專利名稱：：原小檗堿(protoberberine)類生物堿在制備抗耐藥菌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及原小檗堿(protoberberine)類生物堿在制備抗耐藥菌藥物中的用途。技術(shù)背景隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的細(xì)菌對(duì)常用抗生素產(chǎn)生耐藥性，且耐藥程度日益加重。目前耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)感染已與HBV，AIDS并列世界范圍內(nèi)三大最難解決的感染性疾患。MRSA對(duì)多種抗生素耐藥，致病力強(qiáng)且治療效果差，為引起醫(yī)院感染的主要病原菌之一。建國(guó)以來(lái)，我國(guó)雖然對(duì)中草藥抗金葡菌等感染的作用進(jìn)行過(guò)篩選研究，但這些研究多限于藥材提取物，對(duì)耐藥菌的作用也只是在近年來(lái)才得到關(guān)注，迄今罕見(jiàn)針對(duì)MRSA感染的單體化合物的研究報(bào)道。我們針對(duì)臨床上國(guó)內(nèi)外耐藥菌感染的現(xiàn)狀，重點(diǎn)對(duì)傳統(tǒng)中草藥中的生物堿類的作用進(jìn)行了系統(tǒng)篩選和深入研究，從巖黃連中發(fā)現(xiàn)了一類對(duì)這種病原體顯示較強(qiáng)抑制活性的生物堿一原小檗堿(protoberberine)類生物堿。原小檗堿(protoberberine)類生物堿具有異喹啉結(jié)構(gòu)，前人關(guān)于原小檗堿(protoberberine)類生物堿及其衍生物的制備和抗菌作用研究，主要是抗標(biāo)準(zhǔn)菌，如黃連等植物中含有的小檗堿的抗菌譜包括金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、白喉?xiàng)U菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌、淋球菌等細(xì)菌，以及白色念珠菌和紅色毛癬菌等真菌。^Li2L等研究了黃連和黃檗的主要成分小檗堿對(duì)所測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株顯示抗菌活性(YuHH，KimKJ，ChaJD，efa/.Antimicrobialactivityofberberinealoneandincombinationwithampicillinoroxacillinagainstmethicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]./Med_Foot/，2005，8(4):454-461)。還有文獻(xiàn)報(bào)道脫氫卡維丁、卡維丁等對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、白喉?xiàng)U菌有明顯的抑制作用(陳重陽(yáng)，趙一.中藥巖黃連主要成分脫氫卡維丁的藥理研究.中藥通報(bào).1982，7(2):31.)。巖黃連(CorydalissaxicolaBunt.)為罌粟科(Papaveraceae)荷包牡丹亞科紫堇屬多年生草本植物，主要分布于廣西、貴州、云南、四川、西藏、湖北、甘肅等省，多生于巖石峭壁或高山巖洞口。巖黃連具有清熱、消腫、止痛等作用。廣西民間用其根止痛、消腫、拔毒，治療疥瘡腫毒，也用于治療肝炎、肝硬化和肝癌等疾病。其主要有效成分包括多種異喹啉類生物堿，已經(jīng)從該植物中分離鑒定了小檗堿(berberine)、(±)卡維丁[(±)cavidine]、脫氫卡維丁(dehydrocavidine)、白蓬葉堿[(+)thalictrifoline]、(一)13p-hydroxystilopine四氫巴馬丁[(+)tetrahydropalmatine]、(一)四氫非洲l防己胺[(一)tetrahydrocolumbanfme]、(一)斯庫(kù)來(lái)堿[(一)scoulerine]等原小檗堿(protoberberine)類生物堿(柯珉珉，張憲德，吳練中.巖黃連有效成分的研究[J].植物學(xué)報(bào)，1982，24(3):124-125.)。脫氫卡維丁類生物堿的抗肝炎病毒作用有專利記載(脫氫卡維丁類化合物及其在醫(yī)藥中的用途，CN1660836A)?？v觀國(guó)內(nèi)外的報(bào)道，除小檗堿(berberine)夕卜，沒(méi)有一項(xiàng)專利特指本發(fā)明所涉及的原小檗堿(protoberberine)類生物堿的抗MRSA作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種原小檗堿(protoberberine)類生物堿在制備抗耐藥菌藥物中的用途，尤其是化合物黃連堿、脫氫卡維丁和脫氫阿樸卡維丁在抗耐藥菌藥物中方的應(yīng)用。本發(fā)明基于當(dāng)前臨床耐藥菌感染的實(shí)際，結(jié)合植物藥抗菌藥敏篩選和有效成分分離純化方法，從罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬(Corydalis)植物巖黃連(CorydalissaxicolaBunt.)中提取原小檗堿(protoberberine)類生物堿并證實(shí)其抗耐藥菌活性，所述的原小檗堿(protoberberine)類生物堿經(jīng)藥理試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)對(duì)臨床上常見(jiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)具有顯著的抑制作用。本發(fā)明所述的化合物原小檗堿(pmtoberberine)類生物堿，可進(jìn)一步作為活性成分，制成新型治療耐藥菌感染的藥物。上述的活性生物堿類化合物具有下式I和II代表的化學(xué)結(jié)構(gòu)其中，R,至Rs為羥基、具有1一12個(gè)碳原子的烷氧基或酰氧基、芐氧基、X(氯及其他鹵素原子)、氨基、羥甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和一OCONH2，&為氫或甲基。Rr~R2、R3—R4或鄰R4—Rs可以是次甲二氧基。各取代基及化合物l-6情況如表1所示。本發(fā)明涉及的原小檗堿(protoberberine)類生物堿包括化合物黃連堿(Coptisine)、脫氫阿樸卡維丁(Dehydroapocavidine)、剌罌粟咸(stylopine)、阿樸卡維丁(Apocavidine)、脫氫卡維丁(Dehydrocavidine)禾tlThalifaurine?；谠￠迚A(protoberberine)類生物堿及其衍生物的化合物具有抗耐藥菌MRSA的作用。在本發(fā)明中用作有效成分的化合物1至6中的一個(gè)或多個(gè)在多種藥用植物類群中均有分布，如罌粟科(Papaveraceae)植物的紫堇屬(Coo^"仏)，小檗禾斗(Berberidaceae)小檗屬(Berberis)，毛茛禾斗(Ranunculaceae)黃連屬(Coptis)，蕓香禾斗(Rutaceae)黃柏屬(Phellodendron)以及防己禾斗(Menispermaceae)、番蒸枝禾斗(Annonaceae)、旋花禾斗(Convolvulaceae)禾卩馬兜鈴禾斗(Aristolochiaceae)等植物中，常見(jiàn)如巖黃連(CorydalissaxicolaBunt.)，黃連(Cop"sc/z/"em/sFranch.)禾卩黃柏(Macleayacordata)等。具體實(shí)施方式用于本發(fā)明的原小檗堿(protoberberine)類生物堿可以按現(xiàn)有文獻(xiàn)記載的生物堿提取分離方法制備。如下面表1所示的化合物1至6可以從巖黃連中制得。但是，這些實(shí)施僅以例示方式提供，而不起限定作用。表1.原小檗堿(protoberberine)類生物堿1至6的化學(xué)結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.MRSA菌株對(duì)抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.巖黃連單體化合物1-6抑制MSSA和MRSA的MIC(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例1:從巖黃連全草中提取分離單體生物堿1至6取巖黃連(CorydalissaxicolaBunt.)干燥全草粗粉1kg于室溫下用0.5%硫酸5L浸漬48小時(shí)后過(guò)濾，濾液加氯化鈉至濃度為10%，再用飽和氫氧化鈉調(diào)至PHIO，氯仿萃取，回收氯仿得總堿浸膏。將此浸膏用丙酮攪拌，靜置、過(guò)濾，回收丙酮得丙酮可溶物14g和不溶物20g。取丙酮可溶物進(jìn)行低壓硅膠柱層析，用石油醚乙酸乙酯=15:1~3:1梯度洗脫得化合物3(0.08§)、4(0.2§)和5(0.48);丙酮不溶物進(jìn)行低壓硅膠柱層析，用石油醚乙酸乙酯甲醇梯度洗脫=6:1:0.1-5:1:1得化合物l(O.lg)、2U.53g)、6(0.08g)和小檗堿(O.Olg)。實(shí)施例2:單體化合物1至6的理化和波譜數(shù)據(jù)黃連堿(Coptisine)(1)黃色棱狀晶體，C19H14N04+，mp217-218°C。ESIMS(positiveionmode)w/z:320。！HNMR(DMSO-4,400MHz):&9.84(1H，s，H-8)，8.90(IH，s，H-13),7.98(IH，4/=8.4Hz,H-ll)，7.81(IH，d,/=8.6Hz,H-12),7.74(IH，s,H隱l)，7.00(IH，s，H-4),6.52(2H，s，OCAO-9，10),6.11(2H,s,OCH20-2，3)，4.79(2H，dd，J=6.3，5.9Hz，H-6),3.19(2H，dd，/=6.3，6.0Hz,H-5);I3CNMR(DMSO-4,100MHz):&105.1(d,C-l),147.2(s，C-2),149.6(s，C-3),108.0(d,C-4)，130.4(s，C國(guó)4a)，26.1(t，C-5)，55,0(t，C-6)，143.9(d，C-8)，120.2(s，C-8a)，143.5(s，C-9),147.4(s，C-IO)，120.7(d,C畫ll)，120.8(d,C-12),132.4(s，C-12a)，121.5(d，C-13),136.7(s，C-13a),11L4(s,C-13b),101.8(t，OCH20-2,3)，104.2(t，OCH2O-9，10)。脫氫阿樸卡維丁(Dehydroapocavidine)(2)黃色無(wú)定形固體，C20H18N04+。ESIMS(positiveionmode)w/z:336;&NMR(DMSO-4,400MHz):&9.卯(1H，s,H-8),8.02(1H，d,/=9.0Hz,H-12),7.95(1Hd，/-9.0Hz，H-ll),7.31(1H，s,H-l)，6.89(IH，s，H-4),6.53(2H,s，OCH2O-9,10)，4.76(2H,m,H誦6)，3.84(3H，s,OCH3-13),3.06(2H,m，H-5),2.92(3H,s,CH3);13CNMR(DMSO-4100MHz):&114.4(d,C-l),146.3(s，C-2),149.0(s，C-3)，115.5(d，C扁4)，130.1(s，C國(guó)4a),26.5(t，C國(guó)5)，56.7(t，C-6)，142.9(d，C-8),117.8(s，C-8a)，144.4(s，C-9),146.8(s，C陽(yáng)IO)，119.3(d，C陽(yáng)ll),120.1(d，C-12),131.7(s，C-12a);132.5(s，C-13),136.2(s，C-13a),110.8(s，C-13b)，56.5(q,OCH3隱3),104.6(t,OCH2O-9,10)，18.2(q，CH3-13)。剌罌粟堿(Stylopine)(3)黃色晶體，Mp203-204。C,[a]g+305°(c,0.6，CHC13)，C19H17N04，ESIMS(positiveionmode)w/z::324;!HNMR(C5D5N，400MHz):&6.94(IH，s，H-l)，6.82(1H,(!，/=7.9Hz,H-12),6,70(1H,d,J=7.9Hz,H-l1)，6.63(1H,s，H-4),5.97(2H,d,/=5.4Hz,OCH20-2，3)，5.95(2H，d，《/=5.4Hz,OCH2O-9，10),4.11(IH，d,/=15.3Hz，H誦8a),3.43(1H,s，H國(guó)13a)，3.38(1H，d，/=15.3Hz,H-8P)，3.07(1H,in:H誦13a)，2.72(1H，m，H-13|3)，2.46-3,08(4H，m,H-5，H-6);13CNMR(C5D5N，100MHz)107.0(d，C畫l)，143.8(s，C國(guó)2)，146.5(s,C-3),117.5(d，C-4)，128.3(s,C-4a),29.9(t，C-5)，51.4(t，C-6)，53.3(t，C-8)，117.7(s，C-8a),146.8(s，C畫9)，145.5(s，C-IO)，107.0(d,C-ll)，121.5(d，C-12)，129.2(s,C陽(yáng)12a)，36.9(t，C-13),60.0(d，C-l3a),131.5(s,C-13b)，101.2(t，OCH20-2，3)，101.6(t,OCH2O-9,10)。阿樸卡維丁Apocavidine(4)黃色晶體，C20H23NO4,mp175°C。ESIMS(positiveionmode)341;!HNMR(C5D5N,400MHz):&6.92(1H,s，H-4),6.86(1H,7.9Hz,H畫ll)，6.78(IH，d,/=7.9Hz,H-12)，6.76(1H，s，H-l),5.97(2H,d，/=17.8Hz,OCH20-9，10),4.18(1H,d,/=15.3Hz，H曙8a),3.77(3H，s,OCH3)，3.68(IH，d,/=4.1Hz,H-13a)，3.49(1H,d,/=15.3Hz，H鄰)，3.03(1H,dd，《/=4.0,6.8Hz,H-13),2,37-3.35(4H，m，H-5，6),1.09(3H，(!，/=6.8Hz，CH3-13);13CNMR(C5D5N,100MHz)110.0(d，C-l)，147.5(s,C隱2)，145.2(s，C-3),112.4(d,C-4)，128.3(s,C-4a),29.2(t，C-5),51.4(t，C-6),53.8(t,C-8)，117.1(s，C-8a),146.0(s，C-9)，143.3(s,C-IO)，112.5(d，C-ll)，123.5(d，C-12)，136.2(s,C-12a),(d，C-13),63.7(d，C-13a)，129.4(s,C-13b)，102.2(t，OCH2O-9，10),56.2(q,OCH3)，18.8(q，CH3-13)。脫氫卡維丁Dehydrocavidine(5)黃色無(wú)定形固體，C20H18N04+，mp273-274°C。ESIMS(positiveionmode)w/z:350;!HNMR(DMSO-4,400MHz):&9.87(1H,s,H-8)，8.02(IH，d,/=9.0Hz，H-12),7.80(IH，d，《/=9.0Hz,H-ll)，7.11(1H，s,H國(guó)l)，6.89(1H，s,H-4),6.39(2H，s，OCH2O-9,10),4.64(2H,m,H-6)，3.72(3H，s，OCHr13),3.06(2H，m，H-5)，2.82(3H，s，CH3);13CNMR(DMSO-^，100MHz):&114.4(d,C-1)，146.3(s,C-2),149.0(s，C-3),115.5(d,C-4)，130.10，C-4a),26.5(t,C-5),56.7(t，C-6)，143.0(d,C-8),117.8(s,C-8a),144.4(s,C-9),146.8(s，C-10),120.4(d，C-ll),120.1(d，C-12)，131.7(s，C-12a);132.5(s,C-13)，136.2(s，C-13a),110.8(s,C-13b)，55.8(q，OCH3-3),102.9(t，OCH2O-9,10)，18.0(q，CH3-13)。Thalifaurine(6)黃色晶體，C19H16N04+，mp257-259°C。ESIMS(positiveionmode)/r2/z:322;^NMR(DMSO-4，400MHz):&9.64(1H，s,H-8)，8.82(1H，s，H-13),7.81(1H,d，/=8.6Hz，H-12)，7.74(1H，s,H-l)，7.00(1H,s，H-4)，6.71(1H，s，H-9),6.70(1H，s，H-12),6.42(2H,s,OCH2O-10,ll),4.78(2H，dd，/=6.2，6.0Hz，H-6)，3.19(2H，dd，/=6.3，6.0Hz,H-5);13CNMR(DMSO-4100MHz):&112.6(d，C-1),148.1(s，C曙2)，145.6(s，C-3)，114.3(d，C-4)，127.7(s,C-4a)，28.9(t,C國(guó)5)，56.5(t，C-6),144.5(d，C-8),118.2(s，C-8a),113.7(s,C-9)，147.9(s,C-10),148.5(d，C-ll)，113.4(d，C-12),140.9(s，C-12a),131.3(d，C-13)，146.2(s，C-13a)，121.7(s，C-13b)，56.3(q，OCH3)，101.5(t，OCH2O-10，ll)。實(shí)施例3:用作藥敏試驗(yàn)的臨床耐藥菌株MRSA的篩選1.試驗(yàn)材料抗菌素藥敏紙片(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司)。2.標(biāo)本來(lái)源從我院臨床標(biāo)本中分離篩選4株細(xì)菌標(biāo)本，編號(hào)為MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55，冰箱-20。C下保存?zhèn)溆谩?.細(xì)菌鑒別依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的細(xì)菌鑒別方法對(duì)上述標(biāo)本細(xì)菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)，經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素藥敏常規(guī)測(cè)試方法(K-B紙片法)，參照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)2004年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥菌鑒定，頭孢西丁對(duì)該標(biāo)本的抑菌圈均《19mm，故視為耐藥SA菌株(MRSA)。4.藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步用K-B紙片法，按照我國(guó)衛(wèi)生部于2000年5月1日頒布實(shí)施的《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》(SAST)常規(guī)操作，用MH瓊脂培養(yǎng)基于35t:培養(yǎng)17小時(shí)，測(cè)定4株MRSA對(duì)常用抗菌素的敏感性，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)施例4:化合物1至6對(duì)耐藥菌株MRSA的抗菌活性測(cè)定1.試驗(yàn)材料培養(yǎng)基MH肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司)；受試藥化合物1至6樣品(由巖黃連中提取分離得到)，溶劑DMSO(分析純)，蒸餾7jC;標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌(MSSA):ATCC25923(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，耐藥菌(MRSA):MRSA321、MRSA40、MRSA45、MRSA55;對(duì)照藥小檗堿、氨節(jié)西林和萬(wàn)古霉素。2.藥液制備用電子分析天平稱取各受試藥品5mg，以無(wú)菌DMSO配成5mg/ml溶液作為原藥溶液。3.菌液的制備用接種環(huán)把菌株接種在MH瓊脂平板上，置于35。C恒溫箱中培養(yǎng)24h，再用接種環(huán)把菌株轉(zhuǎn)移至試管中，用無(wú)菌生理鹽水配成106cfu/ml作測(cè)定MIC用。4.測(cè)定藥物抑制MRSA的最小抑菌濃度(MIC)采用公知的二倍稀釋法，取10支無(wú)菌試管編號(hào)并置于試管架上，在每支試管中加入lmlMH肉湯培養(yǎng)基，取原藥液lml與第一支試管搖勻，繼而吸取lml加入第二支試管中，依次類推稀釋至第十管，棄去lml，除第十管不加菌液外，其余都加0.1ml稀釋為106CFU/ml菌液搖勻，置培養(yǎng)箱中于35"C培養(yǎng)24小時(shí)，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知方法進(jìn)行受試藥物活性評(píng)價(jià)，所得測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。權(quán)利要求1、具有通式I或/和II的原小檗堿(protoberberine)類生物堿及其衍生物在制備抗耐藥菌藥物中的用途，其中，R1至R5為羥基、具有1-12個(gè)碳原子的烷氧基或酰氧基、芐氧基、氯及其他鹵素原子、氨基、羥甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2，R6為氫或甲基。2.按權(quán)利要求1所述的原小檗堿(protoberberine)類生物堿及其衍生物在制備抗耐藥菌藥物中的用途，其特征在于R1—R2、R3—R4或鄰R4—R5是次甲二氧基。3.按權(quán)利要求1所述的原小檗堿(protoberberine)類生物堿及其衍生物在制備抗耐藥菌藥物中的用途，其特征在于原小檗堿(protoberberine)類生物堿包括化合物黃連堿(Coptisine)、脫氫阿樸卡維丁(Dehydroapocavidine)、刺罌粟堿(stylopine)、阿樸卡維丁(Apocavidine)、脫氫卡維丁(Dehydrocavidine)禾口Thalifaurine。4.按權(quán)利要求1所述的原小檗堿(protoberberine)類生物堿及其衍生物在制備抗耐藥菌藥物中的用途，其特征在于基于原小檗堿(pmtoberberine)類生物堿及其衍生物的化合物具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA的作用。全文摘要一種原小檗堿(protoberberine)類生物堿在制備抗耐藥菌藥物中的用途，尤其是化合物黃連堿、脫氫卡維丁和脫氫阿樸卡維丁在抗耐藥菌藥物中方的應(yīng)用，本發(fā)明從罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬(Corydalis)植物巖黃連(CorydalissaxicolaBunt.)中提取原小檗堿類生物堿，經(jīng)藥理試驗(yàn)證實(shí)對(duì)臨床上常見(jiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)具有顯著的抑制作用；本發(fā)明所述的化合物原小檗堿類生物堿，可進(jìn)一步作為活性成分，制成新型治療耐藥菌感染的藥物。文檔編號(hào)A61P31/00GK101129364SQ20071006614公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者何洪靜,巍余,劉樹(shù)玲,斌唐,左國(guó)營(yíng),青張,徐貴麗,王根春,趙益斌申請(qǐng)人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院