疫于該事實(shí),在出生后7、IO和14天將3組小鼠免疫(6只小鼠/組)。第一組的小鼠接受用Alum作為佐劑的10ligNMB0606蛋白。第二組小鼠接受用磷酸鋁(400)ag/劑)作為佐劑的10ngNMB0606蛋白,而第三組的小鼠接受400jug/劑無(wú)抗原的單獨(dú)氫氧化鋁。21天大時(shí),取血樣并通過(guò)ELISA分析,以便測(cè)量對(duì)抗NMB0606的抗體水平。以下顯示了所有三組小鼠中檢測(cè)的抗-NMB0606滴度。表2.在新生兒期免疫的三組0F1小鼠中檢測(cè)的抗0NMB0606抗體滴度組給藥的制劑MGT*1NMB0606+Al(OH)325952畫0606+A1P0463713Al(0H)352*:MTG,出生21天的小鼠中檢測(cè)的IgG抗NM0606抗體滴度的幾22如表2中可以得知,含有NMB0606蛋白和人可用佐劑的兩種制劑對(duì)于免疫系統(tǒng)明顯不成熟的動(dòng)物模型引發(fā)了顯著的抗體水平,因此表明了給藥于人新生兒后,該疫苗抗原是免疫原性的事實(shí),并且隨后能夠在生命的早期賦予對(duì)抗腦膜炎球菌的免疫力。實(shí)施例9產(chǎn)生能夠介導(dǎo)對(duì)抗腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌活性的抗蛋白NMB0606的單克隆抗體為了產(chǎn)生特異性對(duì)抗蛋白NMB0606的單克隆抗體(mAb),并研究介導(dǎo)對(duì)抗腦膜炎奈瑟氏球菌同源和異源菌林的殺菌活性的功能性能在Balb/C(H-2d,雌性,5-6周大)中進(jìn)行免疫,并且如下使用4個(gè)劑量在第0、15和30天常規(guī)免疫,每只小鼠通過(guò)皮下途徑給予用弗氏佐劑乳化的10jag抗原NMB0606(總體積100ju1);在第50天,每只小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給予磷酸鹽緩沖鹽水(140mMNaCl,270mMKC1,1.5mMKH2P04,6.5mMNa2HP04x2H20,pH7.2)中的10"g抗原。在第0天和第45天進(jìn)行抽血。將來(lái)自具有最高滴度(使用蛋白NMB0606作為包被抗原通過(guò)間接ELISA測(cè)量的(實(shí)施例3))動(dòng)物的脾細(xì)胞與X63Ag8653小鼠骨髄瘤細(xì)胞融合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序分離并篩選所得到的雜交瘤(GavilondoJV.1995.AnticuerposMonoclonales:TeoriayPrActica,ElfosScientiae,LaHabana,Cuba)。使用5ng/ml每種抗原和相同濃度的每種待測(cè)試mAb,通過(guò)間接ELISA測(cè)試由雜交瘤針對(duì)蛋白NMB0606分泌的抗體的反應(yīng)性及其非相關(guān)抗原交叉反應(yīng)性。圖IO顯示了該實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果,總共獲得了2個(gè)陽(yáng)性克隆(mAbD6/34、3F7/14和8C9/26),其特異性地識(shí)別蛋白麗B0606,沒(méi)有與對(duì)應(yīng)于P64k的N端的氨基酸序列反應(yīng),也沒(méi)有與剩余的待測(cè)試的不相關(guān)抗原反應(yīng)。23為了測(cè)定對(duì)抗蛋白NMB0606產(chǎn)生的mAb介導(dǎo)對(duì)抗同源或異源腦膜炎奈瑟氏球菌菌林的殺菌應(yīng)答的能力,進(jìn)行了殺菌測(cè)試。將殺菌抗體滴度表示為所測(cè)試抗體能夠殺滅50%或更多細(xì)菌的最高稀釋度的倒數(shù);兩個(gè)mAb(3F7/14和8C9/26)獲得高于1:128對(duì)抗同源菌林B;4:P1.19,15的殺菌滴度,并且一個(gè)(D6/34)滴度高于1:80。它們還各自顯示出對(duì)抗異源菌林B:15:Pl.7,16和C:2a:P1.5高于1:64的滴度。實(shí)施例10鼠對(duì)抗蛋白NMB0606的免疫應(yīng)答的耙區(qū)域的表征為了鑒定蛋白中的區(qū)域,其通常由對(duì)抗重組抗原產(chǎn)生的鼠抗血清識(shí)別,進(jìn)行了SPOTScan測(cè)試。在纖維素膜上合成跨越蛋白質(zhì)序列的一組重疊肽,用稀釋1:100的合并血清來(lái)孵育。通過(guò)用綴合的抗鼠免疫球蛋白G-堿性磷酸酶賻育,接著添加含有底物溴-氯-吲哚基-磷酸鹽的溶液來(lái)檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)。觀察到蛋白內(nèi)共有的幾個(gè)抗原區(qū)域,不管用于免疫的制劑如何(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例11.人血清對(duì)NMB0606蛋白的識(shí)別在該研究中使用來(lái)自恢復(fù)期個(gè)體的人血清集合,通過(guò)ELISA進(jìn)行該研究。用通過(guò)制備性電泳(5"g/ml)獲得的蛋白NMB0606覆蓋平板。用含有吐溫-20的PBS中的3°/。脫脂奶粉將平板封閉后,將血清在相同溶液中稀釋(1:50)并在平板中孵育。按照已經(jīng)廣泛報(bào)道的繼續(xù)免疫測(cè)定。將健康捐獻(xiàn)者的血清用作負(fù)對(duì)照。此外,將來(lái)自用對(duì)抗乙肝的重組疫苗接種的個(gè)體的集合血清用作不相關(guān)的對(duì)照(數(shù)據(jù)未顯示)。圖ll顯示了該測(cè)定中用5名恢復(fù)期患者血清獲得的結(jié)果??梢钥闯鋈搜遄R(shí)別該蛋白,這表明在腦膜炎球菌感染過(guò)程中得到了表達(dá)并且是免疫原性的。實(shí)施例12.作為肽栽體的蛋白NMB0606為了證明重組蛋白NMB0606的載體能力,-使其與15raer合成肽綴合,所述合成肽源自HIV-1、分離物JY1的蛋白gpl20的V3區(qū)。通過(guò)戊二醛方法進(jìn)行綴合。將游離JYl肽、重組蛋白NMB0606和綴合物JY1-NMB0606以3-劑量給藥方案給藥于成人,其中用弗氏佐劑乳化免疫原。三個(gè)劑量?jī)芍芎?,從免疫的?dòng)物獲得血清樣品,并且通過(guò)ELISA分析樣品來(lái)測(cè)定抗肽抗體滴度。為了進(jìn)行這,用游離肽(20yg/ml)覆蓋平板,按照之前描述的繼續(xù)免疫測(cè)試。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖12)顯示出蛋白NMB0606的載體能力,在綴合后,能夠顯著加強(qiáng)對(duì)抗肽JY1的抗體應(yīng)答。實(shí)施例13.通過(guò)粘膜途徑用賜B0606蛋白免疫后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)蛋白NMB0606的免疫原性,設(shè)計(jì)免疫實(shí)驗(yàn)并在小鼠中進(jìn)行,其中給予包膠到脂質(zhì)體中或用腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖作為佐劑的NMB0606蛋白。按照之前所述的通過(guò)脫水-復(fù)水獲得脂質(zhì)體(CarmenateT,等(2001).RecombinantOpcproteinfromjVeisser/a/z7e/7//7g/〃cf/sreconstitutedintoliposomeselicitsopsonicantibodiesfollowingimmunization.Sic^ecA/2o7.J/>;77.萬(wàn)/oc力e瓜34:63-69)。使用這兩種制劑,將雌性Balb/C小鼠(8-10周大)免疫。通過(guò)鼻內(nèi)途徑使用三個(gè)劑量的50ng,之間為15天的間隔。為了分析粘膜水平的免疫應(yīng)答,在免疫動(dòng)物的肺部沖洗物中測(cè)量IgA抗體水平。在圖13中,顯示了所評(píng)價(jià)的兩個(gè)組中檢測(cè)到的IgA抗體水平。2權(quán)利要求1.一種藥物制劑,其特征在于含有SEQ.ID.No4所標(biāo)識(shí)的蛋白NMB0606。2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,用于預(yù)防或治療由奈瑟氏球菌屬的細(xì)菌引起的感染。3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,用于預(yù)防或治療由腦膜炎奈瑟氏球菌(^e/^er/aize/7//2^7"V/s)或淋病奈瑟氏球菌(vVe/^ireWago/7orr力oeae)引起的感染。4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,其中蛋白NMB0606在藥物學(xué)上可接受的制劑中以0.5-100jag/劑的范圍存在。5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物制劑,其特征在于含有任選的疫苗佐劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,其特征在于還含有一種或幾種通過(guò)重組、合成或天然方式獲得的不同性質(zhì)的抗原。7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物制劑,其特征在于含有多糖抗原,包括細(xì)菌多糖。8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物制劑,其特征在于含有腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。9.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物制劑,其特征在于含有蛋白-多糖綴合物,其中多糖成分是細(xì)菌多糖。10.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物制劑,其特征在于含有肽抗原。11.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,其特征在于是能夠在接受生物體中產(chǎn)生對(duì)抗由奈瑟氏球菌屬細(xì)菌所引起感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物制劑,其特征在于是能夠在接受生物體中產(chǎn)生對(duì)抗由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌所引起感染的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗。13.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,通過(guò)非腸道或粘膜途徑來(lái)給藥。14.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑,其特征在于單獨(dú)、聯(lián)合或融合的NMB0606蛋白作為不同性質(zhì)抗原的佐劑或栽體的用途。15.—種藥物組合物,其特征在于在藥物學(xué)上可接受的制劑中含有NMB0606蛋白抗原的肽片段或模擬肽。16.診斷由奈瑟氏球菌屬細(xì)菌引起的感染的方法,并包括以獨(dú)立的方式或與其他成分結(jié)合檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣品中的NMB0606蛋白或其片段。17.診斷由奈瑟氏球菌屬細(xì)菌引起的感染的方法,并包括以獨(dú)立的方式或與其他成分結(jié)合檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣品中由SEQ.ID.No3所標(biāo)識(shí)的NMB0606編碼基因。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及含有NMB0606蛋白的藥物制劑的研發(fā)。本發(fā)明中所述的制劑能夠賦予對(duì)抗由病原體引起或不是由病原體引起的不同疾病的保護(hù)。NMB0606蛋白被鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌外膜泡囊(OMV)成分,并且其通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得,在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)了它的免疫原性和保護(hù)活性。由于NMB0606編碼基因已經(jīng)顯示的高水平保守性,含有該蛋白的藥物組合物作為交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)物具有很高的價(jià)值。本發(fā)明中呈現(xiàn)的制劑可應(yīng)用于人類醫(yī)藥領(lǐng)域中。文檔編號(hào)A61K38/16GK101448518SQ200780018286公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年3月29日優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日發(fā)明者D·加西亞迪亞茲,G·薩蒂納斯加西亞,K·科瓦斯阿科斯塔,R·帕容費(fèi)伊特,S·岡薩雷斯布蘭克,Y·佩雷拉尼格林申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心