專(zhuān)利名稱(chēng)：：土鱉干粉提取物的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥，具體涉及從土鱉蟲(chóng)干粉中提取鎮(zhèn)痛有效部位的工藝，以及由該提取工藝所得到的一系列多肽組分，以及該多肽組分在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：疼痛不僅是許多疾病的并合癥，而且已經(jīng)被看作是一類(lèi)疾病。從疾病層面上講，由各種各樣的疼痛造成的生活質(zhì)量下降波及了最大量的人群。由于有效的鎮(zhèn)痛劑往往與依賴(lài)性相聯(lián)系，所以發(fā)明新的無(wú)依賴(lài)性的鎮(zhèn)痛劑具有重要價(jià)值。土鱉及土鱉干粉在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用于治療帶狀皰疹。發(fā)明人根據(jù)帶狀皰疹伴隨激烈疼痛及土鱉干粉的治療效果，推斷土鱉干粉中存在鎮(zhèn)痛組分。土鱉及土鱉干粉在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用時(shí)都是口服給藥，土鱉及土鱉干粉經(jīng)口服給藥的一次劑量在10g左右。這樣大的劑量使病人感到不便。依據(jù)土鱉及土鱉干粉的蛋白質(zhì)性質(zhì)、蛋白質(zhì)經(jīng)口服進(jìn)入胃可被胃蛋白酶降解為多肽的性質(zhì)，以及多肽的良好水溶性，發(fā)明人推測(cè)土鱉及土鱉干粉的直接水提物和酶解物有可能在不減弱治療效果的前提下減少服藥量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于依據(jù)土鱉及土鱉干粉的蛋白質(zhì)性質(zhì)、蛋白質(zhì)經(jīng)口服進(jìn)入胃可被胃蛋白酶降解為多肽的性質(zhì)，以及多肽的良好水溶性，研究設(shè)計(jì)土鱉干粉的提取物的制備和用途。本發(fā)明提供了一種土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括水提法或酶解法。1、水提法土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)土鱉水提多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按3:100w/v的比例懸浮、50'C士3t:恒溫?cái)嚢?0分鐘、過(guò)濾、濾液冷凍干燥、得到的水提多肽粗粉Wo(C保存；(2)土鱉水提多肽粗粉的分離與純化將水提多肽粗粉Wo與蒸餾水按6:lw/v的比例溶解、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到W^Wu、Wra和W^四種水提多肽組分。(3)得到W!、Wn、Wm和Ww四種水提多肽組分制成凍干粉。2、酶解法土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)土鱉酶解多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按l:10w/v的比例懸浮、得到的懸浮液與模擬胃液2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HCl，雙蒸水定容于1000ml，pH值為1.2按1:1的比例混合、46r土3t:恒溫振蕩4小時(shí)、減壓過(guò)濾、濾液用固體NaHC03調(diào)pH7.0、3000轉(zhuǎn)離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥，得到的酶解多肽粗品(Eo)4'C保存；(2)建立土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化將酶解多肽粗粉與蒸餾水按5:lw/v的比例溶解、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫流速0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到E!、En和Em三種多肽組分；(3)得到E^Eu和Em三種多肽組分制成凍干粉。通過(guò)測(cè)定分離得到的水解多肽組分WIV的HPLC指紋圖譜和HPLC-ESI-MS指紋圖譜，以及Eo、E!、En和Em四種酶解多肽組分的HPLC指紋圖譜和HPLC-ESI-MS指紋圖譜，確定水解多肽組分WTv和酶解多肽組分EhEn和Em多肽的氨基酸序列。鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng)的Ww水提多肽組分測(cè)定HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測(cè)定ESI-MS，根據(jù)互補(bǔ)原理分析圖譜(圖4)，得到一種序列H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.采用LC-MS技術(shù)確定ET、Eu和Em三種酶解多肽組分的特征多肽序列.其中^為1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn國(guó)Met-Met-Cys-OH和2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;Eu為3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro國(guó)Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr-Thr國(guó)OH和4)H-Phe-Thr-Ser-Asp陽(yáng)His陽(yáng)Ser-Tyr-Asn-Phe陽(yáng)Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)曙Gln(Lys)-OH;Em為5)H-Pro-Gly-Ala-Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr墨Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH和6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met國(guó)OH,Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。本發(fā)明另一目的是提供了土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明用小鼠耳腫脹模型評(píng)價(jià)本發(fā)明分離得到的水解多肽組分WQ、W卜W、Wffl、Ww和酶解多肽組分Eo、E!、En和Em對(duì)疼痛的抑制作用。本發(fā)明用小鼠1個(gè)月喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)本發(fā)明分離得到的水解多肽組分W。、W,、Wu、Wm、Wiv和酶解多肽組分Eo、Et、En和Em的毒性和依賴(lài)性。結(jié)果表明本發(fā)明的土鱉提取物具有鎮(zhèn)痛活性，未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)癥狀和耐受性癥狀及成斷反應(yīng)癥狀。本發(fā)明提供的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，所述藥物為土鱉提取物與藥用輔料組成的制劑。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。圖l.具體實(shí)施過(guò)程描述。圖2.W^的HPLC指紋圖譜。圖3.W^的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖4.WIV的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖5.&的HPLC指紋圖譜。圖6.Eu的HPLC指紋圖譜。圖7.Em的HPLC指紋圖譜。圖8.^的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖9.En的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖10.Em的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖ll.E!的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖12.Ez的組分之二的HPLC-ESI-MS圖譜。圖13.Eu的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖14.En的組分之二的HPLC-ESI-MS圖譜。圖15.Em的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l土鱉水提多肽粗粉的制備將15g土鱉干粉(由干土鱉研磨而得)懸浮于500ml蒸餾水中。得到的懸浮液于50。C恒溫?cái)嚢?0分鐘。懸浮液常壓自然過(guò)濾,濾液冷凍干燥,得到3.0g(20。/。)土鱉水提多肽粗粉，4'C保存待用。實(shí)施例2土鱉水提多肽粗粉的分離與純化SephadexG25經(jīng)處理后裝柱(2.6X60cm),將0.007mo1/L乙酸胺經(jīng)0.45nm微孔濾膜過(guò)濾后作為緩沖液平衡。3.0g土鱉水提多肽粗粉用0.5ml蒸餾水溶解，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘。上清液上SephadexG25層析柱,以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min,8min收一管,每管均選用紫外分光光度計(jì)光度測(cè)量，波長(zhǎng)280nm，記錄數(shù)據(jù)，用MicrosoftExcel做出曲線(xiàn)，按峰形合并餾份，冷凍干燥。得到0.20g(6.7%)Wh0.50g(17%)Wn、0.99g(33%)Wm和0.30g(10.0%)Ww四種水提多肽組分。實(shí)施例3Wz、Wu、Wm和W^的鎮(zhèn)痛活性測(cè)定將雄性ICR小鼠(22士2g)分為對(duì)照組(Wo)，以及W!、Wu、Wm和Ww治療組，每組10只小鼠。Wn、Wm和Ww分別用0.3ml生理鹽水溶解。\^、Wn、Wn#BWIV的灌胃劑量按照劑量(mg/kg"9.01X38mg/只X收率計(jì)算，艮卩0.4mg/0.3ml/只Wj、9.1mg/0.3ml/只Wn、12.5mg/0.3ml/只Wm禾口3.2mg/0.3ml/只Ww。Wo組0.3ml/只生理鹽水。將小鼠置于特制塑料圓筒內(nèi)，尾部暴露在筒外，室內(nèi)溫度保持在(2o土rc),待動(dòng)物穩(wěn)定30min后,以輻射熱甩尾法測(cè)痛，采用一特制燈罩使其發(fā)出直徑為2mm的光束照在距尾端部約2-3cm處,調(diào)節(jié)光源電壓使甩尾潛伏期在6.5-8.5s,兩次測(cè)甩尾潛伏期的間隔為5min，共測(cè)4次,取平均值作為基礎(chǔ)閾值。給藥后30min、60min、90min、120min、150min禾tH80min各測(cè)一次閾值。測(cè)得值與基礎(chǔ)值比較,以變化率表示痛閾變化,g卩(給藥后的痛閾-基礎(chǔ)痛閾)/基礎(chǔ)痛閾X100n/c,痛閾超過(guò)15s者按15s計(jì)算。測(cè)定的數(shù)據(jù)列入表l。表l.服W(Hv后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>0=生理鹽水,11=10,3)與Wo組比較P0.05，b)與Wo組比較PO.01.實(shí)施例4W^的量效關(guān)系測(cè)定按照實(shí)施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22土2g)分為對(duì)照組(Wo)，以及Wjv高劑量組、W^中劑量組和Ww低劑量組，每組10只小鼠。灌胃劑量為3.2mg/0.3m1/只W^(高劑量組)、32嗎/0.3ml/只W^(中劑量組)、3.2|xg/0.3mlARWIV(低劑量組)、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測(cè)定的數(shù)據(jù)列入表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Wo二生理鹽水，n-10,a)與Wo組比較P0.05,b)與W。組比較PO.01.實(shí)施例5Ww的HPLC指紋圖譜將lmg具有明顯鎮(zhèn)痛活性的Wv用lml三蒸水溶解，得到的樣品溶液過(guò)0.2)nm微孔濾膜。然后進(jìn)行HPLC分析。色譜柱為KromasilC18柱，粒徑5nm，4.6mmX250mm。流動(dòng)相為甲醇-水(5:95)。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為10pl。流速為lml/min。得到的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖2。實(shí)施例6Ww的HPLC-ESI-MS將lmg具有明顯鎮(zhèn)痛活性的Wv用lml三蒸水溶解，得到的樣品溶液過(guò)0.2pm微孔濾膜。然后進(jìn)行HPLC分析。色譜柱為KromasilC18柱，粒徑5pm,4.6mmX250mm。流動(dòng)相為甲醇-水(5:95)。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為10pl。流速為lml/min。得到的HPLC-ESI-MS指紋圖譜見(jiàn)圖3。實(shí)施例7Ww中多肽的序列按照實(shí)施例5的方法測(cè)定WIV的HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測(cè)定ESI-MS，根據(jù)互補(bǔ)原理分析圖譜(圖4),得到一種序列H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.實(shí)施例8土鱉酶解多肽粗粉的制備根據(jù)1995年美國(guó)藥典提供的模擬胃液配方(2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HC1,雙蒸水定容于1000ml，pH值約為1.2)酉己制200ml模擬胃液。將10g土鱉干粉懸浮于100ml蒸餾水中。將得到的懸浮液與100ml模擬胃液混合、46°C土3'C恒溫振蕩器中振蕩4小時(shí)、用布氏漏斗抽濾。濾液用固體NaHC03調(diào)pH值7.0(有不溶物出現(xiàn))、3000轉(zhuǎn)離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥。得到酶解多肽粗品(5.5g,收率55%)、命名為Pr-E、4'C保存。實(shí)施例9土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化按照實(shí)施例8的方法，從2g酶解多肽粗品分離到180mg(9X)E!、1440mg(72%)En和380mg(19%)Em三種多肽組分。實(shí)施例IOEt、Eu和Em的HPLC指紋圖譜按照實(shí)施例5的方法，得到E!、Eu和Em的HPLC指紋圖譜(圖5-7)實(shí)施例llEhEn和Em的HPLC-ESI-MS按照實(shí)施例6的方法，得到E!、En和Em的HPLC-ESI-MS指紋圖譜(圖8-10)實(shí)施例12Ei、En和Em中多肽的序列按照實(shí)施例6的方法測(cè)定W!v的HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測(cè)定ESI-MS，根據(jù)互補(bǔ)原理分析圖譜(圖11-15)，En和Em得到六種序列。其中&為1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH禾口2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;En為3)H-Ala-Gln(Lys)陽(yáng)Phe-Pro-Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr陽(yáng)Thr-OH禾口4)H-Phe-Thr-Ser-Asp-His-Ser-Tyr-Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH;Em為5)H-Pro-Gly-Ala誦Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)國(guó)Ala-Pro-OH禾口6)H隱His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp隱Phe-Ala-Ala陽(yáng)Tyr-Met-OH.-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。實(shí)施例13EH和Em的鎮(zhèn)痛活性測(cè)定按照實(shí)施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22±2g)分為對(duì)照組(W0)，以及Et組、En組和Em組，每組10只小鼠。灌胃劑量為0.14mg/0.3ml/只E!、5mg/0.3m1/只Eu、0.31mg/0.3ml/只Em、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測(cè)定的數(shù)據(jù)列入表3。表3.服W。、E!-m后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>\^=生理鹽水，11=10,3)與Wo組比較P0.05,b)與Wq組比狡PO.01.實(shí)施例14Em的量效關(guān)系測(cè)定按照實(shí)施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22±2g)分為對(duì)照組(Wo)，以及Em高劑量組、Em中劑量組和Em低劑量組，每組10只小鼠。灌胃劑量為0.31mg/0.3ml/只Era(高劑量組)、3.1ng/0.3ml/只Em(中劑量組)、0.3.1pg/0.3ml/只Em(低劑量組)、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測(cè)定的數(shù)據(jù)列入表4。表4J艮不同劑量WIV后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Wo:生理鹽水，n-10,a)與Wo組比較P0.05，b)與Wo組比較PO.01.實(shí)施例15WIV和Em的急性毒性評(píng)價(jià)20只雄性ICR小鼠(23±lg)分為2組，每組10只，用WIV和Eml次性灌胃，W^的灌胃劑量為47mg/0.3ml/只，相當(dāng)于最高有效劑量的15倍。Em的灌胃劑量為34mg/0.3ml/只，大約相當(dāng)于最高有效劑量的100倍。小鼠按正常條件飼養(yǎng)7天，期間未觀(guān)察到任何行為異常。第7天小鼠處死，解剖之后未觀(guān)察到任何臟器異常。實(shí)施例16EI、EII、EIII和WIV的耐受性評(píng)價(jià)50只雄性ICR小鼠(31土lg)分為5組，每組10只，用EI、EII、EIII和WIV灌胃，EI灌胃單劑量為0.02184mg/0.3ml/只、EII灌胃單劑量為0.19121mg/0.3m1/只、EIII灌胃單劑量為0.04645mg/0.3ml/只、WIV灌胃單劑量為0.00648mg/0.3m1/只。均相當(dāng)于中等有效劑量。連續(xù)灌胃30天，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)癥狀、耐受性癥狀。小鼠停止給藥7天，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)任何戒斷反應(yīng)癥狀。權(quán)利要求1、土鱉提取物的制備方法，其特征在于該方法為水提法，包括下列步驟(1)土鱉水提多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按3:100w/v的比例懸浮、50℃±3℃恒溫?cái)嚢?0分鐘、過(guò)濾、濾液冷凍干燥、得到的水提多肽粗粉4℃保存；(2)土鱉水提多肽粗粉的分離與純化將水提多肽粗粉與蒸餾水按6:1w/v的比例溶解、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mol/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到WI、WII、WIII和WIV四種水提多肽組分；(3)得到的WI、WII、WIII和WIV四種水提多肽組分制成凍干粉。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述土鱉提取物的制備方法，其特征在于其中水提多肽組分WIV的多肽序列采用LC-MS技術(shù)確定為H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH。3、土鱉提取物的制備方法，其特征在于該方法為酶解法，包括下列步驟(1)土鱉酶解多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸鎦水按l:10w/v的比例懸浮、得到的懸浮液與模擬胃液2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HCl,雙蒸水定容于1000ml，pH值為1.2按1:1的比例混合、46'C士3'C恒溫振蕩4小時(shí)、減壓過(guò)濾、濾液用固體NaHC03調(diào)pH7.0、3000轉(zhuǎn)離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥，得到的酶解多肽粗品4'C保存；(2)土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化將上述酶解多肽粗粉與蒸餾水按5:lw/v的比例溶解、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mol/L乙酸胺緩沖液洗脫流速0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到&、En和Em多肽組分；(3)得到的E!、En和Em三種多肽組分制成凍干粉。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述土鱉提取物的制備方法，其特征在于其中酶解多肽組分&、En和Em采用LC-MS技術(shù)確定的多肽序列為EI:1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH禾口2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;EII:3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro-Ala國(guó)Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met國(guó)Thr-Thr國(guó)OH禾口4)H-Phe-Thr-Ser-Asp隱His-Ser-Tyr國(guó)Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH;5)H-Pro-Gly-Ala曙Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH禾口6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp隱Phe-Ala-Ala-Tyr陽(yáng)Met-OH,Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。5、一種如權(quán)利要求1所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的土鱉提取物含有W卜W、Wm和Ww水提多肽組分。6、一種如權(quán)利要求3所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的土鱉提取物含有E!、En和Em酶解多肽組分。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為土鱉提取物與藥用輔料組成的制劑。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了土鱉干粉提取物的制備方法。本發(fā)明方法包括水提法或酶解法，土鱉干粉先水提或酶解，將水提液或酶解液通過(guò)SephadexG25柱層析分離，得到系列多肽組分，再將所分離的多肽組分經(jīng)冷凍干燥制備成凍干粉。經(jīng)小鼠耳腫脹模型評(píng)價(jià)表明，本發(fā)明的土鱉干粉提取物系列多肽組分對(duì)于疼痛均有顯著的抑制作用。小鼠1個(gè)月喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的多肽組分既無(wú)毒性也無(wú)依賴(lài)性。本發(fā)明提供了土鱉干粉提取物系列多肽組分在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K9/19GK101390881SQ20071004624公開(kāi)日2009年3月25日申請(qǐng)日期2007年9月21日優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日發(fā)明者葉偉東,彭師奇,李春波,偉毛,明趙,蕾魏申請(qǐng)人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠(chǎng)