專利名稱：鼠尾草多糖及其酯類的制備和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鼠尾草多糖及其酯類的制備和用途。該鼠尾草多糖及其酯類均具有較高的抗人艾滋病病毒和人單純皰疹病毒的活性，且選擇指數(shù)高，在制備預防或治療人艾滋病病毒感染和單純皰疹病毒感染的制劑方面有良好的應用前景。
背景技術：
據(jù)《中國藥物志》記載中國鼠尾草屬(Salvia)植物有83種，25變種，9變型，其中藥用的有30余種(含變種、變型)，大多數(shù)以根入藥作丹參用。如白花鼠尾草(Salvia miltiorrhiza，即丹參)、南丹參草(S.bowleyana)、甘西鼠尾草(S.przewalskii)、云南鼠尾草(S.yunnanensis，即滇丹參)、三葉鼠尾草(S.trijuga)、長冠鼠尾草(S.plectranthoides)和毛地黃鼠尾草(S.digitaloides)(騰艷芬，等.中國野生植物資源，2001，21-3)，以及土丹參(S.kiaomaidiensis)、雪山鼠尾草(S.evansiana)、洱源鼠尾草(S.lardcongensis)(錢子剛，等.中藥材，2002，25(9)628-9)等。本屬植物藥用種類多、藥效范圍廣。藥用主要成份為脂溶性的二萜醌類和水溶性的縮酚酸類。按結(jié)構(gòu)可分為精油、萜類化合物、多酚類化合物、甾類化合物等，其中二萜類占90％以上，而二萜醌類占50％以上(屈英薇，等，河北醫(yī)科大學學報，2005，6701-2)。丹參(S.miltiorrhiza)為中國藥典2000年版收載。丹參制劑對許多疾病，如冠心病、腦血栓、肝炎、肝硬化等有顯著療效。在臨床上應用最廣的制劑為丹參水針劑，脂溶性成份經(jīng)磺酸化可制成療效相近的水針劑使用(中國醫(yī)學科學院藥物研究所《中草藥現(xiàn)代研究》第二卷，北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1996)。
在中國發(fā)明專利ZL95105902.5中，滇丹參的冷水提取物(有效部位D1)及熱水提取物(有效部位E1)抗HIV-1IIIB的半數(shù)有效濃度IC50為1.5-20.4μg/mL，選擇指數(shù)39-167，但沒有有關組分化學特性的任何描述。在中國發(fā)明專利CN1546504A中，介紹了從丹參提取的迷迭香酸苷新化合物及其制備方法和在抗艾滋病中的應用。在中國發(fā)明專利CN1546504A中，介紹了一種新酚酸類化合物丹酚酸N，其抗HIV的IC50為0.649μg/mL，選擇指數(shù)5.7。在中國發(fā)明專利ZL 200410074360.2中，丹參的水提取物經(jīng)大孔樹脂吸附低級醇解析物(有效部位A)及有效部位A的乙醇沉淀物(有效部位B)以及有效部位B的凝膠層析分離物(丹參寡糖混合物)抗HIV-1的半數(shù)有效濃度IC50為0.76-1.06μg/mL，選擇指數(shù)7.6-13.6；其寡糖混合物中含有分子量分別為504、666和904道爾頓的物質(zhì)，寡糖混合物的單糖組成為甘露糖、半乳糖、葡萄糖，三者的比例為1∶8∶7。
寡糖是單糖殘基數(shù)低于7的低聚糖的統(tǒng)稱(沈同《生物化學》上冊)，分子量較低。多糖則是高聚糖的通稱，分子量較高。人們曾發(fā)現(xiàn)紅樹多糖[Premanathan，et al.Antiviral Res，1999，44113-22]、藻類多糖[Hoshino，et al.Biol Pharm Bull，1998，21(7)730-4]和人工硫酸酯化的一些來源于其它植物的多糖具有抗HIV活性[蔣巖，等.中華實驗和臨床病毒學雜志，2000，14(1)56-9]。但未見有關鼠尾草多糖及其抗HIV-1活性的研究報道和專利申請。
本發(fā)明從鼠尾草提取鼠尾草多糖，分子量大于5000道爾頓，單糖組成為山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比率為5∶2∶2。未酯化和酯化的鼠尾草多糖均具有抗艾滋病病毒和人單純皰疹病毒的作用，例如，抗HIV-1的半數(shù)有效濃度IC50為0.4-14μg/mL，選擇指數(shù)大于200，故本發(fā)明的鼠尾草多糖及其酯類在分子量、單糖組成和抗病毒活性方面均與已有的專利及文獻報道的不同，是一類新的具有較高抗HIV-1和單純皰疹病毒活性的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以鼠尾草植物(Salivia)為原料，或以鼠尾草經(jīng)提取脂溶性有效成分或(和)水溶性的酚酸類成份過程中的廢棄物為原料，提取和制備鼠尾草多糖及其酯類(包括硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和乙酸酯)。其制備方法是以上述原料經(jīng)熱水浸提、濃縮、乙醇沉淀、脫蛋白處理、冷凍干燥即得本發(fā)明的鼠尾草多糖。進一步經(jīng)酯化處理、中和、醇沉、透析、減壓蒸餾濃縮、醇沉、真空干燥即得本發(fā)明的鼠尾草多糖酯。其特征是單糖組成為山梨醇、半乳糖、鼠李糖，糖苷鍵連接方式有1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵，分子量大于5000道爾頓。
本發(fā)明對所得鼠尾草多糖及其酯類進行了抗人艾滋病病毒和人單純皰疹病毒的活性的實驗檢測。藥效學試驗證明鼠尾草多糖及其酯類具有較高的抗人艾滋病病毒和單純皰疹病毒的作用，對人體細胞毒性低，抗病毒的活性穩(wěn)定，可制備成預防或治療人艾滋病病毒感染和單純皰疹病毒感染的制劑。
具體實施例方式
通過以下實施例可進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一本發(fā)明中化合物鼠尾草多糖的一種制備方法取云南鼠尾草(Salivia yunnanensis C.H.Wright)，經(jīng)熱水浸提、濃縮、乙醇沉淀、脫蛋白處理、冷凍干燥即得本發(fā)明的鼠尾草多糖。經(jīng)分子篩層析測得分子量為26000道爾頓，經(jīng)HPLC分析表明，單糖組成為山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比例為5∶2∶2，通過Smith降解分析表明鼠尾草多糖中沒有1→2糖苷鍵，進一步根據(jù)多糖高碘酸消耗的規(guī)律，推知由1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵連接，三者的比例為1∶3∶1。紅外光譜分析表明在905cm-1和847cm-1左右有吸收峰，分別為α-D-吡喃山梨醇和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。
實施例二本發(fā)明中鼠尾草多糖硫酸酯的一種制備方法取磺化劑80mL置于250mL三口瓶中，控制溫度75℃，加入鼠尾草多糖8克，攪拌反應3h，反應結(jié)束后取出燒瓶冷至室溫，用6mol NaOH溶液中和，乙醇沉淀、離心，沉淀用蒸餾水溶解后于蒸餾水中透析，透析內(nèi)液減壓蒸餾濃縮，乙醇沉淀，離心，干燥，即得本發(fā)明的鼠尾草多糖硫酸酯。經(jīng)分子篩層析測得分子量為18000道爾頓，經(jīng)HPLC分析表明，單糖組成為山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比例為5∶2∶2，硫酸酯化度1.7。根據(jù)多糖高碘酸消耗的規(guī)律，推知由1→6(或非還原末端)、1→4(2)及1→3糖苷鍵連接，三者的比例為1∶3∶1。通過Smith降解分析表明鼠尾草多糖硫酸酯中沒有1→2糖苷鍵。紅外光譜分析表明在905cm-1和847cm-1左右有吸收峰，分別為α-D-山梨醇和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰，以及較強的S＝O伸縮振動的特征吸收(～1240cm-1)和C-O-S伸縮振動的特征吸收(820cm-1)。
實施例三本發(fā)明中鼠尾草多糖及其硫酸酯的藥理作用1.以MTT法測定鼠尾草多糖硫酸酯的細胞毒性，以熒光測定技術測定鼠尾草多糖硫酸酯的抗HIV-1Ba-L(R5病毒)活性。
TZM-b1細胞是一種表達CD4、CXCR4和CCR5等HIV-1受體和輔助受體以及由HIV-1啟動子控制表達的螢火蟲素酶的HeLa細胞系(AIDS Research and References Reagent Program，NIAID，NIH)。首先，測定鼠尾草多糖硫酸酯對TZM-b1細胞的毒性。方法是在96孔平底培養(yǎng)板上，將鼠尾草多糖硫酸酯用RPMI-1640培養(yǎng)基進行2倍系列稀釋。共6個稀釋度，每孔100μl，設3個重復孔，設細胞對照組和空白對照組。然后，每個培養(yǎng)孔加入100μ1含有3×103TZM-b1細胞的培養(yǎng)基。于37℃培養(yǎng)48小時。第3天，將96孔細胞培養(yǎng)板低速離心后(1000rpm，10min)，吸棄150μl培養(yǎng)上清，加人20μl二甲基四氮唑鹽(3，(4，5-dimethylthiazol-2yl)-，5-iphenyl tetrazolium bromide，MTT)(Sigma公司)溶液(5mg/ml)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時，再加入100μl 20％十二烷基磺酸鈉(SDS)(Sigma公司)-50％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)(pH4.7)，孵育過夜；酶標儀測定各孔的OD值(測定波長595nm，參考波長655nm)。
取3×103TZM-b1細胞接種于96孔平底細胞培養(yǎng)板(Coming)內(nèi)。第二天，吸去細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入含有約1000感染單位的HIV-1 Ba-L和以新鮮培養(yǎng)基經(jīng)過系列稀釋的含有不同濃度的鼠尾草多糖硫酸酯，于37℃培養(yǎng)48小時。第3天，每孔加入100μl1×細胞溶解緩沖液(Promega)。然后，取60μl細胞溶解物，以LucLite螢火蟲素酶測定試劑盒(Packard)在Fusion Universal Microplate Analyser(Packard)上進行測定。以Graphpad Prism 4軟件計算各受試樣品在體外對病毒的50％抑制率(IC50)和對不同細胞株增殖的半數(shù)抑制濃度(CC50)值及繪制量-效曲線圖。選擇指數(shù)SI(Selective index)＝CC50/IC50。尾草多糖硫酸酯對TZM-b1細胞的毒性和對HIV-1 Ba-L(R5)的抑制活性的劑量-反應曲線見圖1、圖2。以Graphpad Prism4軟件計算出鼠尾草多糖硫酸酯對TZM-b1細胞的CC50為120.1μg/ml，對HIV-1 Ba-L的IC50為0.467μg/ml，SI為257.2。
2.以P24抗原測定技術，XTT測定和細胞-細胞融合技術分別測定鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯對HIV-1IIIB(X4病毒)的抑制活性。
在96孔培養(yǎng)板上，將鼠尾草多糖或鼠尾草多糖硫酸酯的貯存液以完全培養(yǎng)基分別作5倍比稀釋，共8個梯度，每個梯度設4孔，每孔100μl。同時設置AZT陽性對照組和空白對照組。然后每孔加入100個TCID50的HIV-1IIIB和1×104MT-2細胞懸液，每孔的總液體量為200μl。在37℃培養(yǎng)2小時后，離心洗細胞，以去除游離的病毒和化合物。加入不含化合物的新鮮培養(yǎng)基。在感染后的第四天，每孔收集100μl的細胞培養(yǎng)上清用作P24抗原測定。為此，加入等量的5％Triton X-100溶解病毒(病毒裂解液)，進行定量ELISA測定。測定用的酶標板(Immulon 1B，Dynex Technology，Chantilly，VA)先以0.85 M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)配制的HIVIG鋪板，4℃過夜。接著以PBS-T緩沖液洗滌，以含1％脫脂奶粉的PBS封閉。加入上述培養(yǎng)孔上清液的病毒溶解液，37℃保溫1小時，充分洗滌之后，先后加入抗P24單抗和生物素標記的抗小鼠抗體(Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz，CA)。然后，依次加入SA-HRP和TMB。以1N硫酸終止反應，以ELISA儀(Ultra 384)閱讀。
上述病毒感染的細胞再培養(yǎng)2天，每個細胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入50μl XTT溶液(1μg/ml)(PolySciences，Inc.，Warrington，PA)，于37℃保溫4小時?？扇苄约毎麅?nèi)甲臢化合物以酶標儀在450nm測定。
將加入和不加入被檢化合物的HIV-1IIIB慢性感染的H9細胞(H9/HIV-1IIIB)，以鈣熒光素AM(MolecularProbes，Inc.，Eugene，Oregon)標記，與MT-2細胞(H9/MT-2為1∶5)一起，在96孔培養(yǎng)板上于37℃保溫2小時。然后，在倒置熒光顯微鏡下計數(shù)融合的和未融合的鈣熒光素AM標記的HIV-1感染的細胞。
以Graphpad Prism 4軟件分別計算出不同方法獲得的鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯對HIV-1IIIB的抑制活性(IC50)。其結(jié)果如表1所示。以CPE(XTT)、P24測定和細胞-細胞融合技術測定得到的鼠尾草多糖硫酸酯抗HIV-1IIIB(X4病毒)的IC50的平均值±標準差分別為3.05±0.44、13.42±0.09、7.35±0.34μg/ml。以CPE(XTT)技術測定得到的鼠尾草多糖抗HIV-1IIIB(X4病毒)的IC50的平均值±標準差分別為6.17±1.34μg/ml，對病毒未感染細胞的半數(shù)細胞毒性CC50的均值±標準差為4315±56μg/ml，其SI值為699。
表1以P24抗原測定技術，XTT測定和細胞-細胞融合技術分別測定鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯對HIV-1IIIB(X4病毒)的抑制活性(IC50)。

注ND未測定。
實施例四鼠尾草多糖硫酸酯抗人單純皰疹病毒(HSV)活性按常規(guī)方法進行Vero細胞培養(yǎng)，HSV病毒培養(yǎng)以及HSV的最適感染復數(shù)的確定。將Vero細胞懸液加入24孔板(2-4×105細胞/well)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞長成致密單層，鋪滿24孔板板底。加入滴定過的200μl病毒上清，使病毒稀釋液和細胞單層充分接觸，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時；洗去培養(yǎng)上清，加入1ml未凝固的瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基和稀釋好的待測樣品。設阿昔洛韋(acyclovir，ACV)陽性及無化合物陰性對照。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，移出培養(yǎng)基，并每孔加入1ml 2％的甲醛以固定細胞。以龍膽紫染色，自來水洗滌3次，倒置晾干。在倒置顯微鏡下計數(shù)空斑，并進一步計算對HSV的抑制率。結(jié)果表明，ACV對HSV的IC50為0.15±0.04(M±SD)μg/ml，CC50(M±SD)為264±58.9μg/ml，選擇指數(shù)為1760(表2)；鼠尾草多糖硫酸酯對HSV-I和II的IC50為85.6±0.85μg/ml，CC50(M±SD)為9420±66μg/ml，選擇指數(shù)(SI)為110。提示鼠尾草多糖硫酸酯還具有抗單純皰疹病毒活性。
表2.鼠尾草多糖硫酸酯對人單純皰疹病毒I和II型的抑制作用



圖1鼠尾草多糖硫酸酯對TZM-b1細胞的毒性的劑量-反應曲線。
圖2對HIV-1 Ba-L(R5病毒)的抑制活性的劑量-反應曲線。
權(quán)利要求
1.鼠尾草多糖，其特征是以鼠尾草植物(Salivia)，或鼠尾草經(jīng)提取脂溶性有效成分或(和)水溶性酚酸類成份過程中的廢棄物為原料經(jīng)熱水浸提、濃縮、乙醇沉淀、脫蛋白等公知方法處理而得鼠尾草多糖。
2.鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)，其特征是以鼠尾草多糖為原料，經(jīng)酯化、中和、2-4倍無水乙醇沉淀、蒸餾水溶解、然后用蒸餾水透析、減壓蒸餾濃縮、2-4倍無水乙醇沉淀、真空干燥等公知方法處理即得本發(fā)明的鼠尾草多糖酯類化合物。
3.權(quán)利要求1所述鼠尾草多糖的特征組成山梨醇40％-80％、鼠李糖15％-30％、半乳糖15％-30％。
4.權(quán)利要求1所述鼠尾草多糖的結(jié)構(gòu)特征通過1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵連接。
5.權(quán)利要求1所述鼠尾草多糖在治療或預防人艾滋病病毒或(和)單純皰疹病毒感染的制劑中的應用。
6.權(quán)利要求1所述鼠尾草多糖的制劑，其特征是制備藥物的制劑形式可選擇口服制劑、注射制劑、外用制劑以及陰道和直腸用制劑。
7.權(quán)利要求2所述鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)在治療或預防人艾滋病病毒或(和)單純皰疹病毒感染的制劑中的應用。
8.權(quán)利要求2所述鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)的用途，其特征是制備藥物的制劑形式可選擇口服制劑、注射制劑、外用制劑以及陰道和直腸用制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鼠尾草多糖及其酯類的制備和應用，其特征是糖鏈中含有由山梨醇、鼠李糖、半乳糖，通過1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵連接。本發(fā)明提供的鼠尾草多糖及其酯類是以植物鼠尾草為原料，或鼠尾草經(jīng)提取脂溶性有效成分或(和)水溶性酚酸類成份過程中的廢棄物經(jīng)熱水浸提、濃縮、乙醇沉淀、脫蛋白處理得鼠尾草多糖，多糖經(jīng)酯化處理得鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)。本發(fā)明所得的鼠尾草多糖及其酯類均具有較強的抗人艾滋病毒和單純皰疹病毒活性，對人體細胞的毒性低，可用于制備預防或治療人艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染的制劑。
文檔編號A61P31/00GK101084990SQ200710065989
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日
發(fā)明者趙聲蘭, 陳朝銀, 李立 申請人:陳朝銀