專利名稱：：對喹乙醇、苯并呋咱n-氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及獸藥領域，尤其是用重離子輻照方法改性的獸藥飼料添加劑。
背景技術：
：自1965年黎巴嫩貝魯特(Beirut)的Haddalin和Issidorides發(fā)表Beirut反應第一篇文章以來，已有上百種應用該反應合成的專利問世和合成不下一千種新的N，N—二氮雜奈一l，4二氧化物(喹噁啉)類化合物。事實上，根據(jù)Beirut反應合成的多種喹噁啉化合物的取代衍生物如苯并呋咱N—氧化物(BF0)、喹乙醇(Olaquindox)、乙酰甲喹(MAQ0)等作為抗菌及促生長劑應用于畜牧獸醫(yī)及養(yǎng)殖業(yè)中，已取得了巨大的經(jīng)濟與社會效益。但此類化合物存在較大的毒副作用，單純地改變其側鏈己不能滿足需要，因為結果往往是毒性降低，其效果也大大下降。喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹的分子結構式如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage4</formula>在國外，已有常規(guī)輻射(如X-、Y-射線)對有機化合物進行了分子結構改造的研究，然而常規(guī)輻射的LET(即單位路程上轉移的能量)要比重離子小得多，而且這種輻射粒子不可能參與置換或加成反應，它使分子結構改變的效率較低，而利用重離子束進行這項研究具有獨特優(yōu)勢。在國內，利用離子束來進行藥物品質改良方面，主要是對微生物的輻照誘變育種，因為國內用來做這方面工作的離子束能量都很低，不可能輻照很厚的樣品。而我們擬采用的是蘭州重離子研究裝置(HIRFL)提供的中能重離子束，它可以輻照較厚的固體藥物樣品，類似的工作在國內外還未見報道。荷能重離子對物質的作用，按其能量的高低可有三種基本過程在能量較高、受體線度相對較小情況下，表現(xiàn)為荷能離子的貫穿，這時主要是能量轉移，也可能有電荷交換，它們會產(chǎn)生能量效應或能量與電荷二重效應；在能量較低、受體線度相對較大情況下，表現(xiàn)為荷能離子的注入，這時便會產(chǎn)生能量轉移、電荷交換以及質量沉積三重效應。利用上述過程，在先導藥物分子結構接受了離子能量后，便會造成分子鏈的斷裂和鍵的破壞，當它們修復時，就會發(fā)生重組，也可能與停留在周圍的離子發(fā)生作用，通過置換或加成反應，構成與原來分子結構與組成不相同的新分子或多個單體。這種新分子或單體可能具有更好的藥效(例如，抗菌活性增強，毒性降低等)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的為將重離子束注入喹噁啉類化合物(喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹)中，對其進行結構改造，以獲得抗菌活性明顯增強，且毒性不發(fā)生變化的使喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法。實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案如下對喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法，為將喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹分別在重離子加速器中輻照，重離子為12(:6+或'608+，輻照能量分別為"C"初始能量為20-200MeV/P，能量總沉積為1.656X1011.656X109Gy，'608+初始能量為20-200MeV/m能量總沉積為1.585X1021.585X10"Gy。優(yōu)選的'2C"輻照能量總沉積為1.656X104Gy，優(yōu)選的'608+輻照能量總沉積為1.585X107Gy。輻照結果對上述三種化合物注入的能量大于其每個化學鍵的最低結構能(約10eV/鍵)，結構發(fā)生變化，使一些原來的化合物變成了新的品種，同時出現(xiàn)了新的性能?，F(xiàn)分別敘術如下1、重離子'2(T、1608+對喹乙醇的作用表l喹乙醇的輻照劑量和含量表2喹乙醇對比樣品與輻照后樣品外觀比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1是重離子'2C6+1.656X104Gy與'608+1.585X10'Gy對喹乙醇輻射后的含量變化，喹乙醇的含量用HP8452A型紫外分光光度計測定，對照品含量為99.6%，而12C6+、'608+輻射后其含量分別為83.7%、82.49%。重離子輻照后引起化學成分及抗菌活性的變化喹乙醇外觀變化，表2給出了75mg喹乙醇溶解在濃度70。/。乙醇中，重離子輻射前后外觀的差別。用紫外吸收光譜測定喹乙醇的含量精確稱喹乙醇O.lg，置500ml棕色量瓶中，加入60ml二甲替甲酸膠，搖勻，再加50ml(O.lmol/L)鹽酸，振搖，完全溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻；精確量取5ml，置100ml標色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，在382士lnm的波長處測定吸收度，對照樣品按同法操作，根據(jù)對照樣品與供試品吸收度的比值，計算喹乙醇的含量(P)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>輻照后的喹乙醇在266nm、382nm處的吸收度降低，喹乙醇對照品吸收度J3W=(U7/W，而重離子12(:6+輻照后^§2=0.3/"0、1608+的^52=00677，即其含量降低，生成了新的輻照產(chǎn)物。重離子輻照喹乙醇TLC分析選用10cmx20cmx0.3cm玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈，涼千待用。稱約8gGF254硅膠，加2-2.5倍重的蒸餾7jC，順時針攪成糊狀，制成35mm厚，在U(TC活化，放干燥器中2h后使用。12(:6+重離子輻照喹乙醇后除喹乙醇外，產(chǎn)生4種新化合物；1608+輻照喹乙醇產(chǎn)生3種新化合物。展開劑系統(tǒng)為乙酸乙酯:內酮:乙醇:水=50:40:10:5或50:40:10:1，分離結果理想。抑菌實驗體外抑菌實驗，表3、4是重離子輻照喹乙醇前后抑菌作用的變化，特別是對大腸桿菌抑菌圈明顯增大。表3喹乙醇對比樣品與輻照樣品抑菌環(huán)直徑比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4喹乙醇在重離子輻照前后的最小抑菌濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注..w=&05vscontrolOneara，lelcontrolwasrunwitheachsetoffourExprimentalgroupsandcomparaedwiththeresult體內抗菌實驗不感染、不給藥為健康對照組，與實驗組在同一條件下飼養(yǎng)，觀察結果全部健活。感染組用大腸桿菌進行腹腔感染但不給藥，一般于24h內即明顯發(fā)病，腹瀉沉郁，3天內，全部死亡。給藥組^C"輻照喹乙醇，存活18只，精神正常。1&08+輻照喹乙醇，全部存活，精神正常。對照組與以上相同劑量喹乙醇，存活15只，精神正常?？ǚ綑z驗表明，體外抑菌與體內抑菌結果一致。杯碟法與二倍稀釋法體外抑菌實驗結果表明，兩種方法所得結果基本一致。喹乙醇對大腸桿菌抑菌圈直徑為23.5mm,MlC為156pg/m屬中度敏感，而碳、氧離子輻照后抑菌圈直徑分別為25.22、28.00mm，MIC為9.75、4.88Pg/nil屬高度敏感。用大腸桿菌G^強毒給小鼠人工造病，再用輻照前后的喹乙醇進行保護實驗，結果表明，同樣劑量喹乙醇的保護率為75%，而碳離子輻照后的喹乙醇保護率為90%，氧離子輻照后的喹乙醇保護率為100%。喹乙醇在重離子1608+輻照下產(chǎn)生多種產(chǎn)物，對此進行了薄層掃描，并將分離得到的3種單體進行了紅外、核磁、質譜分析，因其化學結構與原結構變化不大且數(shù)量太微，未能準確鑒定化學結構。但其輻照產(chǎn)物具有很強的抗菌活性。2、重離子輻照對苯并呋咱N—氧化物的作用苯并呋咱N氧化物作為一種喹噁啉類抗菌促生長飼料添加劑在"CS+、|608+兩種重離子注入藥物后，對藥物的生物活性影響進行了研究。材料苯并呋咱N氧化物(BFO):含量98%，精密稱取1.7g，壓成密度為1.2Sg/cm3厚度為1.20!11的藥片。菌種均購自中國獸藥監(jiān)察所。培養(yǎng)基杯碟法用普通瓊脂培養(yǎng)基，二倍稀釋法均用一般營養(yǎng)肉湯，PH為7.0。方法將試驗材料分成兩分，一份作對照，另一份接受重離子輻照，然后將試驗品與對照品在相同條件下進行TLC分析。體外抑菌試驗用杯碟法比較。C"與"(y+重離子輻照BFO后抑菌作用的變化；用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度。37。C培養(yǎng)24小時觀察抑菌情況。體內抗菌活性試驗健康小白鼠50只，體重18-20克，分成5組，每組10只，即健康對照組，感染組，BFO給藥組、12C6+，"0"輻照BFO給藥組。感染菌用大腸桿菌24小時培養(yǎng)物，每只小白鼠腹腔注射約1.5億活菌液。分別于感染前l(fā)h，感染后lh、2h口服60mg/kg，觀察2天。檢驗用儀器HP8452A紫外分光光度儀輻照劑量初始能20-200MeV/u12C6+能量沉積1.656xl04Gy初始能20-200MeV/u16C8+能量沉積1.585xl07Gy結果重離子輻照后BFO的TLC分析選用10x20x0.3m玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈，涼干，待用。稱硅膠GF254約8克左右，力口2-2.5倍蒸溜水，順時針攪成糊狀，制成3-5mm，在11(TC活化，放于干燥器中2小時后使用。溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯丙酮乙酴=50:40:10，點樣量10嗎，得到較理想分離效果，結果示于圖l。BFO液的紫外吸收試驗輻照后的BFO較未輻照BFO吸收峰明顯降低,且'60"離子輻照較"(T離子輻照降低明顯。體外抑菌試驗見表5、6。表5重離子輻照前后BFO的抑菌圈的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6重離子輻照前后BF0最小抑菌濃度藥品菌株藥液濃度(Pg/ml)12506253121567839199.70BFO綠膿桿菌大腸埃希氏菌雞白痢沙門氏菌克雷伯氏菌———++++++一一一一一++++——_—-__++——+++++++'V'BF0綠膿桿菌大腸埃希氏菌雞白痢沙門氏菌克雷伯氏菌-一_一一一_++--———-——+fBFO綠膿桿菌大腸埃希氏菌雞白痢沙門氏菌克雷伯氏菌一一_一一++++_-—一一一+++__一一一++++體內抗菌試驗(a)健康對照組不感染，不給藥，與實驗組在同樣條件下飼養(yǎng)結果全部健活。(b)感染組用大腸桿菌進行腹腔感染但不給藥，一般于24小時內明顯發(fā)病，腹瀉沉郁，內全部死亡。(c)感染給藥組"(T輻照BF0，存活4/10只，精神正常。1608+輻照BF05/10存活，精神正常。(d)感染藥物對照組以上相同劑量BFO，存活2/10只，精神正常。討論用杯碟法和二倍稀釋法所進行的體外抑菌試驗結果表明重離子輻照BFO較未輻照組抗菌作用明顯增強，特別是對大腸桿菌。腹腔注射(18.7mg/kg)"(T—BF0，可保護感染大腸桿菌的50Vj、白鼠不發(fā)病，說明輻照后BF0容易被機體吸收并可在體內產(chǎn)生良好的抗菌作用.綜上所述，1608+-BF0、12(:6+-80與對多種病原菌有較強的體內外抗菌作用，在一般劑量下可被很好的吸收，不會出現(xiàn)中毒反應。3、重離子輻照對乙酰甲喹的作用材料MQA0含量為99.6%，購于中國獸藥監(jiān)察所(對照品級)。精密稱取l.7克，壓成密度為1.28g/cm3,厚度為1.2cm的藥片。菌種共18種，其中綠版桿菌、克雷伯、變形桿菌、金葡萄球菌、結核桿菌購自北京生物藥品鑒定所，其它菌種均購自中國獸藥監(jiān)察所。培養(yǎng)基杯碟法用普通瓊脂培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基pH為7.27.4;二倍稀釋法均用一般營養(yǎng)肉湯，pH為7.0。實驗動物昆明系小白鼠，體重1820g，購于衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所。伊維茵雞，體重0.5kg左右，購于蘭州正大公司。將試驗材料分成兩份，一份作對照，另一份接收重離子輻照。然后將試驗品與對照品在相同條件下按中國獸藥規(guī)范(1990年版)進行檢驗。體外抑菌試驗用杯碟法，比較"C"與'6(T重離子輻照MAQ0后抑菌作用的變化；用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度。37'C培養(yǎng)24h觀察抑菌情況。體內抗菌活性試驗健康小白鼠50只，體重1820g，分成5組，每組10只，即健康對照組、感染組、"C6+、'6CT輻照MAQ0及MAQ0給藥組，口感染菌用大腸桿菌24h培養(yǎng)物，每只小白鼠腹腔注射約1.5億活菌液。分別于感染前l(fā)h，感染后2h口服40mg/kg,觀察2天。毒性試驗小白鼠的急性毒性:體重1821g健康小白鼠，雌雄各半，每組10只分5個劑量組進行測定，腹腔注射比較輻射前后UX。的變化。雞的急性毒性:20日齡健康雞體重0.5kg左右，腹腔注射輻照前后的MAQO，觀察其毒性。惡急性毒性:體重2225g的小白鼠20只，雌雄各半，腹腔注射1608+-MAQO水溶液30mg/kg，觀察其毒性。20R齡伊維茵雞，體重0.30.5kg左右，雌雄兼有，隨機分組，共9組，每組5只，分別飼喂含1608+-MAQ0為200、150、125、100、80、70、60、50、40ppm的混合飼料，連續(xù)飼喂和觀察1個月，并測定有關生化指標。輻照劑量初始能20-200MeV///12C6+，能量沉積1.656X104Gy;初始能20-^WJfel^/"16C8+，能量沉積1.585X107Gy檢驗用儀器HP8452A型紫外分光光度計。結果重離子輻照后MAQO含量的變化見表7，外觀變化見表8表7、重離子輻照MAQO前后的含量表8、重離子輻照MQAO后在氯仿中的外觀<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>重離子輻照后MQAO液的紫外吸收曲線取本品500mg，精密稱定，置250ml棕色容量瓶中，加入二甲替甲酸膠10ml，搖勻，再加入鹽酸(0.1mol/L)振搖。完全溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置100ml棕色瓶中，用甲醇稀釋至刻度，在382ilnm的波長處測定其吸收度，同時取MAQO對照品按同法操作，根據(jù)對照品與供試品吸收度的比值，計算即得MAQO的含量，試驗結果示于圖2。TLC試驗選用10x20x0.3cm玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈，涼干，待用。稱硅膠GF&4約8g左右，力Q2-2.5倍蒸餾水，順時針攪成糊狀，制成3-5mm，在110'C活化，放于千燥器中2h后使用，結果示于圖3體外抑菌試驗見表7和表8。體內抗菌試驗(a)健康對照組不感染、不給藥，與實驗組在同樣條件下飼養(yǎng)結果全部健活。(b)感染組用大腸桿菌進行腹腔感染但不給藥，一般于24h內明顯發(fā)病，腹瀉沉郁，內全部死亡。(c)感染給藥組^C"輻照MAQO，存活18只，精神正常。"OS+輻照MAQO，全部存活，精神正常。(d)感染藥物對照組以上相同劑量MAQO，存活15只，精神正常。急性毒性小白鼠急性毒性體重1820g健康小白鼠，雌雄均有，分5個劑量組測定，每組8只，腹腔注射12<:6+、"OS+輻照MAQO水溶液；觀察2天，按寇氏法求LDs。,結果為0.3362士0.0281與0.3378±0.0313(g/kg)(見表9、表IO)。亞急性毒性小白鼠體重2225g，雌雄各半，20只，腹腔注射"oS+MAQO水溶液30mg/kg體重，第l在給藥3次，第2天給2次，以后每天1次，連續(xù)1周，動物精神正常，無明顯異常表現(xiàn)。剖檢后末見內臟出現(xiàn)實質性病變，注射部位藥物吸收良好。伊維茵雞半月齡，體重0.30.5kg，雌雄兼有，隨機分組，共分9組，每組5只，分別飼喂含i6()8+MAQO為200、150、125、100、80、70、60、50、40ppm的混合飼料，連續(xù)飼喂和觀察1個月，其結果如下連續(xù)飼喂含200ppm飼料的雞，19天后多數(shù)(4/5)出現(xiàn)明顯的中毒反應，甚至死亡。中毒癥狀為紫雞冠，精神沉郁，不食或少食。剖檢可見心臟變小，心肌無彈力，顯灰竭色；肝顯暗紫色。表9重離于輻照前后MAQO的抑菌圈變化表10重離于輻照前后MAQO最小抑菌濃度<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注95%可信限LD5Q=325±24.4mglkg注95%可信限LD5t)=360±25.7mglkg表ll和表12表明MAQO經(jīng)重離子輻照和未輻照的毒性比較，基本未發(fā)生變化。有益效果1、作為喹噁林類化合物的喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹經(jīng)重離子輻照后提高了抗菌作用，而毒性基本未發(fā)生變化，使獸藥詞料添加劑的使用效果提到了新的高度。2、對輻照產(chǎn)物進行分離，找出藥效明顯的單體作為先導化合物進行化學合成，再通過藥理學、毒理學和臨床試驗，從而找到一種快捷有效的研制新藥的新途徑。圖l為輻照的eFO和未輻照的eFO的薄層分析桿顯示注2:BFO;1、3、4為輻照產(chǎn)物圖2為乙酰甲喹輻照前后的紫外線吸收曲線注在波長為382nm、262nm、240nm處的特征輻照后比輻照前峰處含量下降，曲線變低平。圖3為輻照的MAQO和未輻照的MAQO在四種溶劑系統(tǒng)中的薄層分析顯示注a:1608+-MAQO,b:12C6+-MAQO，c:MAQ02:MAQO;1、3、4:輻照產(chǎn)物。分離結果理想。具體實施例方式通過以下實施例對要發(fā)明的技術方案作進一歩闡明。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上實施例在國家試驗室蘭州重離子加速器(HIRFL)上進行，抗菌試驗與毒性試驗在中國農(nóng)科院蘭州畜牧與獸藥研究所進行。權利要求1、對喹乙醇、苯并呋咱N-氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法，其特征為將喹乙醇、苯并呋咱N-氧化物和乙酰甲喹分別在重離子加速器中輻照，重離子為12C6+或16O8+，輻照能量分別為12C6+，初始能量為20-200MeV/μ，能量總沉積為1.656×101～1.656×109Gy；16O8+，初始能量為20-200MeV/μ，能量總沉積為1.585×102～1.585×1011Gy。2、根據(jù)權利要求1所述的對喹乙醇、苯并呋咱N—氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法，其特征為12C6+輻照能量總沉積為1.656X104Gy;'608+輻照能量總沉積為1.585X107Gy。全文摘要本發(fā)明為對喹乙醇、苯并呋咱N-氧化物和乙酰甲喹進行改性的重離子輻照方法，涉及獸藥領域，所述這些喹噁啉類化合物已取得巨大的經(jīng)濟效益，但毒副作用較大，單純改變其側鏈已不能滿足改性的需要，本發(fā)明采用重離子輻照的方法進行改性，重離子采用¹²C⁶⁺，初始能量為20-200MeV/μ，能量總沉積為1.656×10¹～1.656×10⁹Gy，或重離子采用¹⁶O⁸⁺，初始能量為20-200MeV/μ，能量總沉積為1.585×10²～1.585×10¹¹Gy，輻照后提高了抗菌作用，而毒性基本未發(fā)生變化，同時本發(fā)明還具有提供了一種快捷有效的研制新藥的新途徑的有益效果。文檔編號A61K41/00GK101199846SQ20071012291公開日2008年6月18日申請日期2007年7月3日優(yōu)先權日2007年7月3日發(fā)明者衛(wèi)增泉,力張,徐繼英,李宏勝,梁劍平,王曙陽申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所